La luz induce una amplia variedad de respuestas relacionadas con la fisiología celular y el comportamiento de muchos organismos. El conocimiento de los mecanismos moleculares implicados en la regulación de esas respuestas es, sin duda, uno de los grandes retos de la biología molecular. Hongos filamentosos, como Neurospora crassa, han contribuido al conocimiento de algunos de los mecanismos moleculares implicados en las respuestas a la luz. La caracterización de los genes white collar-1 y white collar-2 (wc-1 y wc-2), dos genes claves en todas las respuestas a la luz de este hongo, ha sido crucial en el desarrollo de esos conocimientos. Por otra parte, la biosíntesis de carotenos en hongos, como el propio N. crassa o el cigomiceto Phycomyces blakesleeanus, es una de las respuestas a la luz que más atención ha merecido por parte de un número importante de investigadores. El hongo Mucor circinelloides, otro cigomiceto, responde a la luz azul incrementando notablemente la síntesis de carotenos. La carotenogénesis en M. circinelloides está controlada por crgA, un gen que cifra una proteína RING-finger represora de la carotenogenesis. Este gen está evolutivamente conservado desde hongos hasta humanos y, por tanto, no es un gen exclusivo de la carotenogénesis. De hecho, en el propio M. circinelloides regula también procesos de desarrollo, como la formación de hifas aéreas y producción de esporas asexuales. Este gen está presente en prácticamente todos los eucariotas, pero sólo se ha estudiado en los hongos fundamentalmente en M. circinelloides. El gen crgA regula la carotenogénesis a través del control de la expresión del gen mcwc-1b. En concreto, la proteína CrgA está implicada directa o indirectamente en la adición de una o dos ubiquitinas a la proteína Mcwc-1b, lo que supone su inactivación, pero no su degradación. Esta tesis ha caracterizado en detalle las bases moleculares de dicho mecanismo, que ha includo objetivos específicos como la caracterización de la oligoubiquitilación de Mcwc-1b, la identificación y caracterización de genes regulados por crgA de forma dependiente e independiente de mcwc-1b así como genes exclusivamente regulados por mcwc-1b. Mediante mutagénesis dirigida se ha identificado la lisina de Mcwc-1b que es diana de la ubiquitilación mediada por CrgA. Mediante análisis transcriptómico se ha determinado que la expresión de al menos 350 genes, que representan cerca del 3% de los genes identificados en M. circinelloides, depende de crgA, revelando el importante papel de crgA en la regulación de la expresión génica. La regulación ejercida por crgA es principalmente a través de mcwc-1b, sin embargo, ambos son capaces de regular la expresión de algunos genes de forma independiente. Se ha encontrado un enriquecimiento de genes implicados en el metabolismo de aminoácidos y de metabolitos secundarios regulados por crgA. La regulación de un aspecto tan básico como la síntesis de aminoácidos podría significar que este gen también pueda ejercer esta función en eucariotas superiores. Esta tesis también ha caracterizado a nivel transcriptómico la respuesta a la luz en M. circinelloides. M. circinelloides presenta tres genes homólogos al gen wc-1 (mcwc-1a, mcwc-1b y mcwc-1c). En esta tesis se han planteado el objetivo de caracterizar a nivel molecular las respuestas a la luz de M. circinelloides y la implicación de los tres genes wc-1. El análisis transcriptómico realizado en esta tesis ha identificado 146 genes (1,24 % del genoma) regulados por luz, muchos de ellos a través de mcwc-1a, indicando que es elemento principal de control de las respuestas a la luz. La existencia de genes que se inducen en los mutantes en los tres genes mcwc-1 de M. circinelloides, sugiere que existen otros fotorreceptores que podrán ser caracterizados en futuras investigaciones. / Light induces a wide variety of responses related to cell physiology and behavior of many organisms. Knowledge of the molecular mechanisms involved in the regulation of these responses is undoubtedly one of the great challenges of molecular biology. Filamentous fungi, such as Neurospora crassa, have contributed to the knowledge of some of the molecular mechanisms involved in responses to light. The characterization of the white collar-1 and white collar-2 (wc-1 and wc-2), two key genes in all responses in the light of this fungus, has been crucial in the development of such knowledge. Moreover, the carotenoid biosynthesis in fungi such as itself N. crassa or cigomiceto Phycomyces blakesleeanus, is one of the responsess to light that more attention has been received by a large number of researchers. The fungus Mucor circinelloides, another cigomiceto, responds to blue light significantly increasing the synthesis of carotenoids. In M. circinelloides carotenogenesis is controlled by a crgA, gene that codes a RING-finger repressor protein of the carotenogenesis. This gene is evolutionarily conserved from yeast to humans and, therefore, it is not an exclusive gene carotenogenesis. In fact, itself M. circinelloides also regulates development processes such as the formation of aerial hyphae and production of asexual spores. This gene is present in almost all eukaryotes, but has only been studied in fungi mainly in M. circinelloides. The gene crgA regulates carotenogenesis through expression control of mcwc-1b gene. Specifically, CrgA protein is directly or indirectly involved in the addition of one or two ubiquitin to mcwc-1b protein, resulting in its inactivation, but not degradation. This thesis has been characterized in detail the molecular basis of this mechanism, which has included when specific goals as characterization of oligoubiquitilación of mcwc-1b, identification and characterization genes regulated by crgA dependent or independent of mcwc-1b and genes exclusively regulated by mcwc-1b. By mutagenesis has been identified lysine is the target crgA mediated ubiquitylation. By transcriptomic analysis has determined that the expression of at least 350 genes, representing about 3% of the genes identified in M. circinelloides, it depends crgA, revealing the important role of crgA in regulation of gene expression. The regulation is mainly exerted by crgA through mcwc-1b, however, both are capable of regulating the expression of some genes independently. It found an enrichment of genes involved in amino acid metabolism and secondary metabolites regulated by crgA. The regulation of such a basic amino acid synthesis as aspect could mean that this gene can also perform this function in higher eukaryotes. This thesis has characterized response to light of M. circinelloides at the transcriptome level. M. circinelloides presents three genes homologous to gene wc-1 (mcwc-1a, mcwc-b and mcwc-1c). In This thesis has been raised the characterization at the molecular level responses to light in M. circinelloides and the involvement of three genes wc-1. Transcriptome analysis in this thesis has identified 146 genes (1.24% of the genome) regulated by light, many of them through mcwc-1a, indicating that it is the main control element of responses to light. The existence of genes induced by light in mutants mcwc-1aΔ, suggests that other photoreceptors that may be characterized in future research.

En esta tesis doctoral se desarrollan diferentes aproximaciones al estudio de plantas vasculares de interés para la conservación en la Cordillera Cantábrica, con el objetivo de generar información aplicable a las estrategias de conservación en el territorio. En la primera parte se aborda la biodiversidad vegetal y las prioridades de conservación, estudiando (1) la riqueza florística y de hábitats y su grado de exclusividad o amenaza; (2) la caracterización de áreas de endemicidad en el conjunto de las montañas del noroeste peninsular; (3) los patrones de rareza y hábitat en las plantas orocantábricas amenazadas a escala nacional; y (4) metodologías para el establecimiento de prioridades de conservación a una escala biogeográfica. En la segunda parte se evalúan cuatro plantas prioritarias, estudiando (5) la aplicación de modelos de predicción del área de ocupación potencial de Empetrum nigrum subsp. nigrum como ejemplo de planta relícta boreoalpina; (6) alternativas para evaluar la variabilidad poblacional de Senecio boissieri como herramienta para la definición de unidades de conservación intraespecíficas en plantas orófilas; (7) la implicación de la fragmentación del hábitat en la viabilidad poblacional de Aster pyrenaeus, planta ligada a bordes forestales; y (8) la utilización de una planta indicadora, Centaurium somedanum, como medida de aproximación a la variabilidad y conservación de ecosistemas ligados a fuentes carbonatadas.

Introducción: El conocimiento cada vez mayor sobre la relevancia funcional de los pequeños RNAs endógenos (esRNAs) como riboreguladores ha estimulado la identificación y caracterización de estas moléculas en numerosos eucariotas. En el hongo basal Mucor circinelloides, un patógeno oportunista humano, se han descrito esRNAs que regulan la expresión de muchos genes que codifican proteínas. En la biogénesis de estos esRNAs participan una RNasa III denominada Dicer, una proteína Argonauta y dos RNA polimerasas dependientes de RNA (RdRP). Además de participar en esta ruta canónica de silenciamiento mediado por RNA, los genes rdrp de M. circinelloides están implicados en la producción de una nueva clase de esRNA, que son independientes de Dicer. Estos esRNAs muestran un sesgo muy fuerte en la polaridad de las cadenas y una distribución aleatoria de tamaños, lo que sugiere que son productos de degradación de RNAm endógenos. El objetivo global de esta tesis es caracterizar esta posible ruta de degradación de RNAm, identificar la RNasa implicada y utilizar los mecanismos de silenciamiento de Mucor para realizar un análisis funcional a escala genómica. Estos objetivos globales se concretan en los siguientes: Objetivos: i) Análisis de la función de la ruta independiente de Dicer y dependiente de RdRp en la regulación de la expresión génica. ii) Identificación in silico de RNasas de M. circinelloides candidatas a participar en la ruta de degradación independiente de Dicer. iii) Análisis del papel de los genes candidatos en la producción de esRNAs independientes de Dicer y dependientes de RdRP. iv) Construcción de genotecas genómicas para el análisis funcional de genes mediante RNA de interferencia (RNAi), utilizando vectores de silenciamiento para identificar secuencias de M. circinelloides con un posible papel en patogénesis. v) Generación de mutantes nulos de los genes candidatos para confirmar el fenotipo e investigar su papel en la patogénesis de Mucor. Métodos: El análisis de la función génica se llevó a cabo mediante manipulaciones genéticas in vitro e in vivo. Estas incluyen métodos para aislar, amplificar y analizar la expresión de genes específicos y para la transformación genética de células vivas. Se construyeron genotecas de DNA genómico en vectores de silenciamiento con promotores duales para el análisis funcional del genoma y la identificación de genes candidatos con un posible papel en la patogénesis de Mucor. Se utilizaron análisis fenotípicos para evaluar las funciones de los genes candidatos en el crecimiento, la morfogénesis y la virulencia de este hongo. Resultados: Los análisis de expresión demostraron que la nueva ruta independiente de Dicer y dependiente de RdRP regula la expresión génica mediante la degradación específica de RNAm por una RNasa previamente desconocida. Esta ruta regula principalmente genes conservados implicados en metabolismo y procesos de señalización celular, tales como los requeridos para la biosíntesis del grupo hemo, y controla las respuestas a señales ambientales específicas. La búsqueda en el genoma de Mucor identificó varias RNasas candidatas, y el análisis funcional de los mutantes nulos correspondientes permitió identificar una nueva proteína, R3B2, que es específica de hongos basales. Esta RNasa III participa tanto en la ruta no canónica de degradación independiente de Dicer, como en la ruta canónica de silenciamiento dependiente de Dicer, lo que pone de manifiesto su papel crucial en la biogénesis y función de los esRNAs reguladores. Se ha utilizado el mecanismo canónico de silenciamiento para llevar a cabo el análisis funcional a escala genómica en Mucor, para lo cual se construyeron dos genotecas genómicas basadas en RNAi. La introducción de estas genotecas en M. circinelloides permitió identificar varios transformantes con fenotipos anormales. Los análisis moleculares y de silenciamiento demostraron que dos genes específicos fueron los responsables de las alteraciones fenotípicas estudiadas. El análisis fenotípico de los mutantes nulos correspondientes confirmó el papel de dichos genes en la morfogénesis y patogénesis de M. circinelloides. Conclusiones: Se ha identificado y caracterizado una nueva ruta no canónica de silenciamiento, independiente de Dicer y dependiente de RdRP, que regula la expresión génica mediante la degradación de RNAm específicos. La RNasa implicada en esta ruta, denominada R3B2, presenta una arquitectura de dominios única, es específica de hongos basales y también está implicada en el mecanismo canónico de RNAi. Estos resultados asignan un nuevo papel para las proteínas RdRP en un proceso de degradación de RNA que podría representar el primer paso en la evolución del RNAi. Se ha desarrollado con éxito un procedimiento para realizar análisis funcional a gran escala utilizando RNAi, lo que ha permitido identificar dos genes que participan en la morfogénesis de Mucor. El gen mcmyo5 codifica una miosina de clase V que juega un papel esencial en la morfogénesis y la patogénesis de Mucor. El gen mcclasp codifica una proteína CLASP, que también participa en la morfogénesis, pero no juega ningún papel importante en la patogénesis de Mucor. / The increasing knowledge on the functional relevance of endogenous small RNAs (esRNAs) as riboregulators has stimulated the identification and characterization of these molecules in numerous eukaryotes. In the basal fungus Mucor circinelloides, an emerging opportunistic human pathogen, esRNAs that regulate the expression of many protein coding genes have been described. These esRNAs share common machinery for their biogenesis consisting of an RNase III endonuclease Dicer, a single Argonaute protein and two RNA-dependent RNA polymerases. Besides participating in this canonical dicer-dependent RNA interference (RNAi) pathway, the M. circinelloides rdrp genes are involved in the production of a novel dicer-independent esRNA class, which showed a very strong strand bias, being exclusively sense to the mRNAs, and a random spread of size distribution, suggesting that they are degradation products of endogenous mRNAs. The overall objective of this thesis is to characterize this putative mRNA degradation pathway, identify the RNase involved and use the Mucor silencing mechanisms for whole-genome functional analysis. These global objectives are specified in the following: Objectives: i) Functional analysis of the rdrp-dependent dicer-independent pathway in the regulation of gene expression. ii) In silico identification of M. circinelloides candidate RNases to be involved in the dicer-independent degradation pathway. iii) Functional studies of the candidate genes in the production of rdrp-dependent dicer-independent esRNAs. iv) Construction of genomic libraries for functional analysis by knocking-down genes using silencing vectors to identify M. circinelloides sequences with putative roles in pathogenesis. v) Generation of null mutants for each candidate gene to confirm the phenotype and investigate their roles in Mucor pathogenesis. Methods: in vivo and in vitro genetic manipulations were used to analyze gene functions. These include methods to isolate, amplify and analyze the expression of specific genes and genetic transformation of living cells. Genomic DNA libraries were constructed in silencing vectors containing dual promoters for whole-genome functional analysis and identification of candidate genes with a possible role in Mucor pathogenesis. Phenotypic analyses were used to evaluate the functions of candidate genes in growth, morphogenesis and virulence of this fungus. Results: Expression analysis demonstrated that the new rdrp-dependent dicer-independent pathway regulates gene expression by promoting the specific degradation of mRNAs by a previously unknown RNase. This pathway mainly regulates conserved genes involved in metabolism and cellular processes and signaling, such as those required for heme biosynthesis, and controls responses to specific environmental signals. Searching the Mucor genome for candidate RNases to participate in this pathway, and functional analysis of the corresponding knockout mutants identified a new protein, R3B2, which is only found in basal fungi. This RNase III-like protein participates in both the rdrp-dependent dicer-independent non-canonical pathway and the canonical dicer-dependent RNAi pathway, highlighting its crucial role in the biogenesis and function of regulatory esRNAs. RNAi was applied to carry out whole-genome functional analysis in Mucor. Two RNAi-based genomic libraries were constructed. Introduction of these libraries into M. circinelloides identified several transformants with abnormal phenotypes. Silencing and molecular analyses demonstrated that two specific genes were responsible for the phenotypic alterations. Phenotypic analyses of the corresponding disruption mutants revealed the role of those genes in M. circinelloides morphogenesis and pathogenesis. Conclusions: A novel non-canonical RNA silencing mechanism promoting mRNA degradation in M. circinelloides has been identified and characterized. This pathway is rdrp-dependent dicer-independent and regulates gene expression by degrading specific mRNAs. The RNase involved in this pathway, R3B2, presents unique domain architecture and it is also involved in the canonical dicer-dependent RNAi pathway. Our results expand the role of RdRPs in gene silencing and reveal the involvement of these proteins in a new RNA degradation process that could represent the first step in the evolution of RNAi. A new approach for large-scale functional genomics using RNAi has been successful developed in M. circinelloides. Two genes that participate in Mucor morphogenesis have been identified. Gene mcmyo5 encodes a Myosin class V protein that plays an essential role in Mucor morphogenesis and pathogenesis. Gene mcclasp encodes a CLASP protein, which is also involved in morphogenesis, but does not play any significant role in Mucor pathogenesis.

Los briófitos, en comparación con las plantas con semilla, se dispersan a mayores distancias, tienen mayor amplitud ecológica, menos endemismos y distribuciones geográficas más amplias. Dos hipótesis se han discutido tradicionalmente para explicar sus amplias y disyuntas distribuciones. La primera lo interpreta como resultado de la fragmentación de una antigua distribución continua (vicarianza). La segunda lo explica como consecuencia de la dispersión intercontinental. En general, los estudios genéticos sugieren que ha habido dispersión intercontinental durante la diversificación de briófitos, pero no la suficiente como para evitar la diferenciación alopátrica. Los briófitos cosmopolitas exhiben una baja, quizás insignificante, estructura filogeográfica entre continentes, apoyando la hipótesis de dispersión sobre la de vicarianza. Esto hace preguntarse si la dispersión es ubicua y los variantes de una determinada especie cosmopolita se distribuyen homogéneamente. El principio de Baas Becking postula que "todo está en todas partes, pero el ambiente selecciona”. Las características de los briófitos cosmopolitas los hacen candidatos ideales para probar el principio de Baas Becking, aunque estos no han sido testados, hasta ahora. Por otro lado, si se encontraran límites a la dispersión y por tanto se rechazara la hipótesis del principio de Baas Becking, los briófitos cosmopolitas podrían haber logrado su distribución global ayudados por actividades humanas. Esta hipótesis podría verse reforzada por su afinidad a hábitats perturbados, que recuerda el comportamiento de especies invasoras. Esta tesis aborda diferentes hipótesis concernientes a la ecología, distribución, historia y potencial invasivo de plantas con capacidad para dispersarse a larga distancia y más en concreto, de briófitos cosmopolitas, usando Bryum argenteum como especie modelo. En particular, esta tesis trata del principio de Baas Becking tanto a escala mundial como local, en las montañas de Sierra Nevada (España) y la isla de Tenerife. Además, otras hipótesis fueron testadas en base a los resultados preliminares incluyendo la reciente colonización o la persistencia in situ de B. argenteum en el continente Antártico y discernir si colonizó Tenerife de forma artificial o natural. La metodología aplicada incluye el uso de secuencias genéticas de numerosas muestras recolectadas en Sierra Nevada, Tenerife y en todas las masas continentales. Las secuencias fueron analizadas con técnicas de genética de poblaciones y filogeografía incluyendo análisis comparativos, estimadores de diversidad genética, tests de correlación (tests de Mantel), estimadores de estructura genética entre poblaciones, reconstrucciones de áreas ancestrales, datación de reloj molecular y tests de neutralidad. Las conclusiones generales de esta tesis son: • Las evidencias en Sierra Nevada apoyan la primera mitad de la hipótesis de Baas Becking “Todo está en todas partes” a escala local. Por el contrario, la estructura genética en Tenerife sugiere que la deriva génica juega también un papel en el establecimiento de los patrones de variación genética. • El medio ambiente impulsa la diferenciación genética tanto en Sierra Nevada como en Tenerife, apoyando la segunda mitad del principio de Baas Becking “el ambiente selecciona” a escala local. Así que los briófitos cosmopolitas podrían formar ecotipos. • El factor clave que explica la distribución genética mundial de B. argenteum es la dispersión intercontinental recurrente. Sin embargo, la dispersión no es ubicua y por tanto, se rechaza la hipótesis del principio de Baas Becking a escala global. • La Antártida está mucho más aislada en términos de dispersión de briófitos que cualquier otro continente. • B. argenteum colonizó la Antártida al menos en tres ocasiones persistiendo en el continente durante varios ciclos glaciales. En Sierra Nevada, la especie se mantuvo en una zona glaciar durante el pleistoceno tardío. • B. argenteum colonizó la isla de Tenerife en múltiples ocasiones. Las primeras colonizaciones tuvieron lugar mucho antes de los primeros asentamientos humanos. / The bryophytes, in contrast with seed plants, are capable to disperse over longer distances, have broader ecological amplitudes, less endemism and wider geographical distributions. Two hypotheses have been traditionally discussed to explain their broad and disjunctive geographical distributions. The first hypothesis interprets it as a result of fragmentation of ancient continuous distributions (i.e. vicariance). The second explains it as a consequence of intercontinental dispersal. In general, genetic studies suggest that dispersal among continents has occurred repeatedly during bryophyte diversification, although it has not been recurrent enough to prevent allopatric differentiation. Research on cosmopolitan bryophytes indicates that they exhibit a low, potentially negligible, structure among continents favouring the long distance dispersal hypothesis over vicariance. This raises the question of whether dispersal is ubiquitous and the variants of cosmopolitan species are distributed everywhere. The Baas Becking tenet posits that ‘everything is everywhere, but the environment selects’ (EiE). The peculiar characteristics of cosmopolitan bryophytes suggest that they are ideal candidates to test the EiE tenet, yet they remained untested until now. On the other hand, if there were limits to dispersal at a global scale and, thus, the EiE hypothesis would be rejected, cosmopolitan bryophytes might have achieved their global distribution aided by anthropogenic activities. This hypothesis might be reinforced by the affinity of cosmopolitan bryophytes to disturbed habitats, which is reminiscent of invasive species’ behaviour. This thesis addresses a variety of hypothesis regarding the ecology, distribution, history and potential invasiveness of vagile plants and more specifically, of cosmopolitan bryophytes, taking the moss Bryum argenteum as a model species. In particular, this thesis deals with the EiE tenet at global scale and locally on the Sierra Nevada Mountains (Spain) and on the island of Tenerife. Additionally, based on preliminary findings, further hypotheses were tested including the recent colonization or in situ persistence of the species in the Antarctic continent and the assessment of the potential alien status of B. argenteum on Tenerife. The methodology applied includes the use of genetic sequences from numerous accessions sampled from Spanish Sierra Nevada Mountains, the island of Tenerife and from each of the continental masses on Earth. The DNA sequences were analysed with statistical techniques from the fields of population genetics, and phylogeography such as comparative analyses, genetic diversity estimators, correlation tests (Mantel tests), estimators of genetic differentiation, ancestral areas reconstructions, molecular dating and tests of neutrality. The main conclusions of this thesis are: • Evidence in Sierra Nevada Mountains supports the first half of the EiE tenet “Everything is everywhere” at a local scale. On the contrary, the spatial genetic structure found in Tenerife suggests that genetic drift plays also a role in establishing patterns of genetic variation. • Evidence for an environmentally-driven pattern of genetic differentiation in both, Sierra Nevada and Tenerife, indicates that the second half of the EiE tenet, “the environment selects” applies at a local scale in B. argenteum. Therefore, cosmopolitan bryophytes may form ecotypes. • Recurrent intercontinental dispersal is the key factor that explains the worldwide genetic distribution of B. argenteum. However, dispersal is not ubiquitous but limited. Thus, the EiE tenet is rejected at a global scale. • The Antarctic continent is by far the most isolated continent of all in terms of bryophyte dispersal. • B. argenteum colonized the Antarctica on at least three occasions and successfully persisted in the continent during several glacial cycles. Evidence in Sierra Nevada suggests long term persistence in a range that was glaciated during the late Pleistocene. • B. argenteum colonized the island of Tenerife on multiple occasions. Earlier events of colonization on the island took place well before the first human settlements.

Introducción La luz regula gran cantidad de procesos fisiológicos y del desarrollo en muchos organismos. La mayoría de respuestas a la luz caracterizadas en hongos dependen de fotorreceptores de luz azul similares a la proteína Wc-1 de Neurospora crassa. La respuesta a la luz mejor conocida en el hongo Mucor circinelloides es la síntesis de β-caroteno. En este organismo, CrgA, una proteína que muestra características de ligasas de ubiquitina, reprime la carotenogénesis en la oscuridad, afectando también a otros procesos celulares como la esporulación y el crecimiento vegetativo. Objetivos El objetivo principal de la tesis era investigar las vías de transducción de la señal luminosa en hongos, concretamente en las respuestas fototrópica y fotocarotenogénica, utilizando M. circinelloides como modelo. Este objetivo general se estructuró en los siguientes objetivos específicos: 1. Identificación y aislamiento de los genes wc-1 de M. circinelloides. 2. Caracterización de las respuestas fototrópica y fotocarotenogénica. 3. Generación de mutantes nulos para cada gen wc-1 de M. circinelloides y análisis de sus fenotipos. 4. Generación de mutantes dobles para el gen crgA y cada uno de los genes wc-1 y análisis de sus fenotipos. Metodología M. circinelloides presenta el mayor repertorio de herramientas moleculares dentro de los cigomicetos y una respuesta fotocarotenogénica medianamente caracterizada, con mutantes disponibles en genes estructurales y reguladores de la síntesis de carotenos. Los genes mcwc-1 se identificaron y clonaron utilizando una genoteca de M. circinelloides en el fago λ y mediante hibridaciones tipo Southern. Para la caracterización de los genes mcwc-1a, mcwc-1b y mcwc-1c y el estudio de su relación con el gen crgA se generaron mutantes simples y dobles (crgAΔ) nulos para cada uno de los genes mcwc-1. Se analizó el contenido en β-caroteno de sus micelios y el fototropismo de los esporangióforos. También se estudiaron los cambios en los niveles de mRNAs en respuesta a la luz de los genes carotenogénicos y de los genes mcwc-1 utilizando hibridaciones tipo Northern. Además, en el caso de la proteína Mcwc-1b, se analizó su abundancia, sus modificaciones post-traduccionales y su posible interacción con CrgA por medio de hibridaciones tipo Western y co-inmunoprecipitación. Resultados y Conclusiones En primer lugar, utilizando diferentes longitudes de onda del espectro visible, se demostró que los esporangióforos de M. circinelloides poseen fototropismo positivo inducido por luz azul y verde, mientras que la carotenogénesis se induce sólo por luz azul. Además, se identificaron tres genes white-collar-1 en M. circinelloides (mcwc-1a, mcwc-1b y mcwc-1c) que codifican proteínas similares a Wc-1 de Neurospora crassa. Las tres contienen un dominio LOV (luz, oxígeno y voltaje) parecido al presente en receptores de luz azul de plantas y hongos. Los resultados obtenidos en el análisis de los mutantes simples mcwc-1Δ implicaron al gen mcwc-1a en el control del fototropismo y al gen mcwc-1c en la fotocarotenogénesis. Los resultados indican que mcwc-1a y mcwc-1c controlan diferentes rutas de transducción de la luz, aunque es posible que existan interacciones entre ambas rutas, ya que mcwc-1a está implicado en el regulación por luz de la expresión de mcwc-1c. Análisis de los dobles mutantes crgAΔ mcwc-1Δ demostraron que el efecto de crgA en la carotenogénesis depende de mcwc-1b, que actúa como un activador de la carotenogénesis. Por último, se demostró que CrgA está implicado en la mono- y diubiquitilación no degradativa de Mcwc-1b, resultando en su inactivación. La existencia de tres genes mcwc-1 y los fenotipos observados de sus mutantes apoyan la sucesiva duplicación de los genes tipo wc-1 postulada en cigomicetos, seguida de una especialización de sus funciones permitida por la aparición de las nuevas copias. / Introduction Light regulates many developmental and physiological processes in a large number of organisms. Most light responses studied in fungi require blue-light photoreceptors similar to Wc-1 of Neurospora crassa. The best-known light response in the fungus Mucor circinelloides is the biosynthesis of β-carotene. In this organism, CrgA, a protein that shows characteristics of ubiquitin ligases, represses carotenogenesis in the dark and affects also other cellular processes, like sporulation or vegetative growth. Objectives The main goal of this thesis was to study light transduction pathways in fungi, specifically photocarotenogenesis and phototropism responses, using M. circinelloides as a model. The main objective was divided in the following specific objectives: 1. Identification and isolation of wc-1 genes in M. circinelloides. 2. Characterization of photocarotenogenesis and phototropic responses. 3. Generation of knockout mutants of each wc-1 gene in M. circinelloides and analysis of their phenotypes. 4. Generation of double knockout mutants of crgA and each wc-1 gene and analysis of their phenotypes. Methods The most complete molecular toolset in zygomycetes is available in M. circinelloides. The photocarotenogenesis response has been studied in this organism and there are several mutants available in structural and regulatory genes of the biosynthesis of carotenes. A bacteriophage λ genomic library of M. circinelloides and Southern blots were used to identify and clone the three wc-1 genes of M. circinelloides (mcwc-1). To characterize mcwc-1a, mcwc-1b and mcwc-1c and to study their relationships with crgA, simple and double (crgAΔ) knockout mutants for each mcwc-1 gene were generated. Phototropism of sporangiophores and β-carotene content in the mycelium were analysed. Changes in the level of mRNAs in response to light of carotenogenic genes and of mcwc-1 genes were also studied by Northern blots. In addition, the expression levels of Mcwc-1b, its post-translational modifications and it possible interaction with CrgA were analysed using Western blots and co-immunoprecipitation. Conclusions Here, we show that M. circinelloides sporangiophores exhibit a positive phototropism. Analysis of light responses to different light wavelengths within the visible spectrum demonstrated that phototropism is induced by green and blue light, whereas carotenogenesis is only induced by blue light. Three white-collar-1 genes (mcwc-1a, mcwc-1b and mcwc-1c), coding for proteins showing similarity with the Wc-1, were identified in this thesis. All three contain a LOV (light, oxygen or voltage) domain, similar to the one present in fungal and plant blue-light receptors. The study of the knockout mutants for each mcwc-1 gene, showed that mcwc-1c is involved in the light transduction pathway that controls carotenogenesis and that positive phototropism is controlled by mcwc-1a gene. It seems therefore that mcwc-1a and mcwc-1c genes control different light transduction pathways, although cross-talk between both pathways probably exists, because mcwc-1a is involved in the light regulation of mcwc-1c expression. Analysis of double knockout mutants crgAΔ mcwc-1Δ showed that the effect of crgA on carotenogenesis is mediated by mcwc-1b, which acts as a carotenogenesis activator. Finally, it was demonstrated that CrgA is involved in the proteolysis-independent mono- and di-ubiquitylation of Mcwc-1b, which results in its inactivation. The existence and characteristics of the three mcwc-1 genes and the phenotypes of their knockout mutants support the successive duplication of the wc-1 like genes hypothesized in zygomycetes, followed by the functional specialization allowed by the presence of several copies.

Se ha estudiado variabilidad genética en el musgo Funaria hygrometrica y su relación con los procesos de adaptación al cambio climático en la alta montaña Mediterránea de Sierra Nevada (España). Para ello se han secuenciado cuatro regiones del ADN (espaciadores nuclear ITS1 e ITS2, la región cloroplastidial rps3-rpl16 y la mitocondrial rpl5-rpl16). Asimismo se han usado dos técnicas de fingerprinting (microsatélites y AFLP). Se ha aplicado el método de exploración del genoma sobre los datos AFLP para detectar loci sometidos a selección. Se han desarrollado con éxito nuevos cebadores y/o se han modificado otros para mejorar la amplificación PCR en las regiones rps3-rpl16 e ITS. Los resultados obtenidos han mostrado una alta variabilidad genética y han revelado la existencia de dos linajes divergentes en Funaria hygrometrica. Asimismo, los niveles significativos de la prueba de Mantel han sugerido que Funaria hygrometrica posee una variación adaptativa a lo largo de Sierra Nevada. / The genetic variability in the common cord moss Funaria hygrometrica and its relation to climate change adaptation processes in Mediterranean high mountain of Sierra Nevada (Spain) were studied. Four DNA regions were sequenced (ITS1 and ITS2 nuclear spacers, rps3-rpl16 chloroplast DNA region, and rpl5-rpl16 mitochondrial intergenic spacer). Two fingerprinting techniques (microsatellites and AFLP) were used to complement the sequence data. A genome scan method was applied on the AFLP data in order to find loci under selection. New and/or modified primers were developed to improve the PCR amplification for the nuclear ITS spacer and the chloroplast rps3-rpl16 region. The results obtained showed a high genetic variability and revealed the existence of two divergent lineages of Funaria hygrometrica. Based on the statistical Mantel test, the significant levels of correlation suggested that Funaria hygrometrica possesses an adaptive variation along Sierra Nevada Mountains.

Los objetivos de la presente tesis doctoral son describir la composición taxonómica de las larvas de peces que habitan las aguas del Mar Menor, conocer la distribución espacial y la dinámica temporal del ictioplancton en la laguna, analizar los factores ambientales que determinan dicha distribución y dinámica y, finalmente, valorar el papel de la colonización larvaria a través de los canales de comunicación con el mar abierto y las corrientes en la estructura del poblamiento ictiológico. METODOLOGÍA: El trabajo se ha llevado a cabo en el Mar Menor, laguna costera ubicada en el SE de la península ibérica, en el extremo oriental de la Región de Murcia. Se establecieron en la misma 20 localidades de muestreo donde se recogió material en 1997 y desde 2006 a 2012. Adicionalmente, durante 2009 y 2012 se sumaron 8 estaciones para estudiar la influencia del Mediterráneo adyacente, ubicándolas en la bocana interior de los tres canales de comunicación con el mar abierto y en el propio Mediterráneo. El diseño experimental de muestreo permite el análisis de las escalas espacio-temporales de variabilidad del poblamiento y de las condiciones ambientales. El material trabajado en la presente memoria proviene de un total de 3.342 muestras tomadas con arrastres sub-superficiales (0,5–2 m de profundidad), diurnos, circulares y con una duración de 7 minutos, utilizando una red de plancton estándar, de forma cónica, equipada con un flujómetro. Todos los huevos y larvas de peces fueron separados y contados, y éstas últimas fueron identificadas hasta especie. El análisis de las escalas de variabilidad se ha realizado mediante Permanova y para el estudio de la estructura del poblamiento y las variables ambientales que lo explican se han utilizado regresiones múltiples y análisis multivariantes de ordenación. RESULTADOS: Se colectaron un total de 55.262 huevos y se han examinado 185.135 especímenes de larvas y postlarvas de peces, pertenecientes a 24 familias, 48 géneros y 69 especies. De éstas, 15 especies son exclusivas de la laguna. En el Mediterráneo la riqueza de especies llega a 100, existiendo 46 que no penetran en la laguna como larvas. Las familias más abundantes han sido Gobiidae (64,49%), Engraulidae (16,76%), Blenniidae (16,54%) y Atherinidae (1,11%). A su vez, las especies dominantes fueron Gobius niger (34,65%), Engraulis encrasicolus (16,76%), Gobius paganellus (15,26%), Pomatoschistus marmoratus (8,72%), Parablennius pilicornis (7,83%), Salaria pavo (6,55%), Aphia minuta (2,96%), Gobius cruentatus (1,63%), Parablennius gattorugine (1,48%) y Gobius cobitis (1,08%). De las especies estudiadas, 23 (23,7%) son residentes en el Mar Menor o típicamente lagunares, 27 (27,8%) son migradoras o pobladores cíclicos regulares, 12 (12,4%) son pobladores ocasionales o irregulares y 28 (28,9%) son visitantes extraviados o esporádicos. La densidad media anual total de larvas de peces en la laguna fue de 613,27 (± 37,02) individuos por 1000 m3, muy superior a la encontrada en el Mediterráneo adyacente, de 126,05 (± 13,51) individuos por 1000 m3. CONCLUSIONES: El poblamiento ictioplanctónico lagunar muestra gran variabilidad espacio-temporal. Un 41,3% del poblamiento lagunar varía de un año a otro. No obstante, su dinámica presenta un ciclo estacional claro, con dos picos de abundancia, en primavera y en otoño. La mayoría de las especies de interés pesquero de las familias Mugilidae, Sparidae o Clupeidae en el ictioplancton lagunar solo aparecen testimonialmente, con abundancias relativas medias inferiores al 0,03%, indicando que su penetración en la laguna ocurre principalmente en fases juveniles La distribución espacial está relacionada principalmente con los patrones de circulación de la laguna y con la colonización a través de los canales de comunicación con el mar abierto a la que se superponen las condiciones tróficas asociadas a la entrada de nutrientes por la rambla del Albujón. Existe un importante componente aleatorio en la dinámica del poblamiento que probablemente forma parte de los mecanismos homeostáticos del ecosistema lagunar. La elevada riqueza y diversidad de especies acumuladas y la gran proporción de especies ocasionales y extraviadas sugieren un papel muy importante de los mecanismos de lotería competitiva. / The objectives of this thesis are to describe the taxonomic composition of larval fish that inhabit the waters of the Mar Menor, knowing the spatial distribution and temporal dynamics of ichthyoplankton in the lagoon, analyze the environmental factors that determine this distribution and dynamics and finally assess the role of larval colonization through the channels of communication with the open sea and the currents in the structure of ichthyological settlement. METHODOLOGY: The study has been conducted in the Mar Menor coastal lagoon located in the SE of the Iberian Peninsula at the eastern end of the Region of Murcia. Material was collected in 20 sampling sites in 1997 and from 2006 to 2012. Additionally, during 2009 and 2012, 8 stations, located in the inner mouth of the three channels of communication with the open sea and in the Mediterranean, were added to study the influence of the adjacent open sea. The experimental sampling design allows the analysis of the spatio-temporal scales of variability of the assemblage and environmental conditions. A total of 3,342 samples were analyzed. They were collected using diurnal, circular subsurface tows (0.5-2 m deep), with a duration of 7 minutes, using a standard plankton net, equipped with a flowmeter. All eggs and fish larvae were removed and counted, and the latter were identified to species. The analysis of the scales of variability was performed using PERMANOVA. The study of the structure of the assemblage and the environmental variables that explain it has been made by using multiple regression and multivariate ordination analysis. RESULTS: A total of 55,262 eggs were collected and 185 135 specimens of fish larvae and post-larvae, belonging to 24 families, 48 genera and 69 species, were examined. Of these, 15 species are unique to the lagoon. In the Mediterranean species richness reaches 100, 46 of them do not penetrate the lagoon as larvae. The most abundant families were Gobiidae (64.49%), Engraulidae (16.76%), Blenniidae (16.54%) and Atherinidae (1.11%). In turn, the dominant species were Gobius niger (34,65%), Engraulis encrasicolus (16,76%), Gobius paganellus (15,26%), Pomatoschistus marmoratus (8,72%), Parablennius pilicornis (7,83%), Salaria pavo (6,55%), Aphia minuta (2,96%), Gobius cruentatus (1,63%), Parablennius gattorugine (1,48%) and Gobius cobitis (1,08%). 23 (23.7%) of the studied species are resident in the Mar Menor lagoon, 27 (27.8%) are migratory or regular cyclical residents, 12 (12.4%) are occasional or irregular residents and 28 (28.9%) are marine stragglers or casual visitors. The total annual average density of fish larvae in the lagoon was 613.27 (± 37.02) individuals per 1000 m3, much higher than that found in the adjacent Mediterranean that reach 126.05 (± 13.51) individuals/1000 m3. CONCLUSIONS: The lagoon ichthyoplankton shows large spatial and temporal variability. 41.3% of the lagoon assemblage varies from year to year. However, their dynamics presents a clear seasonal cycle, with two abundance peaks in spring and autumn. Most species of commercial interest of the families Mugilidae, Sparidae or Clupeidae are present in the lagoon ichthyoplankton just in testimony with relative abundances lower to 0.03%, indicating that penetration into the lagoon occurs mainly as juveniles. The spatial distribution is mainly related to the circulation patterns of the lagoon and to the colonization through the channels of communication with the open sea. Overlapping to this act the trophic conditions associated with nutrient inputs from the Albujón watercourse. There is a substantial random component in the assemblage dynamics which is probably part of the homeostatic mechanisms of the lagoon ecosystem. The high richness and diversity of species and accumulated large proportion of occasional and straggler species suggest an important role of the mechanisms of competitive lottery.

Tesi realitzada al Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentàries (IRTA), Centre de Cabrils / The availability of most edible ectomycorrhizal mushrooms depends on their natural fructification. Therefore, mycorrhizal plant production could be an alternative for obtaining ectomycorrhizal edible fungi. The first step to establish a plantation for a certain species of mushrooms is the production of plants, inoculated with the fungus, in order to be outplanted to field. The mycorrhization of plants with species of the Boletus edulis complex has been achieved under pure culture synthesis conditions. The production of B. edulis mycorrhizal plants under nursery conditions could be achieved by acclimation of in vitro-produced mycorrhizal plants, but needs still more research to determine an appropriate procedure. Sporocarp formation of these fungi is linked to habitat characteristics and climate conditions, but these data alone do not explain all the trends of fungal fruiting and dynamics. It could be hypothesized that the amount of soil mycelia could also be related to the production of carpophores. Progress of new technologies in molecular biology and the availability of fungal genomes have led to the development, implementation and use of techniques for the traceability of edible ectomycorrhizal fungi. Through the thesis it has been demonstrated that the real- time PCR technique, with the design of specific oligonucleotides for the detection and quantification of extraradical mycelium in soil, allows us to determine the concentration of soil mycelium in forests and plantations, increasing detection limits over conventional PCR. Specific primers and probes have been designed for B. edulis and Tuber melanosporum for real-time PCR amplification, allowing the traceability of these fungal species in the controlled production of edible mycorrhizal mushrooms. The annual belowground dynamics of extraradical soil mycelium, ectomycorrhizal root tips and sporocarp production of two ectomycorrhizal fungi, B. edulis and Lactarius deliciosus, have been studied in two different pine forests (Pinar Grande and Pinares Llanos, respectively) in Soria in permanent plots. Quantification of extraradical mycelium of Rhizopogon roseolus x Pinus pinea plantations (two in Cabils) and of T. melanosporum x Quercus ilex plantation (one in Cerc), in Catalunya has been carried out from its establishment until 24 or 48 months. T. melanosporum extraradical mycelium has also been quantified by real-time PCR in a natural truffle ground and in seven truffle orchards (around 20 years old) established in Tierra Estella and Valdorba sites (Navarra). Finally, the spatial genetic structure of T. melanosporum population was analyzed in a productive orchard (France). The distribution of the two T. melanosporum mating types was monitored in the soil. Ectomycorrhizas and ascocarps were mapped and genotyped using simple sequence repeat markers and the mating type locus and their genetic profiles were compared. No direct relationships were found between soil mycelium amounts and sporocarp production for any of the studied fungal species, but it was possible to obtain positive correlations between vegetative structures (ectomycorrhiza and extraradical mycelium) for B. edulis, R. roseolus and T. melanosporum. The results obtained open the possibility of using quantification of soil mycelium by real-time PCR as a good indicator for root colonization in field conditions (in natural areas or in manmade orchards), especially when a nondestructive sampling or less time consuming analysis were required. The extraradical mycelial amounts of B. edulis, L. deliciosus and R. roseolus and T. melanosporum mycorrhizas were correlated with climate parameters as temperature, rainfall, solar radiation, relative humidity and evapotranspiration. Moreover, it has been possible to map the distribution of different T. melanosporum genotypes trough the traceability of ascocarps, ectomycorrhizas and soil samples. A pronounced spatial genetic structure was found. A nonrandom distribution pattern of the T. melanosporum was observed, resulting in field patches colonized by genets that shared the same mating types. / La disponibilitat de la majoria dels fongs micorízics comestibles depèn de la seva fructificació natural. La formació de bolets està relacionada amb les característiques de l'hàbitat i les condicions climàtiques, però aquestes dades no expliquen ni la dinàmica de la fructificació ni del miceli d’aquests fongs. L’establiment de plantacions a partir de plantes micorizades pot ser una alternativa per a l'obtenció de fongs comestibles ectomicorízics. El progrés de les noves tecnologies en la biologia molecular han permès el desenvolupament, implementació i ús de tècniques per a la traçabilitat dels fongs ectomicorízics comestibles. A la tesi s'ha demostrat que la PCR en temps real, amb el disseny d'oligonucleòtids específics per a la detecció i quantificació de miceli extraradical, ens permet determinar la concentració de miceli present al sòl tant a boscos com a plantacions. La micorizació de plantes amb espècies del complex Boletus edulis s'ha aconseguit en condicions de cultiu pur. S’han dissenyat encebadors i sondes específics per l’amplificació de B. edulis i Tuber melanosporum per PCR en temps real. S’ha estudiat la dinàmica estacional del miceli extraradical, les ectomicorizes i la producció de B. edulis i Lactarius deliciosus, a dos boscos de Sòria. També s’ha quantificat el miceli extraradical de Rhizopogon roseolus (a dues plantacions) i de T. melanosporum (a una plantació), des del seu establiment. Per altra banda s’ha quantificat el miceli extraradical de T. melanosporum en una tofonera natural i en set plantacions (d’uns 20 anys). Finalment, s’ha analitzat l'estructura genètica d’una població de T. melanosporum a una plantació productiva, determinat la distribució dels tipus de compatibilitat al sòl, i els genotips de micorizes i ascocarps fent us de marcadors microsatèl•lits. No s'ha trobat relació directa entre les quantitats de miceli del sòl i la producció per cap de les espècies estudiades, però s’ha correlacionat positivament les estructures vegetatives de B. edulis, R. roseolus i T. melanosporum. Els resultats obren la possibilitat d'utilitzar la quantificació de miceli del sòl per PCR en temps real com un bon indicador de la colonització de les arrels en condicions de camp. Les quantitats de miceli extraradical de B. edulis, L. deliciosus i R. roseolus i les micorizes de T. melanosporum s’han correlacionat amb diferents paràmetres climàtics. Finalment, ha estat possible determinar la distribució dels diferents genotips de T. melanosporum a una plantació, on es va trobar una estructura genètica espacial amb un patró de distribució no aleatori, resultant en zones de camp colonitzat per genets que compartien els mateixos tipus de compatibilitat.

OBJETIVOS El objetivo principal que se plantea en esta tesis es analizar los patrones de variabilidad en las fuentes de nutrientes y la complejidad de la red trófica planctónica a distintas escalas espaciales. Los objetivos parciales fueron: • Determinar la variabilidad geográfica en la composición isotópica del plancton de distintos tamaños a escalas espaciales de cientos a miles de kilómetros. • Determinar la existencia de patrones macroecológicos en la composición isotópica del plancton en función del tamaño y variables ambientales (principalmente temperatura y nutrientes). • Estimar propiedades de la red trófica (ej. relación de tamaños, diversidad trófica, estado metabólico) a partir de la composición isotópica de los aminoácidos del plancton. MÉTODOS: Analizamos la biomasa y la abundancia natural de isótopos estables de nitrógeno en un amplio muestreo de plancton fraccionado por tamaños durante la expedición Malaspina-2010 a través de tres grandes océanos. La expedición utilizó dos buques oceanográficos para la observación y recolección de muestras de agua, seston y plancton a través de tres de los mayores océanos (http://metamalaspina.imedea.uib-csic.es/geonetwork/srv/en/main.home). En nuestro estudio incluimos muestras de plancton de 145 estaciones. Las muestras fueron recolectadas con redes verticales tipo bongo (30 cm de diámetro, 40 µm de malla y 50 cm de diámetro, y 200 µm de malla) entre 200 m de profundidad y la superficie por la mañana temprano. El plancton fue fraccionado por tamaños usando filtros de 200, 500, 1000, 2000 and 5000 sobre filtros de vidrio pre pesados y secados en horno a bordo (60°C, 24 h). Además, alícuotas de las muestras fueron conservadas en formol (4% concentración final) para la determinación posterior de la abundancia de tricomas de la cianobacteria fijadora de N Trichodesmium. El contaje se realizó con un sistema de análisis de imagen (FlowCam). La biomasa fue determinada en laboratorio para cada fracción de tamaño como contenido de carbono (C) usando un analizador elemental (Carlo Erba CHNSO 1108). La abundancia natural de los isótopos estables de nitrógeno (15N) se determinó usando un espectrómetro de masas (Finnigan Mat Delta Plus) acoplado a un analizador elemental. Para el análisis de isótopos estables en aminoácidos se escogieron un total de 15 muestras en el transecto del Atlántico Norte Subtropical. Los valores de δ15N de aminoácidos individuales se midieron utilizando un espectrómetro de masas de relaciones isotópicas acoplado por combustión a un cromatógrafo de gases (gas chromatography /combustion/isotope ratio mass spectrometry GC/C/IRMS), después por hidrólisis con ácido 6 N HCl y formación de derivados del éster, siguiendo métodos ya publicados (ej., McCarthy et al., 2013; Germain et al., 2013). RESULTADOS Y CONCLUSIONES: Los parámetros del espectro de tamaños de la biomasa y δ15N mostraron baja variabilidad en la mayoría de las regiones, a excepción del noroeste del océano Atlántico. El análisis comparativo del espectro de tamaños de δ15N y la biomasa se reveló como una herramienta práctica para estimar las fuentes de nitrógeno inorgánico y su transferencia neta hacia niveles superiores de la red trófica como se muestra a grandes escalas espaciales con el plancton oceánico. Las diferencias entre el espectro de tamaños de δ15N y la biomasa sugieren homogeneidad geográfica en la transferencia neta de nitrógeno a niveles superiores de la red trófica. El uso de datos de isótopos en compuestos específicos como aminoácidos (CSI-AA) mostró una baja variabilidad del impacto de nitrógeno diazotrófico en las diferentes fracciones de tamaño del plancton, mientras que nuestro primer estudio de 15N en la materia orgánica mostró alta variabilidad con el tamaño. Además estos resultados en aminoácidos indicaron una mayor importancia de la diazotrofía, incluso en zonas con menor abundancia de fijadores de nitrógeno o menores medidas previas de fijación de nitrógeno. Las estimaciones de la posición trófica en CSI-AA para diferentes clases de tamaño del plankton varió en un estrecho rango (1.8 to 2.5), con el valor inferior en la zona central, y un incremento general esperado con el tamaño. El estudio de aminoácidos individuales (en particular Phe y Thr), así como los valores de δ15N del total de proteínas, mostró fuertes correlaciones con 15N en el plancton, lo que sugiere un conjunto de nuevas relaciones que pueden ser importantes en el uso de los datos de CSI-AA para rastrear las contribuciones directas del plancton al pool de nitrógeno orgánico en los océanos. Así estos nuevos resultados representan la investigación más detallada de datos de CSI-AA en clases de tamaños de zooplancton hasta la fecha y apuntan a un papel clave del zooplancton grande en la transmisión del nitrógeno diazotrófico hacia las redes tróficas oceánicas. / OBJECTIVES: The principal goal is to analyze the variability pattern in the nutrient sources and the planktonic trophic web at different spatial scales in the ocean. The secondary objectives were: • To determinate the geographic variability in the isotopic composition to different size fractions of plankton at large-scale spatial scales • To characterize macroecological patterns in the isotopic composition of plankton based on the size and environmental variables (mainly temperature and nutrients). • To estimate food wed properties ( eg. Size ratio, trophic diversity, metabolic state) from the amino acids isotopic composition of plankton. METHODS: We analyzed carbon biomass and the natural abundance of stable nitrogen isotopes in a large set of size-fractionated plankton samples from the research expedition Malaspina-2010 across three ocean basins. The expedition employed two oceanographic ships to make observations and collect water, seston and plankton samples across three major ocean basins (http://metamalaspina.imedea.uib-csic.es/geonetwork/srv/en/main.home). In this study plankton samples from 145 stations were considered. Samples were collected by vertical hauls of bongo-type nets (30 cm diameter, 40 µm mesh size and 50 cm diameter, and 200 µm mesh size) between 200 m depth and the surface during early morning hours. Plankton was size-fractionated using sieves of 200, 500, 1000, 2000 and 5000 µm, collected on pre-weighted glass-fiber filters and oven dried (60°C, 24 h) on board. In addition, sample aliquots were preserved in formalin (4% final concentration) for later determination of the abundance of trichomes of the N-fixing cyanobacterium Trichodesmium. Counts were made using a semiautomatic image analysis flow-through system (FlowCam). Biomass was later determined in the laboratory for each size fraction as carbon content (C) using an elemental analyzer (Carlo Erba CHNSO 1108). Natural abundance of stable nitrogen isotopes (15N) was determined using a mass spectrometer (Finnigan Mat Delta Plus) coupled to the elemental analyzer. In total 15 samples in the transect Subtropical North Atlancic were chosen for CSI-AA. The δ15N values of individual AAs were measured via GC-IRMS, after 6 N HCl acid hydrolysis and the formation of TFA ester derivatives following previously published methods (e.g., McCarthy et al., 2013; Germain et al., 2013). RESULTS AND CONCLUSIONS: Except in the northwestern Atlantic, parameters of biomass and δ15N size-spectra showed low variability in most regions. The comparative analysis of δ15N and biomass size-spectra revealed as a practical tool to estimate the sources of inorganic nitrogen and their net transfer up the food web as illustrated at large spatial scales with ocean plankton. Differences between δ15N and biomass size-spectra suggest geographic homogeneity in the net transfer of nitrogen up the food web. Use of compound-specific amino acid isotope data (CSI-AA) revealed relatively low variability in the impact of diazotrophic nitrogen within the different plankton size fractions, while 15N of bulk organic matter showed high variability with size. Moreover these results indicated a greater importance of diazotrophy than suggested by bulk δ15N, even in zones having less abundant nitrogen fixing organisms and lower concurrent measurements of nitrogen fixation previously reported. Explicit CSI-AA trophic position estimates for different plankton size classes varied in a relatively narrow range (1.8 to 2.5), with the lowest values in the central zone, and showed the expected general increase with mean plankton size class. Investigations of individual amino acids (in particular Phe and Thr), as well as reconstructed total protein δ15N values, revealed strong correlations with bulk plankton 15N, suggesting a set of new relationships that may be important in using CSI-AA data to tracing direct plankton contributions to many detrital organic nitrogen pools in the ocean. Overall, these new results represent the most detailed investigation of CSI-AA data in zooplankton size classes to date, and point to a key role of large zooplankton in the transmission of the diazotrophic nitrogen up oceanic food webs.

En esta tesis se han prentendido ampliar los conocimientos sobre los mecanismos que permiten la adaptación de los cultivos celulares de Nicotiana tabacum BY-2 al estrés abiótico, concretamente estrés salino. En dichas condiciones, la adaptación a nivel subcelular implica modificaciones ultrastructurales que permiten a las celulas crecer. Para la identificación de los factores que influyen en la adaptación celular al estrés salino y las modificaciones que se producen en la célula, se han utilizado técnicas de microcopía electrónica y óptica. Por otra parte, se han estudiado nuevos mecanismos de captación y acumulación subcelular de sodio mediante el análisis del tráfico de membranas (endocitosis). Para este estudio se han utilizado técnicas in vivo mediante microscopía de laser confocal. Estos estudios han sido completados con la utilización de técnicas de transcriptómica, proteómica e ionómica, que nos permiten identificar qué factores moleculares son los que pueden estar regulando la adaptación a altas concentraciones salinas. Así mismo, debido a que las giberelinas están implicadas en el proceso de elongación y crecimiento celular, y estudios recientes han relacionado el papel de las mismas con la tolerancia de plantas a salinidad, hemos estudiado la influencia de estas hormonas en la adaptación de las células vegetales a dicho estrés. Con este fin, se ha realizado un estudio sobre la alteración en el metabolismo de las GAs en condiciones salinas y cómo afecta esta alteración a la adaptación de dichas células a estas condiciones de estrés. Por otra parte, hemos fijado nuestra atención en los cambios producidos en la estructura de la pared celular en el proceso de adaptación a salinidad. En este estudio se han analizado principalmente las extensinas y proteínas ricas en arabinogalactanos (AGPs) mediante su identificación y distribución a nivel subcelular, utilizando anticuerpos específicos contra epítopos de estos compuestos. El desarrollo de estos objetivos se ha llevado a cabo mediante técnicas bioquímicas, celulares y de biología molecular que nos han permitido obtener una visión más integrada de los mecanismos implicados en la adaptación de las células al estrés salino mediante la regulación hormonal de los cambios en la estructura y composición de la pared celular. / The aim of this thesis is to enhance our knowledge about the mechanisms of the cell line Nicotiana tabacum BY-2 to the stress conditions, in particular, to high salinity stress. Under these conditions, the adaptation at the subcellular level implies ultrastructural modifications that allow the cells to grow. To identify the factors that may affect this adaptation process to the salinity stress and the possible modifications that may take place in the cell, electronic and light microscopy has been implemented. Additionally, potential new mechanims for subcellular uptake and accumulation of sodium have been investigated by analysing membranes vesicle trafficking (endocytosis). In this work, laser confocal in vivo techniques have been applied. Transcriptomic, proteomic and ionomic tools have been successfully used to complement these studies. Since gibberellins (GAs) are involved in the growth and elongation of plant cells, and recent studies show evidence of the association between GAs and plant tolerance to salinity conditions, the influence of GAs on the plant cells adaptation to salinity stress has also been investigated. This study has also examined, the putative changes in the GAs metabolism under the salinity stress conditions and how these changes may affect the plant cells adaptation. We are also look at the structural changes that may occur in the cell wall during the adaptation process to the salinity conditions, since this may play a major role in the control of the cell size. For this purpose, we have analyzed extensins and arabinogalactan-proteins (AGPs) by identifying their presence and distribution at the subcellular level using specific antibodies raised against epitopes of these molecules. To carry out all these objectives, several biochemical, cellular and molecular tools have been implemented to obtain an integrated view of the possible mechanisms that underlie the structural and compositional changes that occur during the adaptation process of plant cells to salinity stress and, of the regulation and effects of hormones on those changes.