La homeostasis de la concentración celular de iones es una propiedad fundamental de las células vivas. Muchos parámetros fisiológicos importantes como el volumen celular, la turgencia, el pH intracelular, la fuerza iónica o la concentración interna de cationes dependen de la regulación de los sistemas de toma y salida de los principales cationes monovalentes: protones, sodio y potasio. El potasio, principal catión intracelular en plantas y muchos microorganismos, se retiene de forma activa, por lo que esta presente en el interior de las células a altas concentraciones, siendo el principal determinante de muchos de los parámetros fisiológicos anteriormente comentados. El umbral de toxicidad de otros cationes monovalentes como el sodio o el litio es mucho más bajo que el del potasio, por lo que se debe evitar su acumulación en el citoplasma para proteger enzimas esenciales y sensibles. Las células eucarióticas emplean el transporte activo primario, mediado por ATPasas de tipo P, y el transporte secundario, mediado por canales y cotransportadores, para mantener altas concentraciones de potasio, esencial para las células, y bajas concentraciones de sodio, que puede tener efectos tóxicos. En Saccharomyces cerevisiae el principal sistema de toma de potasio está codificado por los genes TRK1 y TRK2. El trabajo presentado se centra en el estudio de dos proteínas quinasas, Hal4 y Hal5. La sobre-expresión de los genes HAL4 y HAL5 mejora la tolerancia de las células de levadura a cationes tóxicos como el sodio o el litio, mientras que por el contrario, su disrupción produce hipersensibilidad a estos cationes. Se ha comprobado que estos efectos son dependientes del sistema de transporte de potasio Trk1-Trk2, y todo parece indicar que estas dos quinasas funcionan como activadores de este sistema, aumentando la entrada de potasio en las células, y por tanto, haciendo decrecer el potencial de membrana. Esta disminución del potencial de membrana también reduce la toma de cationes / Pérez Valle, J. (2009). Estudio de los mecanismos de la regulación de la homeostasis iónica: Análisis fisiológico y transcriptómico del mutante hal4hal5 de Saccharomyces cerevisiae [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/4329 / Palancia

El factor de transcripción DBP1 de Nicotiana tabacum, es el primer miembro de una nueva familia de reguladores transcripcionales que poseen, además de capacidad de unión al ADN, actividad proteín-fosfatasa de tipo 2C. En este trabajo hemos abordado la caracterización funcional del factor regulador DBP1, determinando que su capacidad de unión al ADN reside en el motivo DNC, el cual se localiza en la región N-terminal de la proteína y está conservado entre las proteínas DBP de diferentes plantas mono y dicotiledóneas. Así mismo hemos llevado a cabo una búsqueda de factores proteicos que interaccionan con DBP1. Así, la isoforma G de la proteína 14-3-3 se presenta como el primer interactor de DBP1, comprometiendo en dicha interacción una zona del dominio N-terminal adyacente al motivo DNC. Mediante expresión transitoria en N. benthamiana hemos podido comprobar que la isoforma G de la 14-3-3 es capaz de promover la exclusión nuclear de DBP1, modificando la distribución núcleo-citoplasma que presenta en condiciones basales y participando así de manera indirecta en la regulación de genes diana de DBP1 como CEVI1. De los cuatro homólogos estructurales de DBP1 identificados en A. thaliana, AtDBP1 es el representante estructuralmente más semejante a DBP1 de tabaco. AtDBP1 mantiene la capacidad de unirse al ADN así como la actividad fosfatasa 2C característica de esta familia, y es capaz de interaccionar a través de su región N-terminal con la proteína GRF6, homóloga a la 14-3-3 G de tabaco. Con el objetivo de identificar dianas de AtDBP1 tanto a nivel transcripcional como post-transcripcional para así averiguar los procesos biológicos en los que están implicados estos factores, se ha realizado un análisis proteómico comparativo entre plantas Col-0 y mutantes atdbp1 que ha puesto de manifiesto una baja acumulación de una de las isoformas del factor de inicio de la traducción 4E, eIF(iso)4E, en el mutante atdbp1. / Castelló Llopis, MJ. (2008). Identificación y caracterización de la familia de factores DBP, nuevos reguladores de la expresión génica en plantas [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/6363 / Palancia

La tristeza de los cítricos es una de las enfermedades de mayor importancia en el cultivo de los cítricos. Dada la imposibilidad práctica de contener su dispersión y evitar su evolución hacia formas más virulentas, el control de los daños mediante protección cruzada o mediante resistencia mediada por genes del patógeno utilizando plantas transgénicas requiere un conocimiento detallado de las interacciones CTV-cítricos. Para este estudio se inocularon cuatro aislados con distintas características patogénicas en lima Mexicana (LM), Citrus macrophylla (CM), naranjo dulce (ND) y naranjo amargo (NA). La estimación de la carga viral mediante ELISA y RT-PCR cuantitativa a tiempo real en la primera brotación y al cabo de 9 meses, mostró que NA ofrece una resistencia inicial a la invasión por CTV. Asimismo, sugirió que la intensidad de los síntomas inducidos por CTV no era una consecuencia directa de la acumulación viral. El análisis de la actividad replicativa de las distintas combinaciones aislado/huésped reveló una cinética de acumulación viral paralela a la actividad replicativa. Por otro lado, mientras en los huéspedes susceptibles se detectaron siRNAs de CTV en la primera brotación, la activación del silenciamiento en NA fue mucho más tardía indicando que la resistencia inicial a la acumulación viral en este huésped no era consecuencia del silenciamiento. Posteriormente, se analizó en más detalle el tipo de limitaciones que ofrecía NA a la invasión sistémica de CTV observándose que éste presentaba una limitación al movimiento viral. El virus se detectó inicialmente en la raíz y el nivel de acumulación del mismo afectaba la posterior carga viral en la copa, de forma variable según los aislados, así para el aislado T385 la raíz actuaría como reservorio viral. Finalmente, el empleo de la tecnología de las micromatrices de cDNA permitió analizar a nivel transcriptómico la respuesta del NA al inicio de la infección por CTV y confirmar las hipótesis formuladas anteriormente. / Comellas Serra, M. (2009). Estudio de la interacción entre naranjo amargo y el virus de la tristeza de los cítricos [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/7323 / Palancia

La salinidad es uno de los estreses ambientales que más incide en la productividad agrícola, especialmente en las regiones semiáridas como la zona mediterránea, donde se ubica la Comunidad Valenciana. Para poder mitigar los efectos perjudiciales de los estreses abióticos resulta necesario conocer las bases moleculares de los fenómenos investigados, ya que soló entonces podrán ser manipulados de la manera más conveniente. En el caso de la tolerancia a la salinidad se conocen una serie de aspectos claves que han contribuido a mejorar las plantas cultivadas, pero es necesaria mucha más investigación para poder obtener resultados adecuados para la practica agrícola. En este trabajo se ha planteado un nuevo abordaje consistente en el uso de norespermidina, una poliamina no metabolizable, como agente de selección para encontrar individuos resistentes a cationes tóxicos. Para ello se ha utilizado una colección de semillas de Arabidopsis mutadas por inserción de un activador transcripcional. Con este abordaje se aisló el mutante par1-1D (polyamine resistant) que presenta un fenotipo pleiotrópico de resistencia a cationes tóxicos como Na+, Li+, norespermidina y espermidina. par1-1D es un mutante dominante que presenta un aumento en la expresión del locus At1g15020. Este locus codifica una proteína perteneciente a la familia de las quiescina sulfidril oxidasas (existen 2 proteínas homólogas de esta familia en Arabidopsis) por lo que se propuso el nombre de QSO2 (quiescina sulfidril oxidasa) para denominar al locus At1g15020. Mediante un análisis de RT-PCR en diferentes partes de la planta se encontró que QSO2 se expresa principalmente en la raíz y el polen, además al expresar de forma transitoria la construcción QSO2::GFP en la epidermis de hojas de N. benthamiana, la expresión de QSO2 se localizó en la pared celular. Por otro lado, se expresó y purificó en S. cerevisae la proteína recombinante QSO2 y se demostró su actividad sulfidril oxidasa. Finalmente, en plántulas y pl / Alejandro Martínez, S. (2007). Identificación de mutantes de Arabidopsis thaliana resistentes a norespermidina. Clonación y caracterización de una sulfidril oxidasa [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/1940 / Palancia

La citricultura es una de las ramas de la fruticultura de mayor producción a nivel mundial, siendo España el cuarto productor y primer país exportador mundial de cítricos para consumo en fresco (FAO, 2005). La obtención de nuevas variedades que se adapten a las exigencias de mercado y de cultivo es la clave para continuar siendo competitivos. La reducción de las precipitaciones en muchas zonas agrícolas provoca que el estrés hídrico sea uno de los estreses abióticos que más limita la producción de los cultivos, entre ellos los cítricos. Aunque son numerosos los estudios orientados a conocer mejor la respuesta de la planta ante el estrés hídrico a nivel molecular en especies modelo, son pocos los trabajos realizados en relación a la respuesta al estrés hídrico en cítricos. Este trabajo tiene como objetivo el desarrollo de herramientas que nos permitan conocer mejor la respuesta de los cítricos frente a este estrés que en un futuro puedan utilizarse para conseguir cítricos que sean capaces de aprovechar mejor el agua disponible en condiciones adversas, evitando las importantes pérdidas de cosecha. El análisis global de la respuesta a estrés hídrico en cítricos se ha llevado a cabo a través de un estudio del transcriptoma de los cítricos sometidos a este estrés. Para ello se han utilizado dos abordajes, la generación de ESTs y la hibridación de micromatrices de cDNA, que han permitido identificar genes candidatos a estar implicados en la respuesta a estrés hídrico. La generación de ESTs se ha realizado a partir de la secuenciación de un total de 2296 clones aislados de dos bibliotecas de cDNA sustraido, Drought1 y Drought2, construidas a partir de hojas y raíces de plantas sometidas a estrés hídrico respectivamente. Las ESTs obtenidas han pasado a formar parte de la colección del CFGP (Citrus Functional Genomics Project). Como resultado del estudio de los unigenes resultantes de las bibliotecas construidas con material sometido a estrés hídrico, en relación con el r / Gimeno Romeu, J. (2007). Respuesta transcripcional al estrés hídrico en mandarino. Estudio genómico-funcional con micromatrices de cDNA [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/1993 / Palancia

El efecto de la aplicación de giberelinas (GAs) y auxinas durante la fructificación y desarrollo del fruto, ha sido investigado en tomate (Solanum lycopersicum L.) cv Micro-Tom. Los resultados indican que constituye un sistema adecuado para el estudio de la regulación hormonal en tomate. Para evitar la competencia entre frutos dentro del mismo racimo, solo un fruto por racimo y hasta dos racimos por planta se utilizaron en los experimentos. Ovarios no polinizados (emasculados) se desarrollaron partenocárpicamente en respuesta a la aplicación de GA3 > GA1 = GA4 > GA20, aunque no de GA19, y de diferentes auxinas tales como los ácidos indolacético (IAA), naftalenacético (NAA) y 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), siendo este último el más eficiente. La morfología de los frutos inducidos por auxinas y giberelinas es diferente. En los frutos tratados con GA3 el tejido locular se desarrolla pobremente dejando las cavidades loculares vacías, mientras que los frutos tratados con 2,4-D presentan pseudoembriones y cavidades loculares llenas. A nivel interno, el GA3 indujo células de mayor tamaño en el mesocarpo interno, lo cual estaba correlacionado con un mayor nivel de ploidía (mayor MCV, mean C value), mientras el 2,4-D favoreció las divisiones celulares, por lo que el número de capas celulares en el pericarpo fue superior al tratamiento con GA3 y al polinizado. Los frutos polinizados tuvieron un mayor tamaño y peso que los frutos inducidos con GA3 aunque ambos fueron más pequeños y de menor peso que los tratados con 2,4-D. El grosor del pericarpo de los frutos inducidos con GA3 y 2,4-D no mostró diferencias hasta 20 días después de antesis, por lo que el tener menos células en el pericarpo (frutos inducidos con GA3) podría ser compensado teniendo un mayor tamaño celular. El uso de inhibidores de biosíntesis de GAs tales como el pablobutrazol (PCB) y LAB 198999 disminuyó la fructificación y desarrollo del fruto, efecto revertido con la aplicación de GA3. Sin embargo, en frut / Serrani Yarce, JC. (2008). Interacción de Giberelinas y Auxinas en la fructificación del tomate [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/2242 / Palancia

El gen OCP3 codifica un factor de transcripción de la familia Homeobox. En trabajos anteriores se ha demostrado que la pérdida de función de este gen en Arabidopsis thaliana causa un notable incremento de la resistencia a infecciones por hongos necrotrofos como Botrytis cinerea o Plectosphaerella cucumerina. Además esa resistencia es dependiente de la correcta señalización mediada por ácido jasmónico (JA), una de las fitohormonas más ampliamente relacionadas con el establecimiento de las respuestas defensivas en plantas junto con el ácido salicílico (SA). A través del balance entre las señalizaciones de estos dos reguladores (JA y SA), la planta es capaz de disparar la respuesta defensiva más apropiada dependiendo del tipo de patógeno que la ataca. Así pues, el estudio de las interrelaciones entre JA y SA y los componentes que transducen las respectivas señales es de gran utilidad para desentramar la compleja red de regulación que compone la respuesta inmune de las plantas. Mediante el estudio de dobles mutantes, se ha demostrado un nuevo papel de OCP3 en la interconexión entre SA y JA en respuesta a Pseudomonas syringae e Hyaloperonospora arabidopsidis, dos patógenos de tipo biotrofo. Además se propone a OCP3 como un nuevo componente de la denominada Resistencia Sistémica Inducida (ISR). Existe cierto grado de solapamiento entre las respuestas de las plantas frente a estreses bióticos y abióticos. La identificación de los componentes comunes a estas dos rutas es de gran valor para conocer cómo las plantas se adaptan ante situaciones de estrés diferentes. Mediante un rastreo por doble híbrido en levadura, se identificaron cuatro proteínas que interaccionan con OCP3. Todas ellas están implicadas en la señalización mediada por ABA, una fitohormona que regula, entre otros procesos, la respuesta frente al estrés hídrico. En el presente trabajo se aportan numerosas evidencias que indican que OCP3 regula el cierre estomático promovido por ABA, y con ello la tolerancia a / Ramirez Garcia, V. (2008). Análisis funcional del gen OCP3 [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/4683 / Palancia

El objetivo de la primera parte de la tesis fue el de averiguar qué genes están involucrados en el proceso formación del fruto de tomate mediado por hormonas, para ello se realizó un análisis transcriptómico comparativo del desarrollo temprano tanto de frutos fertilizados, como de ovarios inducidos a fructificar mediante tratamiento hormonal. El análisis de los resultados reveló que los transcriptomas presentan las mayores diferencias en los primeros días tras la inducción, probablemente debido a la mayor rapidez de las auxinas en estimular la fructificación. Posteriormente, los transcriptomas se van acercando gradualmente entre ellos con independencia del estímulo hormonal inductor. El estudio reveló que existen elementos que configuran los programas de desarrollo del fruto tanto en una componente general independiente del agente inductor, como en la componente específica de la hormona. Además, en el caso específico de giberelinas, el estudio transcripcional de frutos silenciados en el gen SlDELLA mostró que este represor controla al menos una parte de la respuesta transcripcional a esta hormona en el fruto. Esta respuesta parece incluir una serie de mecanismos de defensa que se activan en los ovarios alrededor de antesis. Por otra parte, el estudio transcriptómico y metabolómico del pericarpo de los frutos inducidos por tratamiento hormonal en fase de maduración reveló que el efecto del tratamiento hormonal inductor afecta la expresión de genes relacionados con la síntesis de etileno y da lugar a frutos con alteraciones importantes en la expresión de genes del metabolismo de azúcares. Además, y con objeto de ampliar el rango de herramientas disponibles para ingeniería genética en frutos, se aprovechó el análisis de micromatrices para identificar genes de expresión específica en el ovario/fruto y se clonaron sus secuencias promotoras. / Hueso Estornell, L. (2010). Estudio transcriptómico y metabolómico del desarrollo partenocárpico del fruto de tomate y aplicaciones biotecnológicas [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/7528 / Palancia

"Origen y función de las espermidina aminopropil transferasas en Arabidopsis thaliana " Las poliaminas son pequeñas moléculas con carga positiva a pH fisiológico. Las más abundantes y más ampliamente distribuidas entre todos los seres vivos son la putrescina y la espermidina con dos y tres grupos amino, respectivamente. La espermidina se forma a partir de la putrescina por adición de un grupo aminopropilo. La espermina, con cuatro grupos amino y presente sólo en eucariotas, se forma a partir de la espermidina por adición de un segundo grupo aminopropilo. Las poliaminas han sido relacionadas con procesos fundamentales para la vida, como son la división, el crecimiento, la diferenciación y la muerte celular, habiéndose demostrado en todos los organismos en los que se han conseguido mutantes deficientes en su síntesis que las poliaminas son esenciales. En plantas se han encontrado múltiples correlaciones entre la variación en la concentración de las poliaminas y procesos tales como la germinación, la embriogénesis, la formación de raíces, la iniciación floral o el desarrollo de flores y frutos. Al inicio de esta tesis se publicó la identificación de la primera putativa espermina sintasa en plantas (ACL5), cuya pérdida de función da lugar a un defecto en la elongación del tallo y alteración del patrón normal de los haces vasculares; sin embargo, nuestro análisis del mutante acl5 nos ha revelado que no había perdido la capacidad de sintetizar espermina. Nuestro rastreo del genoma de Arabidopsis thaliana nos permitió identificar y caracterizar el gen SPM, otra putativa espermina sintasa regulada por ácido abscísico. Los mutantes nulos para este gen no muestran diferencias fenotípicas respecto del silvestre pero el doble mutante spm/acl5 nos ha permitido confirmar que no hay más genes responsables de la síntesis de espermina. No obstante, la sobreexpresión de SPM en el mutante acl5 no ha sido capaz de aliviar su fenotipo. / Gómez Minguet, E. (2008). Origen y función de las espermidina aminopropil transferasas en Arabidopsis thaliana [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/8311 / Palancia

En este trabajo de tesis doctoral se ha utilizado el organismo modelo Saccharomyces cerevisiae para estudiar cómo las células eucariotas responden a nivel molecular y se adaptan eficazmente a cambios en la concentración osmótica del medio. Este hecho suscita gran interés en la industria de las fermentaciones; también en la agricultura, dado el creciente problema de salinidad de los suelos. Los resultados obtenidos a través de la utilización de técnicas bioquímicas y de biología molecular demuestran que en situaciones de estrés, las células de levadura ajustan sus niveles de ergosterol a través de la activación de una compleja cascada de regulación transcripcional. Este descubrimiento ha revelado nuevos datos que ayudan a entender mejor la homeostasis de esteroles. Este proceso es fisiológicamente similar al que ocurre en células de mamíferos, donde es fundamental mantener los lípidos a niveles óptimos, ya que alteraciones en los mismos pueden dar lugar a enfermedades como la obesidad, diabetes tipo 2 o arterioesclerosis. Por otra parte, muchas infecciones fúngicas en individuos inmunodeprimidos se tratan mediante el empleo de drogas que actúan sobre enzimas de la ruta de biosíntesis de ergosterol, lo que sostiene la relevancia del estudio de la regulación de la síntesis de este lípido de membrana. Por último, el análisis genómico mediante ensayos ChIP-Chip y ChIP-Seq de algunos de los principales reguladores implicados en la compleja respuesta a estrés osmótico, aporta nueva información para comprender cómo los organismos, a través de la evolución, han organizado diferentes -pero estrechamente vinculados- módulos de regulación para hacer frente rápidamente a situaciones de estrés. / Martínez Montañés, FV. (2010). Adaptación a estrés osmótico en Saccharomyces cerevisiae: Caracterización genómica de factores de transcripción involucrados y represión de la biosíntesis de ergosterol [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/9311 / Palancia