Durante el desarrollo del oído interno, Notch presenta dos modos de funcionamiento: inducción lateral, que se asocia con la especificación prosensorial, e inhibición lateral, asociada a la determinación de las células ciliadas. Estos mecanismos dependen, respectivamente, en dos ligandos diferentes, Jagged1 (Jag1) y Delta1 (Dl1) y se basan en una misma cascada de señalización iniciada con la activación de Notch. En el otocisto de pollo, la expresión de Jag1 y Hey1 se correlacionan bien con la inducción lateral, mientras que Jag1 y Dl1 se expresan durante la inhibición lateral junto con Hey1 y Hes5. Otros Hes/Hey genes no muestran patrones restringidos de expresión en el epitelio ótico. Los experimentos muestran que Jag1 induce niveles más bajos de actividad de Notch que Dl1, y ello resulta en la expresión diferencial de Hey1 y Hes5. Además, Jag1 interfiere con la capacidad de Dl1 para inducir niveles altos de actividad de Notch. Modelando el epitelio sensorial para los dos ligandos se demuestra que la regulación de los ligandos, la fuerza de la señalización y la competencia por la señalización son fundamentales para permitir los dos modos de funcionamiento y para establecer el patrón alterno de las células ciliadas. Jag1, opera en el modo de inducción lateral cuando está sólo, pero facilita la inhibición lateral en presencia de Dl1. Este nuevo comportamiento emerge de que Jag1 actúa como un inhibidor competitivo de Dl1 para la señalización de Notch. Los experimentos muestran que el patrón de células ciliadas es muy robusto, y el modelo sugiere que la autoactivación del factor proneural Atoh1 es un componente fundamental para la robustez del patrón. Los resultados destacan la importancia de los niveles de señalización Notch y la competencia entre los ligandos para la función de Notch. Hey1 y Hes5 están regulados por Notch, sin embargo, el patrón de expresión Hey1 sugiere que puede ser también regulado por otros mecanismos. Los resultados muestran que las vías Bmp, Wnt y Ffg modifican la expresión de Hey1 y Hes5. Particularmente, Hey1 está regulado por Wnt a través de la señalización Jag1-Notch y los Bmps regulan diferencialmente a Hey1 y Hes5. Además, Hey1 y Hes5 muestran diferentes estabilidades de mRNA, lo que al menos en parte subyace a las respuestas temporales diferentes tras el bloqueo de Notch. La ganancia de la función de Hey1 o Hes5 muestra que existe una regulación cruzada y compleja. Tanto como Hey1 y Hes5 suprimen la expresión Dl1, lo que sugiere que cooperan durante la inhibición lateral. Por otro lado, a pesar de su asociación con Jag1, Hey1 no es instrumental para la inducción lateral. Se sugiere que Hey1 y Hes5, son objeto de una regulación compleja que incluye diferentes niveles de actividad de Notch, la estabilidad de sus transcritos, la regulación cruzada y por otras vías de señalización que pueden así determinar los diferentes roles de Hey1 y Hes5 en el oído interno. / During inner ear development, Notch exhibits two modes of operation: lateral induction, which is associated with prosensory specification, and lateral inhibition, which is involved in hair cell determination. These mechanisms depend respectively on two different ligands, Jagged1 (Jag1) and Delta1 (Dl1) and rely on a common signaling cascade initiated after Notch activation. In the chicken otocyst, expression of Jag1 and the Notch target Hey1 correlates well with lateral induction, whereas both Jag1 and Dl1 are expressed during lateral inhibition as are Notch targets Hey1 and Hes5. Other Hes/Hey genes do not show restricted expression patterns in the otic epithelium. We show that Jag1 drives lower levels of Notch activity than Dl1, which results in the differential expression of Hey1 and Hes5. In addition, Jag1 interferes with the ability of Dl1 to elicit high levels of Notch activity. Modeling the sensory epithelium when the two ligands are expressed together shows that ligand regulation, differential signaling strength and ligand competition are crucial for allowing the two modes of operation and for establishing the alternate pattern of hair cells and supporting cells. Jag1, while driving lateral induction on its own, facilitates patterning by lateral inhibition in the presence of Dl1. This novel behavior emerges from Jag1 acting as a competitive inhibitor of Dl1 for Notch signaling. Both modeling and experiments show that hair cell patterning is very robust. The model suggests that autoactivation of proneural factor Atoh1, upstream of Dl1, is a fundamental component for robustness. The results stress the importance of the levels of Notch signaling and ligand competition for Notch function. Hey1 and Hes5 are regulated by Notch, however, Hey1 expression pattern suggests that it may be also regulated by other Notch-independent mechanisms. The results show that Bmp, Wnt and Fgf pathways modify Hey1 and Hes5 expression in the inner ear. Particularly, Hey1 is regulated by Wnt through Jag1-Notch signaling and Bmps differentially regulate Hey1 and Hes5 expression. In addition, Hey1 and Hes5 show different mRNA stability that at least in part underlies differential temporal responses after Notch blockade. The gain of function of Hey1 or Hes5 shows that they cross-regulate each other in a rather complex manner. Both Hey1 and Hes5 suppress Dl1 expression, suggesting that they cooperate during lateral inhibition. On the other hand, in spite of its association with Jag1, Hey1 is not instrumental for lateral induction, which is promoted by Hes5. We suggest that Hey1 and Hes5, are subject of a rather complex regulation that includes different levels of Notch activity, the stability of their transcripts, cross regulation and other signaling pathways that may determine the different roles of Hey1 and Hes5 in inner ear.

Cerebral cortex is essential to exert the highest functions in mammals. Understanding the developmental processes that underlie the generation and functionality of cortical cell populations represents a mayor issue in neurobiology. DYRK1A is a dosage-sensitive gene involved in neurodevelopment with putative roles in corticogenesis. In the present study, we show that the transcriptome of the cerebral cortex of newborn mice lacking one functional copy of Dyrk1a (Dyrk1a+/-) is substantially altered and is mostly the consequence of a delayed developmental gene expression program. We also show that neural progenitors of Dyrk1a+/- mice have a reduced capability to self-renew and to differentiate into oligodendroglial cells in vitro. Moreover, we demonstrate that the epigenetic state of S100b and Gfap glial genes in the cortex of Dyrk1a+/- embryos is altered at specific promoter positions before the onset of gliogenesis, suggesting that Dyrk1a+/- neural progenitors may have an increased astrogliogenic and a decreased oligodendrogenic potential in vivo. In accordance, the number of S100b+ oligodendrocytes is reduced in the postnatal cortex of Dyrk1a+/- mutants whereas the number of Gfap+ astrocytes is increased in the adult. Finally, we show that the myelin thickness of Corpus Callosum axons and of axons of the optic and sciatic nerves is significantly decreased in adult Dyrk1a+/- mice, indicating a possible role of Dyrk1a in myelination. Altogether our results indicate that Dyrk1a dose reduction alters the differentiation potential of the embryonic cortical progenitors and suggest a new role of Dyrk1a in glial development and function. / L’escorça cerebral és essencial per dur a terme les funcions més complexes en els mamífers. Entendre el procés de desenvolupament involucrat en la generació i el funcionament de les poblacions cel·lulars de l’escorça representa un dels principals camps d’investigació de la neurobiologia. DYRK1A és un gen sensible a dosis involucrat en el neurodesenvolupament i molt possiblement en la corticogènesis. En aquest estudi demostrem que la reducció de la dosi gènica de Dyrk1a en ratolí (Dyrk1a+/-) provoca una alteració substancial del transcriptoma de l’escorça cerebral neonatal que es principalment la conseqüencia de un retard en el l’expresió seqüencial dels gens durant el desenvolupament. També hem demostrat que els progenitors neuronals dels ratolins Dyrk1a+/- tenen una menor capacitat d’autorenovació i diferenciació en cèl·lules oligodendroglials in vitro. El estat epigenetic dels gens glials S100b i Gfap es troba alterat en l’escorça d’embrions a posicions especifiques del promotor abans de l’inici de la gliogènesis, suggerint que els progenitors neuronals de ratolins Dyrk1a+/- podrien tenir un potencial astrogliogènic incrementat i un potencial oligodendrogènic disminuït in vivo. En concordança, l’escorça de ratolins Dyrk1a+/- neonatals presenta un major número de progenitors oligodendroglials S100b+, mentres que el número d’astròcits Gfap+ es troba incrementat en ratolins Dyrk1a+/- adults. Finalment, hem demostrat que la vaina de mielina dels axons del cos callos i del nervi òptic i ciàtic es troba significativament reduïda en els ratolins Dyrk1a+/- adults, fet que indica una posible implicació de Dyrk1a en mielinització. En conjunt els nostres resultats indiquen que la baixada de dosi de Dyrk1a altera el potencial de diferenciació dels progenitors embrionaris de l'escorça i suggereix un nou paper de Dyrk1a en el desenvolupament i en la funcionalitat glial.

La regió de l’aorta-gonada-mesonefros (AGM) és el primer nínxol de les cèl·lules mare hematopoètiques. Està descrit que la via de Notch és necessària per generar artèries i cèl·lules mare hematopoètiques. Les cèl·lules mare hematopoètiques es generen a partir de les artèries durant el desenvolupament embrionari. Tenint en compte que els vasos arterials es formen abans que les cèl·lules mare hematopoètiques, durant molt temps ha estat controvertit si la via de Notch només indueix la formació d’artèries i en canvi l’abscència de cèl·lules mare hematopoètiques és un efecte secundari o si per contra, la via de Notch participa activament en la inducció d’ambdós programes genètics, l’arterial i l’hematopoètic. Moltes de les funcions descrites de la via de Notch són conseqüència de l’expressió de les seves dianes transcripcionals: Hes i Hesrelated (Hrt). No obstant cada cop s’estan identificant noves dianes transcripcionals de la via de Notch que són específiques de teixit. En aquesta tesis doctoral, demostrem que l’activació de la via de Notch per part del lligand Jagged1 és necessària per activar el programa hematopoètic però no cal per establir el programa arterial. Aquest fet demostra que la via de Notch juga un paper clau i directe en l’hematopoèsi embrionaria. Per sota de la via de Notch mostrem que els embrions deficients en Hes1 i Hes5 mantenen intacte el programa arterial. Cal remarcar que també generen més quantitat de cèl·lules mare hematopoètiques però que no són funcionals. A més tal mutants, tenen nivells més alts d’expressió dels gens Runx1, Myb i Gata2; els quals són importants reguladors de l’hematopoèsi. Per acabar demostrem que Notch activa la transcripció de Gata2 i que HES-1 l’inhibeix. Això genera un Incoherent Feed-Fordward loop, el qual regula estretament els nivells de Gata2 necessàris per generar cèl·lules mare hematopoètiques. / The aorta-gonad-mesonephros (AGM) is the first Hematopoietic Stem Cell (HSC) niche. It was previously shown that Notch pathway is required to induce the arterial fate as well as to generate Hematopoietic Stem Cells. HSC emerge at the site of arterial vessels during embryonic development. Since arterial fate precedes HSC generation, it has long been controversial whether Notch exclusively induces the arterial program and the lack of HSC is a secondary defect; or Notch is directly involved in activating both genetic programs, arterial and hematopoietic. The best-characterized Notch targets are Hes and Hesrelated genes (Hrt) since they are involved in most of described Notch functions, however there is a growing number of tissue-specific transcriptional Notch-targets. In this thesis, we found that Jagged-mediated activation of Notch is required for the correct execution of the definitive hematopoietic program but not for the establishment of the arterial fate, thus demonstrating that Notch exerts a specific hematopoietic function in the embryo. Downstream of Notch pathway, we also show that embryos deficient for Hes1 and Hes5 alleles contain an intact arterial program but produce increased numbers of non-functional hematopoietic stem cells associated to higher levels of the hematopoietic regulators Runx1, Myb and Gata2. Moreover, Gata2 transcription is positively regulated by Notch and negatively controlled by HES-1. This creates an incoherent feed-forward loop that tightly controls Gata2 levels to generate HSC.

Durant el desenvolupament embrionari, els teixits s’especifiquen gradualment fins a que adquireixen un destí final. En els vertebrats el Sistema Nerviós Central (SNC) deriva del tub neural, una estructura embrionària transitòria que està regionalitzada al llarg de l'eix anteroposterior (AP) en tres diferents vesícules cerebrals i en la medul·la espinal. El romboencèfal, la vesícula cerebral posterior, és la més conservada evolutivament i donarà lloc a estructures importants com el cerebel. La part posterior del cervell està segmentada de manera transitòria al llarg de l'eix AP en diferents compartiments anomenats rhombòmeres (r). Aquesta organització segmentada determina el desenvolupament temporal i espacial de les estructures que es formen en un patró repetit, com els nervis cranials i les neurones reticulars. Els rombòmers són compartiments de llinatge cel·lular separats per fronteres, que restringeixen la barreja de cèl·lules dels diferents compartiments. Una combinatòria gènica específica confereix identitat molecular a cada rombòmer. Aquests gens refinen progressivament el seu límit de expressió, establint fronteres moleculars que prefiguren on es formaran les fronteres morfològiques que impediran que les cèl·lules es barregin. Fins avui, encara no està clar quins són els mecanismes cel·lulars i moleculars responsables de refinament de les fronteres i de la segregació cel·lular. En aquest treball es demostra que el cell-sorting és el principal mecanisme responsable del refinament dels límits moleculars en el romboencèfal. Per a això, vam realitzar un seguiment de les cèl·lules in vivo i una anàlisi de les seves trajectòries. Es demostra que el moviment cel·lular està restringit entre rombòmeres adjacents un cop els límits moleculars han estat refinats, a causa de la formació d'un cable de actomiosina a la part apical de les cèl·lules de la frontera. Finalment, hem demostrat que aquest procés està mediat per la via de senyalització Eph/Ephrin. / During development, embryonic tissues are gradually patterned and they eventually are committed to a specific fate. In vertebrates, the entire Central Nervous System (CNS) derives from the neural tube, a transient embryonic structure that is regionalized along the anteroposterior (AP) axis in three different brain vesicles and the spinal cord. The hindbrain, the posterior brain vesicle, is the most evolutionary conserved and it will give rise to important structures such as the cerebellum. The hindbrain itself is transiently patterned along the AP axis in different metameric segments called rhombomeres (r). This organization dictates the temporal and the spatial development of structures that are formed in a repeated pattern, like cranial nerves and reticular neurons. Rhombomeres are cell-lineage compartments, divided by boundaries where cell mixing is restricted. A specific combinatory of gene expression confers molecular identity to each rhombomere. Rhombomeric-restricted genes are progressively refined during development transiting from jagged to sharp limits of expression, therefore establishing molecular boundaries. After that, morphological borders become visible and impede cell intermingling. Up to date, it was still not clear which are the cellular and molecular mechanisms responsible for boundary refinement and responsible of rhombomeric cell segregation. In this work we demonstrate that cell sorting is the main mechanism responsible for refinement of molecular boundaries in the hindbrain. For this, we performed in vivo cell tracking and fake-cell tracing analysis. We show that once molecular boundaries are refined cell movement is restricted between adjacent rhombomeres due to the formation of an actomyosin cable in the cellular cortex of the cells at the boundary. Finally, we demonstrate that this process is mediated by the Eph/Ephrin signaling pathway.

La pèrdua de funció del sistema vestibular causa vertigen, pèrdua d’equilibri i pèrdua de mirada fixa durant el moviment, sovint acompanyats de marejos i nàusees. Els trastorns de l’equilibri són comuns a les persones grans i alteren el seu patró de marxa, sent un important factor de risc per a les caigudes. En els éssers humans, una de les causes de pèrdua de funció vestibular és la toxicitat d’alguns fàrmacs, com antibiòtics aminoglicòsids, medicaments antipalúdics, diürètics de nansa, agents quimioterapèutics com el cisplatí, així com una sèrie de productes químics d’exposició laboral. La diana principal de la toxicitat són les cèl·lules ciliades. Estudis d’exposició aguda en animals han demostrat clarament que els components ototòxics poden causar discapacitat permanent perquè causen la degeneració de moltes o totes les cèl·lules ciliades. Aquestes cèl·lules no poden regenerar o ho poden fer de manera limitada en algunes espècies de mamífers com el conill d’Índies i la xinxilla i en qualsevol cas la recuperació funcional és limitada o nul·la. En peixos, amfibis i ocells les cèl·lules ciliades es produeixen i es poden regenerar al llarg de tota la vida. Les noves cèl·lules ciliades procedeixen de les cèl·lules de suport seguides de dos possibles mecanismes: mitosis o transdiferenciació. Aquestes evidències d’estudis experimentals no serveixen per explicar la recuperació funcional que té lloc en els humans després de la interrupció de l’exposició crònica ototòxica. Quan en pacients a qui s’ha diagnosticat ototoxicitat es para el tractament, els resultats són molt variables: des de la persistència completa dels símptomes fins una recuperació incompleta o completa. Encara que la recuperació comportamental es pot explicar en part per fenòmens de compensació al sistema nerviós central, es coneix molt poc sobre els mecanismes cel·lulars i moleculars involucrats en el dany vestibular crònic i la seva possible recuperació, així como la seva rellevància a nivell comportamental. Per a estudiar els processos involucrats en el dany i reparació vestibulars associats amb la ototoxicitat crònica i la subsegüent recuperació, es van exposar rates Long Evans mascles a IDPN (3,3’-iminodipropionitrilo) via l’agua de beguda durant vàries setmanes i es van avaluar al final del període d’exposició i al final d’un període de recuperació. Per a identificar les etapes de dany que són susceptibles de reparació i que poden ser la base de la recuperació funcional, es van examinar les característiques ultraestructurals de les crestes i els utricles. La intoxicació crònica per IDPN provoca pèrdua de les cèl·lules ciliades per extrusió. Per a revelar més característiques ultraestructurals del dany ototòxic i la seva posterior recuperació, així com dels efectes ciliars, es van examinar les crestes per microscòpia electrònica de transmissió. Per a caracteritzar la dinàmica del dany aferent i del procés de reparació, es van estudiar mitjançant immunohistoquímica i microscòpia de fluorescència confocal l’expressió de proteïnes prèviament identificades en el contacte entre el calze aferent i la cèl·lula ciliada de tipus I. El següent pas va ser estudiar que passava amb les cintes de les sinapsis aferents de les cèl·lules ciliades de tipus I i de tipus II. El model d’ototoxicitat crònica induït per IDPN a l’aigua de beguda, causa retracció i fragmentació del calze aferent abans que tingui lloc la mort de les cèl·lules ciliades per extrusió. En aquest treball es presenten les evidències que el desmantellament de les unions septades és un procés anterior al dany aferent durant la ototoxicitat crònica i que l’extensa reparació de les unions septades i del calze aferent són possibles després d’aturar-se l’agressió. / Acute toxic insults to the mammalian vestibular system cause loss of the sensory hair cells and subsequent loss of equilibrium. In animal models, many studies have demonstrated apoptosis, sometimes necrosis, of the hair cells. In most mammalian species the functional loss is permanent because the hair cells do not regenerate. Human vestibular dysfunction most commonly arises progressively as a result of chronic exposure to ototoxic compounds such as the aminoglycoside antibiotics. If the exposure is discontinued, a highly variable degree of recovery is observed, being either complete, only partial, or minimal with persistent dysfunction. The cellular and molecular bases of the vestibular dysfunction associated with chronic toxicity and of its remarkable variability in the degree of recovery are not established. One reason for this limited knowledge is the scarcity of animal studies of chronic vestibular toxicity, owing to, at least in part, the resiliency of rats and mice to aminoglycoside ototoxicity. Ototoxic nitriles offer an alternative model to study vestibular toxicity in these species. A particularly dependable model is the one of chronic drinking water exposure of rats to 3,3’-iminodipropionitrile (IDPN). We have established a protocol to study the vestibular sensory epithelia simultaneously by scanning electron microscopy, transmission electron microscopy and confocal immunofluorescence microscopy in rats previously assessed for vestibular dysfunction during chronic ototoxic exposure followed by variable times of recovery. This allows identifying the structural and molecular events associated with the loss and recovery of vestibular function. Initial data indicate that a deep but fully reversible functional loss is associated with synaptic and afferent damage and intact ciliary structure. With continued IDPN exposure, hair cell damage and more persistent functional are observed. We hypothesize that similar events occur in humans and are relevant to chronic damage, including that associated with age.

El procés d’envelliment causa nombrosos canvis a l’organisme, reduint les capacitats funcionals màximes i l’homeòstasi, i augmentant la probabilitat de desenvolupar malalties degeneratives. Tots aquests canvis probablement s’originen en un nombre petit de causes, que operen contínuament al llarg de tota la vida i sembla que l’estrès oxidatiu és un factor clau. Les pèrdues cognitives i psicomotores són manifestacions comuns del procés d’envelliment del sistema nerviós, no obstant això, l’inici i severitat d’aquestes pèrdues semblen ser relativament independents una de l’altra, suggerint que diferents regions del sistema nerviós tenen una vulnerabilitat neuronal regió-dependent. En aquest sentit, l’objectiu ha estat definir les bases moleculars de la vulnerabilitat neuronal selectiva a l’estrès oxidatiu en regions del sistema nerviós central (SNC) humà; determinar l’efecte de l’envelliment del SNC humà; i avaluar el mecanisme d’acció de la restricció de metionina en el SNC de rata, com a intervenció nutricional que redueix l’estrès oxidatiu i el grau d’envelliment. Els resultats mostren l’existència d’una vulnerabilitat neuronal selectiva en les diferents regions del SNC humà, sent l’escorça frontal la regió que presenta un perfil metabolòmic i molecular més diferencial a la resta de regions que conformen el SNC humà. / El proceso de envejecimiento causa numerosos cambios en el organismo, reduciendo las capacidades funcionales máximas y la homeostasis, y aumentando la probabilidad de desarrollar enfermedades degenerativas. Todos estos cambios probablemente se originan en un número pequeño de causas, que operan continuamente a lo largo de toda la vida y parece que el estrés oxidativo es un factor clave. Pérdidas cognitivas y psicomotoras son manifestaciones comunes del proceso de envejecimiento del sistema nervioso, sin embargo, el inicio y la severidad de tales pérdidas parecen ser relativamente independientes una de la otra, sugiriendo que diferentes regiones del sistema nervioso tienen una vulnerabilidad neuronal región-dependiente. En este sentido, el objetivo se ha centrado en definir las bases moleculares de la vulnerabilidad neuronal selectiva al estrés oxidativo en regiones específicas del sistema nervioso central (SNC) humano; determinar el efecto del envejecimiento del SNC humano; y evaluar el mecanismo de acción de la restricción de metionina en el SNC de rata, como intervención nutricional que reduce el estrés oxidativo y la tasa de envejecimiento. Los resultados muestran la existencia de una vulnerabilidad neuronal selectiva en las diferentes regiones del SNC humano, siendo la corteza frontal la región que presenta un perfil metabolómico y molecular más diferencial al resto de regiones que conforman el SNC humano. / The aging process causes numerous changes in the organism, reducing the maximum functional capabilities and homeostasis, and increasing the probability of developing degenerative diseases. All these changes are likely to originate from a small number of causes, operating continuously throughout life span and it seems that oxidative stress plays an important role. Losses in cognition and psychomotor functions are common manifestations in mammals, however, the onset and severity of such casualities seem to be relatively independent of each other, suggesting that different regions of the nervous system have a region-dependent selective neuronal vulnerability. In this sense, this thesis has been designed with the aim of: provide insights into the molecular basis of the selective neuronal vulnerability to oxidative stress in specific regions of the human central nervous system (CNS); to determine the effect of aging in the human CNS; and to evaluate the mechanism of action of methionine restriction in rat CNS, as nutritional intervention that decreases oxidative stress and aging rate. The results show the existence of a selective neuronal vulnerability in different regions of the human CNS, and the frontal cortex is the region that has specific metabolomic and molecular hallmark comparing to all the other regions that comprise the human CNS.

Los ácidos araquidónico (AA), eicosapentaenoico (EPA) y linoleico (LA) son tres ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs) que se encuentran formando parte de los fosfolípidos de las membranas celulares. El AA, EPA y LA, después de ser liberados por las fosfolipasas, pueden ser metabolizados por la vía de las ciclooxigenasas (COXs), de las lipoxigenasas (LOXs) y la del citocromo P450 (CYP450), que constituyen la cascada del AA. Los metabolitos que se generan son los eicosanoides y los ácidos hidroxioctadecanoicos (HODEs), todos ellos con efectos pleitrópicos que incluyen su efecto sobre la proliferación celular, sobre todo en tejidos de renovación rápida como el epitelio intestinal, por ello podrian estar involucrados en el cáncer y concretamente en el cáncer colorrectal (CRC). El CRC principalmente se origina por mutaciones en el epitelio colorrectal que dan lugar a una hiperproliferación celular que puede originar adenomas y finalmente CRC. En el 85% de los adenomas y CRC existe una sobrexpresión de las COXs. Por este motivo, el objetivo de este trabajo ha sido estudiar el papel de la cascada del AA en el control de la proliferación de células epiteliales intestinales humanas. Como modelo experimental se han utilizado células epiteliales intestinales no diferenciadas Caco-2 procedentes de un adenocarcinoma. Los cultivos de células Caco-2 se mantuvieron en condiciones estándar y finalmente se incubaron en las diferentes condiciones experimentales durante 48 horas. Los recuentos celulares se realizaron con microscopia de fluorescencia con tinción de naranja de acridina y bromuro de etidio; la síntesis de DNA por incorporación de timidina tritiada o BrdU; el estudio del ciclo celular por citometria de flujo; estudio de la degradación de DNA cromosómico con el método TUNEL; la determinación de eicosanoides por espectometria de masas; el análisis de activación de las vías de señalización por ELISA y la síntesis de PGE2 por inmunoensayo enzimático. Los resultados indican que las células Caco-2 sintetizan prostaglandina E2 (PGE2), leucotrieno B4 (LTB4) y los ácidos hidroxieicosatetraenoicos 5-HETE, 12-HETE y 15-HETE. Estos eicosanoides, junto con LTD4 y 13-R-HODE, inducen el crecimiento celular y la síntesis de ADN. Estos efectos son consecuencia de la interacción de la PGE2 con los receptores EP1 y EP4, el LTB4 con los receptores BLT1 y BLT2 y el LTD4 con el receptor Cis-LT1R. Hasta el momento no se han identificado receptores celulares para la mayoría de HETEs y HODEs , en esta tesis observamos que el 13-R-HODE interacciona con BLT1 y BLT2 y el 12-HETE con BLT2. Además, cuando se unen a sus receptores activan diferentes vías de señalización implicadas en la regulación de la proliferación celular tales como ERK, p38, CREB, GSK-3β y β-catenina. Cabe destacar que los dos enantiómeros del 13-HODE presentan efectos contrarios. Así, mientras que el 13-R-HODE presenta un efecto proliferativo, el 13-S-HODE inhibe el crecimiento e induce apoptosis al unirse a PPARγ. En relación a los derivados del EPA, tanto la PGE3 como el 12-HEPE inducen la proliferación de las células Caco-2 de forma similar a la PGE2 y al 12-HETE, mientras que el LTB5 no es mitogénico. Finalmente, en este trabajo se propone que el efecto proliferativo de LTB4, LTD4 ,12-HETE, y 13-R-HODE podría deberse principalmente a la activación de la vía COXs y la subsecuente síntesis de PGE2, que a su vez activaría múltiples vías de señalización implicadas en la proliferación celular. Además estos estudios proporcionan nuevas evidencias sobre el papel de diversos eicosanoides y sus receptores en el control del crecimiento de las células epiteliales intestinales. Resultados que pueden ser considerados en futuras investigaciones sobre el CRC y en el planteamiento de su tratamiento. / Arachidonic acid (AA), eicosapentaenoic acid (EPA) and linoleic acid (LA) are three polyunsaturated fatty acids (PUFAs) which are part of the phospholipids of cell membranes. After being released, all of them are metabolized by cyclooxygenase (COXs), lipoxygenase (LOXs) and cytochrome P450 (CYP450) pathways that form the AA cascade. The metabolites generated are eicosanoids and hidroxioctadecanoicos acids (HODEs), all of them with pleiotropic effects. One function that these metabolites regulate is cell proliferation and, as a result, they may be involved in cancer and particularly in colorectal cancer (CRC). Therefore, the objective of this work is to study the role of AA cascade in controlling the proliferation of human intestinal epithelial cells. We have used undifferentiated intestinal epithelial cells Caco-2 derived from an adenocarcinoma, as the experimental model. The results indicate that the Caco-2 cells synthesize PGE2, LTB4 5-HETE, 12-HETE and 15-HETE. These eicosanoids, together with LTD4 and 13-R-HODE, induce cell growth and DNA synthesis. These effects are due to the interaction of PGE2 with EP1 and EP4 receptors, LTB4 and 13-R-HODE with BLT1 and BLT2 receptors, 12-HETE with BLT2 and LTD4 with Cys- LT1R receptor. Also, when they bind to their receptors, they activate different signaling pathways involved in the regulation of Caco-2 cell proliferation. Note that the two enantiomers of 13-HODE have opposite effects. Thus, while 13-R-HODE has a proliferative effect, 13-S-HODE inhibits growth and induces apoptosis by binding to PPARγ. Regarding the metabolites derived from EPA, both PGE3 and 12-HEPE induce cell proliferation similar to PGE2 and 12-HETE, whereas LTB5 is not mitogenic. Finally, this Thesis proposes that the proliferative effect of LTB4, LTD4, 12-HETE, and 13-R-HODE could be due mainly to the activation of the COXs pathway and subsequent synthesis of PGE2 which in turn activate multiple signaling pathways involved in cell proliferation. Taken together, these studies provide new evidence that could be considered in future research on the role of eicosanoids in the pathogenesis of CRC as well as in the development of new pharmacological strategies.

Las lesiones severas de nervio periférico se caracterizan por la desconexión del soma neuronal con el órgano inervado. Esta desconexión causa una pérdida de control motor, sensitivo y autonómico que conducen a una situación incapacitante para el paciente. Después de una lesión el sistema nervioso periférico tiene la capacidad de regenerar, pero para ello se requiere de un proceso de limpieza en el fragmento distal a la lesión y la promoción de la regeneración a través del extremo proximal. En esta tesis hemos querido centrarnos en el papel de la matriz extracelular en la regeneración de nervio periférico. Para ello, en el primer capítulo nos hemos centrado en el papel de dichas proteínas en la promoción de regeneración selectiva de axones motores y sensoriales y si una matriz basada en colágeno resulta un vehículo adecuado para funcionalizar guías neurales artificiales para la reparación de lesiones nerviosas. Utilizamos un cultivo organotípico de secciones transversales de médula espinal y explantes de ganglio de la raíz dorsal de animales postnatales y contrastamos nuestros resultados con un modelo adulto in vivo. Nuestros resultados muestran que tanto las matrices enriquecidas con fibronectina o laminina incrementan la elongación de neuritas sensoriales mientras que las neuritas motoras solo respondían a las matrices enriquecidas con fibronectina, al compararlas con matrices controles de colágeno sin enriquecer in vitro. Además, en etapas postnatales las matrices enriquecidas con fibronectina promovían la regeneración específica de neuritas tanto motoras como sensoriales proprioceptivas, mientras que laminina actuaba sobre neuritas sensoriales cutáneas. Esta respuesta selectiva de las neuronas hacia proteínas de la matriz extracelular resulta importante para facilitar la organización de los axones regenerados hacia ramas musculares o cutáneas después de la lesión. Sin embargo, esta actividad preferencial mostrada se perdía en edad adulta. En segunda instancia buscamos la mejor alternativa quirúrgica al autoinjerto en la reparación de lesiones severas de nervio periférico. Nos centramos en mejorar la técnica de reparación por tubulización en un modelo crítico de regeneración de 15 mm en el nervio de rata, donde en general, la recuperación funcional, reinervación de órganos diana y el número de fibras mielínicas se ve comprometido con respecto al autoinjerto (todavía considerada como la mejor técnica en la práctica clínica). Los resultados muestran que la dificultad de los axones para regenerar en el interior de las guías neurales artificiales se relaciona con la capacidad limitada de dichos axones de crear un ambiente proregenerativo que les permita cruzar por el interior del lumen tubular. En el primer caso, la reparación con tubos de silicona resultó en un fracaso absoluto. Sin embargo, los tubos basados en quitosano, un material biodegradable y absorbible, mejoró el número de animales regenerados hasta porcentajes cercanos al 50%. A pesar de estos resultados esperanzadores, todavía nos encontrábamos lejos del 100% de éxito obtenido con el autoinjerto. Por ello, en el tercer capítulo, mejoramos el lumen tubular mediante la adición de las matrices enriquecidas con laminina o fibronectina estudiadas en el primer capítulo, tanto como hidrogeles hidratados como estabilizados. En este caso, el porcentaje de animales regenerados aumentó hasta un máximo del 75% en las matrices enriquecidas con fibronectina estabilizada. Con el objetivo final de imitar el ambiente regenerativo que encontramos en un fragmento distal de un nervio lesionado, en el último capítulo mejoramos el lumen tubular mediante la incorporación de células de soporte. Cultivamos células de Schwann y células madre mesenquimales y las integramos en matrices alineadas enriquecidas con fibronectina o laminina. Mediante la implementación de estas últimas matrices junto a la administración del agente inmunosupresor FK506, conseguimos obtener unos resultados similares a la reparación con autoinjerto. / Severe peripheral nerve injuries are characterized by the disconnection of the neural soma and the innervated organ. This disconnection causes the loss of motor, sensory or autonomic control which lead to a disabling situation for the patient. Regeneration can occur in the peripheral nervous system, but the clearance of the degenerated distal nerve and the promotion of regeneration of the proximal stump are needed to facilitate adequate reinnervation and functional recovery. In this thesis we wanted to focus in the role of the extracellular matrix (ECM) for peripheral nerve regeneration. For that in our first chapter we focused on the role of the ECM to promote selective regeneration of motor and sensory axons and if collagen-based scaffolds are suitable vehicles to functionalize artificial nerve conduits in limited peripheral nerve gaps. We used organotypic spinal cord slices and DRG explants of early postnatal and young adults animals, and we contrasted our results in the adult in vivo. Our results show that fibronectin and laminin enriched scaffolds increased the elongation of sensory neurites whereas motor neurites were more elongated in fibronectin compared to collagen-based scaffolds in vitro. Furthermore, in young postnatal stages, we were able to preferentially promote elongation of motor neurites and presumptive proprioceptive neurites on fibronectin-enriched matrices, whereas laminin increased the elongation of presumptive cutaneous sensory neurites. This is important, since neuron type preference towards specific extracellular matrix components may facilitate the organization of regenerating axons in muscular or cutaneous nerve branches. However, this preferential activity was gradually decreased and finally lost in the adult. Second, we searched for a feasible surgical alternative to autograft in the repair of severe peripheral nerve injuries. For that we focused in the improvement of the tubulization repair technique for the repair of severe peripheral nerve defects (15 mm in the rat), where the general outcome achieved by this repair technique (degree of recovery, functional reinnervation and number of regenerated fibers) is still inferior to the autograft, (considered the gold standard technique for the clinical practice) despite assuming the loss of a secondary healthy nerve. The results show that the greatest difficulty of axons to regenerate trough tubular devices is related to the limited capacity of injured axons to create an enabling environment that allows regeneration in the lumen of the tubular devices. In the first case, the repair with silicone conduits resulted in a complete failure during the regeneration process. However, the use of chitosan-based guides, a biodegradable and absorbable material, improved the number of regenerated animals to a percentage close to 50%. Although these promising results for a hollow conduit, the percentage of regenerated animals was still far from the 100% found in the autograft. For that reason, in our third chapter we led to the implementation of intratubular content by introducing fibronectin and laminin enriched collagen scaffolds added, both as fully hydrated hydrogels or stabilized and rolled. In this case, the percentage of animals that regenerated increased to a maximum of 75% in the fibronectin-enriched, stabilized and rolled hydrogels. With the ultimate goal of mimicking what is occurring in a healthy nerve or the distal fragment of a degenerated nerve, in the fourth chapter we decided to fully functionalize the lumen of the tube by incorporating support cells. We harvested and cultured Schwann cells and Mesenchymal Stem cells which were embedded in a tethered-aligned collagen-based construct enriched with either fibronectin or laminin and implanted to the animals. By implementing the latter matrices together with the coadjuvant administration of the immunosuppressant agent FK506, we achieved a degree of recovery comparable to the autograft model.

El desarrollo de la medicina y la tecnología ha favorecido el incremento de la proporción de población longeva a nivel mundial. Este contexto demográfico ha generado la necesidad de comprender mejor los cambios que ocurren a nivel cerebral durante el envejecimiento, así como de encontrar estrategias encaminadas a prevenir, retrasar y atenuar sus consecuencias. Aunque no se conocen bien todos los mecanismos moleculares implicados en el proceso de envejecimiento, se ha señalado como causas fundamentales el estrés oxidativo y la activación de la inflamación. En este sentido, los polifenoles, dadas sus propiedades antioxidantes y antiinflamatorias, pueden ser moléculas claves para contribuir a la prevención del envejecimiento. El objetivo de este trabajo fue determinar los efectos protectores de los tratamientos con polifenoles sobre los cambios que ocurren durante el envejecimiento a nivel cerebral, así como analizar los mecanismos de acción implicados. Para ello se realizaron diversos tratamientos crónicos con los polifenoles resveratrol, silimarina, quercetina y naringenina en ratas viejas. Durante los tratamientos se realizaron diferentes pruebas comportamentales para analizar los efectos a nivel cognitivo y motor, comparando los resultados con los de ratas jóvenes y viejas control. Después de los tratamientos y sacrificio de los animales, se analizaron: mediante HPLC con detección electroquímica, la síntesis y acumulación de neurotransmisores monoaminérgicos implicados en los procesos cognitivos y motores; y mediante western blot, los niveles de inmunoreactividad de diferentes proteínas/vías de señalización (PI3K/Akt/mTOR, MEK/ERK, NF-B y SIRT1) implicadas en envejecimiento y/o inflamación. Se comprobó que el envejecimiento genera deterioro cognitivo y motor, que está ocasionado en parte por un declive en los sistemas monoaminérgicos centrales, así como por cambios en los niveles de proteínas relacionadas con envejecimiento e inflamación. Se comprobó que estos cambios son contrarrestados por los tratamientos crónicos con resveratrol, silimarina, quercetina y naringenina. Estos compuestos actúan como antioxidantes y antiinflamatorios, restaurando los niveles de los principales neurotransmisores monoaminérgicos, así como regulando los niveles de proteínas claves en el proceso de envejecimiento y neuroinflamación como SIRT1 y NF-B, en regiones cerebrales fundamentales para la correcta funcionalidad de los procesos cognitivos y motores. / El desenvolupament de la medicina i la tecnologia ha afavorit l'increment de la proporció de població longeva a nivell mundial. Aquest context demogràfic ha generat la necessitat de comprendre millor els canvis que ocorren a nivell cerebral durant l'envelliment, així com de trobar estratègies encaminades a prevenir, retardar i atenuar les seves conseqüències. Encara que no es coneixen bé tots els mecanismes moleculars implicats en el procés d'envelliment, s'han assenyalat com a causes fonamentals l'estrès oxidatiu i l'activació de la inflamació. En aquest sentit, els polifenols, donades les seves propietats antioxidants i antiinflamatòries, poden ser molècules claus per contribuir a la prevenció de l'envelliment. L'objectiu d'aquest treball va ser determinar els efectes protectors dels tractaments amb polifenols sobre els canvis que ocorren durant l'envelliment a nivell cerebral, així com analitzar els mecanismes d'acció implicats. Per a això es van realitzar diversos tractaments crònics amb els polifenols resveratrol, silimarina, quercetina i naringenina en rates velles. Durant els tractaments es van realitzar diferents proves comportamentals per analitzar els efectes a nivell cognitiu i motor, comparant els resultats amb els de rates joves i velles control. Després dels tractaments i sacrifici dels animals, es van analitzar: mitjançant HPLC amb detecció electroquímica, la síntesi i acumulació de neurotransmissors monoaminèrgics implicats en els processos cognitius i motors; i mitjançant Western blot, els nivells de inmunoreactivitat de diferents proteïnes/vies de senyalització (PI3K/Akt/mTOR, MEK/ERK, NF-B i SIRT1) implicades en envelliment i/o inflamació. Es va comprovar que l'envelliment genera deteriorament cognitiu i motor, que està ocasionat en part per un declivi en els sistemes monoaminèrgics centrals, així com per canvis en els nivells de proteïnes relacionades amb envelliment i inflamació. Es va comprovar que aquests canvis són contrarestats pels tractaments crònics amb resveratrol, silimarina, quercetina i naringenina. Aquests compostos actuen com a antioxidants i antiinflamatòries, restaurant els nivells dels principals neurotransmissors monoaminèrgics, així com regulant els nivells de proteïnes claus en el procés d'envelliment i neuroinflamació com SIRT1 i NF-B, en regions cerebrals fonamentals per a la correcta funcionalitat dels processos cognitius i motors. / The development of medicine and technology has helped to increase the proportion of the aging population worldwide. This demographic context has created the need to better understand the changes that occur in the brain during aging and to find strategies to prevent, delay and mitigate its consequences. Although not all the molecular mechanisms involved in the aging process are well known, oxidative stress and activation of inflammation have been identified as the leading causes. In this regard, the polyphenols due to its antioxidant and anti-inflammatory properties, may be key molecules contributing to the prevention of aging. The aim of this study was to determine the protective effects of the treatments with polyphenols on the changes that occur during aging in the brain, and to analyze the mechanisms of the action involved. Various chronic treatments were carried out with the polyphenols resveratrol, silymarin, quercetin and naringenin in old rats. Different behavioral tests were performed during treatments in order to analyze the effects at a cognitive and motor level, comparing the results with those of young and old control rats. After treatments and the sacrifice of animals it was analyzed: the synthesis and accumulation of monoamine neurotransmitters involved in cognitive and motor processes, by HPLC with electrochemical detection; and the immunoreactivity levels of different protein/signaling pathways (PI3K/Akt/mTOR, MEK/ERK, NF-B and SIRT1) involved in aging and/or inflammation, by Western blot. It was found that aging generates cognitive and motor impairment, which is caused in part by a decline in the central monoaminergic systems, as well as changes in the levels of proteins related to aging and inflammation. It was found that these changes are reversed by chronic treatment with resveratrol, silymarin, quercetin and naringenin. These compounds act as antioxidants and anti-inflammatories, restoring the levels of the major monoaminergic neurotransmitters and regulating the levels of key proteins in the aging process and neuroinflammation such as SIRT1 and NF-B in brain regions critical for accurate functionality of cognitive and motor processes.

En els últims anys ha crescut considerablement l’interès per descobrir aliments naturals funcionals amb propietats beneficioses per a l’hoste. En aquest sentit, el cacau ha passat a ser un dels principals subjectes d’estudi pel seu contingut en flavonoides. Són molts els estudis que associen la ingesta de cacau amb efectes beneficiosos sobre la salut. A més, se li han atribuït propietats immunomoduladores en rata. En base a aquests efectes descrits, l’objectiu d’aquesta Tesi Doctoral va ser establir l’efecte de dietes enriquides amb cacau, flavonoides del cacau i fibra de cacau sobre la microbiota intestinal així com sobre la funció immunitària intestinals. Per tal d’assolir aquests objectius, s’han portat a terme estudis preclínics en rata amb una dieta enriquida amb cacau convencional al 10%, dietes elaborades a partir de dos extractes de cacau no fermentats i una dieta amb fibra de cacau. Pel que fa als resultats de microbiota, es va observar diferent patró de composició després de la intervenció nutricional amb les dietes enriquides amb flavonoides del cacau però únicament la dieta de fibra de cacau va mostrar un efecte prebiòtic al promoure el creixement dels gèneres Bifidobacterium i Lactobacillus. A més, la dieta de fibra de cacau va comportar els canvis més pronunciats en la producció d’AGCC en femtes i contingut cecal. Particularment, va augmentar la concentració a nivell fecal i cecal dels àcids acètic, propiònic i butíric. A més, les dietes de cacau i fibra de cacau van modular de forma diferencial l’expressió gènica de TLR en còlon. Quant a les immunoglobulines en el compartiment mucosal, totes les dietes enriquides amb polifenols del cacau van modular la secreció d’IgA intestinal, tot i que de forma no proporcional al seu contingut en flavonoides. La fibra de cacau, depenent del compartiment intestinal estudiat, va exercir un efecte o un altre. Pel que fa al compartiment extraintestinal, tot i que la dieta de fibra de cacau va mostrar el mateix efecte atenuador de la síntesi d’IgA i d’IgM que la dieta de cacau, el mecanisme d’acció va ser diferent. A més, totes les dietes enriquides amb flavonoides del cacau, van disminuir la seva proporció de bacteris fecals units a IgA independentment del seu contingut en flavonoides, mentre que aquest percentatge va incrementar amb la dieta de fibra de cacau. Únicament la dieta al 10% de cacau provoca un alentiment en la corba ponderal. Aquest efecte es correlaciona amb els canvis produïts en la microbiota i es pot associar amb la modificació de l’expressió en còlon dels gens implicats en el metabolisme lipídic. Pel que fa al perfil metabòlic en orina, les dietes de cacau i fibra de cacau van provocar patrons diferencials, els quals poden ser usats com a marcadors d’ingesta. El perfil metabòlic es correlacionen amb els efectes del cacau sobre el pes corporal, amb les hormones metabòliques, amb la immunitat intestinal i amb la composició de la microbiota. A més, aquestes variables també mostren correlació entre si. Els efectes del cacau són el resultat de la suma del efectes del components bioactius present en el cacau: polifenols i fibra de cacau, els quals exerceixen efectes sinèrgics o bé contraris depenent de la variable estudiada. Altres components del cacau també estan involucrats en aquests efectes. / In the last few years, cocoa has become one of the main subjects of study due to its high content in flavonoids. Several studies have associated the cocoa intake with health benefits. Moreover, immunomodulatory properties in rats have been also attributed to cocoa. On this basis, the aim of the present thesis was to establish the impact of diets enriched with cocoa, cocoa flavonoids or cocoa fiber on the fecal microbiota composition and its activity as well as on the immune function in the gut. To achieve this objective, preclinical studies were carried out in rats fed a 10% conventional cocoa-enriched diet, diets elaborated with different amounts of non- fermented cocoa extracts and cocoa fiber diet. Regarding microbiota results, differential composition pattern was observed after all the experimental diets intake but only the cocoa fiber diet increased the Bifidobacterium spp. and Lactobacillus spp. proportion. In addition, the cocoa fiber diet was the one which caused the most pronounced changes in the short chain fatty acids (SCFA) production. Particularly, it increased the cecal and fecal concentration of acetic, propionic and butyric acids. Moreover, both the 10%-cocoa diet and cocoa fiber diets differentially modulated the TLR gene expression in the colon. Concerning the mucosal immunoglobulin production, all cocoa polyphenol-enriched diets modulated the intestinal IgA secretion although this effect was not proportional to their flavonoid content. The cocoa fiber diet also exerted an effect on intestinal IgA secretion but in a different way depending on the compartment. Focusing on the extraintestinal compartment, although the cocoa fiber diet showed the same down- modulatory effect on IgA and IgM secretion as the cocoa diet, its mechanisms were different. In addition, all cocoa flavonoid-enriched diets decreased IgA-coated bacteria proportion in a non-dose dependent manner whereas this percentage increased by the cocoa fiber intake The 10% cocoa diet was the only one that caused a slower body weight gain. This effect is correlated with the microbiota modulation. The change induced by cocoa diet on the expression of genes involved in the lipid metabolism in the colon could be also involved. Regarding the urinary metabolites, the cocoa and the coca fiber diets caused differential metabolic profile that can be used as consumption marker. The metabolic fingerprint correlated well with the body weight, the metabolic hormones, the intestinal immunity and the microbiota composition. Moreover, all these variables showed also an association between them. Therefore, the effects produced by cocoa intake are due to the differential effects caused by each one of its main bioactive compounds - polyphenols and fiber - which act in a synergistic or opposite manner depending on the variable. Other cocoa compounds are also involved in such effects.