Klebsiella pneumoniae és un bacil Gram negatiu que causa infeccions del tracte urinari així com pneumònies adquirides en la comunitat i nosocomials. La membrana externa de les bactèries Gram negatives està formada pel lipopolisacàrid (LPS). El LPS és una molècula formada per un polisacàrid, amb càrrega negativa, ancorat a una regió hidrofòbica, el lípid A, que posseeix característiques d’endotoxina i és, per tant, immunoestimuladora. Els sistemes de transducció de senyals de dos components en bactèries detecten canvies en l’ambient i regulen l’expressió de gens que modifiquen l’estructura del lípid A per tal de mantenir l’homeòstasi de la cèl•lula bacteriana, augmentar la resistència en front als pèptids catiònics o modular la resposta immune de l’hoste. En resultats previs del nostre laboratori va posar-se de manifest que la xaperona Hfq regula les modificacions del lípid A a Yersinia enterocolitica O8. En aquesta tesi doctoral posem de manifest que aquest fet no sols es dóna a Y. enterocolitica si no que Hfq també participa en la regulació de les modificacions dels lípid A tant a Salmonella Typhimurium com a K. pneumoniae. En la segona part d’aquesta tesi doctoral hem caracteritzat l’estructura de lípid A que K. pneumoniae expressa in vivo, durant una infecció, sense la necessitat de realitzar un pas previ d’aïllament bacterià en medis de cultiu tradicionals. Durant una infecció pulmonar, K. pneumoniae expressa un lípid A que es caracteritza per la presència d’una cadena de 2-hidroximiristat com acilació secundària. Les nostres observacions indiquen que el lípid A que K. pneumoniae expressa en el pulmó és menys inflamatori que el lípid A que la bactèria expressa quan creix en medis de cultiu tradicionals. A més a més, el lípid A que K. pneumoniae expressa in vivo juga un importantíssim paper conferint a la bactèria resistència en front als pèptids antimicrobians. / Klebsiella pneumoniae es un bacilo Gram negativo que causa infecciones del tracto urinario así como neumonías adquiridas en la comunidad y nosocomiales. La membrana externa de las bacterias Gram negativas se compone del lipopolisacárido (LPS). El LPS es una molécula formada por un polisacárido, cargado negativamente, anclado a un dominio hidrofóbico, el lípido A, que posee propiedades de endotoxina y, por tanto, es inmunoestimulador. Los sistemas de transducción de señales de dos componentes en bacterias detectan cambios en el ambiente y regulan la expresión de genes que remodelan la estructura del lípido A para mantener la homeóstasis de la célula bacteriana, aumentar su resistencia a péptidos catiónicos o modular la respuesta inmune del huésped. En resultados previos de nuestro laboratorio se puso de manifiesto que la chaperona Hfq participa en la regulación de las modificaciones del lípido A en Yersinia enterocolitica. En esta tesis doctoral se ha puesto de manifiesto que este hecho no sólo ocurre en Y. enterocolitica si no que también Hfq participa en la regulación de las modificaciones del lípido A tanto en Salmonella Typhimurium como en K. pneumoniae. En la segunda parte de esta tesis doctoral se ha caracterizado la estructura de lípido A que expresa K. pneumoniae in vivo durante una infección sin la necesidad de aislar la bacteria previamente en medios de cultivo tradicionales. Durante una infección pulmonar, K. pneumoniae expresa una estructura de lípido A caracterizada por la presencia de una cadena de 2-hidroximiristato como acilación secundaria. Nuestras observaciones indican que el lípido A expresado en el pulmón es menos inflamatorio que el expresado cuando la bacteria crece en medios de cultivo tradicionales. Además, el lípido A expresado por K. pneumoniae in vivo juega un importante papel en la resistencia de la bacteria frente a péptidos antimicrobianos. / K. pneumoniae is a Gram negative bacterium which causes urinary tract infections as well as community-acquired and nosocomial pneumonia. Lipopolysaccharide (LPS) is the major component of the outer membrane of Gram negative bacteria. LPS is a negatively charged polysaccharide anchored to a hydrophobic region, the endotoxic lipid A. In bacteria, two component transduction systems detect environmental changes and trigger the expression of genes responsible for lipid A modifications. Lipid A remodelling helps maintaining cellular integrity, confers resistance to many antimicrobial peptides as well as modulates host’s immune response. Previous results from our laboratory showed that Hfq regulates lipid A modifications in Yersinia enterocolitica O8. In this doctoral thesis we demonstrate that Hfq also regulates lipid A modifications in other Enterobacteriaceae such as Salmonella Typhimurium and K. pneumoniae. In a second study, we have characterised for the first time the lipid A structure expressed by K. pneumoniae in vivo during a lung infection without the need of a previous isolation step on traditional culture media. During the course of a lung infection, K. pneumoniae expresses a lipid A characterised by the presence of a 2-hydroxymiristate as a secondary acylation. Our results show that the lipid A expressed by K. pneumoniae in vivo in the lung is less inflammatory than the lipid A expressed when cultured on traditional culture media. Furthermore, this lipid A found in the lung plays a major role conferring resistance to antimicrobial peptides.

Seminario de Título entregado a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al Título de Ingeniería en Biotecnología Molecular / Xanthophyllomyces dendrorhous es una levadura basidiomicete que sintetiza astaxantina, un carotenoide de interés biotecnológico. La síntesis de este pigmento se produce a partir de metabolitos de la ruta del mevalonato, que también son necesarios para la síntesis de esteroles. La regulación de las rutas biosintéticas de carotenoides y esteroles se encuentran relacionadas. A su vez, ambas rutas han manifestado estar reguladas por la vía SREBP, la cual en mamíferos regula los niveles de colesterol en la células. En hongos la vía SREBP se encuentra conservada, como en la levadura Schizosaccharomyces pombe donde el factor de transcripción Sre1N regula la síntesis de esteroles y la respuesta a hipoxia. En el núcleo, los niveles de Sre1N son regulados por la proteína Ofd1 de manera oxígeno-dependiente, ya que esta proteína inhibe la unión de Sre1N al DNA y promueve su degradación proteosómica en presencia de oxígeno. El objetivo de este trabajo fue caracterizar y estudiar el posible gen de Ofd1 de X. dendrorhous mediante la construcción de cepas que carecen de dicho gen y ensayos de complementación en S. pombe. Mediante análisis bioinformático se identificó el posible gen OFD1 de X. dendrorhous, se dedujo la proteína y se realizó un modelo tridimensional por homología. Se comprobó la conservación del motivo HXD/E…H en el sitio activo, característico de las 2-oxoglutarato oxigenasas. Se realizó la deleción del gen OFD1 en tres cepas de X. dendrorhous: CBS-6938 (silvestre), CBS-cyp61- (mutante que no produce ergosterol y sobre produce carotenoides) y CBS-SRE1N (mutante que expresa solo la forma activa del factor de transcripción Sre1). Se evaluó el fenotipo de las mutantes Δofd1 respecto a sus parentales mediante análisis de carotenoides y esteroles totales por espectrofotometría, en tanto la composición de ambos tipos de xii metabolitos se determinó por RP-HPLC. También se realizó un análisis de expresión mediante RT-qPCR del gen HMGR, el cual posiblemente es regulado por Sre1 en X. dendrorhous. Además, se estudió el fenotipo de crecimiento de la levadura en presencia de los azoles clotrimazol y ketoconazol, en la presencia de cloruro de cobalto (compuesto que imita las condiciones de hipoxia) y en anaerobiosis. Los resultados indican que el producto génico de OFD1 no regularía los niveles de Sre1N en el núcleo debido a que no hubo cambio de fenotipo en ningún caso, por lo que OFD1 no participaría en la vía SREBP de X. dendrorhous. Adicionalmente, los ensayos de complementación heteróloga del gen OFD1 de X. dendrorhous en una cepa mutante para este gen en S. pombe, también indican que Ofd1 de X. dendrorhous no regularía los niveles de Sre1N, ya que no se observaron cambios en los niveles de Sre1N de S. pombe mediante Western blot. En conclusión, el gen OFD1 de X. dendrorhous no participa en la regulación del factor transcripcional Sre1N como se había planteado. Posiblemente exista otro mecanismo de regulación aún no descrito. / Xanthophyllomyces dendrorhous is a basidiomycete yeast that synthesizes astaxanthin, a carotenoid of biotechnological interest. The astaxanthin synthesis is produced through mevalonate pathway metabolites, which are also necessary for sterol synthesis. The regulation of the carotenoid and sterol biosynthesis is related. At the same time, both pathways have been shown to be regulated by the SREBP pathway, which in mammal cells controls cholesterol levels. In fungi as well as in the yeast Schizosaccharomyces pombe the SREBP pathway is conserved. Particularly in the yeast, the transcription factor Sre1N regulates the sterol synthesis and the hypoxia response. In the nucleus, the levels of Sre1N are controlled by the Ofd1 protein in an oxygen-dependent way, due to the fact that this protein acts inhibiting the binding of Sre1N to DNA and promoting its proteosomal degradation under oxygen availability. The aim of this work was to characterize and study the possible Ofd1 gene in X. dendrorhous through strain construction lacking this gene and complementation assays in S. pombe. Bioinformatic analysis shown the possible X. dendrorhous OFD1 gene, the protein was deduced and a three-dimensional homology model was performed. The 2-oxoglutarate oxygenases characteristic motif HXD/E ... H was identified at the active site. Deletion of the OFD1 gene was done in three X. dendrorhous strains: CBS-6938 (wild-type), CBS-cyp61- (mutant that does not produce ergosterol and over produces carotenoids) and CBS-SRE1N (mutant expressing only the active form of transcription factor Sre1). Carotenoid and total sterol content was measured spectrophotometrically, while carotenoid and total sterol composition was determined by RP-HPLC. Expression analysis of HMGR gene, which is possibly regulated by Sre1 in X. dendrorhous, was also performed by RT-qPCR. In addition, the phenotype of the yeast growing in the xiv presence of the azole clotrimazole and ketoconazole, was studied in the presence of cobalt chloride (simulating hypoxic conditions) and in anaerobiosis. The results indicate that the OFD1 gene product would not regulate the levels of Sre1N in the nucleus because there was no change in yeast phenotype, so that OFD1 would not participate in the X. dendrorhous SREBP pathway. In addition, heterologous complementation assays of X. dendrorhous OFD1 gene in a mutant strain for this gene in S. pombe also indicate that X. dendrorhous Ofd1 would not regulate Sre1N levels, due to the fact that no changes were observed in the levels of S. pombe Sre1N by Western blot. In conclusion, the OFD1 gene of X. dendrorhous does not participate in the regulation of Sre1N transcription factor as was previously proposed. There may be another regulation mechanism not described yet. / Proyecto FONDECYT 1160202

Trabajo de Investigación Requisito para optar al Título de Cirujano Dentista / El uso de gomas de mascar se encuentra actualmente muy masificado en la población. Sus beneficios para la salud oral son conocidos ya que corresponde a un método efectivo, tanto físico como mecánico, de remoción de restos alimenticios y limpieza del diente. Sin embargo, sólo es secundario al cepillado dental. Masticar chicle, incrementa el flujo salival, incrementa el pH de la saliva y sirve como vehículo para la entrega y liberación de medicamentos. En la literatura no se describen gomas de mascar que presenten en su composición antisépticos y aceites esenciales, por esto en laboratorio de química de la Facultad de Odontología de la Universidad de Chile, se formuló un chicle que cuenta con Alcanfor (aceite esencial), p-Clorofenol y Peróxido de Hidrógeno, como antisépticos. Se realizó un ensayo clínico para medir efectos y seguridad de estos preparados en recuentos microbianos, evaluar y comparar parámetros químicos salivales, como: flujo salival, pH y capacidad amortiguadora de la saliva. Se usaron chicles con xilitol y clorhexidina a modo de agentes comparativos. Los resultados del estudio muestran que el uso de chicles medicados en base a Alcanfor, p-Clorofenol y Peróxido de Hidrógeno NO modifica parámetros químicos salivales como pH, Capacidad Amortiguadora y Velocidad de flujo salival, ni reduce el número de S. mutans, después de su uso durante un período de 7 días. Las gomas de mascar con clorhexidina fueron las únicas que redujeron en forma significativa el recuento cuantitativo de S. mutans en un período de 7 días, pero al mismo tiempo produjeron una disminución significativa de la Velocidad de Flujo Salival, hecho que amerita una mayor investigación. Los Acontecimientos Adversos registrados luego de masticar las tres gomas de mascar fueron tinciones dentarias, dolor o molestias musculares en zona de cabeza y cuello; y molestias y/o ruidos en ATM. Estas últimas se produjeron en mayor porcentaje para los chicles con Clorhexidina y Xilitol respectivamente. No se reportaron acontecimientos adversos como irritación de mucosas o piel, ni algún tipo de lesión para ninguna de las tres gomas de mascar.

Memoria para optar al Título Profesional de Ingeniero Agrónomo / Las levaduras del género Brettanomyces son consideradas como agentes deteriorantes en vinos en distintas partes del mundo. Comúnmente su presencia en los vinos es detectada por características olfativas específicas (olor animal a tempera y medicinal). Basado en los resultados de Humeres (2006), se demostró que estas mismas características sensoriales pueden ser encontradas en vinos contaminados con levaduras del género Candida spp. Los objetivos de esta investigación fueron comprobar la existencia de levaduras Brettanomyces spp. o Candida spp. en muestras de vinos con caracteres organolépticos “Brett” y correlacionar el microorganismo encontrado en la muestra, con un carácter sensorial definido (olor animal a tempera y medicinal), atribuido a Brettanomyces spp. Con este fin, se recolectaron 15 muestras de vinos, de diferentes cepas (Cabernet Sauvignon, Merlot, Petit Verdot, Carménère y Syrah) y de diferentes viñas. Cada muestra de vino fue sensorialmente reconocida con carácter “Brett” por el enólogo de su respectiva bodega. Las muestras de vino fueron sembradas en placas con medio selectivo para Brettanomyces spp., generándose desarrollo de colonias en todas las muestras de vino. De estas colonias se extrajo ADN para realizar una caracterización molecular de las levaduras obtenidas, la que consistió en la amplificación por PCR de la región 5.8S-ITS del rRNA y la subsiguiente digestión de los amplificados utilizando las enzimas de restricción HaeIII y HinfI. La identificación de los perfiles se realizó mediante la comparación con cepas conocidas de Brettanomyces spp. y la clasificación de especies de Esteve-Zarzoso et al. (1999). A través de estos métodos fue posible la identificación de la cepa Brettanomyces bruxellensis en un 100% de las muestras de vino analizadas, sin detectarse la presencia de Candida spp. A través del análisis sensorial se pudo determinar que la intensidad de los descriptores aromáticos de “Brett”, varían de acuerdo con las distintas cepas de vinos. Con esta investigación se puede concluir que levaduras del género Brettanomyces spp. son causantes de la característica sensorial “Brett” y que el parámetro sensorial reconocido comúnmente en todas la variedades de vinos estudiadas fue el olor medicinal. / The yeasts from the Brettanomyces genre are considered as deteriorative agents in different parts of the world. Commonly their presence in wines is detected by specific sensorial characteristics (animal smell, paint smell, medicinal smell). Experiences from previous studies proved that those same sensorial characteristics can be found in wines contaminated with yeasts from the Candida spp. genre. The objectives of this investigation were verifying the existence of Brettanomyces spp. or Candida spp. yeasts in wine samples with organoleptic “Brett” characteristics and to correlate the microorganism found in the sample, with a defined character (animal smell, paint smell, medicinal smell) attributed to Brettanomyces spp. For this purpose, 15 wine samples were collected, from different strains (Cabernet Sauvignon, Merlot, Petit Verdot, Carménère and Syrah) and from different vineyards. Every sample was sensory recognized with “Brett” character by the winemaker of its respective cellar. The wine samples were plated with selective medium for Brettanomyces spp., generating a development of colonies in all the wine samples. From these colonies DNA was extracted to carry out a molecular characterization of the obtained yeast, which consisted in the amplification by PCR of the region 5.8S-ITS of the rRNA and the subsequent digestion of the amplifications using the restriction enzymes HaeIII and HinfI. The identification of the profiles was realized through the comparison with known strains of Brettanomyces spp. and the species classification of Esteve-Zarzoso et al. (1999). Through these methods the identification of the Brettanomyces bruxellensis strain was possible in 100% of the wine samples that were analyzed, without detecting the presence of Candida spp. Through the sensorial analysis it was determined that the intensity of the aromatic descriptor of “Brett”, varies according to the different strains of wine. With this investigation it can be concluded that the yeasts of the Brettanomyces spp. genre are the cause of the sensorial characteristic “Brett” and that the sensorial parameter commonly recognized in all the studied varieties of wine was the medicinal smell.

Tesis entregada a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al grado de Doctor en Ciencias con mención en Microbiología. / El telurito es un compuesto tóxico para Escherichia coli que genera un aumento de las especies reactivas de oxígeno, protoporfirina IX y en general un desbalance en el metabolismo celular. Genes del metabolismo del nitrato son inducidos en presencia de telurito, lo que se ha relacionado con la contribución de la nitrato reductasa A (NR A) en la resistencia al tóxico. Sin embargo, no se ha estudiado la implicancia de esta vía –reducción de nitrato y nitrito- en la resistencia a telurito. A pesar de la contribución de NR A en la resistencia al tóxico, la reducción de nitrato a nitrito puede ser perjudicial dados los efectos deletéreos del nitrito para la célula, llevando a proponer que las enzimas responsables de disminuir sus niveles en el citoplasma también contribuyen a la resistencia a telurito. Se estudió el crecimiento de cepas mutantes en los genes napA, nirB y nrfA en medio MD con nitrato y se encontró que las dos primeras son más afectadas por el tóxico que la cepa control. Esto sugiere que la nitrato reductasa periplasmática y la nitrito reductasa del citoplasma contribuyen a la resistencia a telurito por disminución de los niveles de nitrito en el citoplasma. Concordante con ello, mutantes carentes de genes que especifican las nitrito reductasas (nirB y nrfA) son más sensibles a la adición conjunta de nitrito y telurito que la cepa control. Para el análisis de los resultados se utilizó el área bajo la curva de crecimiento de cada cultivo, ya que esta métrica refleja en un único valor el tamaño inicial de la población, la velocidad de crecimiento y el crecimiento máximo del cultivo. Además, y dada la capacidad del nitrito de generar óxido nítrico, las cepas mutantes en genes de la maquinaria celular de destoxificación del radical -norR, norV y hmp- también son más sensibles a telurito que la cepa control en medio MD con nitrato. Esto sugiere que la generación de óxido nítrico y especies reactivas de nitrógeno podrían subyacer la toxicidad del telurito en cultivos que crecen en presencia de nitrato. / Tellurite is a toxicant for Escherichia coli which generates increased reactive oxygen species, protoporphyrin IX and in general, an unbalance in cellular metabolism. Genes involved in nitrate metabolism are induced in the presence of tellurite, which has been related to the contribution of nitrate reductase A (NR A) to the toxicant resistance. However, the involvement of this pathway -nitrate and nitrite reduction- in tellurite resistance has not been studied. Despite the contribution of NR A to the toxicant resistance, reduction of nitrate to nitrite can be harmful given the dangerous effects of nitrite inside the cell, thus allowing the proposal that the citoplasmic enzymes responsible for decreasing its levels also contribute to tellurite resistance. Growth of mutants napA, nirB and nrfA was studied using MD medium containing nitrate, E. coli ΔnapA and ΔnirB were more affected by the toxicant than the control strain. This suggests that periplasmic nitrate reductase and cytoplasmic nitrite reductase contribute to tellurite resistance by decreasing nitrite levels in the cytoplasm. In support of this, mutants lacking genes encoding nitrite reductases (nirB and nrfA) are more sensitive than controls regarding the addition of nitrite and tellurite. Results were expressed as area under the growth curve, since this metric reflects in a single value the initial population size, growth rate and the maximum growth of the culture. In addition, and in accordance with the nitrite's ability to generate nitric oxide, mutants in the cellular detoxification machinery of the radical -norR, norV and hmp- were also more sensitive to tellurite than the control strain in MD medium containing nitrate; thus suggesting that nitric oxide and reactive nitrogen species generation could help tellurite toxicity in the presence of nitrate.

Determina la calidad microbiológica de “jurel” y “choro” procedentes de treinta mercados de los distritos de San Juan de Lurigancho y de San Martín de Porres. Para ello, de cada puesto de mercado se toman muestras de “jurel” y “choro”, a las cuales se les realiza el recuento de aerobios mesófilos y recuento de Staphylococcus aureus según la metodología de ICMSF (2000); asimismo, se determina la numeración de Escherichia coli, la detección de Salmonella sp., Vibrio cholerae y Vibrio parahaemolyticus aplicando la metodología descrita en el FDA/BAM. Los resultados indican que el 56% del total de las muestras analizadas son consideradas “No aptas” para consumo humano; además, se observa que el 17% de las muestras de “jurel” y 63% de las muestras de “choro” superan los límites máximos permitidos establecidos para E. coli. Se aisla Salmonella sp. en el 7% de las muestras de “jurel” y el 20% de las muestras de “choro”. V. cholerae y V. parahaemolyticus no son detectadas en ninguna de las muestras analizadas. Se concluye que la mayor parte de las muestras de “choros” se consideran “No aptas” para consumo humano, constituyendo un riesgo para la salud de los consumidores. / Tesis

Introducción Las primeras cepas de Staphylococcus aureus resistentes a la meticilina (SARM) se detectaron en el Reino Unido en 1960. Posteriormente, se diseminaron por todo el mundo. Al principio, el SARM era un patógeno nosocomial; pero, progresivamente, se fue extendiendo a pacientes no ingresados, la mayoría de ellos relacionados con el sistema sanitario, como es el caso de los residentes geriátricos. A partir del año 2000, se detectaron cepas de SARM comunitario, con características clínicas y microbiológicas peculiares, como la presencia de genes codificantes de la leucocidina de Panton-Valentine (LPV). Uno de los antimicrobianos alternativos para tratar el SARM es la linezolida, pero se han detectado cepas de estafilococos resistentes a este antimicrobiano. Objetivos Estudiar la relación clonal de los aislados de SARM detectados en el Hospital Universitari Son Dureta-Son Espases, hospital de referencia de las Islas Baleares, durante cuatro períodos: 1999-2000, 2002-2004, 2008 y 2012-2013. Comparar la relación clonal de los aislados de SARM del hospital de referencia con los de otros hospitales de Mallorca. Determinar la frecuencia de LPV. Estudiar la prevalencia de la colonización por SARM en exudados nasales y de úlcera de los residentes en el mayor centro geriátrico de Mallorca. Determinar los factores de riesgo de colonización y evaluar su evolución temporal. Estudiar la epidemiología molecular y el mecanismo de resistencia a la linezolida en cepas de SARM, Staphylococcus epidermidis y Staphylococcus hominis, resistentes a este antimicrobiano detectadas en dos hospitales de Mallorca. Metodología Se documentaron todos los pacientes con SARM en muestras clínicas en los cuatro períodos de estudio. La relación clonal se determinó mediante electroforesis en campo pulsado y multilocus sequence typing. Se realizaron diversos ensayos de PCR para la detección de los genes de LPV, tipificación del casete cromosómico estafilocócico mec (SCCmec) y subtipificación del SCCmec tipo IV. En el estudio de prevalencia de SARM en geriátricos, se recogieron muestras de exudado nasal y de úlcera durante los meses de octubre y noviembre de 2005. Para determinar los factores de riesgo de colonización, se cumplimentó un formulario estandarizado con datos clínicos de cada participante. Se realizó seguimiento clínico y de la colonización a los 8, 12 y 18 meses, tanto en los pacientes colonizados por SARM (casos), como en un grupo de residentes no colonizados (controles). En los aislados de SARM, S. epidermidis y S. hominis resistentes a la linezolida, se realizaron diversos ensayos de PCR y de transferencia del plásmido. Se procedió a la caracterización del plásmido de multirresistencia (pERGB) tras la clonación de los distintos fragmentos en pUCP24. Resultados y conclusiones La situación epidemiológica de SARM en nuestro hospital se caracterizó por la presencia endémica de 3 clones mayoritarios en 1999-2004 (ST125-IVc, ST228-I y ST22-IVh). Los clones ST125-IVc y ST228-I predominaban también en muchos hospitales españoles, mientras que el ST22-IVh (EMRSA-15), prevalente en el Reino Unido, era prácticamente inexistente en el territorio peninsular español. Estos tres clones predominaban en otros hospitales de Mallorca. En 2008, un 7% de las cepas de SARM hospitalarias fueron productoras de LPV. La prevalencia de SARM en exudados nasales de los residentes geriátricos fue del 8%, relativamente baja y generalmente transitoria. Los factores de riesgo asociados con la colonización fueron el ingreso hospitalario previo, la enfermedad vascular, la diabetes, la presencia de úlceras de decúbito y el tratamiento antibiótico previo. La gran mayoría de residentes colonizados no desarrollaron una infección subsiguiente por SARM. Se detectó la presencia de dos clones distintos, también encontrados en el hospital de referencia. Por primera vez, se describe un plásmido de multirresistencia conjugativo portador de los genes cfr, ant(4’)-Ia, tet(L) y dfrK en S. aureus y S. epidermidis que determina la resistencia a la linezolida y a otros antibióticos. Todas las cepas de S. hominis resistentes a la linezolida pertenecían al mismo clon y presentaban la mutación G2576T en el gen ARNr 23S. / Introducció Les primeres soques de Staphylococcus aureus resistents a la meticil·lina (SARM) es detectaren al Regne Unit l’any 1960. Posteriorment, es disseminaren per tot el món. Al començament, el SARM era un patogen nosocomial; però, progressivament, es va estendre a malalts no ingressats, la majoria d’ells relacionats amb el sistema sanitari, com ara els residents geriàtrics. A partir de l’any 2000, es detectaren soques de SARM comunitari, amb característiques clíniques i microbiològiques peculiars, com la presència de gens codificants de la leucocidina de Panton-Valentine (LPV). Un dels antimicrobians alternatius per tractar el SARM és la linezolida, encara que també s’han detectat soques d’estafilococs resistents a aquest antimicrobià. Objectius Estudiar la relació clonal dels aïllats de SARM detectats a l’Hospital Universitari Son Dureta-Son Espases, hospital de referència de les Illes Balears, durant quatre períodes: 1999-2000, 2002-2004, 2008 i 2012-2013. Comparar la relació clonal dels aïllats de SARM de l’hospital de referència amb els d’altres hospitals de Mallorca. Determinar la freqüència de LPV. Estudiar la prevalença de la colonització per SARM en exsudats nasals i d’úlcera dels residents al centre geriàtric més gran de Mallorca. Determinar els factors de risc d’aquesta colonització i avaluar-ne l’evolució temporal. Estudiar l’epidemiologia molecular i el mecanisme de resistència a la linezolida en soques de SARM, Staphylococcus epidermidis i Staphylococcus hominis, resistents a aquest antimicrobià detectades a dos hospitals de Mallorca. Metodologia Es documentaren tots els malalts amb SARM detectat en mostres clíniques durant els quatre períodes d’estudi. La relació clonal es determinà mitjançant electroforesi en camp polsant i multilocus sequence typing. Es dugueren a terme diferents assajos de PCR per a la detecció dels gens de LPV, tipificació del casset cromosòmic estafilocòccic mec (SCCmec) i subtipificació de l’SCCmec tipus IV. A l’estudi de prevalença de SARM en geriàtrics, es recolliren exsudats nasals i d’úlcera durant els mesos d’octubre i novembre de 2005. Per determinar els factors de risc de colonització, s’emplenà un formulari estandarditzat amb les dades clíniques de cada participant. Es va fer el seguiment clínic i de la colonització als 8, 12 i 18 mesos, tant en els malalts colonitzats per SARM (casos), com en un grup de residents no colonitzats (controls). En els aïllats de SARM, S. epidermidis i S. hominis resistents a la linezolida, s’efectuaren diversos assajos de PCR i de transferència del plasmidi. Es procedí a la caracterització del plasmidi de multiresistència (pERGB) després de la clonació dels diferents fragments en pUCP24. Resultats i conclusions La situació epidemiològica de SARM al nostre hospital es caracteritza per la presència endèmica de 3 clons majoritaris en 1999-2004 (ST125-IVc, ST228-I i ST22-IVh). Els clons ST125-IVc i ST228-I predominaven també en molts hospitals espanyols mentre que el ST22-IVh (EMRSA-15), prevalent al Regne Unit, era pràcticament inexistent en el territori peninsular espanyol. Aquests tres clons van ser els més freqüents en els altres hospitals de Mallorca. L’any 2008, un 7% de les soques de SARM de l’hospital foren productores de LPV. La prevalença de SARM en exsudats nasals dels residents geriàtrics fou del 8%, relativament baixa i generalment transitòria. Els factors de risc associats amb la colonització foren l’ingrés hospitalari previ, la malaltia vascular, la diabetis, la presència d’úlceres de decúbit i el tractament antibiòtic previ. La gran majoria dels residents colonitzats no desenvoluparen una infecció subsegüent per SARM. Es detectà la presència dos clons diferents, trobats també a l’hospital de referència. Per primera vegada, es descriu un plasmidi de multiresistència conjugatiu portador dels gens cfr, ant(4’)-Ia, tet(L) i dfrK en S. aureus i S. epidermidis que determina la resistència a la linezolida i a altres antimicrobians. Totes les soques de S. hominis resistents a la linezolida pertanyien al mateix clon i presentaven la mutació G2576T al gen ARNr 23S. / Introduction Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) strains were first detected in the United Kingdom in the sixties of the past century, and then spread all over the world. At the beginning, MRSA behaved as nosocomial pathogen but progressively was detected outside the hospital, mostly in health-care associated patients. Since year 2000, community-acquired MRSA strains showing a particular clinical and microbiological profile emerged; most of these strains typically contain two genes encoding the Panton-Valentine leucocidin (PVL). Linezolid is a useful alternative for treating patients with staphylococcal infections but resistance to this antimicrobial has arisen. Objectives To study the clonal relatedness of MRSA isolates detected at the Hospital Universitari Son Dureta-Son Espases, along four periods: 1999-2000, 2002-2004, 2008, and 2012-2013; to compare the clonal relatedness of these MRSA isolates with those from other Majorcan hospitals; to determine the frequency of PVL gene detection in the MRSA strains. To study the prevalence of MRSA colonization (nasal and ulcer swabs) in the residents admitted at the major geriatric center of Majorca. To determine the risk factors for colonization, and to evaluate its evolution in over time. To study the molecular epidemiology and the mechanisms of resistance in linezolid-resistant MRSA, Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus hominis strains detected at two Majorcan hospitals. Methodology Clonal relatedness was determined by pulsed-field gel electrophoresis and multilocus sequence typing. Several PCR assays were carried out for detection of PVL genes, typing of staphylococcal chromosomal cassette mec (SCCmec), and subtyping of SCCmec type IV isolates. Regarding the prevalence of MRSA carriage in geriatric patients, nasal and ulcer swabs were collected from the study participants in October-November 2005. In order to determine the risk factors for MRSA colonization, a standardized questionnaire with clinical data from each resident was completed. Two cohorts of residents (MRSA carriers and non-carriers) were followed up to 18 months, with nasal cultures performed every six months. PCR detection of several genes and plasmid transfer assays were done in MRSA, S. epidermidis and S. hominis linezolid-resistant isolates to decipher the determinants of this resistance. The multidrug resistance plasmid (pERGB) was characterized after cloning different gene fragments in pUCP24. Results and conclusions The epidemiologic profile of MRSA strains from our hospital was characterized for the endemic presence of 3 major clones during 1999-2004 (ST125-IVc, ST228-I and ST22-IVh). The ST125-IVc and ST228-I clones were also predominant in many Spanish hospitals at that time, whereas the ST22-IVh (EMRSA-15), the most prevalent in British hospitals, was almost nonexistent in centers of the Iberian Peninsula in that period. These three clones were also predominant in the others Majorcan hospitals. In 2008, 7% of MRSA isolates were PVL-producers. MRSA carriage in participants living in the geriatric facility was 8%, lower in comparison with other studies, and generally intermittent. Previous hospital admission, vascular disease, diabetes mellitus, presence of decubitus ulcers and previous antibiotic treatment were the risk factors for MRSA colonization. Most of the residents carrying MRSA did not develop subsequent MRSA infections. MRSA isolates belonged to two different clones, both found also in the reference hospital. A multidrug resistance conjugative plasmid was described for the first time carriyng cfr, ant(4’)-Ia, tet(L) and dfrK genes driving resistance to linezolid and other antimicrobials in S. aureus and S. epidermidis strains. All the linezolid-resistant S. hominis strains belonged to the same clone and presented the G2576T mutation at the 23S rRNA gene.

Doctor en Ciencias con mención en Microbiología Facultad de Ciencias

Bacterias patógenas como Salmonella, habitantes naturales del tracto intestinal de diversos animales incluido el hombre, están comúnmente presentes en efluentes de desagües principalmente domésticos que desembocan al mar en forma directa o indirecta a través de ríos y acequias, llegando a constituir parte de la flora contaminante del litoral limeño y de los alimentos provenientes del mismo. La presencia de Salmonella está determinada por las condiciones biológicas y fisicoquímicas del ambiente acuático, que permiten su supervivencia, desarrollando mecanismos de adaptación como entrar a un estado de “viable no cultivable”, cambios metabólicos o alteraciones genómicas en respuesta a condiciones ambientales adversas. Debido a la importancia que tiene Salmonella en la incidencia de enfermedades gastrointestinales, se hace necesaria su vigilancia en el medio ambiente acuático para lo cual es preciso desarrollar estudios que faciliten el aislamiento, identificación y diferenciación de estirpes patogénicas en ambientes naturales. Muestras de agua de mar tomadas a lo largo del litoral limeño, durante los meses de marzo, abril y mayo del 2000, fueron procesadas para el aislamiento de Salmonella usando el método de filtración en membrana, pre-enriquecimiento en Agua Bufferada Peptonada; enriquecimiento selectivo en caldo Tetrationato, Selenito Cistina y Rappaport-Vassiliadis y posterior aislamiento selectivo en Agar XLD, Sufito de Bismuto, BPLS, SS, Hektoen y XLD. La identificación bioquímica se realizó mediante las pruebas de Oxidasa, Catalasa, Indol, Urea, TSI, LIA, Citrato y RM-VP. Para la identificación serológica se utilizaron sueros polivalentes agrupadores (A, B, C1, C2, D, E1 y E4), suero capsular Vi y flagelares de Salmonella choleraesuis. Se seleccionaron 203 estirpes oxidasa negativos, catalasa positivos, de las que 18 fueron identificadas como Salmonella choleraesuis, de las cuales 10 cepas fueron del serogrupo C1 y serotipo Salmonella Djugu y 8 del serogrupo D y serotipo Salmonella Enteritidis, una con bioquímica típica y 2 cepas atípicas incluidas en el serogrupo B de Salmonella choleraesuis, 3 cepas rugosas y 24 cepas con bioquímica típica que no aglutinaron con el suero polivalente empleado. Los perfiles de proteínas totales obtenidos mediante PAGE-SDS señalan diferencias de las cepas entre e intra serovar luego del análisis estadístico. El ADN cromosómico de los serotipos identificados fueron cortados con endonucleasas de restricción e hibridados con una sonda específica para el gen rDNA16S marcada por quimioluminiscencia. Se encontraron 4 ribotipos (RB, RC1, RC2 y RD), que correspondieron a cada serovar de Salmonella choleraesuis. / --- Pathogenic bacteria like Salmonella, natural inhabitants of the intestinal tract of diverse animals included the man, they are commonly present in effluents of mainly domestic drainages that discharge into the sea in direct form or through rivers and canals, ending up constituting part of the contaminate flora of the Lima´s coast and of the foods coming from the same one. Their presence is determined by the biological and physico chemical conditions of the aquatic environment that allow its survival, developing mechanisms of adaptation like to enter to state of “viable but no culturable”, metabolic and genomic changes in answer to adverse environmental conditions. Due to the importance that Salmonella has in the incidence of gastrointestinal illnesses, it becomes necessary their surveillance in the aquatic environment for that which is necessary to develop studies that facilitate the isolation, identification and differentiation of parthogenic strains in natural ecosystems. Seawater samples were taked along the Lima´s coast, during the months of march, april and may of 2000. For the isolation the membrane filtration method was used, pre-enrichment in Buffered Peptoned Water; selective enrichment in Tetrathionate, Selenite Cystine and Rappaport-Vassiliadis broths and selective isolation in XLD, Bismuth Sulfite, BPLS, SS, Hektoen, XLD agars. In the biochemical identification Oxidasa, Catalasa, Indole tests were used and it was cultivated in Urea, TSI, LIA, Citrato, RM-VP media. For the serologic identification grouping polyvalents (A, B, C1, C2, D, E1 and E4) and flagellars sera of Salmonella choleraesuis were used. 203 strains negative oxidase and positive catalase were selected, of which 18 were identified as Salmonella choleraesuis, inside those that 10 strains belonged to C1 serogroup and Salmonella Djugu serotype, and 8 to D serogroup and Salmonella Enteritidis serotype, one with typical biochemistry and 2 atypical strains typing inside the B serogroup of Salmonella choleraesuis, 3 rough strains and 24 with typical biochemistry that they didn't agglutinate with the polyvalent serum used. The profiles of total proteins obtained by means of SDS-PAGE point out differences of the strains inter and intra serovar after statistical analyses. The chromosomal DNA of the identified serotypes was cut with restriction endonucleases and hibridized with a specific probe for the gene rDNA16S marked by chemioluminiscens. They were 4 ribotypes (RB, RC1, RC2 y RD), that corresponded to each serovar of Salmonella choleraesuis.

El cultivo de papa (Solanum tuberosum Linnaeus, 1753), que actualmente se encuentra entre los cuatro alimentos más importantes a nivel mundial y que genera cada año aproximadamente 110,000 puestos de trabajo permanentes, ve disminuir su rendimiento debido a los altos costos de fertilizantes químicos, problemas fitosanitarios y el deterioro de los suelos. En el presente trabajo se buscó evaluar la capacidad promotora del crecimiento vegetal (PGPR) de bacterias del género Azotobacter y del grupo Actinomicetos aislados de la rizósfera de plantaciones de papa colectadas en los departamentos de Huancavelica, Junín, Huánuco y Cajamarca. De los 11 campos muestreados, se aislaron 62 cepas de Azotobacter, de las cuales, el 42,3% (25) inhibieron el crecimiento del hongo Fusarium solani, el 17% (10) el del hongo Rhizoctonia solani y el 9% (6) lograron inhibir el crecimiento de ambos hongos evaluados. En el caso de los Actinomicetos, de los 45 aislamientos el 49% (22) resultó antagonista contra Fusarium solani, 42% (19) contra Rhizoctonia solani y el 38% (17) a ambos hongos. Por otro lado, el 56,5% (36) de Azotobacter y el 48,8% (22) de aislamientos de Actinomicetos lograron producir ácido indol acético (AIA). El 46,7% (29) de Azotobacter spp. mostró la presencia de halos de solubilización de fosfato mientras que sólo el 11% (5) de Actinomicetos presentaron dicha actividad. Se realizaron también pruebas de produccion de metabolitos volátiles donde la cepa A1-19/08 de Actinomicetos fue la que mostró mejores resultados, así mismo, se evaluó la capacidad de producir sideróforos, sin embargo los resultados fueron negativos para ambos tipos de bacterias. Luego de la identificación bioquímica, la mayoría de las cepas aisladas de Azotobacter fueron reconocidas como A. chroococcum y A. vinelandii. Por otro lado, las bacterias del grupo Actinomicetos fueron indentificadas tentativamente como especies del género Streptomyces. Se realizaron dos experimentos a nivel de invernadero, en el primero se evaluaron 17 cepas de Actinomicetos y otros tantos de Azotobacter; estas tuvieron un efecto benéfico sobre la planta de papa en cuanto a la promoción del crecimiento de la planta como en la producción de tubérculos. El efecto de los Actinomicetos se vió reflejado en el incremento del número de tubérculos. En el segundo experimento se determinó el efecto de factores que influyen sobre el cultivo de la papa, como el tipo de semilla utilizada o el tipo de suelo empleado, para lo cual, el uso de suelo estéril o no estéril para el desarrollo de los ensayos de invernadero no fue un factor estadísticamente significativo sobre el efecto de las cepas, mientras que la tendencia general para Actinomicetos y Azotobacter mostró que el uso de semillas-tubérculo favorece el efecto benéfico que éstas bacterias ejercen sobre la planta de papa y su producción. / --- The culturing of potato (Solanum tuberosum Linnaeus, 1753), is nowadays among the four most important food worldwide and generates approximately 110,000 permanent working places and its yielding is diminished by factors as costs of fertilizers, phytosanitary issues and the soil deterioration. In this research we evaluate the Plant Growth Promoting (PGPR) of bacterial strains of genus Azotobacter and Actinomycetes group, isolated from potato rhizosphere (S. tuberosum), gathered up from the departments of Huancavelica, Junín, Huanuco and Cajamarca. Of 11 fields sampled, 62 strains of Azotobacter were isolated, from which, 42,3% (25) inhibited the growth of the fungus Fusarium solani, 17% (10) against the fungus Rhizoctonia solani and 9% (6) inhibited both. In the case of Actinomycetes, 45 strains were isolated, from which, 49% (22) were antagosnist against Fusarium solani, 42% (19) against Rhizoctonia solani and 38% (17) inhibited both fungus. On the other hand, the 56,5% (36) of the strains of Azotobacter and the 48,8% (22) of Actinomycetes isolated, were able to produce indole acetic acid (IAA). Of the all Azotobacter isolated, 46,7% (29) showed the presence of solubilization phosphate halo, whereas only the 11% (5) of Actinomycetes evaluated, showed such activity. Tests were carried out of production of volatile metabolites in which the A1-19/08 strain of Actinomycetes showed better results; likewise, the capacity to produce siderophores was evaluated, however, the results was negative for both types of bacteria. It was carried out a biochemical identification of the isolates, after that, the majority of Azotobacter strains isolated were identified as A. chroococcum and A. vinelandii. On the other side, the strains of Actinomycetes group isolated were tentatively identified as species of the genus Streptomyces. Two experiments were performed at the level of greenhouse, in the first one 17 of the best strains of Actinomycetes and Azotobacter were tested; wich had a benefical effect on the promotion of growth in both the plant and the production of tubers of S. Tuberosum. The effect of Actinomicetos was reflected on the increasing in the amount of tubers. In the second experiment, it was determined the effect of such factors as the type of seed used or the type of soil used in the culture, the use of sterile soil or non-sterile for the development of the tests of greenhouse didn’t have a statistically significant factor on the effect of the strains in the cultivation, while the general trend for both Actinomycetes and Azotobacter showed that the use of seed tuber favors the beneficial effect that these bacteria have on the potato plant (S. tuberosum) and its production.