Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La familia de las tetraciclinas, es la segunda familia de antibióticos de mayor producción y uso a nivel mundial. En la industria avícola, son utilizadas para tratar enfermedades infecciosas de origen bacteriano, sin embargo, su uso no está exento de riesgos. Luego de su administración, son excretadas en grandes proporciones a través de orina y heces de humanos y animales de manera activa. Esto resulta relevante debido a que la cama broiler, compuesta en su mayoría por deyecciones de pollo, es utilizada como opción alimenticia para rumiantes. Además, el estiércol es utilizado para optimizar el crecimiento y cosecha en la agricultura, implicando un traspaso de residuos al medio ambiente, generando efectos eco toxicológicos y contribuyendo a la emergencia de resistencia bacteriana. Se llevó a cabo un estudio de depleción utilizando 80 pollos broiler, los cuales fueron tratados con clortetraciclina al 20% en condiciones terapéuticas. El objetivo fue evaluar las concentraciones de clortetraciclina y su epímero 4-epi-clortetraciclina, en las deyecciones de pollos broiler tratados, para lo cual se verificó una metodología analítica mediante cromatografía líquida asociada a un espectrómetro de masas (LC-MS/MS), según la normativa de la Unión Europea. Paralelamente, se llevó a cabo la medición de actividad antimicrobiana mediante un método de “screening”, el cual fue verificado para su uso en deyecciones. Clortetraciclina y su epímero 4-epi-clortetraciclina continuaron excretándose a través de las deyecciones aun cumplido el periodo de resguardo de la formulación farmacéutica en músculo, y sus concetraciones variaron entre 179,5 y 666 μg/kg. Además, del total de muestras analizadas mediante el “screening”, todas presentaron actividad antimicrobiana. Se estableció un tiempo de depleción de 69 días para deyecciones / The family of tetracyclines, is the second family of antibiotics of greater production and use worldwide. In the poultry industry, they are used to treat infectious diseases of bacterial origin, however, their use is not without risks. After administration, they are excreted in large proportions through urine and feces of humans and animals actively. This is relevant because the poultry litter, composed mostly of poultry excreta, is used as a food option for ruminants. In addition, manure is used to optimize growth and harvesting in agriculture, implying a transfer of waste to the environment, generating ecotoxicological effects and contributing to the emergence of bacterial resistance. A depletion study was carried out using 80 broiler chickens, which were treated with 20% chlortetracycline under therapeutic conditions. The objective was to evaluate the concentrations of chlortetracycline in the excrement of treated broiler chickens, for which an analytical methodology was verified by liquid chromatography associated with a mass spectrometer (LC-MS / MS), according to European Union regulations. At the same time, the measurement of antimicrobial activity was carried out using a screening method, which was verified for use in excreta. The concentrations of chlortetracycline plus its epimer 4-epichlortetracycline varied between 179.5 and 666 μg / kg. Of the total samples analyzed, all of them had antimicrobial activity. A depletion time of 69 days for dejections was established / Financiamiento: Proyecto UINICIA 2013

Tesis entregada a la Universidad De Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al grado de Magíster en Ciencias Biológicas. / El aumento en la aparición de microrganismos resistentes a los antibióticos es de gran preocupación en el ámbito de salud pública debido al aumento de la mortalidad y costos de tratamiento causado por las enfermedades que provocan. Se han detectado concentraciones de residuos de antibióticos sobre los niveles inhibitorios en aguas residuales, y los tratamientos actuales no son capaces de eliminar estos residuos. En relación con todo esto, los antibióticos de tipo tetraciclina son de gran interés debido a su alto uso, alto nivel de excreción y a su alta persistencia en el medio ambiente. Se ha reportado el uso de enzimas de tipo laccasa de hongos basidiomicetos para la oxidación de diferentes tetraciclinas mostrando distintas eficiencias. Sin embargo, las propiedades observadas aún están por debajo de lo requerido para una aplicación industrial y la optimización ha sido hasta ahora afrontada desde el ámbito de la Biocatálisis y no desde la Ingeniería de Enzimas. En este trabajo se estudió el uso de la laccasa del hongo ascomiceto Botrytis aclada expresada en P. pastoris para la oxidación de tetraciclinas, enzima que presenta una alta tolerancia a inhibición por iones cloruro y alta producción heteróloga. Se produjo y purificó la enzima y se probó su capacidad para oxidar oxitetraciclina e inactivar oxitetraciclina, clortetraciclina y tetraciclina. Bajo la hipótesis de que el sitio de unión de tetraciclinas corresponde al sitio canónico de las Laccasas y con la información disponible sobre el mecanismo catalítico, se modeló la interacción con estos 3 antibióticos y se calculó su energía de unión por métodos in silico. Además, las constantes de disociación de los distintos complejos fueron estudiadas in vitro mediante análisis de la inhibición competitiva ejercida por el antibiótico sobre la actividad de oxidación de ABTS de la laccasa. Observamos que la energía calculada correlaciona con la constante de disociación determinada para los tres antibióticos, mostrando una afinidad por Clortetraciclina > Tetraciclina > Oxitetraciclina. / The high apparition rate of antimicrobial resistant bacteria is of great concern for public health care due to the rise in mortality and the high cost associated to treat the illnesses caused by them. Antibiotic residual concentrations highly over the inhibitory levels have been detected in wastewaters. Now, wastewater treatment plants are not able to remove this kind of residues. In this matter, tetracycline antibiotics are of great concern due to their high use, high excretion rates and persistence in the environment. The use of Laccases from basidiomycetes for the oxidation of a variety of tetracyclines has been reported, showing variable performance. However, the observed oxidation rates are still under the required for industrial applications. Antibiotics removal has been optimized using approaches from the biocatalysis field and not from rational design enzyme engineer. In this work, we studied the use of laccase from Botrytis aclada, an ascomycete fungus, for the oxidation of tetracyclines. This enzyme shows high tolerance to chloride inhibition and high heterologous production rates. The enzyme was expressed and purified, and we proved its capacity to oxidase oxytetracycline and to inactivate oxytetracycline, and tetracycline. Having in mind the hypothesis that the binding site of tetracyclines is the canonical laccase active site, we modeled the interaction with those three antibiotics and calculated the energy of binding using in silico approaches. Also, we determined in vitro the dissociation constants of the complexes by analyzing inhibition kinetics using the antibiotic as a competitive inhibitor of the enzymatic ABTS oxidation. We observed a good correlation between the calculated Energy and the dissociation constants, showing higher affinity for Chlortetracycline > Tetracycline > Oxytetracycline. / CONICYT-PCHA/MagísterNacional/2016 – folio 22160435 y proyecto FONDEF-VIU16E0084. / Agosto 2019