Las células de la cresta neural (CCN) conforman una población transitoria presente solo en etapas muy tempranas del desarrollo embrionario de vertebrados. Estas células se caracterizan por su multipotencia y capacidad migratoria, y es sabido que defectos en el proceso de migración lleva a severos trastornos congénitos conocidos como neurocristopatias. Las CCN, para adquirir sus propiedades migratorias, sufren un proceso de transición epiteliomesénquima (TEM), similar a lo que ocurre durante el inicio de la metástasis tumoral. Se ha determinado que los microARNs conforman un grupo de reguladores claves de la TEM tumoral. Considerando lo dicho, nos planteamos como objetivo determinar la existencia de una red regulatoria epigenéticamicroARN que desempeñe un papel importante en la migración de las CCN. Es así que, mediante análisis in silico, se encontró que los reguladores claves de la TEM en las CCN, tales como son los genes PHD12 y Snail2, son blancos tentativos del mismo miR-203. Al analizar la expresión de miR-203 mediante hibridación in situ y RT-qPCR se observó que se expresa fuertemente desde estadios muy tempranos en la placa neural y el tubo neural. Sin embargo, su expresión disminuye en el tubo neural dorsal coincidentemente con el inicio de la migración de las CCN. Por otra parte, se observó mediante secuenciación por bisulfito, que la región genómica de miR-203 se encuentra hipermetilada en las CCN pre-migratorias, a diferencia de la hipometilación encontrada en las células del tubo neural ventral y CCN migratorias. Finalmente, la pérdida de función de miR-203, utilizando un vector “esponja” de microARNs, lleva a una migración prematura de las CCN. Estos resultados en conjunto indican que la inhibición de la expresión de miR-203, mediante metilación del ADN, permite el aumento de la expresión de los genes PHD12 y Snail2 los cuales están directamente involucrados en la TEM de las CCN. Los resultados obtenidos en este proyecto pueden tener grandes implicancias que permitirán tener un mayor entendimiento sobre los errores que pueden conducir a un desarrollo anormal, así como también para comprender la metástasis tumoral.

Magister en biomedicina celular y molecular / El síndrome de Sjögren (SS) es una enfermedad autoinmune, inflamatoria, crónica y sistémica, de etiología desconocida y afecta principalmente a glándulas salivales y lagrimales. Se ha estudiado la respuesta a proteínas mal plegadas (UPR= del inglés Unfolded protein response) en glándulas salivales labiales (GSL) de pacientes SS, evidenciando diferencias en la expresión de componentes de la vía de señalización IRE1α (Inositol-requiring enzyme 1a). En esta tesis se evaluó si los cambios de expresión de proteínas involucradas en la vía IRE1α podría deberse a cambios epigenéticos. En este contexto, se realizó el análisis de metilación global del DNA y de las regiones promotoras de genes de la vía IRE1α en GSL de pacientes SS y controles. También se estudió el efecto de citoquinas pro-inflamatorias, sobre el estado de metilación de promotores de genes de la vía IRE1α en cultivos de células de glándula submandibular humana (HSG). La metilación de los promotores se evaluó mediante PCR sensible a metilación o análisis de disociación de alta resolución sensible a metilación y la metilación global se determinó mediante inmunofluorescencia. Los resultados obtenidos mostraron un aumento significativo en la metilación de los promotores de los genes IRE1α, XBP-1 (del inglés X box-binding protein-1) y GRP78 (del inglés Glucose-Regulated Protein, 78kDa) en GSL de pacientes SS. Se observó una correlación positiva significativa del estado de metilación de los promotores mencionados con los niveles de citoquinas pro-inflamatorias (TNF-α e IFN-γ) presentes en las GSL. La metilación global del DNA en cortes de GSL de pacientes SS mostró una disminución significativa comparada con los individuos controles. La metilación global del DNA se relacionó negativamente con el score de foco. La hipometilación global del DNA de GSL de pacientes SS podría explicar la sobre-expresión de ciertos genes, como se ha demostrado en otras enfermedades autoinmunes, como LES. En células HSG tratadas con TNF-α o IFN-γ (10 ng/mL) se evidenció un aumento en el índice de metilación del promotor de GRP78 luego de 24 hrs de tratamiento, mientras que para el promotor de IRE1α se encontró un aumento en el estado de metilación luego de 48 hrs de estimulación con TNF-α (1 ng/mL). El aumento de la metilación en los promotores de los genes de IRE1α, XBP-1 y GRP78 podría explicar, en parte, los niveles disminuidos de sus respectivos mRNAs en las GSL de pacientes SS. Los análisis de correlación sugieren que las citoquinas podrían regular el estado de metilación de los tres promotores estudiados en GSL de pacientes SS. Más aún, los estudios in vitro muestran que las citoquinas pro-inflamatorias (TNF-α e IFN-γ) aumentan los niveles de metilación en los promotores de IRE1α y GRP78, resultados que validan los análisis de correlación entre los niveles de mRNAs de estas citoquinas y los índices de metilación de los promotores respectivos en GSL de pacientes SS.

Varios microsatélites inestables se caracterizan por la presencia de nucleótidos de citosinas en sus unidades de repetición; adoptan estructuras de DNA alternativas a la convencional y en algunos casos, involucran procesos de metilación. El genotipado de tripletes por PCR convencional se fundamenta en la denaturación del DNA y posterior amplificación del triplete repetido. Sin embargo, debido las estructuras alternativas que adoptan estos microsatélites, las reacciones de denaturación y amplificación son ineficientes. En este trabajo desarrollo una alternativa de diagnóstico por PCR para secuencias ricas en citosinas (metiladas y no metiladas) basada en modificación nucleotídica. Previo consentimiento se modificó el gen del retardo mental ligado al fragilidad del cromosoma X tipo 1,cuya siglas en ingles es FMR1(Fragile X Mental Retardation 1) de ocho individuos normales (cuatro mujeres y cuatro varones) empleando bisulfito de sodio, cambiando las citosinas en uracilo. Posteriormente, con el uso de bioinformática, se realizó:1) La simulación de las estructuras alternativas que adopta el microsatélite inestable contenido en la región 5’-UTR del gen. 2) Luego de la ubicación de las islas CpG, se generaron cebadores específicos que hibriden con el microsatélite modificado (Primer T) y cebadores específicos que hibriden con una secuencia modificada del gen FMR1 que contiene las islas CpG (Primer M). Finalmente, ambas secuencias fueron amplificadas por PCR convencional. La modificación del DNA fue evidenciada por espectrofotometría al uracilo, luego de tratamiento químico con bisulfito de sodio. La estructura que fue evidenciada por métodos bioinformaticos fue la estructura llamada hairpins (Horquillas). Se encontraron dos potenciales islas CpG en la región estudiada. La amplificación con los cebadores T confirmó el diseño in silico desarrollado para abordar la estructura en hairpins y el efecto que ejerce la modificación sobre este tipo de estructura. La amplificación con los cebadores M permitió detectar metilación de la primera isla CpG del gen FMR1 en el cromosoma x inactivo. En conclusión se desarrolló un método alternativo para amplificación de secuencias de microsatélite en rango normal, que contengan citosinas metiladas y no metiladas, que permite la amplificación mediante PCR. Se requieren estudios posteriores con muestras de DNA que contengan microsatélites anormalmente expandidos (metilados y no metilados) para validar su aplicación clínica diagnóstica. -- Palabras clave: metilación, modificación nucleotídica, tripletes repetidos / -- Many unstable microsatellites are characterized by presenting cytosine nucleotides in their repeat units, adopting alternative DNA structures and, in some cases, are involved in methylation processes. Triplet sequences genotyping by PCR methodology is based on DNA denaturation and amplification of the unstable microsatellite. However, due to alternative structures adopted by microsatellites, denaturation and amplification processes are inefficient. This thesis developed an alternative PCR genotyping method for cytosine rich sequences (methylated and unmethylated) based on nucleotide modification. After appropriate informed consent, the FMR1 gene from 8 healthy subjects (four male and four female) was modified with sodium bisulfite. Subsequently, using bioinformatics tools, we performed: 1) simulation of alternative structures of the unstable microsatellite in the 5’-UTR region of the gene. 2) After localization of the CpG islands, we generated specific primers which hybridize with the modified microsatellite (Primers T) and specific primers that hybridize to a new sequence of the FMR1 gene containing CpG islands (Primers M). Finally, both of these sequences were amplified by PCR. Modified DNA was obtained after chemical treatment with sodium bisulfite. Alternative structures of the sequence of the microsatellite were characterized. CpG islands of the gene, that can be methylated, were identified. Amplification confirmed expected results obtained previously by bioinformatics analysis. The T primers amplified the modified microsatellite of the FMR1 gene. The M primers amplified the modified sequence containing the CpG Island of the gene. In conclusion, we developed a potential alternative genotyping method for amplification of microsatellite sequences carrying methylated and unmethylated cytosine Further studies are needed in DNA samples from individual with abnormally expanded microsatellites both methylated and unmethylated to validate clinical application. -- Key words: methylation, nucleotide modification, triplet repeats

Grado de magíster en biomedicina celular y molecular / síndrome de Sjögren (SS) es una exocrinopatía autoinmune crónica, inflamatoria y sistémica que afecta principalmente a las glándulas salivales (GS) y lagrimales. Resultados de nuestro laboratorio demuestran que las células acinares de las GS de pacientes SS presentan estrés de retículo endoplásmico (RER) y un aumento en la expresión del sensor ATF6α y del factor de transcripción ATF4 de la vía PERK de la respuesta a proteínas mal plegadas. También, se ha determinado niveles variables de transcrito de la chaperona calreticulina (CALR). Considerando el rol relevante que se le ha atribuido a la epigenética en la patogénesis de otras enfermedades autoinmunes surge la pregunta: ¿Es posible que la expresión diferencial de ATF4, ATF6α y CALR en GS de pacientes SS pueda estar regulada por mecanismos epigenéticos, tal como la metilación del DNA? Para determinarlo se evaluó el porcentaje de metilación del DNA de los respectivos promotores utilizando MS-HRM y los resultados se correlacionaron con los datos clínicos de los pacientes SS. Interesantemente, las GS de pacientes SS han mostrado que las células epiteliales contribuyen con el ambiente inflamatorio al sobreexpresar citoquinas pro-inflamatorias como TNF-α e IFN-. En esta tesis se determinó el efecto de IFN- y TNF-α en la metilación de los promotores de los genes de interés en acinos 3D. Con el propósito de averiguar si los cambios observados se relacionaron con las enzimas metilasas y desmetilasas, es que se determinaron los niveles de transcrito de DNMT1, DNMT3A y TET2. Los resultados obtenidos en GS labiales de pacientes SS comparado con controles mostraron: 1. un aumento significativo en la metilación del DNA para el promotor del gen de ATF4 que se correlacionó positivamente con los niveles de transcritos de TNF-α e IFN-, 2. una disminución de la metilación del promotor del gen de ATF6α que se correlacionó negativamente con los niveles de los transcritos de las citoquinas evaluadas, y 3. no se encontraron cambios en la metilación del promotor de CALR. Paralelamente, se determinó que el porcentaje de metilación del promotor de ATF6α correlacionó negativamente con los autoanticuerpos ANA. Sin embargo, es complejo establecer cuáles son los blancos antigénicos que dan cuenta de esta correlación. Asimismo, las correlaciones clínicas obtenidas validan la muestra de pacientes utilizada en este estudio, mostrando que la inflamación se asocia al daño glandular y consecuentemente a la alteración de la función de las GS. En los acinos 3D estimulados por 24 h con TNF-α o IFN- (1 y 10 ng/mL) se corroboró lo observado en GSL de pacientes SS, evidenciando un aumento del porcentaje de metilación del promotor del gen de ATF4, una disminución del promotor del gen de ATF6α y no cambios en CALR. Por otra parte, la metilación del promotor de los genes de ATF4 y de ATF6α correlacionó negativamente con los niveles de transcritos respectivos. Paralelamente, los niveles de transcritos de DNA-metiltransferasas (DNMT1, DNMT3A) y la desmetilasa TET2 aumentaron significativamente en acinos 3D estimulados con citoquinas. Este aumento en los niveles de transcritos explicaría, en parte, la metilación diferencial del promotor de ATF4 y de ATF6α bajo las condiciones de estudio. Por lo tanto, las citoquinas proinflamatorias promueven cambios en la metilación del DNA de los promotores de los genes estudiados. Además, los niveles de transcritos de metilasas y desmetilasa se podrían incidir en la metilación diferencial de los promotores de ATF4 y ATF6α bajo las condiciones del estudio. En conclusión, las citoquinas pro-inflamatorias promueven cambios en la metilación del DNA de los promotores génicos ATF4 y ATF6α y, estos cambios en la metilación de los promotores podrían contribuir a la regulación de la UPR en las GSL de pacientes con SS. / Sjögren's syndrome (SS) is a chronic, autoimmune, inflammatory and systemic exocrinopathy that mainly affects salivary glands (SG) and lacrimal glands. Results from our laboratory demonstrate that SG acinar cells from SS patients show stress in the endoplasmic reticulum and an increased expression of ATF6α sensor and ATF4 transcription factor, member of the PERK pathway of the unfolded protein response. Also, SS patients showed variable levels calreticulin transcript levels (CALR). Considering the relevant role attributed to epigenetics in the pathogenesis of autoimmune diseases, the question arises: Is it possible that the differential expression of ATF4, ATF6α and CALR in SG from SS-patients could be regulated by epigenetic mechanisms, such as DNA methylation? The percentage of DNA methylation of the ATF4, ATF6α and CALR gene promoters were evaluated using methylation-sensitive high resolution melting (MS-HRM). Results were correlated with the clinical data of SS patients. Interestingly, SG from SS-patients has shown that epithelial cells contribute to the inflammatory environment by overexpressing relevant pro-inflammatory cytokines such as TNF-α and IFN-γ. In this thesis we determined the effect of IFN-γ and TNF-α on methylation of promoters of the genes of interest in 3D acini. To determine if the observed changes were related to the levels of methylase and demethylase enzymes, transcript levels of DNMT1, DNMT3A and TET2 were determined. The results obtained in labial SG (LSG) of SS patients compared with controls showed: 1. a significant increase of DNA methylation in ATF4 gene promoter that positively correlated with TNF -α and IFN-γ transcript levels, 2. a significant decrease in DNA methylation in ATF6α gene promoter that negatively correlated with TNF-α and IFN-γ transcript levels, 3. no changes were found in the methylation of the CALR promoter. The methylation of the ATF6α promoter correlated negatively with ANA antibodies levels. However, it is complex to establish the antigenic targets that account for this correlation. Aditionally, the clinical correlations obtained validate the set of patients used in this study showing that the inflammation is associated with the glandular damage and consequently to the alteration of the GS function. Results observed in LSG of SS patients were confirmed in 3D acini stimulated with TNF-α or IFN-γ (1 and 10 ng/mL) for 24 h, showing an increase in the methylation percentage of the ATF4 gene promoter, a decrease of the ATF6α gene promoter and no changes in CALR. On the other hand, promoter methylation of the ATF4 and ATF6α genes negatively correlated with their respective transcript levels. In parallel, levels of DNA-methyltransferase transcripts (DNMT1, DNMT3A) and TET2 desmethylase increased significantly in cytokine-stimulated 3D acini. These results could partly explain the differential methylation of the ATF4 promoter and ATF6α under the present experimental conditions. Therefore, proinflammatory cytokines promote changes of promoter DNA methylation of the studied genes. Comparatively, levels of methylase and desmethylase transcripts could influence the differential methylation of ATF4 and ATF6α promoters under conditions studied. In conclusion, proinflammatory cytokines promote changes in the methylation of ATF4 and ATF6α promoters and these changes in DNA methylation would contribute to the regulation of UPR in the LSG of patients with SS.

Magister en Neurociencias / La epigenética como ciencia se dedica al estudio de la regulación de la transcripción de genes determinados, que está dada sin alteración en la secuencia de las bases nitrogenadas, siendo esta regulación marcas mitótica y meióticamente heredables. Diversas enfermedades han demostrado alteraciones en los patrones de metilación y por ende implicancia ambiental en la génesis de una patología determinada, entre estas encontramos el síndrome de Rett, Síndrome ATRX, Síndrome X frágil, e incluso publicaciones recientes han demostrado modificaciones epigenéticas en la patogenia del Alzheimer y el Parkinson. En este contexto y dada la prevalencia de enfermedades neurodegenerativas en nuestro país, y en especial de la enfermedad de Parkinson en la población chilena, es primordial evaluar la influencia ambiental que provoca la contaminación por metales en las modificaciones transcripcionales de genes puntuales y de significancia patológica y de cómo estos repercuten en la incidencia del Parkinson. Para esto se ha seleccionado una población minera del norte de nuestro país, en donde se ha descrito una gran incidencia y agregación de pacientes con enfermedad de Parkinson, los cuales comparten un factor ambiental en común: El haber estado expuestos a metales. Mi proyecto de tesis implica evaluar las diferencias en los patrones de metilación globales por medio de anticuerpos específicos para citosinas metiladas, analizando 4 grupos de trabajo: Pacientes parkinsonianos expuestos a contaminantes (trabajadores mineros), pacientes sanos expuestos a metales (trabajadores mineros), pacientes parkinsonianos sin exposición (muestras obtenidas de pacientes de Santiago) y pacientes sanos sin exposición (controles sanos de Santiago). Con esto se espera encontrar un espectro de metilación desde la muestra más metilada, (el control negativo, paciente sano sin exposición), hasta las muestras menos metiladas (pacientes parkinsonianos expuestos a metales). 5 Posteriormente se analizará el gen alfa-sinucleina (SNCA), el cual se ha descrito hipometilado en pacientes con Parkinson Idiopático (Ahmad Jowaed, 2010). Para esto se desarrollarán partidores específicos, tanto para muestras metiladas como no metiladas. Posteriormente se someterán tanto partidores como muestras a la secuenciación por bisulfito para posteriormente amplificar las muestras mediante PCR.

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El cáncer colorrectal (CCR) permanece hoy día como una de las neoplasias con mayor incidencia y mortalidad en España. Su etiología es multifactorial, influyendo alteraciones genéticas y/o epigenéticas por un lado y factores ambientales que incluyen a la dieta y ciertos hábitos tóxicos por otro. El diagnóstico de confirmación se lleva a cabo mediante el análisis anatomopatológico de una muestra tumoral obtenida a través de una colonoscopia, mientras que para el tratamiento curativo se dispone de la opción quirúrgica asociando o no quimioterapia y/o radioterapia, en función de la localización y estadiaje tumoral. La carcinogénesis colorrectal se inicia en las células epiteliales colónicas, experimentando cambios que derivan desde una mucosa sana en la formación de pólipos. Muchas de estas neoformaciones benignas evolucionarán hacia la formación de un adenocarcinoma en caso de no ser extirpadas. Esta secuencia de acontecimientos, la denominada secuencia adenoma-carcinoma, se desarrolla a lo largo de varios años en la mayor parte de los casos. A día de hoy, se conocen 3 vías diferentes de carcinogénesis por las que tiene lugar esta secuencia adenoma-carcinoma: la vía de la inestabilidad cromosómica, la vía de inestabilidad de microsatélites y la vía serrada. Cada una posee alteraciones genéticas/epigenéticas diferentes, aunque en algunos casos se comparten. Visualizando en conjunto estas vías, existen cuatro marcadores al menos que han demostrado ejercer una influencia en la evolución tumoral: BRAF, KRAS, metilación aberrante (CIMP) e inestabilidad de microsatélites. En la presente tesis se pretende investigar si alteraciones a estos niveles puedan implicar pronósticos diferentes y respuesta a la quimioterapia. El artículo 1 divide el CCR en 5 subtipos, según combinaciones genético-moleculares en los 4 marcadores comentados que concuerden con las vías carcinogénicas conocidas. En una muestra de casi 900 pacientes, se evaluó si dichas combinaciones conferían un pronóstico y una respuesta a quimioterapia estándar diferentes. Así, el subtipo 2, perteneciente a un subgrupo de pacientes con CCR de la vía serrada con mutación en BRAF y fenotipo metilador, exhibían la tasa de supervivencia más baja al final del seguimiento. Por el contrario, los pacientes con CCR del subtipo 5, familiares con inestabilidad de microsatélites, presentaban la más alta. El subtipo 3, y principalmente el subtipo 4, es decir, los más frecuentes, mostraron una respuesta favorable a la quimioterapia. En el resto de subtipos dicho efecto no pudo ser valorado con fiabilidad por un tamaño muestral deficiente al tratarse de CCR con combinaciones genético/moleculares menos frecuentes. No obstante, a la luz de los resultados obtenidos parece pertinente dividir el CCR en subtipos con el fin de lograr un mejor manejo de estos pacientes. El artículo 2 pretende evaluar la utilidad del marcador TFAP2E para predecir una falta de respuesta a la quimioterapia, en caso de hallarse metilado, en pacientes con CCR. Se incluyeron pacientes de una cohorte observacional y de un ensayo clínico, en total casi 800 pacientes. Los resultados mostraron que, en estadío metastásico, la presencia de metilación en TFAP2E no se correlacionaba con una mejor ni peor respuesta al tratamiento quimioterápico, mostrando una supervivencia global similar frente a los pacientes con CCR sin metilación. En estadíos II y III, la cohorte observacional no mostró diferencias en términos de supervivencia libre de enfermedad al comparar pacientes con tumores metilados y no metilados en TFAP2E, tampoco al analizar ambos estadíos por separado. Únicamente se objetivó en la cohorte clínica una peor supervivencia en pacientes con CCR estadío II y metilación en dicho gen. En resumen, ambos artículos muestran que las alteraciones genéticas correspondientes a mutaciones en BRAF y KRAS, la inestabilidad de microsatélites y la metilación de ciertos genes pueden ser de gran utilidad a la hora predecir la evolución natural de un paciente con CCR y su respuesta a fármacos. De este modo, queda patente el potencial papel que determinados biomarcadores puede ejercer a la hora de tomar decisiones en el manejo de estos pacientes.

Tesis por compendio / In the first chapter, we determined that cucumber plants infected with hop stunt viroid (HSVd) accumulated high levels of sRNAs derived of ribosomal RNA (rb-sRNAs).Moreover, this effect was correlated with an increase of the transcription of the ribosomal RNAs precursors (rRNAs) due to a decrease in DNA methylation in its promoter region, revealing that certain ribosomal genes (usually silenced) reactivated its transcriptional activity during the infection. In the following chapter and in order to determine whether this process could be a common phenomenon to other plant-pathogen systems, we analyzed N.benthamiana transgenic plants that expressed, in a constitutive way, the viroid dimeric sequence. It was observed that the accumulation of the sRNAs in transgenic plants was similar to the one seen in infected cucumbers, promoting the imbalance of the rb-sRNAs accumulation. By bysulfited DNA sequencing we proved that this phenomenon turned to be linked with the loss of cytosine methylation in a symmetrical context. As with that observed in cucumber, this phenomenon was correlated with an increase of the transcription of these hypomethylated DNA regions. These data supported the idea that the HSVd was able to interfere with the regulation mechanisms in the host epigenetic level (methylation), suggesting that this phenomenon could happen generally in other viroid-host systems. In the third chapter, by immunoprecipitation essays, it was possible to determine that both in cucumberas in N. benthamiana plants, the HSVd formed an in vivo stable complex with the HISTONE DEACETYLASE 6 (HDA6), a key component in the process of methylation of diverse repetitive DNAs. These results suggested that the interaction HSVd-HDA6 would generate a functional deficit of HDA6 that might be responsible of the epigenetic alterations observed in the host during the infection. This hypothesis was consistent with the observation that the transient overexpression of HDA6 in infected plants reverted to the hypomethylation status of the rDNA. Unexpectedly, we observed that the HDA6 overexpression induced a significant reduction in the accumulation levels of the viroid in the infected plants. Also, the viroid accumulation in the infected cells increased when we transiently silenced the HDA6 expression, demonstrating the existence of an antagonistic relationship between the HDA6 concentration and the viroid. A hypothesis that allows explaining the information obtained and correlating them with an increase of biological viroid efficacy in the host is described in detail in the discussion of this chapter. Once determined that, in vegetative host tissue, the HSVd induces alterations in the epigenetic map of the promotor areas of rDNA, in the last chapter of this thesis we analyzed whether or not reproductive host tissue showed similar alterations during the infection. We analyzed pollen grains of infected cucumber plants. The structural analysis of these reproductive cells indicated that the HSVd accumulation induced a nuclear chromatin decodensation, responsible of the rRNAs transcription in the nucleus of the generative cell. This alteration was correlated with a significant demethylation of the ribosomal DNAs and transposable elements. By RT-PCR analysis it was possible to determine that this methylation pattern alteration correlated with a significant increase of transcriptional activity. This observation revealed that the HSVd infection also induced alterations in the transcriptional regulation mechanisms in the host reproductive tissue. This result allowed speculating with the possibility that these epigenetic modifications could happen in the next generation plants, awarding to the viroid an advantage for host adaptation. / En el primer capítulo determinamos que plantas de pepino infectadas con el viroide del enanismo del lúpulo (HSVd) acumulaban altos niveles de sRNAs derivados del RNA ribosomal. Además, este efecto se correlacionó con un aumento de la transcripción de los precursores de los RNAs ribosomales debido a una disminución de la metilación del DNA en su región promotora poniendo de manifiesto que ciertos genes ribosomales (normalmente silenciados) reactivaban su actividad transcripcional durante la infección. En el siguiente capítulo y con el objetivo de determinar si este proceso podía ser un fenómeno común a otros sistemas planta-patógeno, analizamos plantas de N.benthamiana transgénicas que expresaban de forma constitutiva la secuencia dimérica del viroide. Se observó cómo la acumulación de los sRNAs en plantas transgénicas era similar a la observada en los pepinos infectados, promoviendo el desequilibrio de la acumulación de rb-sRNAs. Mediante secuenciación de DNA bisulfitado demostramos que este fenómeno volvía a estar ligado con la pérdida de metilación de citosinas en un contexto simétrico. Al igual que en pepino este fenómeno correlacionaba con un aumento de la transcripción de estas zonas de DNA hipometiladas. En el tercer capítulo y mediante ensayos de immuno-precipitación, fue posible determinar que tanto en pepino como en N. benthaminana el HSVd formaba complejos estables in vivo con la proteína HISTONA DEACETILASA 6 (HDA6), un componente clave del proceso de metilación de diversos DNAs repetitivos, entre los que se encuentra el DNA ribosomal. Estos resultados sugerían que esta interacción HSVd-HDA6 generaría un déficit funcional de HDA6 que podría ser responsable de las alteraciones epigenéticas observadas en el huésped durante la infección. Esta hipótesis fue consistente con la observación de que la sobreexpresión transitoria de HDA6 en plantas infectadas revirtió el estado de hipometilación del rDNA inducido por el viroide. Inesperadamente, observamos que la sobreexpresión de HDA6 inducía una significativa reducción en los niveles de acumulación del viroide en la planta infectada. Además, la acumulación del viroide en las células infectadas aumentó al silenciar de forma transitoria la expresión de HDA6 evidenciando la existencia de una relación antagónica entre la concentración de HDA6 y la del viroide. Una vez determinado que, en tejidos vegetativos del huésped, el HSVd induce alteraciones en el mapa epigenético de las zonas promotoras del rDNA, en el último capítulo de esta tesis analizamos si tejidos reproductivos del huésped mostraban alteraciones similares durante la infección. Para ello se analizaron granos de polen de flores provenientes de plantas de pepino infectadas por el HSVd. El análisis estructural de estas células reproductivas indico que la acumulación de HSVd inducía la descondensación de la cromatina nucleolar responsable de la transcripción de los rRNAs en el núcleo generativo. Esta alteración correlacionó con una significativa desmetilación de DNAs ribosomales y los asociados a Elementos Transponibles. Mediante análisis de qRT-PCR fue posible determinar que esta alteración en los patrones de metilación se correspondía con un significativo aumento de su actividad transcripcional lo que permite afirmar que al igual que lo observado en hoja, la infección por HSVd induce alteraciones a nivel de los mecanismos de regulación transcripcional también en tejidos reproductivos del huésped. Esta observación permite especular con la posibilidad de que estas modificaciones epigenéticas podrían pasar a la siguiente generación de plantas, confiriendo de esta manera al viroide una ventaja en la adaptación al huésped. / En el primer capítol determinem que plantes de cogombre infectades amb el viroide del nanisme del llúpol (HSVd) acumulaven alts nivells d'sRNA derivats de l'RNA ribosòmic (rb-sRNA). A més, aquest efecte es va correlacionar amb un augment de la transcripció dels precursors dels RNA ribosòmics (rRNA) a causa d'una disminució de la metilació del DNA en la seua regió promotora, i va posar de manifest que certs gens ribosòmics (normalment silenciats) reactivaven la seua activitat transcripcional durant la infecció. En el següent capítol i amb l'objectiu de determinar si aquest procés podia ser un fenomen comú a altres sistemes planta-patogen, analitzem plantes de N. benthamiana transgèniques que expressaven de forma constitutiva la seqüència dimèrica del viroide. Es va observar como l'acumulació dels sRNA en plantes transgèniques era similar a l'observada en els cogombres infectats, promovent el desequilibri de l'acumulació d'rb-sRNA. Mitjançant la seqüenciació del DNA bisulfitat vam demostrar que aquest fenomen tornava a estar lligat a la pèrdua de metilació de citosines en un context simètric. De la mateixa forma que en el cogombre, aquest fenomen es correlacionava amb un augment de la transcripció d'aquestes zones de DNA hipometilades. En el tercer capítol, mitjançant assajos d'immunoprecipitació, va ser possible determinar que tant en cogombre com en N. benthaminana, l'HSVd formava complexos estables in vivo amb la proteïna HISTONA DEACETILASA 6 (HDA6), un component clau del procés de metilació de diversos DNA repetitius, entre els quals es troba el DNA ribosòmic. Aquests resultats suggerien que aquesta interacció HSVd-HDA6 generaria un dèficit funcional d'HDA6 que podria ser responsable de les alteracions epigenètiques observades en l'hoste durant la infecció. Aquesta hipòtesi va ser consistent amb l'observació que la sobreexpressió transitòria d'HDA6 en plantes infectades revertia l'estat d'hipometilació de l'rDNA induït pel viroide. Inesperadament, observem que la sobreexpressió d'HDA6 induïa una significativa reducció en els nivells d'acumulació del viroide en la planta infectada. A més, l'acumulació del viroide en les cèl·lules infectades va augmentar en silenciar de forma transitòria l'expressió d'HDA6, evidenciant l'existència d'una relació antagònica entre la concentració d'HDA6 i la del viroide. Una vegada determinat que, en teixits vegetatius de l'hoste, l'HSVd indueix alteracions en el mapa epigenètic de les zones promotores de l'rDNA, en l'últim capítol d'aquesta tesi analitzem si teixits reproductius de l'hoste mostraven alteracions similars durant la infecció. Amb aquesta finalitat, es van analitzar grans de pol·len de flors provinents de plantes de cogombre infectades per l'HSVd . L'anàlisi estructural d'aquestes cèl·lules reproductives va indicar que l'acumulació d'HSVd induïa la descondensació de la cromatina nucleolar responsable de la transcripció dels rRNA en el nucli generatiu. Aquesta alteració es va correlacionar amb una significativa desmetilació de DNA ribosòmics i els associats a elements transposables (TE). Mitjançant anàlisi de qRT-PCR va ser possible determinar que aquesta alteració en els patrons de metilació es corresponia amb un significatiu augment de la seua activitat transcripcional, la qual cosa va permetre afirmar que, igual que l'observat en la fulla, la infecció per HSVd induïa, també en els teixits reproductius de l'hoste, alteracions dels mecanismes de regulació transcripcional. Aquesta observació va permetre especular amb la possibilitat que aquestes modificacions epigenètiques pogueren passar a la següent generació de plantes, conferint d'aquesta manera al viroide un avantatge d'adaptació a l'hoste. / Castellano Pérez, M. (2017). ESTUDIO DE LAS ALTERACIONES EN EL PATRON DE METILACIÓN DEL DNA DEL HUÉSPED INDUCIDAS POR UN VIROIDE NUCLEAR [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/77992 / Compendio

Mi trabajo ha estado enfocado en la implicación de los diferentes mecanismos epigenéticos de PML-RARa en la inducción de la leucemia promielocítica aguda (APL).En particular yo estudié el rol de MBD1, un miembro de la conservada familia de proteinas capaces de unirse al DNA metilado, demostrando que desempeña un papel importante en la progresión de la leucemia. De hecho, mostré que MBD1 es recruida por PML-RARa a sus promotores diana a través de los mecanismos mediados por HDAC3, participando por tanto en la represión transcripcional. Además, investigué hasta donde la metilación de la H3K27 mediada por Polycomb contribuye a la tumorgénesis mediada por PML-RARa. Demostré que PML-RARa dirige al PRC2 hacia el locus del tumor supresor causando la metilación de la H3K27. Fue interesante ser capaz de mostrar que tanto la metilación del DNA como la de las histonas era requerida para mantener el aberrante silencio génico. Esto apuntaba hacia una intercomunicación entre estos diferentes marcadores epigenéticos contribuyendo a la patología molecular de la leucemia. Resumiendo, estos resultados nos proporcionan elementos nuevos para comprender los mecanismos moleculares esenciales en la tumorgénesis y progresión de la APL. / My work was focused on the involvement of different epigenetic mechanisms in PML-RARa-induced acute promyelocytic leukemia (APL). In particular, I studied the role of MBD1, a member of a conserved family of proteins able to bind methylated DNA, demonstrating that has an important function in leukemia progression. Indeed, I showed that MBD1 is recruited by PML-RARa to its target promoters through an HDAC3-mediated mechanism, thus participating in transcriptional repression.. Furthermore, I investigated how far Polycomb-mediated H3K27 methylation contributes to PML-RARa mediated tumorigenesis. I demonstrated that PML-RARa targets the PRC2 to tumor suppressor loci causing H3K27 methylation. Interestingly, I was able to show that both DNA and histone methylation are required to maintain PML-RARa aberrant gene silencing, pointing towards a crosstalk among these different epigenetic layers that contributes to the molecular pathology of leukemia. In summary these results provide new insights into the molecular mechanisms underlying APL tumorigenesis and progression.

Los cuerpos nucleares de Cajal (CBs) son estructuras nucleares implicadas en la biogénesis de ribonucleoproteínas nucleares y nucleolares de pequeño tamaño (snRNPs y snoRNPs) requeridas para el procesamiento nuclear de pre-mRNAs y pre-rRNAs, respectivamente. El CB concentra la proteína coilina, un marcador molecular de esta estructura, snRNPs, el factor de supervivencia de las neuronas motoras (SNM) y las proteínas que comparte con el nucleolo Nopp140 y fibrilarina. Los CB son estructuras dependientes de transcripción, pero los mecanismos de ensamblaje molecular de estos cuerpos nucleares son poco conocidos.En este estudio se utilizan métodos de inmunofluorescencia, expresión ectópica de proteínas del CB y métodos bioquímicos para analizar la importancia de dos modificaciones postraduccionales, la metilación de la coilina y la conjugación con SUMO1 del factor SMN para el ensamblaje molecular de los CBs. Se ha utilizado la línea celular MCF7 como un modelo de hipometilación endógena debido al déficit del gen MTAP. La hipometilación de la coilina conduce al desensamblaje de los CBs y a la relocalización nucleolar de la coilina no metilada. Este efecto revierte en células transfectadas que expresan el gen MTAPwt, indicando que el grado de metilación de la coilina marca su destino nuclear.Respecto a la importancia de la sumoilación en el ensamblaje de los CBs, hemos demostrado la existencia de un subtipo de CBs que concentran SUMO1 y la conjugasa de SUMO Ubc9. En neuronas, hemos detectado la presencia de SUMO durante la fase de reformación de CBs, en la respuesta al estrés. Los experimentos de inmunoprecipitación confirman la interacción de SUMO-1 con el factor SMN y demuestran que la lisina K119, portadora de una secuencia consenso de sumoilación, es esencial para la regulación del número de CBs. / Cajal bodies (CBs) are nuclear structures involved in the biogenesis of small nuclear and nucleolar ribonucleoproteins (snRNPs and snoRNPs) required for nuclear processing of pre-mRNAs and pre-rRNAs, respectively. CBs concentrate the protein coilin, a molecular marker of this structure, snRNPs, the survival of motor neurons factor (SMN) and proteins shared with the nucleolus Nopp140 and fibrillarin. CBs are transcription-dependent structures, but the mechanisms of molecular assembly of these structures are poorly understood.In this study we used inmunofluorescence, ectopic expresion of CB proteins and biochemical methods to analyze the importance of two posttranslational modifications, methylation of coilin and conjugation of SMN with SUMO1, for the molecular assembly of CBs. The cell line MCF7 has been used as a model of endogenous hypomethylation due to the lack of MTAP gene. Coilin hypomethylation leads to the disassembly of CBs and nucleolar relocation of unmethylated coilin. This effect reverses in transfected cells expressing the gene MTAPwt, indicating that the degree of methylation of coilin directs its nuclear destination.On the importance of sumoylation in the assembly of CBs, we have demonstrated the existence of a subset of CBs which concentrate SUMO1 and the SUMO1 conjugase Ubc9. In neurons, we detected the presence of SUMO1 during the reformation of CBs in response to stress. Immunoprecipitation experiments confirm the molecular interaction of SUMO1 with SMN and demonstrate that lysine 119, carrying the SMN sumoylation consensus sequence, is essential for regulating the number of CBs.