Memoria para optar al título profesional de Bioquímico / El daño oxidativo en proteínas es considerado una de las principales consecuencias del envejecimiento celular y de enfermedades crónicas asociadas a la edad. La oxidación de metionina a metionina sulfóxido (MetO), a diferencia de otras modificaciones oxidativas, puede ser reparada por la enzima Metionina sulfóxido reductasa A (MsrA). Numerosos estudios muestran que la expresión de esta enzima se relaciona con resistencia a estrés oxidativo y longevidad, sin embargo se desconocen los mecanismos involucrados en su regulación. El análisis de una región de 2000 pb del promotor de la MsrA, permitió identificar posibles sitios de reconocimiento de factores transcripcionales relacionados con respuesta a estrés oxidativo y longevidad, entre los cuales se identificaron dos sitios de unión a FOXO3A, factor descrito como regulador central de vías de longevidad y de respuestas frente a estrés oxidativo. Un análisis comparativo entre diferentes organismos permitió determinar que estas secuencias FOXO son conservadas en los promotores de enzimas homólogas a la MsrA, lo que sugiere fuertemente que este factor podría ser un regulador de esta enzima. En este estudio se utilizaron líneas celulares transfectadas con el gen reportero luciferasa, acoplado a distintos fragmentos de la región 5’ no codificante del gen msrA humano (2000, 1408 y 260 pb). Los resultados mostraron que en presencia de FOXO3A la actividad promotora de la MsrA aumenta significativamente, y que al mutar el sitio FOXO ubicado a -920 pb del inicio de la traducción de la MsrA, la activación por este factor transcripcional disminuye significativamente en un 50%. Se evaluó también otros posibles estímulos externos que podrían activar al promotor de la MsrA. Para ello, cultivos celulares transfectados con la construcción de 2000 pb del promotor, fueron tratados conjuntamente con peróxido de hidrógeno y el antioxidante resveratrol, lo que produjo un aumento en la actividad del promotor, efecto independiente a la activación por FOXO3A. / Oxidative damage, in particular the protein oxidative damage is considered one of the main consequences of cellular ageing and age-related chronic diseases. The oxidation of methionine to methionine sulphoxide (MetO) unlike other oxidative modifications can be repaired by the enzyme Methionine sulphoxide reductase A (MsrA). Numerous studies show that the expression of this enzyme is related with resistance to oxidative stress and life span, however the mechanisms involved in the regulation of this expression are unknown. Analysis of the putative promoter region of the human MsrA, consisting of 2000 bp, allowed to identify different transcription factor recognition sites related with oxidative stress responses and longevity. Among these, two binding sites for FOXO3A, a binding factor recognized as a central regulator in longevity pathways and oxidative stress responses were identified. A comparative analysis between different organisms showed that these FOXO3A sequences are conserved in the promoters of homologous enzymes of MsrA, strongly suggesting that this factor could be a regulator of the enzyme. In this study, cell lines were transfected with a luciferase reporter gene linked to different fragments of the 5’ non coding region of the human msrA gene (2000, 1408, and 260 pb). The results showed that in the presence of FOXO3A, the promoter activity of MsrA increases significantly, and when the FOXO site located at -920 pb of the translation start site of the MsrA is mutated, the activation by this factor significantly decreased ed by 50%. Other possible stimuli of the MsrA promoter were evaluated. Cellular cultures transfected with the previously described construction of 2000 pb, were treated with hydrogen peroxide and the antioxidant Resveratrol; an increase in the activity of the promoter was observed, independent from the activation by FOXO3A.

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Memoria para optar al título Profesional de Bioquímico / El desarrollo embrionario en vertebrados es coordinado por una red de señales y factores de crecimiento que comandan diferentes procesos celulares. Sonic Hedgehog (SHH), es un ligando considerado como un regulador maestro que dirige los procesos de proliferación celular, migración, apoptosis, sobrevida y diferenciación celular. SHH es liberado al medio y una vez que llega a su célula blanco, ésta activa una compleja vía de señalización intracelular, que finalmente, moviliza a los factores transcripcionales Gli. Estos últimos activan la expresión de genes blanco de la vía reconociendo secuencias específicas en el ADN llamadas GBS (del inglés “Gli Binding Site”). Además, se sabe que una desregulación en la vía de SHH/Gli puede llevar al desarrollo de cáncer, como ocurre en los casos del meduloblastoma y el cáncer de células basales de la piel, entre otros. Recientemente, por resultados obtenidos en el laboratorio, se estableció que en los modelos de ratón y pez cebra, el gen neogenina 1 es un blanco transcripcional de la vía SHH/Gli. Considerando la conservación evolutiva de la vía de SHH/Gli y la característica multifuncional de la proteína Neogenina 1, un receptor de membrana que responde a diferentes ligandos, sumado a su reciente implicancia en cáncer, se planteó estudiar a Neogenina 1 como un nuevo blanco transcripcional directo de la vía SHH/Gli, en un modelo celular de neuroblastoma humano, una patología donde se sabe que la vía está activada. En ensayos de pérdida de función farmacológica de SHH realizados en cultivos celulares de neuroblastoma humano, se observó que la expresión de Neogenina 1 disminuía de manera dosis dependiente. A partir de este resultado, se realizó un análisis in silico que determinó la existencia de tres posibles GBS en la secuencia de Neogenina 1: GBS 1 ubicado a los 18,6 Kb río arrida desde el inicio de la traducción, GBS 2 y GBS 3, localizados dentro del primer intrón, a 39,1 y 54,4 Kb desde el inicio de la traducción, respectivamente. Luego, se estudió el reconocimiento y la unión de factores transcripcionales Gli a los posibles GBS mediante ensayo de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) en células de neuroblastoma. Sólo el sitio GBS 3 fue reconocido por Gli 2. Finalmente, para evaluar la funcionalidad de los GBS encontrados en Neogenina 1, éstos se clonaron río arriba del gen reportero luciferasa. Concordante con el resultado del ChIP, sólo el sitio GBS 3 activó la expresión de luciferasa en respuesta a la activación con Gli 2. Por lo tanto, este trabajo de tesis permite establecer a Neogenina 1 como un nuevo gen blanco transcripcional directo de la vía SHH/Gli en modelo celular de neuroblastoma humano. Con esto, se pretende aportar al entendimiento de los mecanismos celulares que hacen a SHH contribuir en procesos tan diversos durante el desarrollo embrionario y que probablemente subyacen al desarrollo de cáncer. / The patterning and growth of a multicellular embryo is orchestrated by a number of developmental signaling pathways, such as the Sonic Hedgehog (SHH) signaling pathway. SHH is considered a master regulator controlling a variety of complex processes such as proliferation, cellular migration, apoptosis, differentiation and cellular survival. SHH is secreted by a group of specialized cells and once reaching its receptors in targets cells, activates a complex intracellular signaling pathway that finally mobilizes the Gli transcriptional factors. These factors move to the nucleus and recognize specific sequences in the DNA known as Gli Binding Sites (GBS), activating the transcription of their target genes. It is known that a deregulation of the SHH pathway drives the development of several cancers, like medulloblastoma and basal cell carcinoma. Recently our laboratory established neogenin 1 as a transcriptional target of the SHH/Gli pathway both in the mouse and zebra fish models. Considering the evolutionary conservation of de SHH/Gli pathway and the multifunctional properties of Neogenin 1, a transmembrane receptor that binds different ligands, and that has been implicated in cancer, we proposed to study human Neogenin 1 gene as a new and direct transcriptional target of the SHH/Gli pathway using a human cell line of neuroblastoma, a cancer where this pathway is constitutively active. In pharmacological SHH-loss of function assays made in neuroblastoma cell cultures, we observed that Neogenin 1 expression was decreased in a dose-dependent manner. Based on this result, we performed an in silico analysis that showed the presence of three putative GBS in the Neogenin 1 sequence: GBS 1, located 18.6 Kb upstream from the translation start, and GBS 2 and GBS 3, which were located within the first intron, 39.1 Kb and 54.4 Kb from the translation start, respectively. Next, we studied the Gli transcriptional factor recognition and binding to these putative GBS through chromatin immunoprecipitation (ChIP) in neuroblastome cells. We found that only Gli 2 activator recognized only GBS 3. Finally, in order to evaluate the Neogenin 1 GBS functionality, we cloned them upstream of the luciferase reporter gene. Concordant with the ChIP result, only the GBS 3 induced luciferase expression upon Gli 2 stimulation. In summary, this thesis proposes Neogenin 1 as a new direct transcriptional factor of the SHH/Gli pathway in a human neuroblastoma cell model. Our results aim to contribute to the understanding of how the SHH pathway is involved in diverse processes during embryonic development, and also, to the cellular mechanisms that explain the role of SHH in cancer. / Fondecyt 1110237

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