Thesis (doctoral)--München, 1979.

Freie Univ., Diss.--Berlin, 1999.

Interés del estudio: Los viroides son patógenos exclusivos de plantas que infectan un gran número de especies de interés agronómico. Sin capacidad descrita para codificar proteínas, todas las fases de su ciclo vital son estrictamente dependientes de su interacción con factores del huésped. Históricamente se ha asumido que la patogénesis es consecuencia de la competencia huésped-patógeno por factores celulares implicados en el ciclo vital del viroide. En los últimos años se ha propuesto que la respuesta de silenciamiento de RNA (RNAi) del huésped frente a estos patógenos es la responsable de la respuesta patogénica de los viroides. En el presente trabajo se ha tratado de estudiar en profundidad la relación entre el mecanismo de silenciamiento de RNA y la patogénesis viroidal (en concreto del viroide del enanismo del lúpulo, HSVd). Objetivos: 1- Estudiar el proceso de patogénesis inducido por HSVd y la maquinaria de RNAi 2- Caracterizar mediante secuenciación masiva los sRNAs derivados de HSVd (vd-sRNAs). 4- Analizar la distribución diferencial de vd-sRNAs en distintos tejidos (hoja y floema). 5- Determinar las alteraciones inducidas por la infección en las vías endógenas de RNAi. Elementos de la metodología a destacar: - Uso de un sistema transgénico para estudiar el fenómeno de la patogénesis. - Uso de técnicas de secuenciación masiva para la caracterización de sRNAs. - Análisis bioinformático de los datos generados por la secuenciación masiva. Resultados logrados: - Primera publicación en la literatura de la relación de un componente de las rutas de RNAi en la patogénesis viroidal ocasionada por HSVd. - Publicación de una de las primeras secuenciaciones masivas de sRNAs derivados del HSVd. - Primera caracterización de las poblaciones de sRNAs endógenos de C.sativus, incluyendo la primera caracterización de microRNAs en esta especie. - Identificación y detección de nuevos microRNAs en C.sativus. / Martínez Arias, GE. (2011). Relación entre el silenciamiento de RNA y la patogénesis inducida por un viroide con replicación nuclear [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/11302 / Palancia

Tesis por compendio / [ES] Los viroides son los patógenos con replicación autónoma más simples y sólo se han encontrado de forma natural infectando plantas superiores. Desde que se descubrieron en los años setenta, se ha adquirido un conocimiento considerable sobre su naturaleza y mecanismos de replicación en las plantas huésped. Sin embargo, aún quedan por descubrir muchos aspectos de la biología de los viroides. Por lo tanto, un conocimiento más profundo de la naturaleza y el modo de acción de los viroides han sido los objetivos principales que engloban esta tesis. Para ello, es esencial contar con procedimientos sencillos y eficientes para la obtención de clones de ADNc infecciosos. Se desarrolló un nuevo método eficiente para construir clones de viroides infecciosos y se probó con un viroide de cada familia: El viroide latente de la berenjena (ELVd, Avsunviroidae) y el viroide del lúpulo (HSVd, Pospiviroidae). Esta aproximación se basó en enzimas de restricción de tipo IIS que cortan fuera del sitio de reconocimiento y supone un procedimiento universal para obtener clones infecciosos de un viroide independientemente de su secuencia, con una alta eficiencia. A pesar de que los viroides han sido considerados como ARN no codificantes desde su descubrimiento, nuestro análisis computacional predijo pequeños marcos de lectura abiertos en cada uno de los genomas de HSVd y ELVd. No se encontraron similitudes significativas con las proteínas de la base de datos de plantas superiores, pero algunos de estos péptidos predichos estaban altamente conservados entre todas las variantes de HSVd y ELVd. Curiosamente, la fusión de estas secuencias conservadas con una proteína fluorescente reveló una localización subcelular específica en el correspondiente orgánulo donde tiene lugar la replicación/acumulación para cada viroide: nucleolo y cloroplasto para HSVd y ELVd, respectivamente. Las mutaciones que truncan el dominio nucleolar de HSVd fueron perjudiciales para el viroide, mientras que el truncamiento de cualquiera de los dos ORF de ELVd que contiene una señal de localización al cloroplasto también disminuyó (pero en menor medida) la eficiencia biológica del viroide, tal vez debido a la redundancia funcional. Se encontraron formas circulares de los ARN de HSVd y ELVd en fracciones polisómicas, lo que revela su interacción física con la maquinaria de traducción de la célula vegetal. En conjunto, estas observaciones experimentales indican que no se puede descartar la capacidad de codificación de los viroides, aunque la prueba definitiva (la detección de los péptidos codificados por los circRNAs) es un reto tecnológico que deberá abordarse en futuras líneas de investigación. Finalmente, para estudiar qué cambios se producen en el huésped durante la infección con un viroide sintomático, se realizó un análisis integrador de las alteraciones genómicas de plantas de pepino infectadas con HSVd. Se integraron los transcriptomas, el sRNAnomas y el metilomas para determinar la respuesta temporal a la infección por el viroide. Nuestros resultados apoyan que el HSVd promueve el rediseño de las vías reguladoras del pepino afectando predominantemente a capas reguladoras específicas en diferentes fases de la infección. La respuesta inicial se caracterizó por una reconfiguración del transcriptoma del hospedador mediante el uso diferencial de exones, seguido de una predominante regulación a la baja de la actividad transcripcional modulada por los cambios epigenéticos del hospedador asociados a la infección y caracterizada por un aumento de la hipermetilación. Las alteraciones en el metabolismo de los ARN pequeños y microARNs del huésped fueron marginales y se produjeron principalmente en la fase tardía. En general, estos datos constituyen el primer mapa exhaustivo de las respuestas de la planta a la infección de un viroide. / [CA] Els viroids són els patògenes més simples amb replicació autònoma i només s'han identificat de forma natural infectant a plantes superiors. Des que es descobriren als anys setanta, s'ha adquirit un coneixement considerable sobre la seua natura i els mecanismes de replicació en plantes hoste. No obstant, encara queden per descobrir molts aspectes de la biologia dels viroids. Per tant, un coneixement més profund de la natura i el mode d'acció dels viroids han sigut els objectius principals que engloben aquesta tesi. Per a això, és essencial la disponibilitat de procediments senzills i eficients per a l'obtenció de clones infecciosos. Es va desenvolupar un nou mètode eficient per a construir clones infecciosos y es fa provar amb un viroid de cada família: el viroide latent de la albergínia (ELVd, Avsunviroidae) y el viroid del llúpol (HSVd, Pospiviroidae). Aquesta aproximació es basà en enzims de restricció de tipus IIS que tallen fora del lloc de reconeixement i suposa un procediment universal per obtenir clones infecciosos de un viroid independentment de la seua seqüencia amb una elevada eficiència. Tot i que els viroids s'han considerat com ARNs no codificants des del seu descobriment, el nostre anàlisi computacional va predir xicotets ORF als genomes de HSVd y ELVd. No es trobaren similituds significatives amb proteïnes depositades a les bases de dades, però alguns d'aquest pèptids estaven altament conservats a les variants de HSVd y ELVd. Curiosament, la fusió d'aquestes seqüencies conservades amb una proteïna fluorescent revelà una localització subcel·lular especifica al orgànul on te lloc la replicació/acumulació de cada viroid: nuclèol i cloroplast per a HSVd i ELVd, respectivament. Les mutacions que trunquen el domini nucleolar de HSVd foren perjudicials per al viroid, mentre que el truncament de qualsevol de les dos ORF de ELVd que contenen una senyal de localització al cloroplast també va disminuir (però en menor mesura) l'eficiència biològica del viroid, el que pot ser degut a una redundància funcional. Es detectaren formes d'ARN circular de HSVd i ELVd a les fraccions polisòmiques, el que revela la seua interacció física amb la maquinaria de traducció cel·lular. En conjunt, aquestes observacions experimentals indiquen que no es pot descartar la capacitat codificants dels viroids, encara que la evidencia definitiva (la detecció del pèptids codificats per ARN circulars) es un repte tecnològic que s'haurà d'adreçar en línies d'investigació futures. Finalment, per tal d'estudiar que canvis es produeixen a l'hoste durant la infecció amb un viroid simptomàtic, es va realitzar un anàlisi integrador de les alteracions genòmiques de les plantes de cogombre infectades amb HSVd. S'integraren els transcriptomes, sARNomes i metilomes per determinar la resposta temporal a la infecció per viroid. Els resultats obtinguts suporten que HSVd promou un redisseny de les vies reguladores de cogombre afectant predominantment a nivells reguladors específics a les diferents etapes de la infecció. La resposta inicial es caracteritzà per una reconfiguració del transcriptoma de l'hoste mitjançant l'ús diferencial d'exons, seguit d'una repressió transcripticional modulada per canvis epigenètics de l'hoste caracteritzats per una major hipermetilació. Les alteracions al metabolisme de ARN xicotets i microARNs de l'hoste van ser marginals i es produïren principalment al final de la infecció. En general, aquestes dades constitueixen el primer mapa exhaustiu de les respostes de la planta a la infecció per un viroid. / [EN] Viroids are the simplest pathogens with autonomous replication and have only been found naturally infecting higher plants. Since viroids were discovered in the seventies, we have gained considerable knowledge about their nature and replication mechanisms in host plants. However, many aspects of viroid biology are yet to be discovered. Therefore, a deeper understanding of the nature and mode of action of viroids have been the encompassing main goals of this thesis. For this purpose, simple and efficient procedures for obtaining infectious cDNA clones are essential. A new efficient method for constructing infectious viroid clones was developed and tested with one viroid of each family: eggplant latent viroid (ELVd, Avsunviroidae) and hop stunt viroid (HSVd, Pospiviroidae). This procedure was based on type IIS restrictions enzymes that cut outside of the recognition site and supposes a universal procedure for obtaining infectious clones of a viroid independently of its sequence, with a high efficiency. Despite viroids have been considered as plant-pathogenic non-coding RNAs since their discovery, our computational analysis predicted small open reading frames in each of the HSVd and ELVd genomes. No significant similarities with proteins in the database of higher plants were found, but some of these predicted peptides were highly conserved among all HSVd and ELVd variants. Interestingly, the fusion of these conserved sequences to a fluorescent protein revealed a specific subcellular localization in the corresponding organelle where replication/accumulation takes place for each viroid: nucleolus and chloroplast for HSVd and ELVd, respectively. Mutations that truncate the nucleolar domain of HSVd were detrimental for the viroid while truncating any of the two ELVd ORF that contains a chloroplast transit signal also diminished (but to a lesser extent) viroid biological efficiency, maybe because of functional redundancy. Circular forms of both, HSVd and ELVd RNAs were found in polysome fractions, revealing their physical interaction with the translational machinery of the plant cell. Altogether, these experimental observations indicate that the coding capacity of viroids cannot be ruled out, although the definitive evidence (detection of the circRNA-encoded peptides) is a technological challenge to be addressed in future research lines. Finally, to study the host changes that are produced during a symptomatic viroid infection, an integrative analysis of the timing and intensity of the genome-wide alterations in cucumber plants infected with HSVd was performed. Differential host transcriptome, sRNAnome and methylome were integrated to determine the temporal response to viroid-infection. Our results support that HSVd promotes the redesign of the cucumber regulatory-pathways predominantly affecting specific regulatory layers at different infection-phases. The initial response was characterized by a reconfiguration of the host-transcriptome by differential exon usage, followed by a predominant down-regulation of the transcriptional activity modulated by the host epigenetic changes associated to infection and characterized by increased hypermethylation. The alterations in host sRNA and microRNA metabolism were marginal and mainly occurred at the late stage. Overall, these data constitute the first comprehensive map of the plant responses to a viroid infection. / La Conselleria d’Educació, Investigació, Cultura i Esports (Generalitat Valenciana) y el Fondo Social Europeo (FSECV 2014-2020) han cofinanciado la contratación del doctorando como personal investigador de carácter predoctoral (ACIF/2017/114) y unas estancias predoctorales fuera de la Comunitat Valenciana (BEFPI/2020). La realización de esta tesis doctoral también se ha realizado en el marco de dos proyectos de investigación del Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, con cofinanciación de fondos FEDER [BIO2017-88321-R y AGL2016-79825-R] . / Márquez Molins, J. (2022). Novel Insights of Viroid Biology and Host Responses to Their Infection [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/183479 / TESIS / Premios Extraordinarios de tesis doctorales / Compendio

Los viroides, los agentes infecciosos conocidos más simples, están constituidos por una molécula circular de RNA monocatenario. A pesar de su pequeño tamaño (246-401 nt) y de no codificar proteínas, son capaces de replicarse autónomamente, moverse sistémicamente, y causar enfermedades en ciertas plantas. En el presente trabajo hemos profundizado en el estudio de dos metodologías para el control de viroides basadas en ribozimas de cabeza de martillo con motivos de estabilización terciaria, y en RNAs interferentes que inducen en la planta una respuesta defensiva de silenciamiento génico mediado por RNA. Las ribozimas derivadas del viroide latente de la berenjena (Eggplant latent viroid, ELVd), que en su contexto natural median el autocorte de los RNAs multiméricos generados por un mecanismo de replicación de círculo rodante, son particularmente interesantes para adaptarlas a un formato trans. Hemos observado que la secuencia del trinucleótido que precede el sitio de autocorte de la ribozima de polaridad (+) del ELVd afecta a su actividad autocatalítica. Las constantes catalíticas de distintas variantes de este trinucleótido (AUA, AUC, GUA, GUC) determinadas in vitro a baja concentración de magnesio son diferentes en condiciones co- y postranscripcionales. Estos resultados sugieren que la ribozima de polaridad (+) del ELVd, y muy posiblemente otras ribozimas de cabeza de martillo naturales, han sido evolutivamente seleccionadas para actuar durante la transcripción de los RNAs viroidales, y que el trinucleótido AUC que precede al sitio de autocorte no se encuentra en la mayoría de las ribozimas de cabeza de martillo naturales por favorecer la adopción de estructuras metaestables catalíticamente inactivas durante la transcripción. La variante ELVd(+)-GUC, que presenta una constante catalítica alta e induce el corte de una amplia fracción del transcrito primario, fue seleccionada para diseñar variantes en trans frente al viroide del tubérculo fusiforme de la patata (Potat / Carbonell Olivares, A. (2008). Resistencia a viroides inducida por ribozimas de cabeza de martillo y RNAs interferentes [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/2005 / Palancia

Estudios realizados en Atalantia citroides, un género afín de los cítricos, mostraron que estaba infectada con un viroide no descrito hasta el momento. Este nuevo viroide tiene un genoma de 293-294 nucleótidos con una alta proporción de bases GC, una región central conservada que es característica de los miembros del género Apscaviroid, y también la región terminal conservada que tienen este y otros géneros de la familia Pospiviroidae. La estructura secundaria de mínima energía libre predicha para este nuevo viroide es una conformación en forma de varilla con un 68.7% de nucleótidos apareados y con una identidad de secuencia respecto a los otros viroides inferior al 90%, que es el límite convenido para separar las diferentes especies de viroides dentro de un mismo género. Los ensayos de infectividad utilizando el cidro Etrog han mostrado que este nuevo viroide produce síntomas característicos suaves. La co-inoculació de este nuevo viroide con Citrus bent leaf viroid o con Citrus dwarfing viroid, que también son miembros del género Apscaviroid, causa interacciones sinérgicas que se manifiestan induciendo síntomas muy pronunciados en las hojas y un enanismo muy marcado. Este aumento en la intensidad de síntomas no está acompañado por variaciones en la acumulación del viroide en la planta ya que su concentración se mantiene inalterada en plantas co-inoculadas. De acuerdo con estas propiedades moleculares y biológicas, así como por su capacidad por replicarse en A. citroides, este nuevo viroide que tentativamente hemos nombrado Citrus viroid V (CVd-V), ha sido propuesto como una nueva especie del género Apscaviroid. El análisis de 64 muestras provenientes de varias zonas citrícolas ha mostrado que CVd-V está presente en los Estados Unidos, España Nepal, y el Sultanato de Oman. Estos resultados indican que este viroide no ha surgido recientemente y está bastante difundido por diferentes partes del mundo. Los ensayos de transmisión a naranjo, mandarino, híb / Serra Alfonso, P. (2009). Estudios de Patogenicidad de Viroides del Género Apscaviroide y Hostuviroide en cítricos [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/6028 / Palancia

In the first chapter, we determined that cucumber plants infected with hop stunt viroid (HSVd) accumulated high levels of sRNAs derived of ribosomal RNA (rb-sRNAs).Moreover, this effect was correlated with an increase of the transcription of the ribosomal RNAs precursors (rRNAs) due to a decrease in DNA methylation in its promoter region, revealing that certain ribosomal genes (usually silenced) reactivated its transcriptional activity during the infection. In the following chapter and in order to determine whether this process could be a common phenomenon to other plant-pathogen systems, we analyzed N.benthamiana transgenic plants that expressed, in a constitutive way, the viroid dimeric sequence. It was observed that the accumulation of the sRNAs in transgenic plants was similar to the one seen in infected cucumbers, promoting the imbalance of the rb-sRNAs accumulation. By bysulfited DNA sequencing we proved that this phenomenon turned to be linked with the loss of cytosine methylation in a symmetrical context. As with that observed in cucumber, this phenomenon was correlated with an increase of the transcription of these hypomethylated DNA regions. These data supported the idea that the HSVd was able to interfere with the regulation mechanisms in the host epigenetic level (methylation), suggesting that this phenomenon could happen generally in other viroid-host systems. In the third chapter, by immunoprecipitation essays, it was possible to determine that both in cucumberas in N. benthamiana plants, the HSVd formed an in vivo stable complex with the HISTONE DEACETYLASE 6 (HDA6), a key component in the process of methylation of diverse repetitive DNAs. These results suggested that the interaction HSVd-HDA6 would generate a functional deficit of HDA6 that might be responsible of the epigenetic alterations observed in the host during the infection. This hypothesis was consistent with the observation that the transient overexpression of HDA6 in infected plants reverted to the hypomethylation status of the rDNA. Unexpectedly, we observed that the HDA6 overexpression induced a significant reduction in the accumulation levels of the viroid in the infected plants. Also, the viroid accumulation in the infected cells increased when we transiently silenced the HDA6 expression, demonstrating the existence of an antagonistic relationship between the HDA6 concentration and the viroid. A hypothesis that allows explaining the information obtained and correlating them with an increase of biological viroid efficacy in the host is described in detail in the discussion of this chapter. Once determined that, in vegetative host tissue, the HSVd induces alterations in the epigenetic map of the promotor areas of rDNA, in the last chapter of this thesis we analyzed whether or not reproductive host tissue showed similar alterations during the infection. We analyzed pollen grains of infected cucumber plants. The structural analysis of these reproductive cells indicated that the HSVd accumulation induced a nuclear chromatin decodensation, responsible of the rRNAs transcription in the nucleus of the generative cell. This alteration was correlated with a significant demethylation of the ribosomal DNAs and transposable elements. By RT-PCR analysis it was possible to determine that this methylation pattern alteration correlated with a significant increase of transcriptional activity. This observation revealed that the HSVd infection also induced alterations in the transcriptional regulation mechanisms in the host reproductive tissue. This result allowed speculating with the possibility that these epigenetic modifications could happen in the next generation plants, awarding to the viroid an advantage for host adaptation. / En el primer capítulo determinamos que plantas de pepino infectadas con el viroide del enanismo del lúpulo (HSVd) acumulaban altos niveles de sRNAs derivados del RNA ribosomal. Además, este efecto se correlacionó con un aumento de la transcripción de los precursores de los RNAs ribosomales debido a una disminución de la metilación del DNA en su región promotora poniendo de manifiesto que ciertos genes ribosomales (normalmente silenciados) reactivaban su actividad transcripcional durante la infección. En el siguiente capítulo y con el objetivo de determinar si este proceso podía ser un fenómeno común a otros sistemas planta-patógeno, analizamos plantas de N.benthamiana transgénicas que expresaban de forma constitutiva la secuencia dimérica del viroide. Se observó cómo la acumulación de los sRNAs en plantas transgénicas era similar a la observada en los pepinos infectados, promoviendo el desequilibrio de la acumulación de rb-sRNAs. Mediante secuenciación de DNA bisulfitado demostramos que este fenómeno volvía a estar ligado con la pérdida de metilación de citosinas en un contexto simétrico. Al igual que en pepino este fenómeno correlacionaba con un aumento de la transcripción de estas zonas de DNA hipometiladas. En el tercer capítulo y mediante ensayos de immuno-precipitación, fue posible determinar que tanto en pepino como en N. benthaminana el HSVd formaba complejos estables in vivo con la proteína HISTONA DEACETILASA 6 (HDA6), un componente clave del proceso de metilación de diversos DNAs repetitivos, entre los que se encuentra el DNA ribosomal. Estos resultados sugerían que esta interacción HSVd-HDA6 generaría un déficit funcional de HDA6 que podría ser responsable de las alteraciones epigenéticas observadas en el huésped durante la infección. Esta hipótesis fue consistente con la observación de que la sobreexpresión transitoria de HDA6 en plantas infectadas revirtió el estado de hipometilación del rDNA inducido por el viroide. Inesperadamente, observamos que la sobreexpresión de HDA6 inducía una significativa reducción en los niveles de acumulación del viroide en la planta infectada. Además, la acumulación del viroide en las células infectadas aumentó al silenciar de forma transitoria la expresión de HDA6 evidenciando la existencia de una relación antagónica entre la concentración de HDA6 y la del viroide. Una vez determinado que, en tejidos vegetativos del huésped, el HSVd induce alteraciones en el mapa epigenético de las zonas promotoras del rDNA, en el último capítulo de esta tesis analizamos si tejidos reproductivos del huésped mostraban alteraciones similares durante la infección. Para ello se analizaron granos de polen de flores provenientes de plantas de pepino infectadas por el HSVd. El análisis estructural de estas células reproductivas indico que la acumulación de HSVd inducía la descondensación de la cromatina nucleolar responsable de la transcripción de los rRNAs en el núcleo generativo. Esta alteración correlacionó con una significativa desmetilación de DNAs ribosomales y los asociados a Elementos Transponibles. Mediante análisis de qRT-PCR fue posible determinar que esta alteración en los patrones de metilación se correspondía con un significativo aumento de su actividad transcripcional lo que permite afirmar que al igual que lo observado en hoja, la infección por HSVd induce alteraciones a nivel de los mecanismos de regulación transcripcional también en tejidos reproductivos del huésped. Esta observación permite especular con la posibilidad de que estas modificaciones epigenéticas podrían pasar a la siguiente generación de plantas, confiriendo de esta manera al viroide una ventaja en la adaptación al huésped. / En el primer capítol determinem que plantes de cogombre infectades amb el viroide del nanisme del llúpol (HSVd) acumulaven alts nivells d'sRNA derivats de l'RNA ribosòmic (rb-sRNA). A més, aquest efecte es va correlacionar amb un augment de la transcripció dels precursors dels RNA ribosòmics (rRNA) a causa d'una disminució de la metilació del DNA en la seua regió promotora, i va posar de manifest que certs gens ribosòmics (normalment silenciats) reactivaven la seua activitat transcripcional durant la infecció. En el següent capítol i amb l'objectiu de determinar si aquest procés podia ser un fenomen comú a altres sistemes planta-patogen, analitzem plantes de N. benthamiana transgèniques que expressaven de forma constitutiva la seqüència dimèrica del viroide. Es va observar como l'acumulació dels sRNA en plantes transgèniques era similar a l'observada en els cogombres infectats, promovent el desequilibri de l'acumulació d'rb-sRNA. Mitjançant la seqüenciació del DNA bisulfitat vam demostrar que aquest fenomen tornava a estar lligat a la pèrdua de metilació de citosines en un context simètric. De la mateixa forma que en el cogombre, aquest fenomen es correlacionava amb un augment de la transcripció d'aquestes zones de DNA hipometilades. En el tercer capítol, mitjançant assajos d'immunoprecipitació, va ser possible determinar que tant en cogombre com en N. benthaminana, l'HSVd formava complexos estables in vivo amb la proteïna HISTONA DEACETILASA 6 (HDA6), un component clau del procés de metilació de diversos DNA repetitius, entre els quals es troba el DNA ribosòmic. Aquests resultats suggerien que aquesta interacció HSVd-HDA6 generaria un dèficit funcional d'HDA6 que podria ser responsable de les alteracions epigenètiques observades en l'hoste durant la infecció. Aquesta hipòtesi va ser consistent amb l'observació que la sobreexpressió transitòria d'HDA6 en plantes infectades revertia l'estat d'hipometilació de l'rDNA induït pel viroide. Inesperadament, observem que la sobreexpressió d'HDA6 induïa una significativa reducció en els nivells d'acumulació del viroide en la planta infectada. A més, l'acumulació del viroide en les cèl·lules infectades va augmentar en silenciar de forma transitòria l'expressió d'HDA6, evidenciant l'existència d'una relació antagònica entre la concentració d'HDA6 i la del viroide. Una vegada determinat que, en teixits vegetatius de l'hoste, l'HSVd indueix alteracions en el mapa epigenètic de les zones promotores de l'rDNA, en l'últim capítol d'aquesta tesi analitzem si teixits reproductius de l'hoste mostraven alteracions similars durant la infecció. Amb aquesta finalitat, es van analitzar grans de pol·len de flors provinents de plantes de cogombre infectades per l'HSVd . L'anàlisi estructural d'aquestes cèl·lules reproductives va indicar que l'acumulació d'HSVd induïa la descondensació de la cromatina nucleolar responsable de la transcripció dels rRNA en el nucli generatiu. Aquesta alteració es va correlacionar amb una significativa desmetilació de DNA ribosòmics i els associats a elements transposables (TE). Mitjançant anàlisi de qRT-PCR va ser possible determinar que aquesta alteració en els patrons de metilació es corresponia amb un significatiu augment de la seua activitat transcripcional, la qual cosa va permetre afirmar que, igual que l'observat en la fulla, la infecció per HSVd induïa, també en els teixits reproductius de l'hoste, alteracions dels mecanismes de regulació transcripcional. Aquesta observació va permetre especular amb la possibilitat que aquestes modificacions epigenètiques pogueren passar a la següent generació de plantes, conferint d'aquesta manera al viroide un avantatge d'adaptació a l'hoste. / Castellano Pérez, M. (2017). ESTUDIO DE LAS ALTERACIONES EN EL PATRON DE METILACIÓN DEL DNA DEL HUÉSPED INDUCIDAS POR UN VIROIDE NUCLEAR [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/77992 / TESIS

Le viroïde de la mosaïque latente du pêcher (PLMVd) est un pathogène mondialement répandu et responsable de pertes (directes et indirectes) relativement importantes au niveau de la culture des pêchers. Cependant, peu de données sont actuellement disponibles en ce qui concerne dune part le(s) déterminant(s) de pathogénicité de ce viroïde et dautre part les éventuels mécanismes de résistance des plantes vis-à-vis des viroïdes. Lapproche originale de ce travail a été de jeter les bases de cette double caractérisation. Dans un premier temps, le rôle du pseudo-nud P8, commun à tous les variants du PLMVd actuellement séquencés, a été étudié par mutagenèse dirigée. Dans un second temps, la réponse moléculaire de plants de pêchers infectés par des variants de pathogénicités différentes a été caractérisée par le biais de la cDNA-AFLP. Lobjectif principal de cette thèse était didentifier une voie métabolique éventuellement impliquée dans la résistance des plants de pêcher contre ce viroïde. Au terme de ce travail, il est apparu que le pseudo-nud P8 était impliqué soit dans la stabilité du viroïde au sein des cellules infectées soit dans la réplication du viroïde. En effet, le variant inoculé présentant un pseudo-nud déstabilisé a montré une réplication réduite au cours des douze mois de létude. De plus, bien que le viroïde muté soit présent dans les plantes inoculées, aucun symptôme na été observé. Il est cependant trop tôt pour déterminer si cette latence apparente est due à une quantité trop faible du viroïde ou bien à une implication du pseudo-nud dans la pathogénicité du viroïde. La caractérisation de lexpression des gènes de plants de pêchers infectés par des variants de pathogénicité différente a permis de montrer que le PLMVd réprimait des gènes impliqués dans la photosynthèse et en particulier dans la protection des deux photosystèmes. Cette expression particulière des gènes des plantes infectées peut être mise en relation avec les symptômes de chlorose et de mosaïque sexprimant au cours dune infection par le PLMVd. Cependant, nous ne pouvons encore affirmer avec certitude si elle est une cause ou une conséquence de ces symptômes. De même, la cDNA-AFLP a permis de mettre en évidence la répression de protéines de choc thermique (HSPs) dans les feuilles symptomatiques. Ces protéines jouent généralement un rôle dans le repliement des protéines ainsi que dans leur assemblage, leur déplacement, leur stabilisation et leur dégradation. La régulation de leur expression peut donc avoir une grande influence dans les plantes infectées et, peut-être, jouer un rôle dans lexpression des symptômes. De même, le gène codant pour une novel cap-binding protein (nCBP) est apparu sous-exprimé dans les feuilles symptomatiques. Le rôle de ces protéines est encore mal connu mais elles pourraient intervenir dans la régulation de la traduction des ARNm. Leur répression peut donc également avoir un impact important et déstabiliser diverses voies métaboliques. Enfin deux gènes codant clairement pour des protéines de défense des plantes ont été identifiés. Il sagit dun gène codant pour un intermédiaire de la thiamine (impliquée dans le déclenchement de la SAR, surexprimé dans les feuilles asymptomatiques) et dun autre gène codant pour une protéine inhibitrice des polygalacturonases (sur-exprimé dans les feuilles symptomatiques). Le rôle exact de ces protéines dans la protection des plantes vis-à-vis du viroïde nest cependant pas encore clair. Ce travail constitue une première étude des relations hôte-pathogène établies durant une infection de plants de pêcher par le PLMVd. Cest également le premier, à notre connaissance à avoir analysé lexpression des gènes de plantes infectées en fonction des symptômes observés./ The Peach latent mosaic viroid (PLMVd) infects peach trees in all production areas. This pathogen is responsible of direct and indirect crop losses. However only a few data are available as regards on one hand the determinant of pathogenicity of this viroid and on the other hand the resistance mechanisms of plants against this pathogen. The original approach of this work was to give the foundation of this double characterization. Firstly, the role of the P8 pseudoknot, present in every sequenced PLMVd, was studied by directed mutagenesis. Secondly, the molecular response of different peach trees infected by different variants was evaluated by the use of the cDNA-AFLP. The main objective of this thesis was to identify a metabolic pathway implicated in the plant defence against the PLMVd. In the term of this work, it seemed that the P8 pseudoknot was implicated either in the stability or in the replication of the viroid into the infected cells. Indeed, the inoculated variant (with a destabilized pseudoknot) has shown a reduced replication during the cultural season. In spite of the presence of the mutated variant in the plants, no symptom was observed on the peach tree leaves. However, we cannot conclude if this absence of symptom is due to the low viroid quantity either to an implication of the pseudo-knot in the pathogenicity of the PLMVd. The characterization of the gene expression in the infected peach trees has allowed to highlight that the PLMVd represses genes implicated in the photosynthesis and more specifically genes involved in the protection of the two photosystems. This particular gene expression in the infected leaves was linked to the chlorosis and mosaic induced by the PLMVd. However, we cannot conclude with certitude if these symptoms are a cause or a consequence of this particular genes expression. The cDNA-AFLP has also allowed to identify the repression of genes coding for heat shock proteins (HSPs) in symptomatic leaves. These proteins generally have a role in the protein folding, assembly, translocation, stabilization and degradation. The regulation of their expression may have a great influence in the infected plants and, maybe, play a role in the symptoms expression. The gene coding for the novel cap-binding protein (nCBP) was also identified has repressed in the symptomatic leaves. The biological role of these proteins is unclear but it seems that these proteins act in the regulation of the mRNA translation. The repression of nCBP may thus have an important impact and to destabilize various biological pathways. Finally, two genes implicated in the plant defence were identified. One coding for a polygalacturonase inhibitor (over-expressed in symptomatic leaves) and the other one coding for a thiamine intermediate (involved in the SAR and over-expressed in the non-symptomatic leaves). The role of these proteins in the plant defence against the PLMVd is however unclear. To our knowledge, this is the first work where the host-pathogen relationship established during a PLMVd infection are studied. This is also the first time were the gene expression is linked to the viroid-induced symptoms.

El ácido salicílico (SA) juega un papel fundamental en la respuesta defensiva de las plantas. Este compuesto se acumula en las mismas como consecuencia de infecciones patogénicas de tipo incompatible, y su aplicación exógena induce resistencia. Asimismo, plantas transgénicas incapaces de acumularlo presentan una mayor susceptibilidad a patógenos de distinta naturaleza. Por otra parte, el ácido gentísico (GA, ácido 2,5-dihidroxibenzoico) se acumula en plantas en infecciones compatibles no necrotizantes. La aplicación exógena de GA induce un conjunto de proteínas de defensa PR (Pathogenesis related) distintas a las que induce el SA, por lo que podría tener un papel complementario en la señalización frente a patógenos en plantas. Ambos compuestos se acumulan en plantas en forma de glicósidos, es decir, conjugados a una o más moléculas de azúcar. Estas reacciones de conjugación son catalizadas por proteínas denominadas glicosiltransferasas. En plantas de tomate el SA se acumula como SA 2-O-ß-glucósido, unido a una molécula de glucosa, mientras el GA lo hace en forma de GA 5-O-ß-xilósido, unido a xilosa. GAGT (Gentisic Acid Glycosyl Transferase) ha sido descrita como la proteína que conjuga GA en tomate. Dado que la glicosilación de metabolitos es una forma rápida de inactivarlos, la existencia de esta proteína con actividad conjugadora de GA refuerza la idea del ácido gentísico (GA) como molécula señal complementaria al SA en la interacción planta-patógeno. Por otra parte, la proteína Twi1 (Tomato wound inducible), descrita en tomate como una posible glicosiltransferasa debido a sus características comunes con este grupo de proteínas, presenta inducción por SA y otros compuestos de naturaleza fenólica, además de herida e interacciones de tipo incompatible. Trabajos en los que se ha llevado a cabo la sobreexpresión o el silenciamiento de una GT han puesto de manifiesto cómo ello conlleva la aparición de resistencia o susceptibilidad frente a una infección patogénica. Por tanto, las GTs tienen un papel fundamental en la respuesta defensiva de la planta, modulando los niveles de moléculas que intervienen en dicha respuesta. Por otra parte, se han realizado estudios dirigidos a elucidar la implicación de compuestos del metabolismo secundario en la interacción de plantas de tomate con distintos patógenos. Ello ha permitido detectar cambios concretos de los niveles de un número determinado de metabolitos a lo largo de las infecciones, como son cuatro amidas derivadas del ácido hidroxicinámico (HCAAs) que se acumulan en plantas de tomate infectadas con la bacteria Pseudomonas syringae pv. tomato. Las HCAAs son un conjunto de metabolitos, pertenecientes al grupo de los fenilpropanoides, de bajo peso molecular y que se caracterizan por la presencia de nitrógeno en su estructura. En su ruta de biosíntesis participan diversos enzimas tales como la fenilalanina amonio liasa (PAL), la tirosina descarboxilasa (TYDC) o la tiramina hidroxicinamoil transferasa (THT). La acumulación en tomate de las cuatro amidas como consecuencia de la infección bacteriana va acompañada de la inducción del isoenzima THT1-3. La obtención de plantas transgénicas que sobreexpresen o silencien las proteínas GAGT, Twi1 y THT1-3 permitirá llevar a cabo ensayos de resistencia frente a infecciones patogénicas que contribuyan al conocimiento del sistema defensivo de las plantas, tanto en sus aspectos de señalización como en los referidos a componentes de la respuesta final de la planta. Al mismo tiempo, esta estrategia puede constituir, en sí misma, un medio de obtención de plantas más resistentes frente a ataques patogénicos de diversa naturaleza. / Campos Beneyto, L. (2014). Metabolitos secundarios de naturaleza fenólica: papel en la respuesta defensiva de plantas de tomate [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/44236 / TESIS

[ES] Los viroides, genomas mínimos de RNA circular no codificante, monocatenarios y muy estructurados, parasitan factores celulares de las plantas para replicarse autónomamente, establecer infecciones sistémicas y usualmente causar enfermedades. Los de la familia Avsunviroidae se replican y acumulan en cloroplastos por un mecanismo de círculo rodante simétrico. Una RNA polimerasa cloroplástica produce concatémeros lineales de polaridad complementaria que son reducidos a monómeros por las ribozimas de cabeza de martillo (HHR) del concatémero. Producen extremos 5'-hidroxilo y 2',3'-fosfodiéster cíclico, que la isoforma cloroplástica de la tRNA ligasa convierte en enlaces 5',3'-fosfodiéster intramoleculares, generando viroides circulares de polaridad complementaria que pueden entrar en otra ronda de transcripción, simétrica a ésta. En esta Tesis se han analizado las secuencias y estructuras viroidales esenciales para su circularización, usando como modelo el viroide latente de berenjena (ELVd), que induce infecciones asintomáticas en berenjena. Expresamos en Escherichia coli precursores del ELVd(+) lineales flanqueados por dos copias de su HHR. Su procesamiento genera monómeros con los extremos adecuados para la ligación por la tRNA ligasa de la berenjena, que es coexpresada. Mutaciones puntuales y deleciones en el sitio nativo de ligación sugieren que solo el dominio HHR es esencial para la circularización. La conservación de la secuencia y estructura de la HHR con las del sustrato natural del enzima (los tRNAs) nos hacen proponer que la HHR del ELVd secuestra la ligasa mimetizando las características generales del bucle anticodón de los tRNAs. Este sistema de expresión permite también producir RNAs recombinantes, insertándolos en una posición particular del RNA del ELVd. Las quimeras son procesadas por las HHRs flanqueantes y sus extremos ligados por la tRNA ligasa. El andamiaje viroidal circular, compacto y posiblemente asociado a la ligasa, permite aumentar la vida media del RNA de interés y su acumulación en la bacteria. En esta Tesis adaptamos el sistema para producir RNAs de doble cadena (dsRNAs) que desencadenen interferencia por RNA (RNAi), un mecanismo de defensa y regulación génica eucariota basado en la complementariedad de bases entre RNAs. dsRNAs complementarios a genes endógenos reducen los niveles de sus transcritos y generan fenotipos de pérdida de función. Los insectos pueden tomar dsRNAs del ambiente, internalizarlos en sus células y distribuirlos sistémicamente, haciendo al RNAi una estrategia prometedora para el control de plagas. Para producir dsRNAs, separamos las repeticiones invertidas del gen diana que genera la horquilla con el cDNA de un intrón autocatalítico del grupo I de Tetrahymena thermophila, aumentando la estabilidad de los plásmidos de expresión. El intrón es eliminado tras la transcripción, resultando en una molécula viroidal de la que protruye el dsRNA de interés. Flanquear las repeticiones invertidas con una copia adicional permutada del intrón permite separar el ELVd del producto final, un dsRNA circular cerrado en ambos lados por pequeños bucles. Ambas moléculas poseen actividad reguladora: las quimeras viroide-dsRNA con homología al gen de la unión septada suave 1 del gusano de la raíz del maíz (Diabrotica virgifera virgifera) exhiben actividad insecticida oral contra las larvas similar a la de horquillas sintetizadas in vitro, y los dsRNAs circulares sin andamiaje viroidal homólogos al gen de la ATPasa vacuolar (subunidad A) y la proteína ribosomal S13 silencian eficientemente estos genes en adultos de la mosca del Mediterráneo (Ceratitis capitata); este caso es de especial relevancia al ser la primera demostración del RNAi para el control de esta plaga. En conclusión, a pesar de su limitada relevancia agrícola, el ELVd es útil para investigar la biología molecular de la familia Avsunviroidae y una poderosa herramienta biotecnológica en combinación con el sistema de expresión en E. coli. / [CA] Els viroides, genomes mínims d'RNA circular no codificant, monocatenaris i molt estructurats, parasiten factors cel·lulars de les plantes per a replicar-se autònomament, establir infeccions sistèmiques i usualment causar malalties. Els de la família Avsunviroidae es repliquen i acumulen en cloroplasts per un mecanisme de cercle rodant simètric. Una RNA polimerasa cloroplàstica produeix concatèmers lineals de polaritat complementària que són reduïts a monòmers per els ribozims de cap de martell (HHR) del concatèmer. Produeixen extrems 5'-hidroxil i 2',3'-fosfodièster cíclic, que la isoforma cloroplàstica de la tRNA lligasa converteix en enllaços 5',3'-fosfodièster intramoleculars, generant viroides circulars de polaritat complementària que poden entrar en una nova ronda de transcripció, simètrica a la primera. En aquesta Tesi s'han analitzat les seqüències i estructures viroidals essencials per a la seua circularització, emprant com a model el viroide latent d'albergínia (ELVd), que indueix infeccions asimptomàtiques en albergínia. Expressem en Escherichia coli precursors de l'ELVd(+) lineals flanquejats per dos còpies del seu HHR. El seu processament produeix monòmers amb els extrems apropiats per a la lligació mediada per la tRNA ligasa de l'albergínia, que és coexpressada. Mutacions puntuals i delecions en el lloc nadiu de lligació suggereixen que només el domini HHR és essencial per a la circularització. La conservació de la seqüència i estructura del HHR amb les del substrat natural de l'enzim (els tRNAs) ens fan proposar que el HHR de l'ELVd segresta la lligasa mimetitzant les característiques generals del bucle anticodó dels tRNAs. Aquest sistema d'expressió també permet produir RNAs recombinants, inserint-los en una posició particular de l'RNA de l'ELVd. Les quimeres són processades pels HHR flanquejants i els seus extrems lligats per la tRNA lligasa. L'RNA viroïdal circular, compacte i possiblement associat a la lligasa, permet augmentar la vida mitjana de l'RNA d'interés i la seua acumulació en els bacteris. En aquesta Tesi adaptem el sistema per a produir RNAs de doble cadena (dsRNAs) que desencadenen interferència per RNA (RNAi), un mecanisme de defensa i regulació gènica eucariota basat en la complementarietat de bases entre RNAs. dsRNAs complementaris a gens endògens redueixen els nivells dels seus transcrits i generen fenotips de pèrdua de funció. Els insectes poden prendre dsRNAs de l'ambient, internalitzar-los en les seues cèl·lules i distribuir-los sistèmicament, fent a l'RNAi una estratègia prometedora en el control de plagues. Per a produir dsRNAs, separem les repeticions invertides del gen diana que genera la forqueta amb el cDNA d'un intró autocatalític del grup I de Tetrahymena thermophila, augmentant l'estabilitat dels plasmidis d'expressió. L'intró és eliminat després de la transcripció, resultant en una molècula viroïdal de la qual protrueix el dsRNA d'interés. Flanquejar les repeticions invertides amb una còpia addicional permutada de l'intró permet separar l'ELVd del producte final, un dsRNA circular tancat als dos costats per xicotets bucles. Els dos tipus de molècules posseeixen activitat reguladora: les quimeres viroide-dsRNA amb homologia al gen de la unió septada suau 1 del cuc de l'arrel de la dacsa (Diabrotica virgifera virgifera) exhibeixen activitat insecticida oral contra les larves similar a la de forquetes sintetitzades in vitro, i els dsRNAs circulars sense l'RNA viroïdal homòlegs al gen de la ATPasa vacuolar (subunitat A) i la proteïna ribosomal S13 silencien eficientment aquests gens en adults de la mosca del Mediterrani (Ceratitis capitata); aquest cas és d'especial rellevància perquè és la primera demostració de l'RNAi per al control d'aquesta plaga. En conclusió, malgrat la seua limitada rellevància agrícola l'ELVd és útil per a investigar la biologia molecular de la família Avsunviroidae i una poderosa ferramenta biotecnològica en combinació amb el sistema d'expressió en E. coli. / [EN] Viroids, minimal genomes of non-coding circular RNA, single-stranded and highly structured, parasitize plant cellular factors to replicate autonomously, establish systemic infections, and typically cause disease. Those of the family Avsunviroidae replicate and accumulate in chloroplasts by a symmetrical rolling circle mechanism. A chloroplast RNA polymerase produces linear concatemers of complementary polarity that are reduced to monomers by the hammerhead ribozymes (HHR) of the concatemer. They produce 5'-hydroxyl and 2',3'-cyclic phosphodiester ends, which the chloroplastic isoform of tRNA ligase converts to intramolecular 5',3'-phosphodiester bonds, generating circular viroids of complementary polarity that can enter another round of transcription, symmetric to the first one. In this Thesis, the viroid sequences and structures essential for its circularization have been analyzed, using as a model the eggplant latent viroid (ELVd), which induces asymptomatic infections in eggplant. We expressed in Escherichia coli linear ELVd(+) precursors flanked by two copies of its HHR. Its processing generates monomers with suitable ends for ligation by the eggplant tRNA ligase, which is co-expressed. Point mutations and deletions at the wild-type ligation site suggest that only the HHR domain is essential for circularization. The conservation of the sequence and structure of the HHR with those of the natural substrate of the enzyme (the tRNAs) lead us to propose that the HHR of the ELVd hijacks the ligase, mimicking the general characteristics of the anticodon loop of the tRNAs. This expression system also allows the production of recombinant RNAs, inserting them into a particular position of the ELVd RNA. Chimeras are processed by flanking HHRs and their ends ligated by the tRNA ligase. The compact, circular viroidal scaffold, possibly associated with the ligase, allows increasing the half-life of the RNA of interest and its accumulation in the bacteria. In this Thesis we adapt the system to produce double-stranded RNAs (dsRNAs) that trigger RNA interference (RNAi), a eukaryotic gene regulation and defense mechanism based on base complementarity between RNAs. dsRNAs complementary to endogenous genes reduce the levels of their transcripts and generate loss-of-function phenotypes. Insects can take dsRNAs from the environment, internalize them into cells, and distribute them systemically, making RNAi a promising pest control strategy. To produce dsRNAs, we separated the inverted repeats of the target gene that generates the hairpin with the cDNA of a group-I autocatalytic intron from Tetrahymena thermophila, increasing the stability of the expression plasmids. The intron is removed after transcription, resulting in a viroidal molecule from which the dsRNA of interest protrudes. Flanking the inverted repeats with an additional copy of the intron in a permuted form allows the ELVd molecule to be separated from the final product, a circular dsRNA molecule capped on both sides by small loops. Both molecules have regulatory activity: the viroid-dsRNA chimeras with homology to the smooth septate junction 1 gene of the corn rootworm (Diabrotica virgifera virgifera) exhibit oral insecticidal activity against larvae similar to that of in vitro synthesized hairpins, and the circular dsRNAs without the viroid scaffold homologous to the vacuolar ATPase (subunit A) and ribosomal protein S13 genes efficiently silence those genes in adult Medfly (Ceratitis capitata); this case is of special relevance as it is the first demonstration of RNAi for the control of this pest. In conclusion, despite its limited agricultural relevance, the ELVd is useful for investigating the molecular biology of the Avsunviroidae family and a powerful biotechnological tool in combination with the E. coli expression system. / This work was supported by the Ministerio de Ciencia e Innovación (Spain; co-financed by the European Regional Development Fund) [BIO2017-83184-R] and [BIO2017‐ 91865‐EXP]; Universitat Politècnica de València [PAID-01-17]. We acknowledge support of the publication fee by the CSIC Open Access Publication Support Initiative through its Unit of Information Resources for Research (URICI). / Ortolá Navarro, B. (2023). Heterologous expression of circular RNAs in Escherichia coli for analyzing the ligation process of chloroplastic viroids and producing double-stranded RNAs with insecticidal activity [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/192635