L’etil tert-butil éter (ETBE) és un compost oxigenant de combustibles utilitzat a Europa per tal de reduir la contaminació de l’aire produïda per la combustió dels carburants d’automòbils. L’ús continuat d’ETBE pot contaminar les aigües degut a la seva elevada solubilitat en aigua i també podria ser un potencial agent carcinogènic. L’objectiu d’aquest treball és la identificació i l’estudi de microorganismes biodegradadors potencials d’ETBE i l’anàlisi dels mecanismes moleculars de la biodegradació. Dues mostres d’aigua contaminades amb gasolina s’han enriquit amb ETBE i s’han aïllat dos consorcis anomenats A i B. El consorci A, format per Methylovorus sp. i Xanthomonas sp., degrada l’ETBE i BTX simultàniament i cometabòlicament amb metanol, mentre que el consorci B va ser capaç de créixer amb només ETBE i el va degradar. El consorci B degrada ETBE quasi completament i fins i tot a elevades concentracions del compost, constituint així un consorci amb major capacitat degradadora de l’ETBE. Methylophilus sp., Pseudomonas sp., i Xanthomonas sp. varen ser identificats com els bacteris participants en la degradació de l’ETBE en el consorci B. L’anàlisi proteòmica del consorci B ha revelat que les proteïnes sobreexpressades estan relacionades amb el metabolisme de l’ETBE, síntesi d’aminoàcids, transport, xaperones i metabolisme energètic. Per altra banda, el gen citocrom P450 (CYP), descrit en la primera reacció de la degradació de l’ETBE, ha estat identificat en la soca degradadora de MTBE i ETBE Achromobacter xylosoxidans MCM2/2/1. La seqüència de nucleòtids identificada de CYP ha estat sotmesa a la base de dades del NCBI amb el número d’accés JX454599. Addicionalment, el nou gen CYP identificat ha estat clonat i expressat a E. coli per l’estudi, en un futur, de la seva potencial activitat versus ETBE i altres contaminants comuns. / Ethyl tert-butyl ether (ETBE) is a commonly used fuel oxygenate in Europe, to reduce air pollution in automobile fuels. Continued use of ETBE may render water bodies contaminated as they are fairly soluble in water and also they could be a potential carcinogen. The aim of this study is to identify and study the potential biodegraders of ETBE from microbial source and also to understand the molecular mechanisms behind the degradation. Two bacterial consortia namely A and B were enriched with ETBE from gasoline contaminated water samples. Consortium A consisted of Methylovorus sp., and Xanthomonas sp., was found to degrade ETBE and BTX simultaneously and cometabolically along with methanol, while bacterial consortium B was able to grow alone on ETBE and degrade them. Consortium B degrades ETBE almost completely and even in higher concentrations of ETBE which made them to be better biodegrader of ETBE. Methylophilus sp., Pseudomonas sp., and Xanthomonas sp. were identified as the participating bacteria in ETBE degradation in consortium B. The proteomic analysis done on bacterial consortium B revealed that proteins related to ETBE metabolism, amino acid, transport, chaperons and energy metabolism were found to be up-regulated. On the other hand cytochrome P450 gene which is believed to initiate ETBE degradation, was identified in ETBE and MTBE degrading strain Achromobacter xylosoxidans MCM2/2/1. The identified nucleotide sequence of CYP from A. xylosoxidans MCM2/2/1 was submitted to NCBI under the accession number JX454599. Moreover, the newly identified CYP gene was cloned and heterologoulsy expressed in E.coli in order to study its potential in converting ETBE and other common pollutants in future.

The generaBipolaris, Curvularia, Exserohilium and Pithomyceshave species clinically relevant.However, their identification is not easy. A total of 281 clinical isolates of Bipolaris,Curvularia,ExserohilumandPithomyceshave been studied by morphological and molecular methods. The in vitrosusceptibility studies of these genera were performed against the different antifungal drugs availables. Our studies revealed the presence of many species of Bipolaris, Curvularia and Pithomyces species can be isolated from human specimens; we proposed five new species ofCurvularia such as C. americana, C. chlamydospora, C. hominis, C. muehlenbeckiae and C. pseudolunata.Our phylogenetic analysis revealed that only E. rostratum should be considered as human opportunist. Evaluation of the in vitro antifungal susceptibility profile revealed that most of the antifungal drugs tested presented a good activity against the genera studied. / Bipolaris, Curvularia, Exserohilumand Pithomycesson agentes responsables de infecciones oportunistas.El gran número y lasemejanza morfológicaentre las especies en estos géneros dificultan su identificación. Se han estudiadoun total de 281 cepasde Bipolaris, Curvularia, Exserohilum y Pithomyces por métodos morfológicos y moleculares además dela susceptibilidad in vitro de los mismo frente alos antifúngicos. Los resultados obtenidos demuestran la presencialas siguientes especies:Bipolariscynodontis, B. micropus, B. setariae, Curvulariaaeria, C. borreriae, C. intermedia, C. protuberata, C. pseudorobusta,C. sorghina, Pithomycessacchariy P. maydicus,por primera vez en muestras clínicas, además de las 5 nuevas especies de Curvularia. Nuestro análisis filogenético ha demostrado que del género Exserohilum sólo E. rostratum debe de ser considerada como un patógenooportunista. Laevaluación del patrón de susceptibilidad antifúngicaha evidenciado que la mayoría de antifúngicosensayados presentan una buena actividad frente a las distintas especies estudiadas.

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La emergencia y diseminación de resistencias a antimicrobianos supone un problema para la salud pública y la sanidad animal puesto que pone en serio peligro la eficacia del principal tratamiento contra las infecciones bacterianas. Por este motivo son especialmente interesantes los estudios centrados no sólo en la identificación de los determinantes de resistencia, sino también de los mecanismos que intervienen en su dispersión. En este contexto, la presente Tesis Doctoral profundiza en la incidencia y caracterización molecular de elementos genéticos implicados en la captura, diseminación y mantenimiento de genes de resistencia a antimicrobianos por cepas de serotipos no tifoideos de Salmonella enterica, un patógeno bacteriano que, por su carácter zoonótico, podría estar ocupando un lugar relevante como donador y receptor de genes de resistencia. Los puntos desarrollados en este trabajo fueron fundamentalmente tres:1.- Se demostró el importante papel que juegan los integrones de clases 1 y 2, constatando su presencia en un gran número de cepas multirresistentes (mayoritariamente clínicas), aisladas en el Principado de Asturias y el resto de España. Dos hechos destacables fueron: a) la nueva descripción de los integrones de clase 1 con las regiones variables: 2300 pb/estX-smr-aadA1 y 2100 pb/dfrA1-597pb-aadA24; y b) la primera identificación de integrones de clase 2 en los serotipos S. Virchow, S. Grumpensis, S. Panama y S. Worthington. Se confirmó la asociación de estas unidades genéticas con elementos transponibles, observando diferentes configuraciones integrón de clase 1-transposón tipo Tn21 o integrón de clase 2-transposón tipo Tn7. Además, en la mayoría de los casos estas estructuras se encontraban localizadas en plásmidos conjugativos de gran tamaño, a veces portadores de resistencias adicionales no asociadas a integrones.2.- Dada la creciente emergencia de las resistencias a cefalosporinas de tercera y cuarta generación, se rastrearon β-lactamasas de espectro extendido (BLEEs) y enzimas plasmídicas tipo AmpC en cepas alemanas procedentes de alimentos y animales. Subrayar que la familia de cefotaximasas CTX-M-1 era la más frecuente, y se encontraba asociada a secuencias de inserción tipo ISEcp1. Tanto los genes de BLEEs como de enzimas AmpC, se localizaban en plásmidos de tamaño variable, la mayoría conjugativos.3.- Otro hecho alarmante, dentro del panorama de la multirresistencia, es la aparición de plásmidos híbridos de virulencia-resistencia. En esta Tesis Doctoral se identificó y caracterizó parcialmente un plásmido, denominado pUO-SeVR1, que se encontró en un aislamiento de S. Enteritidis, el serotipo con mayor incidencia en infecciones humanas. Los resultados obtenidos sugieren que deriva de pSEV (el plásmido de virulencia específico de S. Enteritidis) por haber adquirido genes de resistencia asociados a un integrón y a diversos elementos transponibles. A la vez se desvelan algunos de los mecanismos que controlan la transmisión estable del plásmido dentro de la población bacteriana. Esta Tesis Doctoral ilustra el concepto de "ingeniería evolutiva" que, aplicado en este contexto, refleja la importancia que las secuencias "acompañantes" de un gen y sus propiedades combinatorias tienen en la adaptabilidad bacteriana. / The emergence and dissemination of antimicrobial resistance is a worrisome problem for human and veterinary medicines, threatening the effectiveness of the main treatment against the bacterial infections. For this reason, studies focused not only on the identification of the resistance determinants but also on the mechanisms involved in their spread, are especially interesting. In this context, this Doctoral Thesis analyzed the incidence and molecular characterization of mobile genetic elements related to the capture, maintenance and dissemination of antimicrobial resistance genes. For this purpose, multidrug resistant strains belonging to different non-typhoidal serovars of Salmonella enterica were studied. This bacterial pathogen, because of its zoonotic quality, might perform a relevant function as donor and recipient of resistance genes. The main objectives developed in this work were the following:1.- The important role played by class 1 and class 2 integrons was demonstrated by ascertaining their presence in many multidrug resistant strains (mostly from clinical origin), isolated in the Principality of Asturias and the rest of Spain. Two remarkable facts were: a) the new description of class 1 integrons with the variable regions: 2300 bp/estX-smr-aadA1 and 2100 bp/dfrA1-597bpaadA24; and b) the first identification of class 2 integrons in serovars S. Virchow, S. Grumpensis, S. Panama and S. Worthington. The linkage between these genetic units and transposable elements was also established, finding different class 1 integron-Tn21-like transposon or class 2 integron-Tn7-like transposon configurations. Moreover, in most cases these structures were located on large conjugative plasmids, some of them carrying additional non integron-associated resistances.2.- Due to the increasing emergence of the resistance to the third- and fourth-generation cephalosporins, the presence of extended spectrum β-lactamases (ESBLs) and plasmidic AmpC enzymes was analyzed in German isolates of animal and food origin. The CTX-M-1 family was the prevalent, and was associated with insertion sequences ISEcp1-like. The ESBL and AmpC encoding genes were in all cases located on plasmids of variable sizes, mainly self-transferable.3.- Another alarming trend in the multidrug resistance background, is the emergence of virulence-resistance hybrid plasmids. In this Doctoral Thesis, the identification and partial characterization of the plasmid pUO-SeVR1 (found in a S. Enteritidis isolate) was carried out. The results obtained suggest that it derived from pSEV (the virulence plasmid specific of S. Enteritidis), through acquisition of resistance genes associated with a class 1 integron and diverse transposable elements. Some mechanisms involved in the stable inheritance of the plasmid were also identified.This Doctoral Thesis illustrates the concept of "evolutionary engineering" which, used in this context, shows the significance that "adjacent" sequences to a particular gene and their combinatorial properties have in the bacterial adaptability.

Objetivos: (i) caracterizar los mutantes delecionados en las rutas de consumo/producción de acetato y determinar las consecuencias de su deleción a distintos niveles celulares, (ii) estudiar la regulación in vivo del metabolismo de acetato por acetilación de proteínas en E. coli , (iii) describir el contexto genómico de los genes de las enzimas responsables de la acetilación de proteínas en E. coli (cobB y patZ) y estudiar su regulación transcripcional, (iv) discernir el papel de la acetilación de proteínas en las diferencias metabólicas observadas entre las cepas de E. coli K12 y BL21, (v) identificar los patrones de acetilación de proteínas en distintas condiciones y fondos genéticos en E. coli y (vi) caracterizar la funcionalidad de la acetilación de proteínas en el metabolismo del acetato y la regulación transcripcional. Metodología: durante esta Tesis se utilizaron la cepa de Escherichia coli BW25113 y sus mutantes delecionados en algunos genes de interés. Además se utilizaron técnicas para determinar expresión génica (RT-PCR, DNA-microarrays y vectores sonda de promotor), actividades enzimática en extractos crudos y enzimas purificadas, western blot, cuantificación de metabolitos por HPLC y espectrometría de masas de alta resolución para proteómica. Resultados. La deleción de la mayor vía de producción de acetato alteró el metabolismo central a distintos niveles, desde la transcripción a los niveles energéticos celulares, mostrando la conexión de este metabolismo y el central, y también mostrando la importancia de un funcionamiento equilibrado de este metabolismo. La sirtuina CobB y la acetiltransferasa PatZ alteraron la actividad in vivo de la enzima acetil-CoA sintetasa. El gen cobB se expresa constitutivamente mientras que la expresión génica de patZ se activa transcripcionalmente por el factor de transcripción CRP, al igual que el gen de la enzima acetil-CoA sintetasa, teniendo dos sitios de unión en su región aguas arriba de su secuencia. La ausencia de las proteínas CobB y PatZ en la cepa BL21 alteró mas severamente el metabolismo del acetato que en la cepa K12. Esto indicó que probablemente la regulación diferencial de estas enzimas puede ser la clave de porque ambas cepas tienen un metabolismo del acetato distinto. La actividad desacetilasa de CobB es global y contribuye a la desacetilación de numerosos substratos , generando un gran efecto sobre la fisiología. La acetilación de la isocitrato liasa contribuye al ajuste fino del ciclo del glioxilato y la acetilación de la lisina 154 de RcsB previene la unión de este factor de transcripción al ADN. Este último efecto de la acetilación activa la biosíntesis de flagelos y proteínas relacionadas con la motilidad, e incrementa la susceptibilidad a estrés. La deleción de la proteín-acetiltransferasa patZ aumenta la acetilación en cultivos con acetato. Esto sugiere que tal vez el papel de esta proteína sea regular los niveles de agentes acetilantes en la célula. Este hecho esto explicaría la activación transcripcional simultanea de los genes de patZ y su sustrato acs. Conclusiones. Los resultados presentados en esta Tesis ofrecen nuevos aspectos de las funciones del metabolismo del acetato y la acetilación de proteinas en E. coli. El metabolismo de acetato está directamente unido al metabolismo central, regulando los niveles de metabolitos clave como el acetil-CoA y el acetil-fosfato, que son clave para la acetilación enzimática y química de los residuos de lisina de las proteínas. Esta regulación post-traduccional es importante para el control del metabolismo pero también en otras funciones celulares como pueden ser la movilidad y la supervivencia a estrés. La proteín-acetiltransferasa PatZ no es responsable, directamente, de la mayor parte de las acetilaciones en E. coli, pero juega un papel importante en la regulación de la acetilación química en E. coli. Summary Objectives: (i) to characterise knockout mutants of the acetate producing/consuming pathways and to determine the consequences of the deletion at different metabolic levels; (ii) to study the regulation in vivo of the acetate metabolism by protein lysine acetylation in E. coli; (iii) to describe the genomic context of the genes that encode for the enzymes involved in protein lysine acetylation in E. coli (cobB and patZ) and to study their transcriptional regulation; (iv) to decipher the role of lysine acetylation in the different acetate metabolism observed between the BL21 and K12 E.coli strains; (v) to identify protein acetylation patterns in different growing conditions and genomic backgrounds; (iv) and to characterise the function of protein lysine acetylation in acetate metabolism and transcriptional regulation. / Methodology: the strain Escherichia coli BW25113 and its knockout mutants deleted in the pathways of interest were used during this PhD thesis. Several techniques were used in order to achieve the objectives mentioned above, such as RT-PCR, promoter probe plasmids, DNA microarray, enzyme activities in cell crude extracts and purified enzymes, metabolite measurement by HPLC and High resolution MS proteomics. Results and discussion. The deletion of the main acetate-producing pathway altered central metabolism at different levels, from the transcripts to the energetic levels, showing the link between this metabolism and central carbon metabolism, and also the importance of a proper-balance of acetate metabolism. The sirtuin CobB and the acetyltransferase PatZ altered the activity of acetyl-CoA synthetase in vivo. the cobB gene is expressed constitutively while the patZ gene expression is activated transcriptionally by the transcription factor CRP, similarly to what has been described for the acetyl-CoA synthetase gene, having two putative binding sites in its upstream region. The absence of the CobB and PatZ protein in the BL21 strain altered more severely the acetate metabolism than in the K12. This indicates that probably the differential metabolic regulation of these enzymes could be the key for this different acetate production. Further, the deacetylase activity of CobB is global, contributes to the deacetylation of a big number of substrates and has a major impact on bacterial physiology. Acetylation of isocitrate lyase contributes to the fine-tuning regulation of the glyoxylate shunt and the acetylation of lysine 154 of RcsB prevents DNA binding. This last effect activates flagella biosynthesis and motility proteins, and increases susceptibility to acid stress. Besides, deletion of the acetyltransferase patZ increased acetylation especially in acetate cultures. These results suggest that the role of PatZ could be the regulation of the levels of acetylating agents in the cell. In fact this last finding would explain the simultaneous transcriptional activation of the protein acetyltransferase (patZ) and acetyl CoA synthetase (acs). Conclusions. The results presented in this PhD thesis offered new insights into the roles of acetate metabolism and lysine acetylation in E. coli. Acetate metabolism is linked to central metabolism regulating the levels of key metabolites, such as acetyl-CoA and acetyl-phosphate, both having been shown involved in protein lysine acetylation. This post-translational modification mechanism is important in the control of metabolism, but also in other important physiological roles such as motility and stress survival. Also, the protein acetyltransferase, PatZ, is not a major protein-acetyltransferase in E. coli, but rather might play a role in the regulation of chemical acetylation in E. coli.

El objetivo del presente trabajo fue hacer un recuento de Vibrio parahaemolyticus Kanagawa positivo a partir de 50 muestras de pescados, moluscos y crustáceos crudos procedentes de terminales pesqueros, muelles y supermercados de consumo en Lima Metropolitana y Callao entre noviembre de 1999 y abril de 2000. El análisis microbiológico se realizó de acuerdo a la metodología recomendada por el Manual Bacteriológico Analítico (BAM, 7 ed.). Se halló Vibrio parahaemolyticus Kanagawa positivo en 4 muestras aislándose 5 cepas con las características bioquímicas correspondientes de un total de 568 cepas sospechosas. Los valores hallados de Número Más Probable (NMP) fueron en pescados y crustáceos de 3/g cada uno y en moluscos un valor mínimo de 3/g y un máximo de 7,4/g. Las muestras que presentaron Vibrio parahaemolyticus Kanagawa positivo (n=4) representaron un 8% del total de especies marinas (n=50), siendo los porcentajes hallados en pescados 2% (n=1), moluscos 4% (n=2) y crustáceos 2% (n=1). -- Palabras Clave: Vibrio parahaemolyticus, pescados, crustáceos, moluscos, Kanagawa positivo, NMP, Lima Metropolitana y Callao. / -- The aim of this research was performing a count of Vibrio parahaemolyticus Kanagawa positive out of 50 samples including raw fish, mollusks and crustaceans collected from fishermen’s wharf, fisheries, and supermarkets of edible character in Metropolitan Lima and Callao between november 1999 and april 2000. The microbiological analysis was performed according to Bacteriological Analytical Manual (BAM, 7 ed.). Vibrio parahaemolyticus Kanagawa positive was found in 4 samples from 5 strains with biochemical features that met those of Vibrio parahaemolyticus out of a total of 568 analized strains. The Most Probable Number (NMP) values found are as follows: Fish and crustaceans 3/g each, while molluscs had a minimum value of 3/g and a maximum of 7,4/g. Vibrio parahaemolyticus Kanagawa positive samples (n=4) represented 8% out of the total marine samples (n=50), being the percentages found in fish 2% (n=1), mollusks 4% (n=2) and crustaceans 2% (n=1) out of the total number of samples as well. -- Key Words: Vibrio parahaemolyticus, fish, mollusks, crustaceans, Kanagawa positive, MPN, Metropolitan Lima and Callao.

El objetivo del presente trabajo fue hacer un recuento de Vibrio parahaemolyticus Kanagawa positivo a partir de 50 muestras de pescados, moluscos y crustáceos crudos procedentes de terminales pesqueros, muelles y supermercados de consumo en Lima Metropolitana y Callao entre noviembre de 1999 y abril de 2000. El análisis microbiológico se realizó de acuerdo a la metodología recomendada por el Manual Bacteriológico Analítico (BAM, 7 ed.). Se halló Vibrio parahaemolyticus Kanagawa positivo en 4 muestras aislándose 5 cepas con las características bioquímicas correspondientes de un total de 568 cepas sospechosas. Los valores hallados de Número Más Probable (NMP) fueron en pescados y crustáceos de 3/g cada uno y en moluscos un valor mínimo de 3/g y un máximo de 7,4/g. Las muestras que presentaron Vibrio parahaemolyticus Kanagawa positivo (n=4) representaron un 8% del total de especies marinas (n=50), siendo los porcentajes hallados en pescados 2% (n=1), moluscos 4% (n=2) y crustáceos 2% (n=1). Palabras Clave: Vibrio parahaemolyticus, pescados, crustáceos, moluscos, Kanagawa positivo, NMP, Lima Metropolitana y Callao. / The aim of this research was performing a count of Vibrio parahaemolyticus Kanagawa positive out of 50 samples including raw fish, mollusks and crustaceans collected from fishermen’s wharf, fisheries, and supermarkets of edible character in Metropolitan Lima and Callao between november 1999 and april 2000. The microbiological analysis was performed according to Bacteriological Analytical Manual (BAM, 7 ed.). Vibrio parahaemolyticus Kanagawa positive was found in 4 samples from 5 strains with biochemical features that met those of Vibrio parahaemolyticus out of a total of 568 analized strains. The Most Probable Number (NMP) values found are as follows: Fish and crustaceans 3/g each, while molluscs had a minimum value of 3/g and a maximum of 7,4/g. Vibrio parahaemolyticus Kanagawa positive samples (n=4) represented 8% out of the total marine samples (n=50), being the percentages found in fish 2% (n=1), mollusks 4% (n=2) and crustaceans 2% (n=1) out of the total number of samples as well. Key Words: Vibrio parahaemolyticus, fish, mollusks, crustaceans, Kanagawa positive, MPN, Metropolitan Lima and Callao.

Objetivos: Estudiar in vitro el efecto sobre la viabilidad y la proliferación celular de los compuestos: extracto de semilla de uva (flavan-3-oles polímeros de catequinas), extracto de cacao (flavan-3-oles epicatequinas), extracto de pomelo (glicósidos de flavanonas naringina y neohesperidina), extracto de piel de limón (glicósido de flavanona eriocitrina), naringenina (flavanona), apigenina (flavona) y apigenina potásica. Así mismo estudiar la influencia de estas sustancias sobre el ciclo celular y la apoptosis de las líneas celulares Vero y Ca-Co2. Material y Métodos: Los compuestos fueron ensayados sobre la línea celular no tumoral Vero (túbulo renal de mono verde africano) y la línea celular tumoral CaCo-2. Utilizamos el test de MTT con diferentes concentraciones de los extractos. Todo ello junto con el conocimiento de la composición cromatográfica de cada extracto nos permitió hallar posibles relaciones entre la estructura molecular y su efecto en la proliferación celular. Resultados: En las condiciones de nuestro estudio, no hallamos efecto negativo significativo sobre la proliferación celular en ninguno de los extractos testados a concentraciones inferiores a 10 μM en la línea celular Vero. Podría establecerse como orden de actividad antiproliferativa de las estructuras flavonoides estudiadas: flavan-3-ol > flavanona > flavona. Sobre la línea transformada CaCo-2, todos los extractos estudiados mostraron efecto antiproliferativo y/o citotóxico, sobre todo apigenina potásica. Sobre la línea Vero apigenina potásica y extracto de semilla de uva, provocaron un mayor bloqueo del ciclo celular. Y sobre la línea CaCo-2, extracto de piel de limón y de cacao. El análisis del porcentaje de población celular que se encontraba en apoptosis mostró unos valores en general muy bajos en relación a la población total analizada en la línea celular Vero. Sin embargo, sobre CaCo-2, consideramos especialmente relevantes los resultados obtenidos por la flavona apigenina potásica, que mostró una capacidad apoptótica significativa a partir de las 72 horas de tratamiento. Conclusión: Las estructuras moleculares más complejas y de mayor peso molecular causan mayores efectos antiproliferativos, y parecen influir más sobre el ciclo celular y la apoptosis. / Introduction: Molecular structure is a very important factor in relation of any substances with cells or biological system. Objective: Present study is an in vitro research about the viability and proliferation activity of following products and extracts: grape seed extract (flavan-3-ols catechins polymers), cocoa extract (flavan-3-ol epicatechins), grapefruit extract (flavanones glycosides naringin y neohesperidin), skin lemon extract (flavanone glycoside eriocitrin), naringenin (flavanone), apigenin (flavone). Also study the influence of these extracts on cellular cycle and apoptosis on Vero and CaCo2. Material and Methods: We have study the different extracts and products effects concentrations on Vero cells proliferation and CaCo-2 cells culture, using the MTT assay. It together with the knowledge of the chromatographic composition of every extract of the experiment allows us to find relations between structures or molecular skeletons and his effect on the cellular proliferation. Results: In our study conditions, we have not negative effect on cellular proliferation with all the extracts, on concentrations lower than 10 µMa on Vero. The order in antiproliferative capacity could be: flavan-3-ol > flavanone > flavone. On CaCo-2, all the extracts showed antiproliferative effect or citotoxicity especially apigenine. On Vero apigenine and grape fruit seed, showed the best arrest in cell cycle. On CaCo-2, citrus and cocoa were he most significant. Cellular population percentage analyses, in apoptosis were very low regarding the total population in Vero. But, on CaCo-2, we considered relevant results on Apigenine, which showed an important apoptotic capacity after 72 hours. Conclusion: We have found the more complex molecular structures it provokes antiproliferative activity increase. This fact would interact in relationship between cell and environment.

Objetivos: (i) Esbozar una imagen general del metabolismo central de C. salexigens a partir de la información del genoma, (ii) determinar los principales flujos extracelulares (asimilación de carbono, excreción de subproductos) y de síntesis de sus solutos compatibles, las ectoínas, y analizar el efecto de la salinidad sobre dichos flujos empleando fuentes de carbono marcadas isotópicamente, (iii) estudiar el efecto de la composición del medio (en términos de ratio C/N y tipo de fuente de nitrógeno) sobre los flujos metabólicos, síntesis de ectoínas/biomasa y excreción de subproductos y aplicar esta información en el diseño de una estrategia de cultivo que maximice la producción de biomasa/ectoínas, (v) analizar el efecto del uso de fructosa como fuente de carbono sobre la fisiología de C. salexigens y (vi) identificar las rutas de consumo de fructosa y demostrarlas experimentalmente. Metodología: Se aplicó HPLC para identificación y cuantificación de metabolitos y ectoínas, 13C-RMN para cuantificación de ectoínas y rastreo de marcaje isotópico y 31P-RMN para medida de actividad enzimática en extractos crudos. Se usaron métodos espectrofotométricos para medida de actividades enzimáticas (en extractos crudos y en proteínas purificadas). Se aplicó RT-PCR en determinaciones de expresión génica y técnicas de biología molecular en la clonación y expresión heteróloga de genes de C. salexigens en E. coli. Resultados: Se llevan a cabo cultivos crecidos en glucosa a diferentes salinidades que muestran una menor eficacia metabólica a baja salinidad, en forma de metabolismo overflow (excreción de piruvato y acetato), menor síntesis de biomasa y mayor velocidad de consumo de glucosa. Los estudios con glucosa marcada con 13C indican que i) C. salexigens carece de ruta glucolítica funcional, metabolizando la glucosa casi exclusivamente mediante la ruta de ED, debido a la probable falta de una enzima Pfk funcional, ii) el nivel de anaplerosis es alto en comparación con microorganismos relacionados, iii) algunos flujos relativos clave del metabolismo central no se alteran con la salinidad, lo que implica una rigidez metabólica que podría justificar la presencia de overflow a baja salinidad. En cultivos con distintas ratios C/N, se observa un mayor nivel de overflow en ratios C/N altas (fuente de nitrógeno limitante). La eficacia en síntesis de ectoínas es mayor en medio con menor cantidad de fuente de carbono (glucosa) y de nitrógeno (amonio). Estos resultados se aplican al diseño de una estrategia de cultivo fed-batch en dos fases, con la que se consigue alcanzar alta densidad celular y eliminar el overflow. La ratio C/N no afecta a las ratios de flujos centrales confirmando la rigidez metabólica. En cultivos con fructosa como fuente de carbono se observa la ausencia de overflow y mayor síntesis de biomasa. El empleo de fructosa marcada con 13C confirma la presencia de dos rutas para el catabolismo de la fructosa en C. salexigens: la ruta de ED, mayoritaria, y la ruta de EMP que contribuye en un 15-20% del flujo. Conclusiones: La glucólisis no es funcional debido a la carencia de Pfk, y la glucosa se asimila mediante la ruta de ED, más eficaz en producción de NADPH; existe un alto nivel de anaplerosis. Estos datos apuntan a una adaptación al gran esfuerzo anabólico para síntesis de ectoínas. El metabolismo central del carbono es rígido, sus flujos relativos no varían con la salinidad, ni con la proporción C/N en el medio. Esta rigidez hace el metabolismo menos eficiente en medios pobres en fuente de nitrógeno y con baja salinidad. Esto indica una adaptación a ambientes pobres en nutrientes. Las condiciones en las que el metabolismo es menos eficiente dan lugar a un menor crecimiento, y la aparición de metabolismo overflow. C. salexigens metaboliza la fructosa mediante dos rutas: las rutas de ED y EMP. ED es mayoritaria, debido a las altas necesidades de cofactores reducidos. La disponibilidad adicional de la ruta de EMP hace al metalismo en fructosa más eficiente que en glucosa, lo que se traduce en ausencia de overflow en fructosa, y mayor síntesis de biomasa. / Objectives: (i) Drawing a draft of central metabolism from C. salexigens based on the annotated genome, (ii) assessing the main extracellular fluxes (carbon source uptake, by-products excretion) and the synthesis of the main compatible solutes, ectoines, and analyzing the effect of salinity on such fluxes using isotopically labeled carbon sources, (iii) studying the effects of medium composition (as C/N ratio and nitrogen source) on metabolic fluxes, biomass/ectoines synthesis and by-products excretion and applying this information to devise a culture strategy able to maximize biomass/ectoines production, (v) analyzing the effect of fructose as carbon source on the C. salexigens physiology and (vi) identifying the pathways for fructose uptake and give experimental evidence of them. Methodology: HPLC was applied to identify and quantify metabolites and ectoines, 13C-NMR for ectoines quantification and isotopic label tracing and 31P-NMR for assessing enzyme activities on crude extracts. Spectrophotometric methods were applied for measuring enzyme activities (both in crude extracts and purified proteins). RT-PCR was used in gene expression experiments and molecular biology techniques for cloning and heterologous expression of genes from C. salexigens in E. coli. Results: Glucose grown cultures were performed at different salinities, showing a less efficient metabolism at low salinity as overflow metabolism (pyruvate and acetate excretion), lower biomass synthesis and higher glucose uptake rate. Studies using 13C-labeled glucose show that i) C. salexigens lacks a functional glycolytic pathway, and metabolizes glucose almost exclusively through ED pathway, which is likely due to the lack of Pfk enzyme, ii) high anaplerosis levels, compared to related microorganisms, iii) certain key flux ratios from central metabolism were not affected by salinity, involving a metabolic rigidity which could explain the presence of overflow at low salinity. Higher overflow levels are shown by cultures grown on a higher C/N ratio (limiting nitrogen source). Ectoines synthesis yield is higher when growing in media with low carbon (glucose) and nitrogen (ammonium) sources content. These results are applied to devising a two-step fed-batch culture strategy, which allowed reaching high cell density and overflow removal. C/N ratio did not affect central metabolism flux ratios, further confirming the metabolic rigidness. Lack of overflow and higher biomass yields are shown by fructose grown cultures. Using 13C-labeled fructose confirmed the existence of two alternative pathways for fructose uptake in C. salexigens: ED pathway which contributes to 80-85% of fructose uptake flux, and EMP pathway for the remaining part of carbon flux. Conclusions: Glycolysis is not present due to lack of Pfk enzyme, thus, glucose must be assimilated through ED pathway, which is more efficient in NADPH production; anaplerosis is relatively high. These results suggest C. salexigens has adapted to meet the high biosynthesis needs posed by salinity. Central metabolism is rigid, as central flux ratios were not affected by salinity or C/N ratio in growth medium. Such rigidity makes metabolism less efficient in low nitrogen and low salinity growth media. This could be understood as an adaptation to grow in nutrient-poor environments. Environmental conditions where central metabolism is less efficient lead lower growth yield due to overflow metabolism. C. salexigens can metabolize fructose by means of two different routes: ED and EMP pathways. Most of fructose is assimilated by ED pathway, due to high cofactor synthesis needs. The availability of an additional EMP route makes fructose metabolism more efficient than glucose metabolism, resulting in lack of overflow and higher biomass yields in fructose.

Trabajo de Investigación Requisito para optar al Título de Cirujano Dentista / En patologías pulpares irreversibles, la endodoncia es el tratamiento de elección para evitar la extracción de la pieza afectada. Su éxito se basa principalmente en la desinfección del sistema de conductos radiculares. El propósito de este trabajo fue evaluar el efecto de Endox®, sobre la desinfección de conductos radiculares de piezas con necrosis pulpar séptica, sin el uso adicional de otros agentes comúnmente empleados para este fin. El principio por el que actúa Endox® se denomina electrofulguración, que consiste aplicar una corriente eléctrica de alta frecuencia en una fracción de segundo, que generaría daño a la materia orgánica. Objetivo: Establecer in vitro que el sistema Endox® produce una disminución de la microbiota total obtenida de conductos radiculares, en piezas con necrosis pulpar séptica, mediante el recuento de la microbiota total cultivada antes y después de su aplicación. Materiales y Métodos: Se seleccionaron 40 pacientes con diagnostico de necrosis pulpar séptica total en una de sus piezas dentarias. Se realizó la exodoncia correspondiente conformando 2 grupos de 20 dientes. Grupo 1: Endox®, Grupo 2: Hipoclorito de Sodio 5,25%. Se trepanaron las piezas y se tomaron muestras con conos de papel estériles, para cuantificar su contaminación inicial. Grupo Endox®, aplicación siguiendo instrucciones del fabricante. Grupo 2, irrigación con 5 ml de hipoclorito de sodio 5,25% por 2 minutos. Para los 2 grupos se tomaron nuevas muestras bajo las mismas condiciones que en el paso inicial. Todas las muestras fueron depositadas en medio de transporte RTF, frío, y llevados al laboratorio para su procesamiento. Fueron cultivadas por 10 días para realizar recuento de colonias formadas. Se comparó el resultado obtenido, antes y después de utilizar los métodos de desinfección. Resultados: La aplicación de Endox® disminuyó significativamente el recuento de UFC/ml de microbiota total, el que fue evaluado antes y después de la aplicación de este sistema (P=0,004). Existe diferencia significativa entre el recuento de la microbiota total antes y después de aplicar Endox® Conclusiones: Se obtuvo una diferencia significativa entre el recuento de la microbiota total antes y después de aplicar el sistema de desinfección mediante pulsos eléctricos de alta frecuencia Endox®