Memoria para optar el título de Bioquímico / La transcripción del DNA, primera etapa de la expresión génica, corresponde a la conversión de un DNA molde a RNA por acción enzimática de la RNA polimerasa (RNAP). En las células de los organismos eucariontes existen tres clases de RNA polimerasas nucleares (RNAP I, II y III). Cada clase de RNAP reconoce promotores específicos mediante la formación de complejos de preiniciación (Pre-initiation Complex o PIC) entre la RNAP y el uso factores de transcripción generales (General Transcription Factors o GTFs), siendo estos últimos los que dan especificidad a cada PIC. Los promotores son secuencias de DNA, normalmente ubicadas río arriba del inicio de la transcripción (Transcription Start Site o TSS), relativamente conservadas en el genoma, que poseen todos los elementos en cis necesarios para el inicio y la regulación de la transcripción de un gen. Los promotores de la RNAP II son los más estudiados y se clasifican en los que poseen caja TATA y en los que no, llamados TATA-Less. Entre los factores de transcripción que se unen a estos promotores están TFIIB, TFIID, TFIIA, entre otros. La caja HomolD es un elemento del promotor mínimo que se encuentra en un promotor de tipo TATA-less de secuencia consenso CAGTCACA, descubierto en genes de proteínas ribosomales de Schizosaccharomyces pombe, y que es capaz de reclutar la RNAP II e iniciar la transcripción. Estudios recientes indican que para iniciar la transcripción desde estos promotores se necesitan los siguientes GTFs: TFIID, TFIIB, TFIIF, TFIIH y TFIIE. Además, se ha propuesto que el factor Rrn7 (antes conocido como miembro de la maquinaria de la RNAP I) podría interaccionar con algunos de estos GTFs, como por ejemplo TFIIB y/o TBP (miembro del complejo TFIID), lo que le conferiría a Rrn7 la facultad de unirse a la caja HomolD y dirigir la transcripción. Sin embargo, aún se desconoce cuáles de estos factores junto a Rrn7 conforman el PIC, que se ensambla sobre la caja HomolD. En este trabajo se estudió la participación de los factores TFIIB y TBP, como miembros candidatos del complejo de pre-iniciación formado sobre la caja HomolD. Mediante ensayos en geles de retardo o EMSA y ensayos de inmunoprecipitación de cromatina se analizaron las interacciones DNA-proteína y proteína-proteína. Para realizar los ensayos de EMSA fue necesario expresar y purificar la proteína Rrn7 recombinante utilizando una etiqueta de histidina, la que se utilizó junto a TBP y TFIIB. Además, se purificaron anticuerpos policlonales contra ambos factores, y fueron usados en ensayos de EMSA a modo de control. Los resultados de los EMSA muestran una intensificación de la banda representativa al complejo Rrn7-caja HomolD al agregar cada factor a la reacción (TFIIB o TBP). Los ensayos de ChIP se realizaron en una cepa silvestre de S. pombe utilizando los mismos anticuerpos purificados contra los factores TBP y TFIIB. El DNA obtenido, fue sometido a amplificación mediante PCR utilizando partidores específicos para la caja HomolD. Además se realizaron dos controles, uno utilizando partidores que amplificaron parte del promotor y del primer exón del gen nmt1 para la caja TATA como control positivo, y otros para una región del gen de actina (act1) como control negativo. Se observó amplificación del DNA representativo a la caja HomolD, al precipitar cada factor, reflejando la presencia de éstos en la región promotora. Los resultados obtenidos en este trabajo muestran in vitro (EMSA) un efecto potenciador de TBP y TFIIB sobre la formación del complejo Rrn7-caja HomolD, lo que es complementario a la presencia mostrada in vivo (ChIP) de estos factores en el promotor. De estos experimentos se concluye la participación de ambos factores en la formación del complejo de pre-iniciación sobre la caja HomolD. Además los resultados de EMSA indicaron que TFIIB posee un efecto potenciador mayor que TBP a una determinada concentración. Por otro lado, en ensayos EMSA ambos factores produjeron un desplazamiento o retardo de la banda del complejo Rrn7-HomoID, pero el desplazamiento provocado por TBP fue más intenso y estable, a diferencia del de TFIIB que fue solo temporal. Estos resultados sugieren que los roles que cumplen los factores TFIIB y TBP en el PIC en la caja HomolD, son el de un factor reclutador de Rrn7 al promotor y el de un factor potenciador de la interacción proteína-DNA, respectivamente / DNA transcription, the first stage of gene expression, is defined as the conversion of a template DNA to RNA by the enzymatic action of the RNA polymerase (RNAP). In the eukaryotic cells there are three classes of nuclear polymerases (RNAP I, II and III). Each class of RNAP recognizes specific promoters through the formation of pre initiation complexes (PIC) between the polymerase and general transcription factors (GTF). The latter provide the specificity to each PIC. These promoters are relatively conserved DNA sequences that usually are located upstream from the transcriptional start site (TSS), and have all the cis elements needed for the start and regulation of the transcription of a gene. RNAP II promoters are the most studied ones, and are categorized as those that have a TATA box or those that lack a TATA box, called TATA-less promoters. The factors that bind to these promoters are TFIIB, TFIIA and TFIID, among others. The HomolD box is a core promoter element (CPE) that is found in a TATAless type promoter, whose consensus sequence is CAGTCACA. This CPE was discovered in ribosomal protein genes of the fission yeast Schizosaccharomyces pombe, and recruits RNAP II and starts transcription. Recent studies have shown that to start transcription from these RNAP II promoters the GTFs: TFIID, TFIIB, TFIIF, TFIIH and TFIIE are needed. Furthermore, it has been proposed that the Rrn7 factor (formerly known as a member of the RNAP I machinery) interacts with some of these GTFs, for instance with TFIIB and/or TBP (member of the TFIID complex), which could confer Rrn7 the ability to bind the HomolD box and promote transcription. However, it is still unknown which of these factors in addition to Rrn7 conform the PIC that assembles over the HomolD box. In this work the participation of the factors TBP and TFIIB, as candidate members of the PIC formed over the HomolD box, was studied. Using Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) and Chromatin Immunoprecipitation assays (ChIP), DNA-protein and protein-protein interactions were analyzed. To carry out the EMSA studies, it was necessary to express and purify the recombinant Rrn7 protein using a 6xHis tag, which was then used with the factors TBP and TFIIB, also recombinant from S. pombe. Additionally, polyclonal antibodies for both factors were purified and used in EMSA experiments as a control. The EMSA results showed an intensification of the band representative of the complex when each factor was added to the reaction (TBP or TFIIB). ChIP assays were performed in a wild type S. pombe strain, using the same antibodies purified for TFIIB and TBP. The DNA obtained was amplified with PCR using specific primers for the HomolD box. Two controls were carried out, one using primers that amplified part of the promoter and the first exon of the nmt1 gene for the TATA box as a positive control. The other control used primers for a region of the actin gene (act1) as a negative control. When each factor was precipitated, an amplification of the HomolD box sequence, revealing the presence of both factors at the promoter region. Results obtained in this work show in vitro (EMSA) an enhancer effect of TBP and TFIIB on the formation of the Rrn7-HomolD box complex, which is complementary to the presence shown in vivo (ChIP) of these factors in the promoter. From these experiments it is concluded that both factors participate in the formation of the PIC over the HomolD box. Furthermore, the EMSA results indicate that TFIIB has a greater enhancer effect than TBP. On the other side, EMSA assays of both factors produced a shift of the complex Rrn7-HomolD band, but the one produced by TBP was more intense and stable, in comparison with the complex produced by TFIIB, which was temporal and less intense. These results suggest that TFIIB recruits Rrn7 to the PIC and that TBP enhances the interaction between protein and DNA of the PIC at the HomolD box

Memoria para optar el título de Bioquímico / TonEBP es el factor transcripcional de eucariontes responsable de regular la transcripción de genes involucrados en la respuesta al estrés osmótico. Las proteínas codificadas por estos genes permiten la acumulación de osmolitos orgánicos compatibles, tales como sorbitol. Este se genera a partir de glucosa por la acción de aldosa reductasa (AR). Se desconoce si TonEBP está presente en el cardiomiocito neonato como en el adulto y si se regula por cambios en la osmolaridad externa como también por estrés oxidativo. Los resultados inmunocitoquímicos y de Western blot mostraron que basalmente TonEBP y AR están en el citosol y núcleo de manera homogénea en cardiomiocito de rata neonata, sin embargo en cardiomicitos adultos TonEBP y AR basalmente se encuentran sólo en la periferia celular. Cultivos primarios de cardiomiocitos expuestos a estrés hiperosmótico (Sorbitol 600 mOSm) por 8, 16 y 24 h, mostraron un aumento de TonEBP y de su translocación al núcleo. Los niveles de AR y su actividad también aumentaron significativamente a las 8, 16 y 24 h postestímulo. En cambio, los cultivos expuestos a estrés hiposmótico (30% de dilución del medio de cultivo, 202 mOsm), la cantidad de proteína de TonEBP y AR disminuyeron respecto al control y no se detectó actividad de AR. Dado que nuestro laboratorio previamente demostró que el estrés hiperosmótico inducido por sorbitol genera ROS y aumenta los niveles intracelulares de Ca2+, también se estudió sus efectos en la regulación de TonEBP. Los resultados mostraron que la translocación de TonEBP al núcleo es independiente del calcio y que las ROS son necesarias pero no suficiente para su completa activación. Bajo estas últimas condiciones, TonEBP migró al núcleo pero no se activó dado que no aumentaron sus niveles de proteína ni los de su gen blanco AR. En su conjunto, estos resultados sugieren que TonEBP está presente en el cardiomiocito y tanto este factor transcripcional como AR modifican sus niveles y actividad en respuesta a cambios en la osmolaridad externa en forma independiente del calcio. El estrés oxidativo estimuló su translocación al núcleo pero no su activación / The transcription factor TonEBP has been implicated in regulation of gene transcription involved in the response to osmotic stress. These genes allow the accumulation of intracellular organic osmolytes and protect to the cell against hypertonicity, normalizing both cell volume and inorganic ion concentration. Sorbitol, one of these compatible organic osmolytes, is generated from glucose by action of Aldose Reductase (AR). It remains unknown whether TonEBP is present in the neonate and adult cardiac myocytes and if it is regulated by changes in the external osmolality and also by oxidative stress. Both immunofluorescence and Western blot results showed that in basal conditions, TonEBP and AR were localized in the cytosol and nucleus in equal amount of cultured neonatal cardiac myocytes. But in adult rats in basal conditions, TonEBP and AR were localizated only in the external membrane cellular. When these cells were exposed to hyperosmotic stress (Sorbitol 600 mOSm) by 8, 16 and 24 h, TonEBP levels increased and it is translocated to the nucleus. Levels of AR and their activity also increased significantly after 8, 16 and 24 h post-stimulus. However, cells exposed to hyposmotic stress (30% dilution in culture medium, 202 mOsm), the amounts of TonEBP and AR decreased respect to controls and AR activity was not detected. On the other hand, our laboratory has previously shown that hyperosmotic stress induced by Sorbitol generates ROS and induces increase in intracellular calcium levels. We tested whether these variables regulates TonEBP. The results showed that nuclear translocation of TonEBP was independent of calcium but ROS were necessary but not sufficient for a complete TonEBP activation. Under these conditions, TonEBP is translocated to the nucleus but that was not induced and neither increased AR levels. Collectivelly, these results suggest TonEBP is present in cultured cardiac myocytes and response to changes in the external osmolality independent of calcium. Nevertheless oxidative stress was not sufficient for a complete activation of TonEBP

Memoria para optar al Título Profesional de Químico Farmacéutico / La hipertensión arterial es uno de los factores de riesgo cardiovascular más importante en todo el mundo industrializado. En las últimas décadas, la vía de señalización RhoA/ROCK ha mostrado tener un rol clave en la hipertensión arterial al ser responsable de la sensibilización del calcio en células musculares lisas y estimular diversos procesos celulares, entre los que se incluye al crecimiento, diferenciación, proliferación y migración celular entre otros. En este trabajo se planteó como hipótesis que “La vía RhoA/ROCK está sobreactivada en ratas hipertensas, generando una mayor fosforilación de las proteínas Smad2/3 en tejido de aorta, ventrículo izquierdo y riñón, resultado que se ve revertido por la administración de candesartán y/o fasudil”. Los objetivos de este estudio fueron: a) Investigar los efectos antihipertensivos de fasudil y/o candesartan el modelo de hipertensión arterial experimental por sobrecarga de volumen independiente de renina y b) estudiar si fasudil y/o candesartan modifican las formas totales y fosforiladas de Smad2/3 en aorta, ventrículo izquierdo y riñón de ratas hipertensas y controles. Para responder a estos objetivos, ratas Sprague Dawley se uninefrectomizaron y trataron con DOCA (100 mg/kg/semana) más dieta hipersódica (NaCl 1%; KCl 0,4%) por 6 semanas para generar hipertensión arterial por sobrecarga de volumen. Fasudil (50 mg/kg/día) y candesartán (10 mg/kg/día) se administraron por gavage desde la tercera semana de hipertensión. Al término del tratamiento, se determinó presión sistólica y peso corporal. Los animales se sacrificaron, extrayéndose la aorta toraco-abdominal, corazón y riñón. Estos tejidos se pesaron y se almacenaron a -80°C hasta su procesamiento. La fracción soluble de extractos tisulares se utilizaron para separar las proteínas por electroforesis en geles de poliacrilamina-SDS y detectar las formas fosforiladas y totales de Smad2/3 por Western blot. Los resultados mostraron que las ratas experimentaron un aumento del 42% en la presión arterial sistólica debido a la administración de DOCA-sal: 164 vs 118 mmHg. El peso disminuyó significativamente en las ratas Doca-sal mientras que las masas cardiaca y pulmonar relativa aumentaron significativamente (p<0,01). Fasudil y candesartán redujeron la presión arterial significativamente (fasudil: 111 mmHg, candesartán: 125 mmHg). Sin embargo, no se observó sinergia al asociar fasudil con candesartán. Solo candesartán pero no fasudil atenuaron el efecto de la hipertensión arterial sobre el peso corporal y las masas cardiaca y pulmonar relativas. Por otro lado, los niveles de las formas fosforiladas de Smad2/3 no cambiaron por acción de la administración DOCA/sal ni tampoco por efectos de fasudil o candesartán ni ambos lograron disminuir la fosforilación de Smad2/3 en aorta, ventrículo izquierdo y riñón. Los niveles de relativos de las formas totales de Smad2/3 tampoco se modificaron en estos grupos y tejidos, excepto en riñón (p<0,05). Se concluye de este trabajo de tesis que fasudil y candesartán redujeron el aumento de la presión arterial inducida por la administración de DOCA/sal, pero su asociación no logró un efecto sinérgico. Candesartán pero no fasudil atenuó la hipertrofia cardiaca inducida por la sobrecarga de presión. Los factores transcripcionales Smad2/3 no se activan en este modelo de hipertensión experimental ni tampoco por acción de fasudil o candesartán en los tejidos blancos estudiados / The arterial hypertension is one the most important cardiovascular risk factor in the industrialized world. In the last decades, the RhoA/ROCK signaling pathway has a key role in the arterial hypertension. This pathway is responsible for calcium sensitization in smooth muscle cells but it also regulate cell growth, differentiation, proliferation and migration in these cells. We hypothesized here that “The RhoA/ROCK pathway is upregulated in hypertensive rats, promoting and activation of Smad2/3 transcription factor in aorta, left ventricle and kidney, effect that is prevented by fasudil and/or candesartan”. The specific aims were: a) To investigate the effect of fasudil and/or candesartan on systolic blood pressure and cardiac hypertrophy in an experimental renin-independent hypertension model. b) To study if fasudil and/or candesartan modify total and phosphorylated Smad2/3 levels in aorta, left ventricle and kidney in hypertensive and control rats. To this end, Sprague Dawley rats were uninephrectomized and treated with DOCA (100 mg/kg/week) and NaCl 1%; KCl 0.4% for 6 weeks to develop hypertension induced by volume overload. Fasudil (50 mg/kg/day) and candesartan (10 mg/kg/day) were administrated by gavage since third week of hypertension. At end of treatment, systolic pressure and body weight were measured. The animals were sacrified, and toraco-abdominal aorta, heart and kidney were obtained, weighted and stored at -80°C until processing. Protein from soluble tissue fraction were resolved polyacrylamide-SDS electrophoresis and total and phosphorylated Smad2/3 levels were determined by Western blot. The results showed that the DOCA-salt administration induced a 42% increase in systolic blood pressure and a significantly decreased in body weight. Relative cardiac and pulmonary mass were significantly increased (p<0,01) in DOCA-salt treated rats. Fasudil and candesartan decreased systolic blood pressure significantly. However any synergistic effect was observed by fasudil-candesartan coadministration. Only candesartan but not fasudil prevented the increase in systolic blood pressure induced by DOCA/salt and in the relative cardiac and pulmonary mass. Both total and phosphorylated Smad2/3 levels did not change by the DOCA-salt administration or by fasudil or candesartan in the studied tissues Total Smad2/3 protein levels did not change by effect of hypertension, fasusil or candesartan , except in kidney (p<0,05). In summary, fasudil and candesartan prevented hypertension induced by DOCAsalt administration butany synergistic effect was observed between both drugs. Candesartan but not fasudil attenuated cardiac hypertrophy induced by volume overloadhypertension. The Smad2/3 transcriptional factors were not activated in the studied tissues using this experimental hypertension model and neither fasudil or candesartan

Memoria para optar al título profesional de Bioquímico / El cáncer ovárico epitelial (COE) es el cáncer ovárico más común, siendo en Chile la segunda causa de muerte por neoplasias ginecológicas. Un aspecto importante para la mantención y progresión tumoral es el establecimiento de nueva vasculatura. En COE, NGF y su receptor TRKA son mediadores directos de angiogénesis in vitro, e indirectos al inducir la expresión y secreción de VEGF. El factor transcripcional RUNX2 induce procesos oncogénicos como proliferación, migración e invasión celular. Adicionalmente, se cree que RUNX2 puede ser un mediador de angiogénesis tumoral, ya que en varios modelos de cáncer promueve la expresión de VEGF y sus niveles proteicos se incrementan en hipoxia. En COE, RUNX2 los niveles se relacionan con mal pronóstico y en modelos in vitro promueve proliferación, migración e invasión en células de cáncer ovárico, sin embargo, no existen estudios que busquen vincularlo con angiogénesis en este cáncer. Hipótesis: En cáncer ovárico epitelial se produce un aumento en los niveles de RUNX2, y en la línea celular A2780 de cáncer ovárico sus niveles son incrementados por los factores proangiogénicos NGF e hipoxia cuando se comparan con la línea celular HOSE de epitelio superficial ovárico normal. Objetivos: Establecer si RUNX2 se expresa en cáncer ovárico epitelial, si sus niveles se incrementan con la progresión de la transformación maligna del epitelio ovárico, y determinar si en el modelo de líneas celulares, RUNX2 es aumentado por las condiciones proangiogénicas de hipoxia y estímulo con NGF. Metodología: Se evaluaron los niveles proteicos de RUNX2 en tejidos ováricos (OVI, ovario normal inactivo; TBE-TBO, tumores ováricos Benignos y Borderline; y COE) mediante Western Blot, y a través de inmunohistoquímica se determinó el % células positivas con RUNX2 nuclear. En las líneas celulares HOSE y A2780 se evaluaron los niveles proteicos de RUNX2 en extractos totales y en fracciones subcelulares mediante Western Blot, y su localización subcelular mediante inmunocitoquímica. Adicionalmente, se realizaron estímulos con NGF, CoCl2 y ensayos de hipoxia en ambas líneas celulares, para posteriormente determinar los niveles proteicos de RUNX2 y HIF-1α por Western Blot. Resultados: Se determinó que los tejidos ováricos correspondientes a TBE-TBO y COE presentaron un mayor porcentaje de células positivas para RUNX2 nuclear respecto a lo observado en OVI. Por otro lado, ambas líneas celulares, HOSE y A2780, presentaron RUNX2 con localización principalmente nuclear, mostrando la línea HOSE niveles más altos respecto a la línea A2780. Los estímulos con NGF y CoCl2 no modificaron los niveles proteicos de RUNX2 en las líneas celulares en las condiciones analizadas. Por otra parte, se determinó que en la línea celular HOSE los niveles de RUNX2 disminuyen durante hipoxia, manteniéndose constantes los de HIF-1α. En el caso de las células A2780, no se observaron cambios en los niveles de las proteínas RUNX2 y HIF-1α en condiciones de hipoxia. Conclusiones: El presente trabajo permite concluir que los tejidos transformados de epitelio ovárico poseen un alto porcentaje de células con RUNX2 nuclear. Consistente con esto, la línea celular A2780 presenta altos niveles de RUNX2 en el núcleo, sugiriendo estos antecedentes un rol de RUNX2 en COE. Por otro lado, en las condiciones evaluadas, NGF e hipoxia no produjeron cambios en los niveles de RUNX2 en las líneas celulares. Proyección: Es necesario realizar nuevos ensayos para determinar con certeza si las condiciones proangiogénicas de NGF e hipoxia pueden inducir angiogénesis a través de RUNX2 en COE. En el caso de NGF es necesario evaluar si este puede influenciar la actividad transcripcional de RUNX2, y en el caso de hipoxia, se requiere modificar las condiciones experimentales para determinar con mayor seguridad si la restricción de oxígeno afecta los niveles de RUNX2 / Epithelial ovarian cancer (COE) is the most common ovarian cancer, being Chile the second cause of death due to gynecological neoplasias. An important aspect for tumor maintenance and progression is the establishment of new vasculature. In COE, NGF and its TRKA receptor are direct mediators of in vitro angiogenesis, and indirectly by inducing VEGF expression and secretion. RUNX2 transcriptional factor induces oncogenic processes such as cell proliferation, migration and invasion. In addition, it is believed that RUNX2 may be a mediator of tumor angiogenesis, since in several cancer models it promotes the expression of VEGF and its protein levels increase in hypoxia. In COE, RUNX2 levels are related to poor prognosis and in vitro models promote proliferation, migration and invasion in ovarian cancer cells, however, there are no studies that seek to link it with angiogenesis in this cancer. Hypothesis: In epithelial ovarian cancer there is an increase in RUNX2 levels, and in the A2780 cell line of ovarian cancer their levels are increased by the proangiogenic factors NGF and hypoxia when compared to the HOSE cell line of normal ovarian surface epithelium. Objective: To establish whether RUNX2 is expressed in epithelial ovarian cancer, if its levels increase with the progression of malignant transformation of ovarian epithelium, and to determine if RUNX2 is increased in the cell lines model by the proangiogenic conditions of hypoxia and stimulation with NGF. Methods: RUNX2 protein levels in ovarian tissues (OVI, normal ovary, TBE-TBO, Benign ovarian tumors and Borderline, and COE) were evaluated by Western Blot, and by means of immunohistochemistry the percentage of RUNX2 nuclear positive cells was determined. In the HOSE and A2780 cell lines the protein levels of RUNX2 in total extracts and subcellular fractions were evaluated by Western Blot, and its subcellular localization by immunocytochemistry. Additionally, stimuli were performed with NGF, CoCl2 and hypoxia assays in both cell lines, to later determine the protein levels of RUNX2 and HIF-1α by Western Blot. Results: It was determined that the ovarian tissues corresponding to TBE-TBO and COE presented a higher percentage of RUNX2 nuclear positive cells than observed in OVI. On the other hand, both cell lines, HOSE and A2780, presented RUNX2 with mainly nuclear localization, showing the line HOSE levels higher than the line A2780. The stimuli with NGF and CoCl2 did not modify the protein levels of RUNX2 in the cell lines in the conditions analyzed. On the other hand, it was determined that in the HOSE cell line the levels of RUNX2 decrease during hypoxia, keeping those of HIF-1α constant. In the case of A2780 cells, no changes were observed in the levels of the RUNX2 and HIF-1α proteins under conditions of hypoxia. Conclusions: The present work concludes that the transformed tissues of ovarian epithelium possess a high percentage of cells with nuclear RUNX2. Consistent with this, the A2780 cell line presents high levels of RUNX2 in the nucleus, suggesting this background a RUNX2 role in COE. On the other hand, under the conditions evaluated, NGF and hypoxia did not produce changes in the RUNX2 levels in the cell lines. Projection: Further testing is required to determine with certainty whether the proangiogenic conditions of NGF and hypoxia may induce angiogenesis tHRPough RUNX2 in COE. In the case of NGF it is necessary to evaluate if this can influence the transcriptional activity of RUNX2, and in the case of hypoxia, it is necessary to modify the experimental conditions to determine more safely if the oxygen restriction affects RUNX2 levels / Fondecyt

Magister en biomedicina celular y molecular / En Chile la incidencia y mortalidad del cáncer de próstata (CaP) está aumentado, siendo actualmente la segunda causa de muerte por cáncer en hombres. Durante la progresión tumoral las células epiteliales disminuyen sus moléculas de adhesión, polaridad, posicionamiento, reordenan su citoesqueleto y aumentan sus capacidades migratorias e invasivas. Todos estos cambios se conocen bajo el concepto de Transición Epitelio-Mesénquima (TEM). La TEM se caracteriza por el aumento de ciertos factores transcripcionales, tales como SNAIL1, que reprime genes característicos de un fenotipo epitelial, como E-cadherina, y aumenta indirectamente la expresión de genes que promueven el fenotipo mesenquimático. Se propone que el factor transcripcional SNAIL1 disminuye la proliferación y aumenta las capacidades migratorias e invasivas en líneas celulares de CaP. Para ello se trabajó con las líneas celulares LNCaP y PC3 con expresión ectópica y silenciamiento de SNAIL1 obtenidas mediante el uso de vectores lentivirales. Se caracterizó la expresión de marcadores de TEM mediante PCR en tiempo real, western blot e inmunofluorescencia. Además, se analizó la sobrevida mediante MTS; proliferación utilizando anticuerpos contra PCNA y Ki-67; migración a través de placas con poros de 8 μm (que permiten el paso de células) e invasividad mediante cámaras de membranas cubiertas con una capa de membrana basal. Complementariamente se determinó la apoptosis mediante un kit que contiene un sustrato que es modificado por las caspasas 3 y 7. Se determinó que ambas líneas celulares de CaP con sobreexpresión y silenciamiento de SNAIL1 la proliferación y sobrevida disminuyen. Sin embargo, la sobreexpresión de SNAIL1 disminuye la apoptosis respecto a las células con silenciamiento de la expresión de éste gen, en las cuales aumenta la muerte celular. Respecto a las capacidades migratorias e invasivas, aumentaron sólo en las células con sobreexpresión de SNAIL1 y disminuyeron en las células con silenciamiento. En conclusión, células de CaP con sobreexpresión de SNAIL1 exhibieron características fenotípicas tipo TEM, mientras que el silenciamiento de éste represor transcripcional condujo a las células a un fenotipo tipo epitelial con la disminución de características mesenquimales como la migración e invasión. / FONDECYT No 1110269

TonEBP, la proteína que se une al elemento regulatorio que responde a tonicidad “TonE” es el único factor transcripcional conocido de eucariontes que responde a cambios de la osmolaridad extracelular. Este factor transcripcional pertenece a la familia Rel, al igual que NFAT1-5 y NFκB. TonEBP también se conoce como NFAT5 y se ha asociado al mecanismo de adaptación celular a condiciones de hiperosmolaridad, regulando la expresión de genes que codifican para aldosa reductasa y para los transportadores de taurina, mio-inositol y betaina. Todas estas proteínas regulan los niveles de osmolitos intracelulares compatibles asociados al control del volumen celular. El corazón es un órgano que normalmente no está sujeto a cambios osmóticos excepto durante isquemia-reperfusión, coma diabético y shock séptico. La capacidad de regular el volumen celular se ha vinculado a la sobrevida celular en condiciones de estrés hiperosmótico. Por lo tanto, la capacidad de las células cardíacas de regular el volumen celular, podría ser un factor de sobrevida en patologías como el infarto al miocardio. En nuestro Laboratorio, se describió previamente que TonEBP está presente en los cardiomiocitos y que responde al estrés hiperosmótico. Además, se demostró que el estrés hiperosmótico induce la masa y la actividad de aldosa reductasa con acumulación intracelular de sorbitol, y que la muerte inducida por estrés hiperosmótico es mediada por esta enzima. La activación de TonEBP induce un aumento de los niveles y actividad de aldosa reductasa que mediaría la muerte de los cardiomiocitos inducida por estrés hiperosmótico. Sin embargo, ratones knock out para TonEBP muestran una severa atrofia de su médula renal, incremento de la sensibilidad de sus timocitos al estrés hiperosmótico e incremento de la fragmentación del DNA en células de la fibra del lente, indicando que TonEBP tendría un efecto protector frente al daño inducido por estrés hiperosmótico. Por lo tanto, de estos resultados se deduce que existiría una contradicción entre los datos descritos en la literatura y nuestros hallazgos sobre el papel de TonEBP en la sobrevida celular. La hipótesis de la presente tesis es “TonEBP media la adaptación del cardiomiocito a la hiperosmolaridad generada por isquemia cardiaca”. Los objetivos específicos son: • Caracterizar el mecanismo de muerte inducida por estrés osmótico. • Determinar si el factor de transcripción TonEBP se activa bajo condiciones de isquemia cardiaca in vivo e in vitro. • Determinar el efecto directo de TonEBP en la viabilidad del cardiomiocito. • Evaluar si TonEBP protege a los cardiomiocitos de la muerte inducida por hiperosmolaridad Como modelo experimental se utilizaron cultivos primarios de cardiomiocitos de ratas neonatas expuestos a estrés hiperosmótico en presencia y en ausencia de la sobreexpresión adenoviral de TonEBP tipo silvestre (wtTonEBP) o TonEBP dominante negativo (dnTonEBP). Además se utilizaron modelos experimentales de infarto al miocardio por ligación de la arteria coronaria descendente anterior y de sobreexpresión in vivo de wtTonEBP y dnTonEBP por transducción intracardíaca de adenovirus. El estrés hiperosmótico indujo muerte de los cardiomiocitos por un mecanismo que involucra aumento entrada de Ca2+ a través de un canal de Ca2+ tipo L, aumento de los niveles citoplasmáticos y mitocondriales de Ca2+, depolarización de la mitocondria y reducción de los niveles intracelulares de ATP. Además se detectó liberación de citocromo c pero no del factor inductor de apoptosis (AIF), desde la mitocondria, con activación secuencial de procaspasa 9 y procaspasa 3. Sin embargo, se determinó que la muerte de los cardiomiocitos inducida por sorbitol 600 mOsm correspondía a una apoptosis independiente de caspasas, ya que el pretratamiento con el inhibidor general de caspasas Z VAD fmk, no previno la muerte inducida por estrés hiperosmótico. En un modelo de infarto al miocardio se detectó un aumento de los niveles proteicos de TonEBP en el sitio vecino al infarto a los 2 días post cirugía. Este mismo aumento se detectó en cultivos in vitro de cardiomiocitos sometidos a 30 o 60 min de isquemia simulada seguida de 4 u 8 h de reperfusión. Estos resultados sugieren que la isquemia induce a TonEBP. Debido a que no existen inhibidores y/o activadores farmacológicos para TonEBP se construyeron adenovirus que sobrexpresaban wtTonEBP (Ad wtTonEBP) y dnTonEBP (Ad dnTonEBP). Determinando los niveles proteicos de aldosa reductasa, un blanco transcripcional de TonEBP, se demostró que ambos adenovirus eran funcionales en cardiomiocitos. Estos experimentos demostraron que la sobreexpresión de wtTonEBP aumentó los niveles proteicos de â-actina en forma dependiente de la dosis viral mientras que disminuyó los niveles de la cadena pesada de la β-miosina (β-MHC). La sobreexpresión del dnTonEBP tuvo un efecto contrario al wtTonEBP en los niveles proteicos de β-actina y β-MHC. El aumento de los niveles proteicos de βctina inducida por la sobreexpresión de wtTonEBP se acompañó de una reorganización del citoesqueleto de actina, visualizada por inmunocitoquímica usando faloidina-rodamina. La sobreexpresión de wtTonEBP, pero no de dnTonEBP, indujo muerte de los cardiomiocitos, principalmente por necrosis. Los niveles de necrosis dependieron del nivel de sobreexpresión de wtTonEBP y del tiempo de transducción adenoviral. La transducción adenoviral por inoculación intracardíaca de Ad wtTonEBP y Ad dnTonEBP mostró que Ad dnTonEBP indujo mortalidad en 3 de los 8 animales transducidos, efecto que no se detectó en ratas transducidas con Ad wtTonEBP y Ad LacZ (control). Este resultado sugiere que TonEBP cumpliría alguna función importante en el corazón. Utilizando una multiplicidad de infección de 1000, dosis viral que no inducía muerte celular, se mostró que la sobreexpresión de tanto de wtTonEBP como del dnTonEBP no protegieron a los cardiomiocitos de la muerte inducida por estrés hiperosmótico. La sobreexpresión de ambas proteínas tampoco indujo un cambio en el mecanismo de muerte, apoptosis o necrosis, inducida por estrés hiperosmótico. Se determinó que la muerte inducida por sobreexpresión de wtTonEBP no dependía de la sobreactivación de aldosa reductasa, ya que un inhibidor específico de aldosa reductasa, zopolrestat, no atenuó la muerte inducida por Ad wtTonEBP. Esta muerte tampoco se asemejó al colapso metabólico detectado al someter a los cardiomiocitos a sorbitol 600 mOsm, ya que no se observó disminución de los niveles intracelulares de ATP. Finalmente, los datos obtenidos en esta tesis permiten concluir que el infarto o la isquemia/reperfusión in vitro induce a TonEBP, pero la sobreexpresión de este factor transcripción no está asociada con la protección de los cardiomiocitos al estrés hiperosmótico, sino más bien es un inductor de muerte celular por necrosis.

Memoria para optar al título de Bioquímico / El uso de elevadas dosis de testosterona produce hipertrofia cardiaca, sin embargo los mecanismos celulares no son completamente entendidos. La proteína quinasa GSK3-β (glycogen synthase kinase 3-β) es una quinasa que regula una amplia gama de procesos celulares como la síntesis proteica y actividad de factores transcripcionales, siendo el factor nuclear de células T activadas, NFAT, uno de los más importantes. La GSK3-β ha sido descrita como el principal regulador anti-hipertrófico celular. En este trabajo se estudió si los efectos hipertróficos de la testosterona son mediados, en parte, por la actividad de la vía de transducción de señales GSK3-β/NFAT en cultivo primario de cardiomiocitos de rata neonata. Los resultados muestran que dosis de testosterona que provocan la hipertrofia del cardiomiocito (100 nM) inducen el aumento la fosforilación de GSK3-β, determinado mediante western blot. GSK3-β puede ser fosforilada a través de las vías de señalización intracelulares PI3K/Akt y ERK1/2. En nuestro laboratorio hemos descrito que la testosterona activa ambas vías. Para evaluar si estas quinasas modulan la actividad de GSK3-β se utilizaron inhibidores específicos para ERK1/2 (PD98059), PI3K (LY294002) y Akt (Akt-inhibitor-VIII). La inhibición de la PI3K o de Akt bloqueó la fosforilación de GSK3-β inducida por testosterona, mientras que la inhibición de ERK1/2 no tuvo efectos significativos, lo que sugiere que la vía PI3K/Akt está involucrada en la inhibición de la GSK3-β. El mecanismo de acción de la testosterona involucra la unión de la hormona al receptor intracelular para andrógenos (AR). Para evaluar la contribución del AR en la inhibición de la GSK3-β, los cardiomiocitos fueron pre-incubados con ciproterona, un inhibidor del AR. La inhibición del AR no provocó cambios en el aumento de la fosforilación de la GSK3-β, lo que sugiere que el AR no participa en la inhibición de la GSK3-β inducida por testosterona. Para determinar los efectos de la testosterona sobre los principales efectores río abajo de la GSK3-β se evaluó tanto el cambio en el estado de fosforilación del eIF2Bε y el cambio en la actividad de NFAT. La estimulación de los cardiomiocitos con la hormona disminuyó la fosforilación de eIF2Bε, lo que se asocia al aumento de su actividad traductora y aumento de la síntesis proteica. Además, utilizando el inhibidor específico de GSK3-β, 1-Azakenpaulona (1-Azk), se indujo la desfosforilación de eIF2Bε, lo que sugiere que la inhibición de GSK3-β modula la activación del factor eIF2Bε inducida por testosterona. Por otra parte, la testosterona aumento la actividad transcripcional de NFAT, medida como actividad luciferasa. Al estimular con testosterona cardiomiocitos tratados con diferentes dosis de 1-Azk se observa un efecto aditivo sobre la activación de NFAT-luc, lo que sugiere una relación entre la inhibición de la GSK3-β y el incremento de la actividad de NFAT inducida por testosterona. La testosterona aumentó el tamaño celular y la expresión de la cadena pesada de la β-miosina (β-MHC) y la α-actina esquelética (SKA), considerados como parámetros hipertróficos. El tratamiento con el inhibidor de NFAT, ciclosporina A (CsA, 1 μM), evitó el aumento en del área célula inducido por testosterona. Además, el bloqueo del receptor para IP3 inhibió el aumento de los marcadores de hipertrofia β-MHC y SKA, lo que en conjunto sugiere que la vía Cn/NFAT participaría en la hipertrofia de la célula cardiaca inducida por testosterona. Por otra parte, el uso de 1-Azk por sí sólo incrementó ambos parámetros hipertróficos, lo que sugiere que la inhibición de la GSK3-β participaría en la hipertrofia del cardiomiocito. El tratamiento en conjunto con testosterona y 1-Azk no incremento los efectos hipertróficos de la hormona, lo que se podría deber a que la célula cardiaca en cultivo primario crece hasta un límite definido. La evidencia experimental de este trabajo sugiere que la testosterona induce la inhibición de GSK3-β a través de la vía PI3K/Akt, lo que se traduce en un aumento de la actividad de NFAT y de eIF2Bε. Además, la inhibición de NFAT bloquea la hipertrofia inducida por testosterona. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que la vía GSK3-β/NFAT podría participar en la hipertrofia del cardiomiocito inducida por la testosterona / Elevated doses of testosterone produce cardiac hypertrophy. However, the cellular mechanisms are not fully understood. The GSK3-β (glycogen synthase kinase 3-β) is a protein kinase that regulates several cellular processes like protein synthesis and transcription factors activity. Moreover, this kinase has been described as an anti-hypertrophic regulator. In this study we examined whether the hypertrophic effects of testosterone are mediated, in part, by GSK3-β in primary cultures of neonatal rat cardiomyocytes. The results from this study show that hypertrophic testosterone concentrations (100 nM) increased GSK3-β phosphorylation. GSK3-β can be phosphorylated by upstream signaling pathways as PI3K/Akt and ERK1/2. Previously, we have described that testosterone activates both signaling pathways. To evaluate the contribution of these kinases on GSK3-β activity specific inhibitors for ERK1/2 (PD98059), PI3K (LY294002) and Akt (Akt-inhibitor-VIII) were used Inhibition of either PI3K or Akt completely blocked the GSK3-β phosphorylation induced by testosterone, while inhibition of ERK1/2 had no effect, suggesting that PI3K/Akt pathway is involved in the inhibition of GSK3-β. Testosterone exerts most effects through the direct binding to specific intracellular androgen receptor (AR). To assess the contribution of AR in the GSK3-β inhibition, cardiomyocytes were prei-ncubated with cyproterone an inhibitor of AR. Inhibition of AR did not modifies testosterone-induced GSK3-β phosphorylation, suggesting that the AR is not involved in this event. To determine the effects of testosterone on the main downstream GSK3-β effectors both eIF2Bε phosphorylation and NFAT activity were determined. The hormone decreased eIF2Bε phosphorylation which is associated with translation activity and protein synthesis increase. Moreover, testosterone increased NFAT transcriptional activity, which is associated with gene expression. The specific inhibitor of GSK3-β, 1-Azakenpaullone (1-Azk), induced both eIF2Bε dephosphorylation and increase in the NFAT activity. In cardiomyocytes treated with 1-Azk, testosterone produced eIF2Bε activation and NFAT over-activation. Testosterone increased cell size and expression of β-MHC and SKA, both hypertrophic parameters. Treatment with the upstream NFAT phosphatase calcineurin (Cn) inhibitor cyclosporin A (CsA, 1 mM) prevented the cell area increase induced by testosterone. Furthermore, the IP3 receptor (IP3R) blockade inhibited the increase of β-MHC and SKA, which together suggest that the IP3R/Cn/NFAT pathway modulates the cardiac cell hypertrophy. Moreover, 1-Azk alone increased both hypertrophic parameters, showing that GSK3-β is involved in cardiomyocyte hypertrophy. The combined treatment of testosterone and 1-Azk did not increase the hypertrophic effects on cardiomyocytes, suggesting that cardiac cell grows until a defined limit. Experimental evidence of this work suggests that testosterone induces the inhibition of GSK3-β through the PI3K/Akt pathway, resulting in an increase in the activity of NFAT and eIF2Bε. Furthermore, inhibition of NFAT blocks testosterone-induced hypertrophy. Taken together, these results suggest that the GSK3-β/NFAT pathway is involved in cardiomyocyte hypertrophy induced by testosterone

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La capacidad de las leguminosas de establecer una asociación simbiotica con bacterias de suelo es de fundamental importancia para la incorporación de nitrógeno a los ecosistemas, particularmente en sistemas agronómicos. En el presente trabajo de tesis se estudió la dinámica de la asociación de transcriptos (mRNAs) y miRNAs a complejos traduccionales durante las etapas tempranas de la simbiosis. Para ello, inicialmente, se puso a punto de la técnica de purificación por afinidad de ribosomas y polisomas (TRAP) en Medicago truncatula. Se cuantificó la variación de los niveles de asociación a polisomas de quince mRNAs en respuesta a la inoculación con su simbionte Sinorhizobium meliloti. Se identificó un grupo de genes, cuyos mRNAs no varían significativamente a nivel de abundancia celular, pero que se regulan positivamente a nivel de su asociación a polisomas en respuesta al rizobio. Este grupo incluyó genes que codifican receptores de tipo quinasas requeridos para la infección bacteriana o la organogénesis del nódulo y factores de transcripción de la familia GRAS y NF-Y. Posteriormente, se evaluaron los niveles de asociación a polisomas de los mRNAs seleccionados en los tejidos específicos de la raíz involucrados en la formación de nódulos: epidermis, córtex y floema. Este análisis permitió identificar mRNAs que se asocian diferencialmente a polisomas en los distintos tipos celulares durante las etapas tempranas de la simbiosis. Por otro lado, se evaluó la presencia de pequeños RNAs (sRNAs) en los complejos traduccionales purificados mediante TRAP. Los sRNAs seleccionados, incluyendo miRNAs de 21 y 22 nts y tasiRNAs, se encontraron asociados a complejos traduccionales. En particular, los niveles de miR169 presentes en polisomas disminuyeron significativamente en respuesta a la inoculación. Esta dismunución se vió acompañada de un incremento en la asociación a polisomas de su gen blanco, NF-YA1, y de los niveles de la proteína en las raíces inoculadas. Estos resultados indican que tanto los mRNAs como los miRNAs estarían sometidos a un reclutamiento diferencial a polisomas y expone la importancia de la traducción selectiva durante la simbiosis. La extensión de la técnica TRAP a M. truncatula abre la posibilidad de profundizar este nivel de regulación tanto a nivel de raíz completa como de tipos celulares específicos en asociaciones simbióticas como la nodulación y la micorrización arbuscular. El presente trabajo de tesis contribuye a sustentar la relevancia de los niveles de regulación post-transcripcional en los cambios de la expresión génica que ocurren durante el establecimiento de una asociación simbiótica de importancia ecológica y agronómica.