El objetivo del presente estudio fue aislar e identificar por técnicas moleculares cepas bacterianas pertenecientes a géneros con potencial aplicación probiótica presentes en el intestino de cuyes (Cavia porcellus), como futura posible alternativa al uso de antibióticos. Para ello, se utilizaron 13 cuyes, diez de ellos neonatos de 2 a 6 días de edad y tres adultos de 2 meses de edad, se les extrajo el intestino de cada uno de ellos y se tomaron muestras raspando la mucosa intestinal, éstas se sembraron en diferentes medios de cultivo sólido con la finalidad de lograr aislar colonias con características fenotípicas de géneros bacterianos de conocido potencial probiótico (Lactobacillus, Enterococcus, Streptococcus, Bacillus, Bifidobacterium). Se identificaron las 27 cepas más representativas por medio de la amplificación, secuenciamiento y análisis bioinformático del gen 16S RNAr. Las secuencias de DNA fueron comparadas con tres diferentes bases de datos: Blast server for bacterial identification, Ribosomal database Project, BIBI database para identificar género. Resultó que el 85.18% (23) de las bacterias identificadas pertenecieron a los géneros Lactobacillus, Enterococcus, Streptococcus y Bacillus; el 14.81% (4) restante identificó géneros bacterianos gran positivos que no son objetivo de éste estudio, pero que, sin embargo, contribuyen con la identificación de la microbiota intestinal del cuy; se halló, Staphylococcus. Finalmente, se llegó al objetivo en cuestión; la identificación de géneros bacterianos con probable potencial probiótico. Se sugiere evaluar; en investigaciones posteriores; el potencial probiótico de dichos géneros bacterianos. Palabras clave: Cuy, potencial probiótico, PCR, identificación. / --- The objetive of this study was to isolate and identify bacterial strains by molecular techniques belonging to genera with potential for probiotics in the intestine of guinea pigs (Cavia porcellus) as possible future alternative to antibiotics. To do this, we used 13 guinea pigs, ten infants from 2 to 6 days old and three adults from 2 months old, the intestine was extracted from each sample were taken by scraping the intestinal mucosa, they were planted in different culture media in order to achieve isolated colonies with phenotypic characteristics of bacterial species of known potential probiotic (Lactobacillus, Enterococcus, Streptococcus, Bacillus, Bifidobacterium). We identified 27 representative strains by amplification, sequencing and bioinformatic analysis of 16S rRNA gene. DNA sequences were compared with three different databases: Blast server for bacterial identification, Ribosomal Database Project, BIBI database to identify the genus. It turned out that 85.18% (23) obtain Lactobacillus, Enterococcus, Streptococcus and Bacillus, the 14.81% (4) remaining bacterial species gram positive identified that are not objective of this study, but that however, contribute to the identification of guinea pig intestinal microbiota, was found Staphylococcus. Finally, we reached the target in question, identification of probable bacterial genera with probiotic potential. Is suggested to evaluate, in subsequent research, the probiotic potential of these bacterial genera. Keywords: Guinea pig, probiotic potential, PCR, identification.

A escala mundial hay interés en la búsqueda de nuevos medicamentos antibacterianos para tratamientos de enfermedades infecciosas. Ante la comprobada resistencia y recurrencia de Candida albicans, Staphylococcus aureus y otras bacterias, se busca encontrar nuevos productos para el tratamiento contra estos microorganismos. El objetivo de este trabajo fue hallar la acción antifúngica del aceite de la cáscara de la nuez del Anacardium occidentale sobre Candida albicans y la actividad antibacteriana sobre Staphylococcus aureus por lo que se trabajó con cepas de la American Type Culture Collection y con cepas de pacientes portadores de VIH y de prótesis bucal. Se usó como control positivo a la Nistatina para C. albicans y Clorhexidina 2 % para S. aureus. Cada prueba se realizó por quintuplicado. Los resultados mostraron que el aceite del Anacardium occidentale no tiene actividad antifúngica, pero sí demostró tener gran actividad antibacteriana contra S. aureus, mucho mayor que la mostrada por la clorhexidina.

Se realizó un estudio para determinar el nivel de conocimiento y aplicación de medidas preventivas para reducir el riesgo de transmisión de enfermedades a través de aerosoles, en los alumnos que llevan clínica en la Facultad de Odontología de Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Se tomó una muestra de 70 alumnos, los cuales fueron escogidos al azar para ser evaluados en cuanto al nivel de conocimiento y aplicación de las medidas preventivas frente a la exposición de los aerosoles. Se evaluó el nivel de aplicación por medio de la observación del comportamiento de los alumnos en la clínica odontológica durante la atención a sus pacientes de acuerdo a los ítems mencionados en una lista de cotejos previamente diseñada. La evaluación del nivel de conocimiento, se realizó por medio del desarrollo de un test que constaba de 14 preguntas y que tuvo una duración de 10 a 15 minutos. Una vez obtenidos los datos se procedió a la calificación de las pruebas y listas de cotejos, haciéndose las tabulaciones y cálculos correspondientes encontrándose los siguientes resultados: Se encontró un conocimiento entre regular y bueno por parte de los alumnos sobre las medidas preventivas con 91,40% de los casos, el nivel de aplicación de dichas medidas no se cumplen en la mayoría de los casos observados, no pudo encontrarse una relación estadísticamente significativa entre el nivel de conocimiento y nivel de aplicación de las medidas preventivas frente a la exposición de los aerosoles.

El objetivo de la presente investigación fue determinar la actividad antibacteriana in vitro del aceite esencial de minthostachys mollis frente a S. mutans, Lactobacilluys sp., Fusobacterium nucleatum, Actinobacillus actinoyicetencomitans y Actinomyces sp. Mediante la técnica de arrastre de vapor se obtuvo el aceite esencial de los talluelos, hojas y flores de la “Muña” que fué la sustancia en estudio, se utilizó la amoxicilina de 30ugr como control positivo y agua destilada como control negativo. Al realizar las pruebas de sensibilidad in vitro con estas 3 sustancias se obtuvo los siguientes resultados: Los diámetros de los halos de inhibición de Amoxicilina tuvieron una media de 49.89 mm (±10.52). Los diámetros de los halos de inhibición de Muña tuvieron una media de 16.75 mm (±4.40). En todos los ensayos se obtuvo que el diámetro del halo de inhibición del H2O era de 0 mm. Encontrándose que éstos difieren en forma estadísticamente significativa al 95% de confianza (p=0.000). Al comparar los halos de inhibición formados por la acción del aceite esencial de Muña en las 5 cepas bacterianas estudiadas, se observó que había diferencia estadísticamente significativa entre ellos según tipo de bacteria (p=0.007, ANOVA). En promedio, el mayor diámetro de inhibición fue para el Fusobactrium nucleatum (Media=20.13mm) y el menor fue para el Actinoyces sp. (Media= 11.00mm). Al analizar los diámetros obtenidos por la acción del control psoitivo (Amoxicilina), se encontró también una diferencia estadísticamente significativa según el tipo de bacteria (p < 0.000, ANOVA), siendo la más sensible el S. mutans (Media=68.00mm) y el de menor diámetro corresponde al Actinomyces sp. (Media=33.25mm). Se concluye que Minthostachys mollis tiene accion antibacteriana frente a las cinco especies bacterianas estudiadas. / Determintation of the Antibiotic Activity of Minthostachys mollis "Muna" in vitro against important oral bacteria. The objetive of this research was to determinte the antibacterial activity of the esenial oil of Minthostachys mollis "Muna", in vitro, against S. mutans, Lactobacilluys sp., Fusobacterium nucleatum, Actinobacillus actinoyicetencomitans y Actinomyces sp. The esencial oil was obtained with the vapor distilation from steams, leafes and flowers of "Muna".The positive control was Amoxicilin 30ug and the negative was distillated water. The results were as follows: The diameters of inhibition for Amoxicilin had an average of 49.89mm(±10.52). Those for Muna had an average of 16.75 mm (±4.40). In all the cases, the inhibition diameter obatined for H2O were of 0 mm. There was a stadistical diference, in 95%, between the diameters (p=0.000). When the inhibition diameters where compared amomg the 5 studied strains, there was a stadistical diference by the bacteria strains (p=0.007, ANOVA). The highest agerage of inhibition was for Fusobactrium nucleatum (20.13mm) and teh lowest for Actinomices sp. (11.00mm). Where the inhibition diameters obtained by the action of the positive control (Amoxicilin)were compared by the bacteria strain,there was a stadistical diference (p < 0.000, ANOVA), the most sensbible was S. Mutans (68.00mm) and that with the lowest diameter was Actinomyces sp. (33.25mm).

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Se realizó un estudio descriptivo, de los registros del Servicio de Microbiología Clínica Veterinaria de la Universidad de Chile, que abarcaron el período 1995 a 2002. Se observó que las principales muestras analizadas fueron sangre (5.061), pelos (899), secreciones óticas (308), secreciones vaginales (290), leches (222) y orinas (107). El 69% de ellas correspondieron a la Región Metropolitana. La especie animal de mayor frecuencia fue la canina. El examen más solicitado fue serología de brucelosis, que se diagnosticó positiva en el 20,56% de los sueros caninos y en el 28,38% de sueros ovinos. Se diagnosticó positividad a dermatofitos en el 21,52% de pelos felinos y 8,85% de pelos caninos; el Género Microsporum fue el principal responsable en ambas especies. En las muestras de secreción ótica los principales agentes aislados fueron Staphylococcus aureus (46,37%) y Pseudomonas aeruginosa (18,55%) en caninos y Staphylococcus spp. (54,5%) y Micrococcus spp. (18,2%) en felinos. En las muestras de secreción vaginal equina principalmente, las bacterias más aisladas fueron Streptococcus spp. y S. zooepidemicus (42,28%) y, Corynebacterium spp. (38,26%). En las muestras de leche bovina los principales Géneros aislados fueron Staphylococcus (26,77%), Corynebacterium (21,83%) y Streptococcus (20,42%). De las muestras de orina en caninos y felinos E. coli fue el agente más aislado. Por primera vez en el país se aisló Mycoplasma mycoides sub especie mycoides large colony (tipificado externamente) desde una explotación caprina de la Región Metropolitana y Listeria monocytogenes con importante connotación de foco epidemiológico en una explotación ovina de la VI Región.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Se analizaron 309 muestras de leche (150 en polvo y 159 fluida procesada), correspondientes a productos elaborados por las principales empresas lecheras de Chile, mediante métodos de “screening” para detectar residuos de antimicrobianos en leche bovina. Todas las muestras fueron analizadas por 2 métodos microbiológicos: Delvotest SP (Gist Brocades®) y el método de Cilindros en Placa (A.O.A.C., 1990). El “screening” microbiológico originó 28 muestras (9,06%) positivas y otras 25 muestras sospechosas. Estas muestras fueron analizadas por los métodos inmuno–enzimáticos Snap β–Lactámicos, Snap Tetraciclina, Cite Probe Gentamicina y Cite Sulfa Trio (IDEXX®). De las 53 muestras analizadas en la segunda fase, 16 fueron positivas a los métodos inmuno–enzimáticos; 15 con Snap β–Lactámicos (entre éstas, una a Cite Probe Gentamicina) y una con Cite Sulfa Trio. Doce de estas muestras coincidieron con positivas a los métodos microbiológicos y cuatro coincidieron con muestras sospechosas. Paralelamente, las 159 muestras de leche fluida fueron analizadas por el ensayo de receptor enzimático, específico para β-Lactámicos, Delvotest X–PRESS βL-II (Gist Brocades®). Este método originó 31 muestras positivas, las que también fueron analizadas por Snap β–Lactámicos, resultando negativas en su totalidad. Una de éstas, sí coincidió con un resultado positivo de Delvotest SP. En resumen, 62 muestras (20,06%) resultaron positivas. 49 de estas muestras (15,86%) resultaron positivas sólo a un método (15 a un microbiológico y 34 a un enzimático), mientras que 13 muestras (4,2%) presentaron resultados positivos al “screening” microbiológico y confirmados inmuno–enzimáticamente. 15 muestras (4,85%) fueron positivas únicamente a los métodos microbiológicos, por lo que no puede establecerse la naturaleza de tal contaminación o si estos resultados correspondieron a falsos positivos. Se concluyó que tanto en leche en polvo como fluida se detectó contaminación por antimicrobianos. De acuerdo a los resultados de los métodos enzimáticos, la mayor contaminación fue originada por residuos de β–lactámicos. También se detectó gentamicina en una muestra y sulfonamidas, en otra. El sistema analítico utilizado en este estudio no fue adecuado para detectar todos los residuos de antimicrobianos que pueden encontrarse en la leche producida en Chile, por lo que debiera ser ampliado y perfeccionado para futuros estudios, implementándose métodos más sensibles y más específicos, que abarquen un mayor espectro de antimicrobianos.

Doctor en ciencias con mención en Microbiología / Doctor en Ciencias con mención en Microbiología / El género Vibrio incluye un alto número de especies indígenas de agua de mar, algunas de las cuales pueden causar importantes enfermedades en humanos aún en ausencia de contaminación antropogénica (V. cholerae, V. vulnificus y V. parahemolyticus). Aunque la infección por estos vibrios se ha observado en Chile con baja frecuencia, el surgimiento de brotes es una amenaza constante a la salud humana y a la producción y explotación acuícola. En esta tesis se estudió el polimorfismo intra-cromosómico de los genes repetidos del rRNA 16S de bacterias del género Vibrio, y se exploró la presencia de genes relacionados con patogenicidad en aislados ambientales de estas bacterias. En este proyecto el análisis de los rDNAs 16S obtenidos de una sola colonia de cepas tipo o cepas ambientales del género Vibrio reveló la presencia de polimorfismo en cada una de las cepas analizadas. El polimorfismo se detectó por la visualización de heterodupletes que se generan después de la amplificación por PCR del rDNA 16S, un procedimiento que permite examinar un gran número de aislados. El amplificado del rDNA 16S obtenido tanto de V. parahaemolyticus como de una cepa ambiental fueron clonados. Las secuencias nucleotídicas revelaron diferencias de hasta un 2% entre genes repetidos del rDNA 16S de una misma cepa. Los sitios polimorfos se encontraron concentrados en una región del gen rRNA 16S bacteriano que forma un lazo y una horquilla. En algunas cepas esta región concentraba hasta un 83% del total de sitios polimorfos. La acumulación de muchos cambios compensatorios en la región de lazo y horquilla implican que la divergencia de las diferentes versiones de este lazo y horquilla es relativamente muy antigua. Esta divergencia podría ser el resultado de un proceso de selección o transferencia lateral de genes o regiones de genes que evolucionaron independientemente en otras bacterias. El polimorfismo también se observó en el rRNA después de ser amplificado por RTPCR, indicando que algunos de los genes diferentes eran expresados. La exploración por genes relacionados con la patogenicidad de diferentes especies de Vibrio en aislados ambientales mostró sólo un gen relacionado con un aislado. Se exploró la presencia de tdh, trh y gyrB relacionados con la patogenicidad en V. parahaemolyticus; vvhA relacionado a V. vulnificus; y ctxA, tcpA y el espaciador de los genes rRNA 16 y 23S relacionados con V. cholerae. Este aislado, llamado C1, contiene el gen gyrB, relacionado al V. parahaemolyticus. La caracterización detallada mostró corresponder a un V. parahaemolyticus, pero con algunas características de V. alginolyticus. Este aislado no contiene todo el conjunto de genes considerados necesarios en una especie realmente patógena. Sin embargo, este aislado alberga un fago de amplio espectro de huésped que puede infectar tanto V. alginolyticus como V. parahaemolyticus. Aunque es posible aislar bacterias con genes asociados a vibrios patógenos en las aguas costeras chilenas, éstas no parecen ser cepas realmente virulentas. / The genus Vibrio includes a number of bacterial species that in spite of being indigenous of the sea (V. parahaemolyticus and V. vulnificus) with the exception of V. cholerae, which is terrestrial, may infect humans with serious consequences. In this work we explore the commonness polymorphism and the extent of sequence dissimilarity among repeated 16S rRNA genes, in type strains of genus Vibrio and environmental isolates. Analysis of the 16S rDNAs obtained from cultures of single colonies of either type collection strains or environmental strains of the genus Vibrio revealed the presence of polymorphism in almost every one of the strains examined. Polymorphism was detected by visualization of heteroduplexes produced after 16S rDNA PCR amplification, a procedure that allows for the screening of a large number of isolates. Amplified 16S rDNAs obtained from both V. parahaemolyticus and an environmental strain were cloned. Their nucleotide sequences revealed differences of up to 2% among 16S rDNAs from the same strain. Polymorphic sites were concentrated in a recognized variable stem loop of bacterial 16S rRNA that contained in some cases up to 83% of the total mismatches observed. Most of the substitutions present in the stem loop region showed compensating base covariation. The accumulation of so many compensating changes in the stem loop region implies that the divergence of the different versions of this stem loop is relatively ancient. This divergence could be the result of either a selection process or a lateral transference of independently evolved genes. Polymorphism was also observable in the rRNA when this was amplified by RT-PCR, indicating the expression of at least some of the different genes. In this work we also explored the presence of putative pathogenic vibrio strains, carrying amplicons related to pathogenic species of this genus, isolated in coastal waters of the Southern Pacific Ocean (Chile). A search for bacteria of this genus containing genes related with virulence was conducted and isolates of the genus Vibrio were grouped according to the size pattern of their 16-23S rDNA spacer regions. One isolate from each of 20 different groups was then tested by PCR amplification for the presence of the following genes, related with pathogenicity: tdh , trh, and the girB related to pathogenic V. parahaemolyticus; vvhA related to V. vulnificus; and ctxA, tcpA and the 16-23S rDNA spacer region related to V. cholerae. Only a single Vibrio isolate carrying a pathogenicity associated gene was detected. Further characterization of this isolate suggested, however, that it lacked additional properties to be virulent. The results indicated that this strain belong to the species V. parahaemolyticus but contains many properties more closely related to V. alginolyticus. This strain can host a phage present in the Chilean coastal waters.

El documento digital no refiere un asesor / Establece la tendencia histórica de los factores en la dinámica del dengue en la ciudad de Guayaquil, durante el período 2008 - 2013. Utilizando un estudio observacional, de tipo descriptivo ecológico. En sus resultados, coincide que en la época de invierno se encuentra el mayor número de casos, pero con presencia durante todo el año; y al paso de los años 2010 y 2012 fueron de mayor incidencia, con una variabilidad en su comportamiento. Las variables ambientales mostraron hallazgos, en el que a más temperatura, con humedad por encima del 70% y escasos vientos, estos provocan condiciones para que pueda existir un incremento en la transmisión de la enfermedad. Además, los picos epidémicos de dengue presentados en los dos primeros períodos de cada año se relacionan en los mismos períodos con los índices de Breteau elevados considerados de alto riesgo, pudiendo influir en la transmisión de la enfermedad. Se comprueba la presencia de los 4 serotipos de virus circulante de dengue en Guayaquil, considerándose la existencia de circulación simultánea de DEN1, DEN2, y DEN4 durante los últimos 3 años. Por la historicidad de lo acontecido anteriormente en Guayaquil sobre la existencia del virus y personas susceptibles con infecciones previas, se ha creado una situación que pone en riesgo de dengue grave en un futuro próximo. / Tesis

Tesis entregada a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al grado de Doctor en Ciencias con Mención Microbiología. / Salmonella Typhimurium is an enteric pathogen able to infect different animal hosts, including humans. In immunocompetent humans, S. Typhimurium mainly causes gastroenteritis, a disease characterized by an inflammatory diarrhoea with massive neutrophil infiltration in the ileum and colon. The infective cycle of Salmonella starts with the ingestion of bacteria that reach the small intestine and invade epithelial cells by its apical face. After crossing the epithelial barrier, bacteria are captured by phagocytic cells of the immune system present in the sub-epithelium, such as macrophages, neutrophils and dendritic cells, being contained within a membrane bound compartment. Here, Salmonella subverts the endocytic route, avoiding the fusion of this compartment with the lysosomes and generating the Salmonella-containing vacuole (SCV). In this compartment, Salmonella is able to survive and replicate. The ability to modify this intracellular niche explains the ability of this pathogen to survive intracellularly. To carry out this process, Salmonella employs two Type Three Secretion Systems (T3SS) and an arsenal of secreted effector proteins in order to take control over the eukaryotic cell. An important aspect of Salmonella’s life cycle that has not been studied in detail is its survival in the environment, where bacteria are exposed to predation by protozoa, and specially by amoebae. These organisms are specialized phagocytes that feed on bacteria and fungi. To address this interaction, we and other groups use amoeba models to characterise the molecular processes involved in the survival of intracellular pathogens within environmental protozoa. Among these model organisms, the social amoeba Dictyostelium discoideum is amenable for molecular analyses in laboratory settings and several tools have been developed in this organism for the study of different aspects of its interaction with bacterial pathogens. Recently, our group described that S. Typhimurium is able to survive intracellularly in the social amoeba Dictyostelium discoideum, and that mutants in genes required for virulence in other infection models present survival defects in this host. Despite of this, the mechanisms that allow the intracellular survival of this pathogen in this kind of organism have not been studied in detail. This Thesis proposed the characterization at the cellular level of this interaction, with a focus on two secreted effector proteins of S. Typhimurium that are directly related to SCV generation and modification in other cell models: SopB and SifA. Our results show that these effectors are needed for intracellular survival of S. Typhimurium in D. discoideum. Furthermore, by means of a combination of microscopy and proteomic analyses we were able to characterise the protein composition of the vacuolar compartment containing Salmonella in this host. Our results show that known markers linked to this compartment in other cell types and the autophagy machinery play a role in the biogenesis of this intracellular niche in D. discoideum. / Salmonella Typhimurium es un patogeno enterico que tiene la capacidad de infectar diversos hospederos animals, incluyendo el ser humano. En individuos inmunocompetentes, S. Typhimurium provoca gastroenteriris, una enfermedad diarreica inflamatoria caracterizada por la masiva infiltracion de neutrofilos en el ileon y el colon. El ciclo infectivo de Salmonella comienza con la ingestion de las bacterias que al llegar al intestino delgado invaden las celulas epiteliales por la cara apical. Luego de cruzar la barrera epitelial, las bacterias son capturadas por las celulas fagociticas del sistema inmune que residen en el sub-epitelio, como macrofagos, neutrofilos y celulas dendriticas, quedando contenida en un compartimento membranoso. En esta etapa, Salmonella interviene la ruta endocitica, evitando la fusion de este compartimento con el lisosoma y generando la vacuola contenedora de Salmonella (Salmonella-containing vacuole: SCV). En este compartimento, Salmonella es capaz de sobrevivir y replicarse. La habilidad de modificar este nicho intracelular explica la habilidad de este patogeno de sobrevivir intracelularmente. Para esto, Salmonella utiliza dos Sistemas de Secrecion Tipo Tres (Type Three Secretion Systems: T3SS) y un arsenal de proteinas efectoras secretadas para tomar control sobre la celula eucarionte. Por otra parte, un importante aspecto del ciclo de vida de Salmonella que no ha sido estudiado en detalle es su supervivencia en el ambiente, donde las bacterias se encuentran expuestas a la depredacion por protozoos y en particular, amebas. Estos organismos son fagocitos profesionales que se alimentan de bacteria y hongos. Recientemente, nuestro grupo describio que S. Typhimurium es capaz de sobrevivir intracelularmente en la ameba social Dictyostelium discoideum y que mutantes en genes requeridos para la virulencia en numerosos modelos de infeccion tambien presentan defectos de supervivencia en este hospedero. A pesar de esto, los mecanismos que le permiten a este patogeno en este tipo de organismo no han sido estudiado en detalle. Para entender esta interaccion, nosotros y otros grupos usamos modelos de ameba a fin de caracterizar los procesos moleculares involucrados en la supervivencia de patogenos intracelulares en el interior de protozoos ambientales. Dentro de estos organismos modelo, la ameba social Dictyostelium discoideum es sencilla para el analisis molecular en condiciones de laboratorio. Por otra parte, numerosas herramientas se han desarrollado en este organismo para el estudio de diversos aspectos de su interaccion con patogenos bacterianos. Esta Tesis propuso caracterizar a nivel cellular esta interaccion, enfocandonos en dos proteinas efectoras secretadas de S. Typhimurium que estan directamente relacionadas a la formacion y modificacion de la SCV en otros modelos celulares: SopB y SifA. Nuestros resultados muestran que estos efectores son necesarios para que S. Typhimurium sobreviva intracelularmente en D. discoideum. Adicionalmente, mediante una combinacion de tecnicas de microscopia y analisis proteomicos pudimos caracterizar la composicion proteica de este compartimento vacuolar que contiene a Salmonella en este hospedero. Nuestros resultados muestran que marcadores asociados a la SCV en otras lineas celulares se encuentran en elcompartimento que se genera en D. discoideum y que la maquinaria de autofagia juega un rol importante en la biogenesis de este nicho intracelular en D. discoideum. / FONDECYT grants 1140754 y 1171844, CONICYT Doctoral Fellowship 21140615. / Enero 2020.

Seminario de Título entregado a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al Título de Ingeniera en Biotecnología Molecular. / El océano comprende el 71% de la superficie de la Tierra, participando en el control del clima, y proveyendo más del 50% del oxígeno disponible en la atmósfera. Las comunidades microbianas que habitan los ambientes marinos se caracterizan por ser determinantes en la producción primaria, además de ser diversas en sus funciones y distribución, siendo fundamentales en la mantención de los ciclos biogeoquímicos. Éstas poseen distintas estrategias para habitar estos ambientes, ya que en estos existen variaciones en los factores abióticos, tales como temperatura, disponibilidad de oxígeno o salinidad, que determinan cambios a nivel biótico. El dinamismo de los ambientes marinos favorece el intercambio de información genética mediado por la transferencia horizontal de genes (HGT). Está descrito que la conjugación es el mecanismo que posee una mayor tasa de ocurrencia en estos ambientes, por lo que estudiar los elementos genéticos móviles (EGM) conjugativos resulta necesario para comprender que genes son potencialmente transferidos. Este proceso se inicia cuando la enzima relaxasa, codificada por el EGM identifica el origen de transferencia (oriT) en el ADN del elemento a transferir, y realiza el corte con el que se inicia la movilización del elemento conjugativo a la célula receptora por medio del sistema de secreción de tipo IV (T4SS). Esta misma relaxasa es la que empalma el ADN transferido. Lo particular de esta enzima, es que es un elemento ubicuo para los elementos conjugativos, lo que la convierte junto a los genes que la codifican (genes mob) en marcadores de movilidad génica por conjugación, y por tanto en un sistema de clasificación de estos elementos. Se ha descrito que los genes transferidos en plásmidos movilizables o conjugativos son capaces de conferir capacidades adaptativas a determinados microorganismos, tales como resistencia a antibióticos o a metales pesados, mientras que a nivel comunitario su efecto aún requiere de mayor estudio. En este seminario de título se planteó la búsqueda e identificación de relaxasas y genes mob, tanto in sílico como in situ, en muestras marinas de la región de Valparaíso. In sílico, se identificaron 28 proteínas con dominios funcionales descritos para relaxasas mediante la utilización de modelos ocultos de Markov (HMM) en un metagenoma obtenido desde el proyecto “TARA Oceans”, correspondiente a una estación ubicada frente a las costas de la región central de Chile, realizando además una cuantificación de los genes mob correspondientes a las proteínas identificadas, obteniendo que más del 70% de las lecturas reclutadas respondían a sólo dos familias de relaxasas (MOBP y MOBH). Para el estudio in situ se analizaron muestras marinas colectadas de una zona intermareal en Montemar, región de Valparaíso, en los meses de enero, marzo y julio de 2018. Estas muestras se trataron utilizando distintos protocolos de extracción de ADN, diferenciando ADN total y ADN plasmidial. Se evaluó la presencia de genes codificantes para relaxasas en los distintos tratamientos de las muestras mediante DPMT (Degenerate Primer Mob Typing) donde se logró identificar la presencia de la familia MOBQu mediante esta técnica. Posteriormente se realizó una cuantificación del gen codificante para esta familia mediante q-PCR, obteniendo que la muestra extraída con un kit comercial para extracción de ADN plasmidial se encontraba enriquecida en estos genes. Con estos resultados podemos demostrar que estas estrategias permitieron la identificación de relaxasas y los genes que las codifican en sistema marino, y así inferir la presencia de elementos conjugativos en estos. / The ocean comprises 71% of the Earth's surface, participating in climate control, and providing more than 50% of the oxygen available in the atmosphere. The microbial communities that inhabit marine environments are characterized by being determinant in primary production, diverse in their functions and distribution, and fundamental in the maintenance of biogeochemical cycles. These communities have different strategies to inhabit these environments, since in these there are variations in the abiotic factors, such as temperature, availability of oxygen or salinity, which determine changes at the biotic level. The dynamism of marine environments favors the exchange of genetic information by horizontal gene transfer (HGT). It is reported that conjugation is the mechanism that has a higher rate of occurrence in these environments, so studying the conjugative mobile genetic elements (EGM) is necessary to understand which genes are potentially transferred. This process is initiated when the relaxase enzyme, encoded by the EGM, identifies the origin of transfer (oriT) in the DNA of the element to be transferred, and performs the cut with which the mobilization of the conjugative element to the recipient cell is initiated through the Type IV secretion system (T4SS). This same relaxase enzyme is the one that splices the transferred DNA. A particular issue about this enzyme is that it is a ubiquitous element for the conjugative elements, which converts it together with the genes that code it (mob genes) into markers of gene mobility by conjugation, and therefore in a classification system of these elements. It has been reported that genes transferred in mobilizable or conjugative plasmids are able to confer adaptive capacities to certain microorganisms, such as resistance to antibiotics or heavy metals, while at the community level their effect still requires further V-ix study. In this work we proposed the search and identification of relaxases and mob genes, both in silico and in situ, in marine samples from the Valparaíso region. In silico, 28 proteins with functional domains described for relaxases were identified by using hidden Markov models (HMM) in a metagenome obtained from the "TARA Oceans" project, corresponding to a station located off the coasts of the central region of Chile, also carrying out a quantification of the mob genes corresponding to the identified proteins, obtaining that more than 70% of the readings recruited responded to only two families of relaxases (MOBP and MOBH). For the in situ study, marine samples collected from an intertidal zone in Montemar, Valparaíso region, in the months of January, March and July 2018 were analyzed. These samples were subjected to different protocols for total DNA and plasmid DNA extraction, evaluating the presence of genes coding for relaxases in the different treatments of the samples by means of DPMT (Degenerate Primer Mob Typing) where it was possible to identify the presence of the MOBQu family. A quantification of the gene coding for this family was performed by q-PCR, obtaining that the sample extracted with a commercial kit for plasmid DNA extraction was enriched in these genes. With these results we can demonstrate that these strategies allowed the identification of relaxases and the genes that codify them in the marine system, and thus infer the presence of conjugative elements in them.