Los especies de cítricos y géneros afines pertenecen a la familia Rutaceae. Los cítricos son huéspedes naturales de siete viroides, pero solamente Citrus exocortis viroid (CEVd) y variantes específicas de Hop stunt viroid (HSVd) causan patologías (exocortis y cachexia, respectivamente) en especies sensibles. La mayoría de los cítricos son tolerantes a las infecciones viroidales salvo algunas especies que son sensibles y manifiestan síntomas. En variedades comerciales infectadas, es frecuente encontrar los viroides como infecciones múltiples. El objetivo de este trabajo es estudiar la respuesta de distintos genotipos de cítricos a la infección con viroides. Se ha caracterizado un aislado de campo que contenía CEVd (clase A), HSVd (variante no patogénica), CBLVd (variante tipo CVd-Ia) y CDVd (variantes de tipos CVd-IIIa y CVd-IIIb), y se ha estudiado su efecto en el comportamiento de árboles de naranjo dulce 'Navelina' y clementino 'Nules', ambos injertados sobre citrange Carrizo y mantenidos en condiciones de campo durante 10 años. Los árboles de ambos cultivares alcanzaron un tamaño inferior y su cosecha fue menor que la de los controles no inoculados. Las características de los frutos también resultaron afectadas: (i) Los frutos de naranjos infectados presentaban un tamaño, índice de madurez y contenido en zumo superiores a los de los controles no infectados; (ii) los frutos de clementinos infectados presentaban un tamaño y relación diámetro/altura mayores que los de los controles no infectados; (iii) En ambos cultivares, la densidad, contenido en sólidos solubles y acidez del zumo eran inferiores a los de los controles no infectados. Los árboles infectados tenían un sistema radicular poco desarrollado y mediante histología se demostró que sus raicillas contenían menos amiloplastos que las de los controles no inoculados. / Bani Hashemian, SM. (2009). RESPUESTA DE DISTINTOS GENOTIPOS DE CÍTRICOS Y GÉNEROS AFINES A LA INFECCIÓN CON VIROIDES [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/6283

Los viroides son pequeños RNAs circulares de cadena sencilla (246-401 nt) patógenos de plantas. A pesar de su pequeño tamaño y de no codificar proteínas, son capaces de replicarse autónomamente, moverse sistémicamente y, en la mayoría de los casos, provocar enfermedades en sus plantas huésped. La replicación de los viroides ocurre a través de un mecanismo de círculo rodante con intermediarios de RNA que consta de tres etapas: (1) transcripción RNA-RNA que origina RNAs oligoméricos de polaridad complementaria, (2) procesamiento de algunos de estos oligómeros a monómeros lineales, y (3) circularización de estos últimos. Puesto que los viroides no codifican proteínas, su replicación depende de la interacción del RNA viroidal con factores del huésped. La etapa menos conocida de este ciclo replicativo es la ligación de los monómeros lineales para generar el producto de la replicación, la forma circular monómerica. Así pues, los objetivos de esta Tesis Doctoral han sido: 1) Identificar los factores del huésped implicados en la ligación de los viroides nucleares (familia Pospiviroidae) y cloroplásticos (familia Avsunviroidae) durante su replicación, empleando los sistemas experimentales viroide del tubérculo fusiforme de la pata (PSTVd)-tomate y viroide latente de la berenjena (ELVd)-berenjena. 2) Caracterizar la interacción de estos factores con los RNAs viroidales desde un punto de vista bioquímico y funcional. En el caso de los viroides nucleares, se ha identificado la DNA ligasa 1 como el factor probablemente implicado en la ligación de los RNAs monoméricos lineales. Respecto a los viroides cloroplásticos, diferentes ensayos in vitro han puesto de manifiesto que la tRNA ligasa es muy probablemente el factor del huésped implicado en la ligación de los intermediarios replicativos. / Nohales Zafra, MA. (2011). Caracterización de actividades RNA ligasa implicadas en la replicación de los viroides nucleares y cloroplásticos [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/12266

Los cítricos son huéspedes naturales de diferentes especies de viroides, todos pertenecientes a la familia Pospiviroidae. Estudios preliminares para detectar viroides en especies y variedades comerciales dieron resultados erráticos, excepto cuando se utilizaba la especie indicadora cidro Etrog como huésped bioamplificador. Para evitar el uso de este huésped en los ensayos de detección, se desarrolló un método basado en la hibridación northern. El protocolo desarrollado consistía en: (i) extracción de ácidos nucleicos de muestras de corteza recolectadas en diferentes épocas y/o almacenadas en distintas condiciones; (ii) separación de los RNAs en 5% PAGE o 1% agarosa y transferencia a membranas; (iii) hibridación con sondas de DNA marcadas con digoxigenina (DIG) específicas para cada viroide, detección con un anticuerpo anti-DIG conjugado con fosfatasa alcalina y revelado con un substrato quimioluminiscente (CSPD). Con este método se pueden detectar viroides en todas las especies de cítricos ensayadas. La técnica es extremadamente sensible, y acorta el tiempo necesario para la detección fiable de los viroides de cítricos conocidos hasta el momento. La aplicación de esta técnica ha permitido realizar prospecciones en árboles cultivados en distintas regiones citrícolas de Colombia, Perú y Brasil. En limas Tahití de Colombia se han identificado infecciones múltiples con HSVd y CDVd o con CEVd, HSVd y CDVd. Las muestras procedentes del Banco de Germoplasma de Palmira estaban libres de viroides, excepto una fuente de cidro Etrog que estaba infectada con CEVd y CDVd. / Murcia Riaño, N. (2009). DETECCIÓN Y CARACTERIZACIÓN AGRONÓMICA DE VIROIDES DE CÍTRICOS. IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN MOLECULAR Y BIOLOGÍCA DE VARIANTES DEL VIROIDE DEL ENANISMO DE LOS CÍTRICOS CDVd [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/6343

Tesis por compendio / In the first chapter, we determined that cucumber plants infected with hop stunt viroid (HSVd) accumulated high levels of sRNAs derived of ribosomal RNA (rb-sRNAs).Moreover, this effect was correlated with an increase of the transcription of the ribosomal RNAs precursors (rRNAs) due to a decrease in DNA methylation in its promoter region, revealing that certain ribosomal genes (usually silenced) reactivated its transcriptional activity during the infection. In the following chapter and in order to determine whether this process could be a common phenomenon to other plant-pathogen systems, we analyzed N.benthamiana transgenic plants that expressed, in a constitutive way, the viroid dimeric sequence. It was observed that the accumulation of the sRNAs in transgenic plants was similar to the one seen in infected cucumbers, promoting the imbalance of the rb-sRNAs accumulation. By bysulfited DNA sequencing we proved that this phenomenon turned to be linked with the loss of cytosine methylation in a symmetrical context. As with that observed in cucumber, this phenomenon was correlated with an increase of the transcription of these hypomethylated DNA regions. These data supported the idea that the HSVd was able to interfere with the regulation mechanisms in the host epigenetic level (methylation), suggesting that this phenomenon could happen generally in other viroid-host systems. In the third chapter, by immunoprecipitation essays, it was possible to determine that both in cucumberas in N. benthamiana plants, the HSVd formed an in vivo stable complex with the HISTONE DEACETYLASE 6 (HDA6), a key component in the process of methylation of diverse repetitive DNAs. These results suggested that the interaction HSVd-HDA6 would generate a functional deficit of HDA6 that might be responsible of the epigenetic alterations observed in the host during the infection. This hypothesis was consistent with the observation that the transient overexpression of HDA6 in infected plants reverted to the hypomethylation status of the rDNA. Unexpectedly, we observed that the HDA6 overexpression induced a significant reduction in the accumulation levels of the viroid in the infected plants. Also, the viroid accumulation in the infected cells increased when we transiently silenced the HDA6 expression, demonstrating the existence of an antagonistic relationship between the HDA6 concentration and the viroid. A hypothesis that allows explaining the information obtained and correlating them with an increase of biological viroid efficacy in the host is described in detail in the discussion of this chapter. Once determined that, in vegetative host tissue, the HSVd induces alterations in the epigenetic map of the promotor areas of rDNA, in the last chapter of this thesis we analyzed whether or not reproductive host tissue showed similar alterations during the infection. We analyzed pollen grains of infected cucumber plants. The structural analysis of these reproductive cells indicated that the HSVd accumulation induced a nuclear chromatin decodensation, responsible of the rRNAs transcription in the nucleus of the generative cell. This alteration was correlated with a significant demethylation of the ribosomal DNAs and transposable elements. By RT-PCR analysis it was possible to determine that this methylation pattern alteration correlated with a significant increase of transcriptional activity. This observation revealed that the HSVd infection also induced alterations in the transcriptional regulation mechanisms in the host reproductive tissue. This result allowed speculating with the possibility that these epigenetic modifications could happen in the next generation plants, awarding to the viroid an advantage for host adaptation. / En el primer capítulo determinamos que plantas de pepino infectadas con el viroide del enanismo del lúpulo (HSVd) acumulaban altos niveles de sRNAs derivados del RNA ribosomal. Además, este efecto se correlacionó con un aumento de la transcripción de los precursores de los RNAs ribosomales debido a una disminución de la metilación del DNA en su región promotora poniendo de manifiesto que ciertos genes ribosomales (normalmente silenciados) reactivaban su actividad transcripcional durante la infección. En el siguiente capítulo y con el objetivo de determinar si este proceso podía ser un fenómeno común a otros sistemas planta-patógeno, analizamos plantas de N.benthamiana transgénicas que expresaban de forma constitutiva la secuencia dimérica del viroide. Se observó cómo la acumulación de los sRNAs en plantas transgénicas era similar a la observada en los pepinos infectados, promoviendo el desequilibrio de la acumulación de rb-sRNAs. Mediante secuenciación de DNA bisulfitado demostramos que este fenómeno volvía a estar ligado con la pérdida de metilación de citosinas en un contexto simétrico. Al igual que en pepino este fenómeno correlacionaba con un aumento de la transcripción de estas zonas de DNA hipometiladas. En el tercer capítulo y mediante ensayos de immuno-precipitación, fue posible determinar que tanto en pepino como en N. benthaminana el HSVd formaba complejos estables in vivo con la proteína HISTONA DEACETILASA 6 (HDA6), un componente clave del proceso de metilación de diversos DNAs repetitivos, entre los que se encuentra el DNA ribosomal. Estos resultados sugerían que esta interacción HSVd-HDA6 generaría un déficit funcional de HDA6 que podría ser responsable de las alteraciones epigenéticas observadas en el huésped durante la infección. Esta hipótesis fue consistente con la observación de que la sobreexpresión transitoria de HDA6 en plantas infectadas revirtió el estado de hipometilación del rDNA inducido por el viroide. Inesperadamente, observamos que la sobreexpresión de HDA6 inducía una significativa reducción en los niveles de acumulación del viroide en la planta infectada. Además, la acumulación del viroide en las células infectadas aumentó al silenciar de forma transitoria la expresión de HDA6 evidenciando la existencia de una relación antagónica entre la concentración de HDA6 y la del viroide. Una vez determinado que, en tejidos vegetativos del huésped, el HSVd induce alteraciones en el mapa epigenético de las zonas promotoras del rDNA, en el último capítulo de esta tesis analizamos si tejidos reproductivos del huésped mostraban alteraciones similares durante la infección. Para ello se analizaron granos de polen de flores provenientes de plantas de pepino infectadas por el HSVd. El análisis estructural de estas células reproductivas indico que la acumulación de HSVd inducía la descondensación de la cromatina nucleolar responsable de la transcripción de los rRNAs en el núcleo generativo. Esta alteración correlacionó con una significativa desmetilación de DNAs ribosomales y los asociados a Elementos Transponibles. Mediante análisis de qRT-PCR fue posible determinar que esta alteración en los patrones de metilación se correspondía con un significativo aumento de su actividad transcripcional lo que permite afirmar que al igual que lo observado en hoja, la infección por HSVd induce alteraciones a nivel de los mecanismos de regulación transcripcional también en tejidos reproductivos del huésped. Esta observación permite especular con la posibilidad de que estas modificaciones epigenéticas podrían pasar a la siguiente generación de plantas, confiriendo de esta manera al viroide una ventaja en la adaptación al huésped. / En el primer capítol determinem que plantes de cogombre infectades amb el viroide del nanisme del llúpol (HSVd) acumulaven alts nivells d'sRNA derivats de l'RNA ribosòmic (rb-sRNA). A més, aquest efecte es va correlacionar amb un augment de la transcripció dels precursors dels RNA ribosòmics (rRNA) a causa d'una disminució de la metilació del DNA en la seua regió promotora, i va posar de manifest que certs gens ribosòmics (normalment silenciats) reactivaven la seua activitat transcripcional durant la infecció. En el següent capítol i amb l'objectiu de determinar si aquest procés podia ser un fenomen comú a altres sistemes planta-patogen, analitzem plantes de N. benthamiana transgèniques que expressaven de forma constitutiva la seqüència dimèrica del viroide. Es va observar como l'acumulació dels sRNA en plantes transgèniques era similar a l'observada en els cogombres infectats, promovent el desequilibri de l'acumulació d'rb-sRNA. Mitjançant la seqüenciació del DNA bisulfitat vam demostrar que aquest fenomen tornava a estar lligat a la pèrdua de metilació de citosines en un context simètric. De la mateixa forma que en el cogombre, aquest fenomen es correlacionava amb un augment de la transcripció d'aquestes zones de DNA hipometilades. En el tercer capítol, mitjançant assajos d'immunoprecipitació, va ser possible determinar que tant en cogombre com en N. benthaminana, l'HSVd formava complexos estables in vivo amb la proteïna HISTONA DEACETILASA 6 (HDA6), un component clau del procés de metilació de diversos DNA repetitius, entre els quals es troba el DNA ribosòmic. Aquests resultats suggerien que aquesta interacció HSVd-HDA6 generaria un dèficit funcional d'HDA6 que podria ser responsable de les alteracions epigenètiques observades en l'hoste durant la infecció. Aquesta hipòtesi va ser consistent amb l'observació que la sobreexpressió transitòria d'HDA6 en plantes infectades revertia l'estat d'hipometilació de l'rDNA induït pel viroide. Inesperadament, observem que la sobreexpressió d'HDA6 induïa una significativa reducció en els nivells d'acumulació del viroide en la planta infectada. A més, l'acumulació del viroide en les cèl·lules infectades va augmentar en silenciar de forma transitòria l'expressió d'HDA6, evidenciant l'existència d'una relació antagònica entre la concentració d'HDA6 i la del viroide. Una vegada determinat que, en teixits vegetatius de l'hoste, l'HSVd indueix alteracions en el mapa epigenètic de les zones promotores de l'rDNA, en l'últim capítol d'aquesta tesi analitzem si teixits reproductius de l'hoste mostraven alteracions similars durant la infecció. Amb aquesta finalitat, es van analitzar grans de pol·len de flors provinents de plantes de cogombre infectades per l'HSVd . L'anàlisi estructural d'aquestes cèl·lules reproductives va indicar que l'acumulació d'HSVd induïa la descondensació de la cromatina nucleolar responsable de la transcripció dels rRNA en el nucli generatiu. Aquesta alteració es va correlacionar amb una significativa desmetilació de DNA ribosòmics i els associats a elements transposables (TE). Mitjançant anàlisi de qRT-PCR va ser possible determinar que aquesta alteració en els patrons de metilació es corresponia amb un significatiu augment de la seua activitat transcripcional, la qual cosa va permetre afirmar que, igual que l'observat en la fulla, la infecció per HSVd induïa, també en els teixits reproductius de l'hoste, alteracions dels mecanismes de regulació transcripcional. Aquesta observació va permetre especular amb la possibilitat que aquestes modificacions epigenètiques pogueren passar a la següent generació de plantes, conferint d'aquesta manera al viroide un avantatge d'adaptació a l'hoste. / Castellano Pérez, M. (2017). ESTUDIO DE LAS ALTERACIONES EN EL PATRON DE METILACIÓN DEL DNA DEL HUÉSPED INDUCIDAS POR UN VIROIDE NUCLEAR [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/77992 / Compendio

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:33:40Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-07-04Bitstream added on 2014-06-13T18:45:43Z : No. of bitstreams: 1 silva_sr_dr_jabo.pdf: 2004552 bytes, checksum: 9add4746708701cae05ee9a28f001bfe (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Estacao Experimental de Bebedouro / Fundecitrus / Objetivando caracterizar sanitariamente a lima ácida ‘Tahiti’ clone Quebra-galho [C. latifolia (Yu. Tanaka) Tanaka] e selecionar plantas candidatas a matrizes, 80 plantas foram avaliadas quanto aos sintomas de tristeza, exocorte, sorose e pelo estado nutricional, desenvolvimento, produção e qualidade de frutos e por testes biológicos para as viroses citadas e xiloporose. Para viróides, empregou-se também RT-PCR. Todos os testes biológicos foram positivos para tristeza e negativos para xiloporose. Para exocorte, 82,5% dos testes foram positivos. No caso da sorose, 11,2% dos testes foram positivos apesar das plantas de campo não apresentarem sintomas. Quanto à tristeza, a reação em ‘Galego’ foi fraca (58,8%), média (40%) e forte (1,2%), sem caneluras nos ramos das plantas no campo. Os viróides Hop stunt viroid (HSVd), Citrus dwarfing viroid (CVd-III) e o Citrus exocortis viroid (CEVd) foram encontrados em 31,3%, 82,5% e 100,0% das plantas, respectivamente. Todas as plantas estudadas estavam infectadas com o CTV e com o CEVd, que foi encontrado isoladamente ou em combinação com outros viróides. Diferenças observadas na expressão dos sintomas de exocorte e tristeza na copa e no porta-enxerto podem ser atribuídas a interferências entre os viróides e a seleção pela multiplicação de gemas de árvores contaminadas por variantes pouco virulentas. O estado nutricional, o desenvolvimento, a produção e a qualidade dos frutos não apresentaram associação com o tipo de contaminação por viróides, o que também ocorreu com as plantas selecionadas como candidatas a matrizes em função da produção e qualidade física dos frutos. / Aiming at to characterize sanitarily the acid lime ‘Tahiti’ clone “Quebragalho” [C. latifolia (Yu. Tanaka) Tanaka] and select applicant mother plants, 80 plants were evaluated about the symptoms of tristeza disease, exocortis, psorosis and nutritional state, development, production and quality of the fruits, and by biological tests for the cited viruses and xyloporosis. For the viroids, was used RT-PCR too. All the biological tests were positive for tristeza disease and negative for xyloporosis. For exocortis, 82.5% of the tests were positive. In the case of the psorosis, 11.2% of the tests were positive although the plants in the field do not present symptoms. To the tristeza disease, the reaction in 'Galego' was of weak (58.8%), middle (40.0%) and strong (1.2%), without pittings in the branches of the plants in the field. The viroids Hop stunt viroid (HSVd), Citrus dwarfing viroid (CVd-III) and the Citrus exocortis viroid (CEVd) were found, respectively, in 31.3%, 82.5% and 100.0% of the plants. All of the plants in study were infected with the CTV and the CEVd, that was found isolately or in combinations with other viroids. Differences observed in the expression of the exocortis symptoms and tristeza disease in the cup and in the rootstock can be attributed to interferences between the viroids and the selection by the multiplication through cuttings of infected trees by strains few virulent. The nutritional state, development, production and quality of the fruits, did not presented association with the type of contamination by viroids, what also occurred with the applicant mother plants selected in function of the production and physical quality of the fruits.

Tesis por compendio / Viroids, small circular RNAs (246-401 nt) with a high content in secondary structure that until recently have been detected only in higher plants, are the simplest infectious agents in the biological scale and do not encode any protein. Therefore, they depend on their genomic sequence and structural motifs to use the transcription, processing, and trafficking machinery of their hosts in order to be replicated and invade them systemically, leading eventually to economically important diseases. The secondary structure of nuclear viroids (family Pospiviroidae) is generally rod-like, while in some chloroplastic viroids (family Avsunviroidae) it is multi-branched. These conformations are mostly supported by data in silico (resulting from algorithms that predict the secondary structure with minimal free energy) and in vitro (using biophysical or biochemical approaches). The assumption that the conformation of the viroid RNAs in vitro is similar or even identical to that adopted in vivo is questionable due, among other reasons, to the different ionic conditions used in in vitro analyses with respect to those existing in planta, as well as to a number of interactions with the proteins or other factors in the host. Therefore, in the present Doctoral Thesis, the in vivo structures of three viroids have been studied, applying different approaches. In the eggplant latent viroid (ELVd), taking advantage of its high genetic variability, co-variations and compensatory mutations have been screened in natural variants in order to confirm or refine in vivo the structures predicted in silico for both viroid strands and those obtained through in vitro SHAPE (2'-hydroxyl groups analysed by primer extension). The results of the three methodologies are consistent for ELVd (+) RNA and lead to a quasi-rod-like conformation with a bifurcation at each terminal domain. This structure, although similar, is not identical to that of ELVd (-) RNA, because its conformation has a central cruciform motif (confirmed in vivo by the presence of covariations therein) and because, in addition, both RNAs show different electrophoretic mobilities in native polyacrylamide gels. The in vitro results for ELVd (-) RNA were less consistent with those obtained in silico and in vivo. On the other hand, the high accumulation of the monomeric circular (mc) positive RNAs of potato spindle tuber viroid (PSTVd) and avocado sunblotch viroid (ASBVd) in Nicotiana benthamiana, and avocado respectively, allowed the determination of the in vivo structure of both RNAs by SHAPE, enabling their direct comparison with the conformations derived previously in vitro using the same technique, and those predicted in silico. The structures determined in vivo for mc PSTVd (+) and mc ASBVd (+) RNAs are very similar (but not identical) to those observed in silico and by in vitro SHAPE. These results provide the first direct evidence that, in their physiological context, the circular RNAs of two viroids, one nuclear and other chloroplastic, are essentially naked and not strongly associated with host proteins. However, we have observed that the conserved central region of mc PSTVd (+) RNA, particularly the loop-E involved in replication and other functions, shows a lower SHAPE reactivity in vivo, possibly due to interactions with one or more proteins mediating these functions or to structural changes induced by other factors of their natural habitat. The low accumulation of mc ASBVd (-) RNA in its host, only allowed for the examination of its structure in silico and by in vitro SHAPE, leading to a rod-like conformation similar to, but not identical, that of mc ASBVd (+) RNA, since the electrophoretic mobility of both RNAs in native polyacrylamide gels is slightly different. / Los viroides, pequeños RNAs circulares (246-401 nt) con un elevado contenido en estructura secundaria que hasta ahora sólo han sido detectados en plantas superiores, son los agentes infecciosos más simples de la escala biológica y no codifican proteína alguna. Por lo tanto, dependen de motivos de secuencia y estructura de su genoma para utilizar la maquinaria de transcripción, procesamiento y tráfico de sus huéspedes con el fin de ser replicados e invadirlos sistémicamente, llegando a producir enfermedades de importancia económica. La estructura secundaria de los viroides nucleares (familia Pospiviroidae) es en general de tipo varilla, mientras que presenta múltiples ramificaciones en algunos viroides cloroplásticos (familia Avsunviroidae). Estas conformaciones están sostenidas por datos mayoritariamente obtenidos in silico (con algoritmos que predicen la estructura secundaria con menor energía libre) e in vitro (por métodos biofísicos o bioquímicos). La asunción de que la conformación de los RNAs viroidales in vitro es similar o incluso idéntica a la que adoptan in vivo es cuestionable debido a las diferentes condiciones iónicas utilizadas en los análisis in vitro con respecto a las existentes in planta, así como a las interacciones con proteínas u otros factores del huésped. Por ello, en la presente Tesis Doctoral se han estudiado las estructuras in vivo de tres viroides aplicando diferentes metodologías. En el viroide latente de la berenjena (ELVd), aprovechando su gran variabilidad genética, se han rastreado covariaciones y mutaciones compensatorias en variantes naturales que confirmen o afinen in vivo las estructuras de las dos cadenas del viroide predichas in silico y las obtenidas in vitro mediante SHAPE (2'-hidroxilo analizada por extensión del cebador). Los resultados de las tres metodologías son consistentes entre sí para el ELVd (+) RNA y conducen a una conformación en varilla con una bifurcación en cada extremo. Esta estructura es similar pero no idéntica a la del ELVd (-) RNA, ya que su conformación presenta un motivo cruciforme central (confirmado in vivo por la presencia de covariaciones en el mismo) y, además, ambos RNAs muestran movilidades electroforéticas distintas en geles de poliacrilamida nativos. Los resultados in vitro para el ELVd (-) RNA fueron menos consistentes con los obtenidos in silico e in vivo. Por otra parte, la alta acumulación de las formas monoméricas circulares (mc) positivas de los viroides del tubérculo fusiforme de la patata (PSTVd) y del manchado solar del aguacate (ASBVd) en Nicotiana benthamiana y aguacate, respectivamente, ha permitido aplicar una modificación de la metodología SHAPE para determinar la estructura in vivo de ambos RNAs, facilitando su comparación directa con las estructuras previamente derivadas in vitro mediante la misma técnica, y las predichas in silico. Las estructuras in planta de los mc PSTVd (+) y mc ASBVd (+) RNAs son muy similares (pero no idénticas) a las observadas in silico y mediante SHAPE in vitro. Estos resultados aportan las primeras pruebas directas de que los RNAs circulares de dos viroides, uno nuclear y el otro cloroplástico, se encuentran en su contexto fisiológico mayoritariamente desnudos y no fuertemente asociados a proteínas del huésped. Sin embargo, hemos observado que la región central conservada del mc PSTVd (+) RNA, particularmente el bucle E implicado en replicación y otras funciones, muestra una menor reactividad SHAPE in vivo posiblemente debida a la interacción con una o más proteínas que medien dichas funciones o a cambios estructurales motivados por otros factores del hábitat natural. Dada la baja concentración en su huésped del mc ASBVd (-) RNA, su estructura únicamente se ha estudiado in silico y por SHAPE in vitro, conduciendo a una conformación de tipo varilla parecida a, pero no la misma que la del mc ASBVd (+) RNA, ya que la movilidad electroforética de los dos RNAs e / Els viroides, menuts RNAs circulars (246-401 nt) amb un elevat contingut en estructura secundària que fins ara només han estat detectats en plantes superiors, són els agents infecciosos més simples de l'escala biològica, i no codifiquen proteïnes. Per tant, depenen de motius de seqüència i estructura del seu genoma per tal d'utilitzar (i fins i tot modular) la maquinària de transcripció, processament i tràfic dels seus hostes amb la finalitat de ser replicats i envair-los sistèmicament, arribant a produir malalties d'importància econòmica. L'estructura secundària dels viroides nuclears (família Pospiviroidae) és en general de tipus vareta, i presenta múltiples ramificacions en alguns viroides cloroplàstics (família Avsunviroidae). Aquestes conformacions estan majoritàriament sostingudes per dades in silico (mitjançant algoritmes que prediuen l'estructura secundària amb menor energia lliure) i in vitro (amb mètodes biofísics o bioquímics). L'assumpció que la conformació dels RNAs viroidals in vitro és similar, o fins i tot idèntica, a aquella que adopten in vivo és qüestionable a causa de, entre altres raons, les diferents condicions iòniques utilitzades en les anàlisis in vitro pel que fa a les existents in planta, així com a les interaccions amb proteïnes o altres factors de l'hoste. Per això, en la present Tesi Doctoral s'han estudiat les estructures in vivo de tres viroides aplicant diferents metodologies. En el viroide latent de l'albergínia (ELVd), aprofitant la seua gran variabilitat genètica, s'han rastrejat covariacions i mutacions compensatòries en variants naturals que confirmen o afinen in vivo les estructures de les dues cadenes del viroide predites in silico i aquelles obtingudes in vitro mitjançant SHAPE (2'-hidroxil analitzada per extensió del cebador). Els resultats de les tres metodologies són consistents entre si per a l'ELVd (+) RNA, i condueixen a una conformació en vareta amb una bifurcació a cada extrem. Aquesta estructura, si bé similar, no és idèntica a aquella de l'ELVd (-) RNA, ja que la seua conformació presenta un motiu cruciforme central (confirmat in vivo per la presència de covariacions en el mateix) i, a més, tots dos RNAs mostren mobilitats electroforètiques diferents en gels de poliacrilamida natius. Els resultats in vitro per a l'ELVd (-) RNA són menys consistents amb les dades obtingudes in silico i in vivo. D'altra banda, l'alta acumulació de les formes monomèriques circulars (mc) positives dels viroides del tubercle fusiforme de la creïlla (PSTVd) i del tacat solar de l'alvocat (ASBVd) en Nicotiana benthamiana i alvocat respectivament, ha permès aplicar una modificació de la metodologia SHAPE per a determinar l'estructura in vivo de tots dos RNAs, possibilitant la comparació directa amb l'estructura prèviament derivada in vitro amb la mateixa tècnica, i la conformació predita in silico. Les estructures de tipus vareta obtingudes per als mc PSTVd (+) i mc ASBVd (+) RNAs és molt similar (però no idèntica) a les observades in silico i mitjançant SHAPE in vitro. Aquests resultats aporten les primeres proves directes que, en el seu context fisiològic, els RNAs circulars dels viroides nuclears i cloroplàstics es troben majoritàriament nus i no fortament recoberts per proteïnes de l'hoste. No obstant això, hem observat una menor reactivitat SHAPE in vivo de la regió central conservada del PSTVd, particularment del bucle E implicat en replicació i en altres funcions, possiblement a causa de la interacció amb una o més proteïnes que intervenen aquestes funcions o a canvis estructurals motivats per altres factors de l'hàbitat natural. Atesa la baixa concentració del mc ASBVd (-) RNA en el seu hoste, la seua estructura únicament s'ha estudiat in silico i amb SHAPE in vitro, conduint a una conformació de tipus vareta semblant a, tot i que no la mateixa, aquella del mc ASBVd (+) RNA, ja que la mobilitat electroforètica de / López Carrasco, MA. (2017). Disección de la estructura secundaria in silico, in vitro e in vivo de RNAs viroidales nucleares y cloroplásticos [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/86145 / Compendio