Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / En producción animal, el uso de antimicrobianos es una práctica que tiene como objetivo tratar enfermedades de origen bacteriano. Sin embargo, cuando estas terapias farmacológicas no son realizadas de manera adecuada existe la posibilidad que residuos de fármacos puedan permanecer en los productos y subproductos de origen animal. En particular, el subproducto plumas por su composición estructural presenta afinidad por las tetraciclinas, lo que permite suponer el traspaso de residuos de este antimicrobiano en altas concentraciones y por tiempos más prolongados hacia las plumas en comparación a tejidos comestibles. Estas, al ser transformada en harina de pluma, son utilizadas principalmente como pienso alimenticio en dietas de diversos sistemas productivos, reincorporándose a la cadena alimenticia y llegando de manera indirecta a la población humana, siendo un riesgo para la salud pública. Basándose en los efectos adversos que pueden generar los fármacos, la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura (FAO) y la organización mundial de la salud (OMS), a través de su comité de expertos (JECFA), establecen los límites máximos residuales para los antibióticos en tejidos comestibles. No obstante, no existe suficiente información científica sobre plumas que permita establecer medidas de control sobre la presencia de residuos de antimicrobianos en esta matriz. Para evaluar la depleción de oxitetraciclina (OTC) y su metabolito activo (4epi-OTC) en musculo, hígado y plumas, se utilizaron 60 pollos broiler criados bajo condiciones ambientales controladas, a los cuales se les administró un tratamiento con una formulación comercial de oxitetraciclina al 10% oral durante siete días. Las concentraciones del analito y su metabolito en las matrices analizadas fueron calculadas a través de la ecuación del análisis de regresión lineal de las curvas de calibración de matriz fortificada (r ≥ 0.95). Se estableció el período de resguardo para las tres matrices con un 95% de confianza, dando como resultado 46 días en plumas, 12 días en músculo y 6 días en hígado. / In animal production, the use of antibiotics is a practice that has as objective the treatment of bacterial diseases. However, when these pharmacologic therapies are not performed in the correct way, there is a chance that pharmacologic residues could stay in the animal products and subproducts. In particular, the feathers subproduct, because of its structural composition, it presents some kind of affinity for tetracyclines, which suggests the transfer of high concentrations and for longer times of this antibiotic to feathers, compared to edible tissues. These feathers, after being transformed into feather meal, are mainly used as animal feed in diets of various food production systems, returning to the food chain and indirectly reaching the human population, becoming a risk for public health. Based on the adverse effects that drug can generate, Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO) and World Health Organization (WHO), through its committee of experts (JEFCA), establish the maximum residue limits for antibiotics in edible tissues. However, there is insufficient scientific information about feathers that allow to establish control measures over the presence of antimicrobial residues in this matrix. To evaluate oxytetracycline (OTC) and its active metabolite (4epi-OTC) depletion in muscles, liver and feathers, they were used 60 broilers raised under controlled conditions, which were administered a treatment with a commercial formulation of 10% oral oxytetracycline during seven days. The concentrations of analyte and its metabolite in the matrices analyzed were calculated by the equation of linear regression analysis of standard curves of fortified matrix (r ≥ 0.95). The withdrawal time was established for the three matrices with 95% confidence, resulting 46 days in feathers, 12 days in muscle and 6 days in liver / Proyecto U-INICIA VID 2013 “Evaluación de la bioacumulación de residuos de antimicrobianos en subproductos de aves y su relación con la concentración de estos residuos en tejidos comestibles”. Proyecto FIV 2013 “Bioacumulación de oxitetraciclina, clortetraciclina y sus epímeros en plumas de aves tratadas y su relación con la concentración de estos residuos en tejidos comestibles”

Diversos organismos nacionales e internacionales han establecido los límites máximos de residuos (LMRs); con el fin de realizar un adecuado monitoreo de fármacos veterinarios en alimentos de origen animal. Las metodologías elegidas para el monitoreo deben caracterizarse por ser sensibles e identificar volúmenes en partes por billón (ppb). De todas las metodologías existentes la cromatografía acoplada a espectrómetro de masas es la mejor alternativa ya que responde a las exigencias de las normas. Este trabajo presenta diversos protocolos cromatográficos desarrollados y propuestos para la identificación de los residuos de antibióticos veterinarios en matrices alimentarias de origen animal.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Se analizaron 309 muestras de leche (150 en polvo y 159 fluida procesada), correspondientes a productos elaborados por las principales empresas lecheras de Chile, mediante métodos de “screening” para detectar residuos de antimicrobianos en leche bovina. Todas las muestras fueron analizadas por 2 métodos microbiológicos: Delvotest SP (Gist Brocades®) y el método de Cilindros en Placa (A.O.A.C., 1990). El “screening” microbiológico originó 28 muestras (9,06%) positivas y otras 25 muestras sospechosas. Estas muestras fueron analizadas por los métodos inmuno–enzimáticos Snap β–Lactámicos, Snap Tetraciclina, Cite Probe Gentamicina y Cite Sulfa Trio (IDEXX®). De las 53 muestras analizadas en la segunda fase, 16 fueron positivas a los métodos inmuno–enzimáticos; 15 con Snap β–Lactámicos (entre éstas, una a Cite Probe Gentamicina) y una con Cite Sulfa Trio. Doce de estas muestras coincidieron con positivas a los métodos microbiológicos y cuatro coincidieron con muestras sospechosas. Paralelamente, las 159 muestras de leche fluida fueron analizadas por el ensayo de receptor enzimático, específico para β-Lactámicos, Delvotest X–PRESS βL-II (Gist Brocades®). Este método originó 31 muestras positivas, las que también fueron analizadas por Snap β–Lactámicos, resultando negativas en su totalidad. Una de éstas, sí coincidió con un resultado positivo de Delvotest SP. En resumen, 62 muestras (20,06%) resultaron positivas. 49 de estas muestras (15,86%) resultaron positivas sólo a un método (15 a un microbiológico y 34 a un enzimático), mientras que 13 muestras (4,2%) presentaron resultados positivos al “screening” microbiológico y confirmados inmuno–enzimáticamente. 15 muestras (4,85%) fueron positivas únicamente a los métodos microbiológicos, por lo que no puede establecerse la naturaleza de tal contaminación o si estos resultados correspondieron a falsos positivos. Se concluyó que tanto en leche en polvo como fluida se detectó contaminación por antimicrobianos. De acuerdo a los resultados de los métodos enzimáticos, la mayor contaminación fue originada por residuos de β–lactámicos. También se detectó gentamicina en una muestra y sulfonamidas, en otra. El sistema analítico utilizado en este estudio no fue adecuado para detectar todos los residuos de antimicrobianos que pueden encontrarse en la leche producida en Chile, por lo que debiera ser ampliado y perfeccionado para futuros estudios, implementándose métodos más sensibles y más específicos, que abarquen un mayor espectro de antimicrobianos.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La familia de las tetraciclinas, es la segunda familia de antibióticos de mayor producción y uso a nivel mundial. En la industria avícola, son utilizadas para tratar enfermedades infecciosas de origen bacteriano, sin embargo, su uso no está exento de riesgos. Luego de su administración, son excretadas en grandes proporciones a través de orina y heces de humanos y animales de manera activa. Esto resulta relevante debido a que la cama broiler, compuesta en su mayoría por deyecciones de pollo, es utilizada como opción alimenticia para rumiantes. Además, el estiércol es utilizado para optimizar el crecimiento y cosecha en la agricultura, implicando un traspaso de residuos al medio ambiente, generando efectos eco toxicológicos y contribuyendo a la emergencia de resistencia bacteriana. Se llevó a cabo un estudio de depleción utilizando 80 pollos broiler, los cuales fueron tratados con clortetraciclina al 20% en condiciones terapéuticas. El objetivo fue evaluar las concentraciones de clortetraciclina y su epímero 4-epi-clortetraciclina, en las deyecciones de pollos broiler tratados, para lo cual se verificó una metodología analítica mediante cromatografía líquida asociada a un espectrómetro de masas (LC-MS/MS), según la normativa de la Unión Europea. Paralelamente, se llevó a cabo la medición de actividad antimicrobiana mediante un método de “screening”, el cual fue verificado para su uso en deyecciones. Clortetraciclina y su epímero 4-epi-clortetraciclina continuaron excretándose a través de las deyecciones aun cumplido el periodo de resguardo de la formulación farmacéutica en músculo, y sus concetraciones variaron entre 179,5 y 666 μg/kg. Además, del total de muestras analizadas mediante el “screening”, todas presentaron actividad antimicrobiana. Se estableció un tiempo de depleción de 69 días para deyecciones / The family of tetracyclines, is the second family of antibiotics of greater production and use worldwide. In the poultry industry, they are used to treat infectious diseases of bacterial origin, however, their use is not without risks. After administration, they are excreted in large proportions through urine and feces of humans and animals actively. This is relevant because the poultry litter, composed mostly of poultry excreta, is used as a food option for ruminants. In addition, manure is used to optimize growth and harvesting in agriculture, implying a transfer of waste to the environment, generating ecotoxicological effects and contributing to the emergence of bacterial resistance. A depletion study was carried out using 80 broiler chickens, which were treated with 20% chlortetracycline under therapeutic conditions. The objective was to evaluate the concentrations of chlortetracycline in the excrement of treated broiler chickens, for which an analytical methodology was verified by liquid chromatography associated with a mass spectrometer (LC-MS / MS), according to European Union regulations. At the same time, the measurement of antimicrobial activity was carried out using a screening method, which was verified for use in excreta. The concentrations of chlortetracycline plus its epimer 4-epichlortetracycline varied between 179.5 and 666 μg / kg. Of the total samples analyzed, all of them had antimicrobial activity. A depletion time of 69 days for dejections was established / Financiamiento: Proyecto UINICIA 2013

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Los antimicrobianos son la principal herramienta en el tratamiento de enfermedades causadas por bacterias en humanos y animales. El excesivo y mal uso de estos compuestos ha causado la aparición de resistencia bacteriana y uno de los problemas de interés público es el posible traspaso de estas resistencias de los animales al hombre. Es así que a nivel mundial, los Programas de Armonización y Globalización Internacional han hecho énfasis en el uso racional de los antimicrobianos en animales de producción, a través de programas de monitoreo de resistencia bacteriana. El método de determinación bacteriana más utilizado y aceptado mundialmente es el método de dilución en placa, que da valores de MIC (Concentración Mínima Inhibitoria) para un determinado antimicrobiano. Otro método que está siendo utilizado estos años en medicina humana, por su rapidez y sencillez es el de las Tiras Reactivas de MIC (E-test). En este trabajo se evaluó la utilización de este método como base para un plan de monitoreo de resistencia bacteriana en Medicina Veterinaria. Siendo las mastitis una de las principales causas de uso de antimicrobianos en el ganado bovino, se evaluó la susceptibilidad a 178 cepas aisladas de mastitis clínica de bovinos de leche por métodos de dilución en placa y E-test. Se encontró concordancia de resistencia. No se obtuvieron diferencias significativas entre los valores de MIC obtenidos por ambos métodos con cefoperazona, ampicilina, amoxicilina, bencilpenicilina y enrofloxacino, excepto con gentamicina. Estos resultados indicarían que E-test podría ser utilizado como método de screening por ser simple y rápido, pero faltan estudios con algunos antimicrobianos utilizados en Medicina Veterinaria. Por otro lado, una de las resistencias mas conocidas es a los compuestos -lactámicos. Es así, que en este trabajo también se estudió la presencia de vi enzimas -lactamasas en cepas de E. coli y estafilococos. Además, se estudió la presencia de -lactamasas de espectro expandido (BLEE) y la resistencia a meticilina, en ambos tipos de cepas respectivamente, ya que son causas de fallas terapéuticas comunes en humanos y posibles mecanismos de resistencia a las bacterias de mastitis bovina evaluadas. Se encontró la presencia de -lactamasas en el 100% de las cepas de E. coli y no se detectaron BLEE. En las cepas de estafilococos se detectó un 34% de presencia de -lactamasas: 1/26 en Staphylococcus aureus, 6/26 en Staphylococcus coagulasa negativos y 4/10 en Staphylococcus spp., fueron resistentes a meticilina. Estos resultados sugerirían que la presencia de -lactamasas y mecanismos de resistencia más complejos, como lo son a meticilina, podrían dar cuenta de las resistencias observadas a diferentes antimicrobianos del tipo -lactámicos en aislados de mastitis bovina.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El uso de antimicrobianos en animales de producción trae consigo el riesgo de presencia de residuos que superen los límites máximos permitidos de estos medicamentos en alimentos de origen animal. Esto ha llevado a desarrollar programas de control para lo cual es necesario contar con métodos de detección de estas sustancias, entre los cuales están los métodos de “screening”. El objetivo del presente estudio fue validar la prueba de “screening” microbiológico “Fast Antimicrobial Screen Test” (“FAST”) para la detección de 16 antibióticos frecuentemente usados en la producción animal en Chile. Para esto, se siguieron las pautas recomendadas por la Unión Europea (U.E) publicadas en el Diario Oficial de las Comunidades Europeas (2002). La implementación de la técnica, se basó en las recomendaciones del fabricante (Medtox®). En esta experiencia se determinó que la zona inhibitoria alrededor del sensidisco control N5 estuvo, en la mayoría de los casos, dentro de un rango de 25 a 30 mm, valor un poco más elevado que aquel descrito para la técnica (20 a 26 mm). Por otro lado, si bien en este estudio se observó que pueden obtenerse resultados tan pronto como a las seis horas de iniciada la incubación, para la validación del método la lectura de las placas se fijó a las 24 horas, tiempo al cual se visualizaron inequívocamente los halos de inhibición. La especificidad del método se determinó analizando los solventes y diluyentes utilizados en el estudio y tejido renal libre de antimicrobianos, observándose que ninguno de ellos produjo interferencia con los resultados. Para medir la capacidad de detección del método se fijó el límite de determinación para los 16 antibióticos como drogas puras con los siguientes resultados: amoxicilina (25 μg/kg o ppb), ampicilina (25 μg/kg), ceftiofur (3000 μg/kg), cloxacilina (25 μg/kg), enrofloxacino (100 μg/kg), eritromicina (100 μg/kg), estreptomicina (500 μg/kg), florfenicol (300 μg/kg), flumequina (1000 μg/kg), gentamicina (375 μg/kg), neomicina (2500 μg/kg), oxitetraciclina (300 μg/kg), penicilina (25 μg/kg) y tilosina 2 (200 μg/kg). Para ácido oxolínico y lincomicina no pudo ser determinado. Además, se obtuvo el límite de determinación para enrofloxacino y oxitetraciclina presentes en matrices renales de aves tratadas con dosis terapéuticas, obteniéndose valores de 1467 y 247μg/kg, respectivamente. El análisis de robustez indicó que el método no es lo suficientemente robusto frente a los 4 factores seleccionados, los cuales fueron operador, pH del medio, concentración de esporas y temperatura de incubación. En conclusión, a pesar de la baja robustez del método, éste resultó tener una especificidad y sensibilidad adecuadas siendo capaz de detectar, en conformidad a los niveles de exigencia, un amplio espectro de antimicrobianos como drogas puras. Sin embargo, si se desea emplear este método en Chile, es importante que se continúen los estudios basados en la matriz renal, para definir con mayor precisión la sensibilidad de la técnica.

Desarrolla un método de identificación y cuantificación de cloranfenicol en carnes por cromatografía liquida acoplada a espectrometría de masas LC-MS-MS. Se utilizó el método de cromatografía líquida de alta resolución acoplada a espectrometría de masas tipo tándem Triple Cuadrupolo Masa-Masa (LC-MS/MS), efectuando su validación según lo establecido por las regulaciones internacionales como la Directiva 96/23/EC 2002 Comisión Decisión Unión Europea, para los parámetros de especificidad, límite de detección (LOD), límite de cuantificación (LOQ), precisión intradía e interdia, exactitud, linealidad y recuperación. Se empleó un sistema de extracción en fase sólida para el análisis de las muestras de carne de pollo, mediante cartuchos de Octadecilsilano C18, con carga de 100 mg y 3 mL de volumen, para la detección de los analitos cloranfenicol (CAF) y su estándar interno cloranfenicol deuterado (CAFD5) evidenciándose las transiciones de 320.90→150.96 m/z, por Monitoreo de Reacción Simple (SRM), para el analito cloranfenicol (CAF) y 325.85→ 155.98 m/z, SRM para el estándar interno cloranfenicol deuterado (CAFD5). Los valores obtenidos durante la validación del método establecieron una muy buena especificidad al no obtener pico cromatográfico alguno en los tiempos de retención del analito cloranfenicol (CAF) y su estándar interno, cloranfenicol deuterado (CAFD5), el límite de detección (LOD) fue de 1,0 ng/mL, correspondiente a 0,1 ng/g, límite de cuantificación (LOQ) de 3,0 ng/mL correspondiente a 0,3 ng/g , precisión intradía: control de calidad A (QCA) 19,61%,control de calidad B (QCB) 4,46% y control de calidad C (QCC) 6,87%, precisión interdia: QCA 3,86%, QCB 15,07% y QCC 3,22%, linealidad con un coeficiente de correlación lineal r= 0.9987 y un porcentaje de recuperación para los seis (06) niveles propuestos entre 84,6% y 105,0% De las veinte seis (26) muestras evaluadas procedentes de 4 mercados de distribución de carne de pollo de las ciudades de Lima y Callao, se evidenció que catorce (14) muestras no cumplieron con el Límite Máximo Residual 2 permitido para el antibiótico cloranfenicol en carne pollo definida por la FDA y la Unión Europea ≤ 0,3 ng/g. Se logró desarrollar un método validado capaz de identificar y cuantificar residuos del antibiótico cloranfenicol en muestras de carne de pollo empleando cromatografía líquida de alta resolución acoplada a espectrometría de masas tipo tándem Triple Cuadrupolo Masa-Masa (LCMS/MS). / Tesis

Determina si la leche de vacas que retornan a la producción después de terminado el periodo de retiro postratamiento presentan residuos de sustancias antibióticas. Se tomaron muestras de leche de 60 vacas que fueron tratadas contra mastitis con antibióticos Betalactámicos y que retornaron a la producción después de terminado el periodo de retiro de la leche (3 días). Las muestras se analizaron mediante la prueba inmunoenzimática SNAP (Betalactam), que indica la presencia de antibióticos betalactámicos en leche. De las muestras analizadas el 45% (27/60) fueron positivas a la prueba de detección de residuos de antibióticos Betalactámicos. En relación al tipo de antibiótico utilizado el 56% (14/25), 26.67% (4/15) y 45% (9/20) fueron positivas para la asociación entre Penicilina y Estreptomicina, Kanamicina y Penicilina y Amoxicilina y Ácido Clavulónico, respectivamente; de acuerdo a la vía de administración, 50% (14/28) de los animales tratados por vía intramuscular y 40.63% (13/32) por vía intramamaria fueron positivos a la prueba; de acuerdo al nivel de producción el 46.67%(7/15), 57.14% (12/21) y 33.33% (8/24) de las vacas de baja, media y alta producción, respectivamente, fueron positivas a la prueba. Se evaluó si había asociación entre cada una de las variables y la presencia de residuos de antibióticos con la prueba de Chi cuadrado, no observándose asociación entre la presencia de residuos en la leche por efecto de las variables tipo de antibiótico utilizado, vía de administración y nivel de producción. Concluye que el 45% de la leche de vacas que retornan a la produccion despues de terminado el periodo de retiro postratamiento presentan residuos de antibióticos y ademas, factores como la vía de administración del antibiótico utilizado, factores intrínsecos del establo, nivel de produccion lechera y tipo de antibiótico utilizado podrian influir en la persistencia de residuos de antibioticos en leche. / Tesis