Cardiovascular disease continues to be the leading cause of morbidity and mortality worldwide with an estimated 17 million annual deaths. A majority of cases are attributed to disease affecting the vascular system including arterial, venous and lymphatic vessels. Despite progress in understanding the molecular bases of vascular development and disease, the role of chromatin modifying enzymes in vascular processes remains ill defined. Here we show that the histone-modifying enzyme Hdac3 is a critical regulator of lymphatic vascular development. Endothelial specific loss of Hdac3 in mice affects the development of lymphovenous and lymphatic valves resulting in aberrant blood lymph separation, lymphedema and complete lethality. We demonstrate that Hdac3 functions in a flow responsive manner to regulate the expression of Gata2, a transcription factor essential for lymphatic valve development. In response to flow, transcription factors Tal1, Ets1/2 and Gata2 recruit Hdac3 to an evolutionarily conserved intragenic enhancer of Gata2 gene. In turn, Hdac3 recruits p300, a histone acetyl transferase, to render activation of the Gata2 enhancer, and thus promotes Gata2 transcription. Together, our findings demonstrate the molecular basis by which cell extrinsic and intrinsic cues cooperate to regulate lymphatic development.

Certains cancers, comme celui du sein et de la prostate forment préférentiellement des métastases au niveau des os et sont dits ostéotropiques. Les SIBLINGs sont des protéines non-collagéniques de la matrice osseuse notamment impliquées dans la régulation de la minéralisation de cette matrice. Nos travaux antérieurs et présents montrent que certaines protéines de la famille des SIBLINGs sont exprimées de manière ectopique au niveau des cellules de cancers considérés comme ostéotropiques. Notre travail a tout dabord permis de mettre en évidence pour la première fois lexpression des SIBLINGs : (a) BSP dans les lésions (pré)néoplasiques du col de lutérus ; (b) DMP1 dans les cancers pulmonaires humains et (c) DSPP dans les cancers prostatiques et sa corrélation avec lagressivité des tumeurs. Dautre part, nous avons contribué significativement à la compréhension des mécanismes responsables de lactivation et de la régulation de la transcription du gène de la BSP dans les cellules cancéreuses et ostéoblastiques. Dans une première étude, nous avons réalisé des constructions comprenant différentes délétions de la région promotrice humaine du gène de la BSP que nous avons ensuite transfectées de manière transitoire dans les cellules cancéreuses mammaires (MDA-MB-231 et MCF-7) et dostéosarcome humain (Saos-2). La comparaison des profils de transfection obtenus pour ces trois lignées nous a permis de déterminer une région du promoteur importante pour la régulation transcriptionnelle de la BSP et suffisante pour expliquer lactivité du promoteur dans les cellules cancéreuses mammaires. Suite à la recherche des sites cis potentiellement actifs, nous avons identifié un élément CRE (cAMP Responsive Element) comme étant principalement responsable de lexpression de la BSP dans les cellules cancéreuses mammaire tandis quun élément FRE (Fibroblast growth factor Response Element) est par contre un acteur incontournable de cette même expression dans les cellules de la lignée osseuse. Des expériences de retard sur gel nous ont ensuite permis didentifier les facteurs CREB-1, Jun-D et Fra-2 comme étant associés à lélément CRE aussi bien dans les lignées cancéreuses mammaires que dans les Saos-2. Nous avons montré que dans nos modèles cellulaires : (a) CREB-1 agit de manière constitutive et positive sur la régulation du gène de la BSP et que (b) Jun D et Fra-2, sont des facteurs de transcription importants pour la régulation transcriptionnelle du gène de la BSP dans les cellules cancéreuses mammaires. Dans une seconde étude basée sur lobservation que lexpression endogène de BSP est fortement augmentée, tant au niveau protéique que de lARNm, dans les cellules Saos-2 confluentes par rapport aux cellules préconfluentes, nous avons voulu déterminer le rôle potentiel du facteur de transcription Runx2 dans la régulation transcriptionnelle du gène de la BSP au niveau de ce modèle de différenciation ostéoblastique. Le facteur de transcription Runx2 est en effet connu comme étant essentiel au développement ostéoblastique, à la différenciation et à la formation osseuse. Ce facteur régule positivement ou négativement lexpression des gènes ostéoblastiques en interagissant avec divers co-facteurs transcriptionnels. Nous avons démontré quun site de liaison pour le facteur Runx2 présent au niveau du promoteur de la BSP lie ce facteur dans les cellules préconfluentes et à un degré significativement moindre dans les cellules post-confluentes suggérant que ce facteur jouerait un rôle répresseur de lexpression du gène de la BSP. Etant donné quil a été démontré que la déacétylase dhistones HDAC3 est capable dinteragir avec Runx2 pour réprimer le promoteur dautre gène osseux, nous avons vérifié lhypothèse selon laquelle HDAC3 et Runx2 seraient présents au niveau du promoteur de la BSP pour réprimer lexpression de la BSP dans les cellules préconfluentes. Des expériences dimmunoprécipitation de la chromatine nous ont permis de mettre en évidence la présence concomitante de Runx2 et de HDAC3 au niveau du promoteur de la BSP dans les cellules Saos-2 préconfluentes et non dans les cellules post-confluentes. Finalement, la suppression de Runx2, dHDAC3 et des deux simultanément par interférence à lARN dans les cellules Saos-2 préconfluentes induit une augmentation de lexpression de la BSP dans ces cellules. Ces travaux ont donc permis de démontrer pour la première fois que la levée de la répression exercée par laction conjointe de Runx2 et de HDAC3 au promoteur de la BSP est nécessaire pour permettre lexpression de cette protéine au cours de la différenciation ostéoblastique. Lensemble de nos résultats nous a permis de dresser de nouveaux modèles de lactivation et de la régulation du gène de la BSP dans les cellules ostéoblastiques au cours de leur différenciation mais aussi dans les cellules cancéreuses.

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Mi trabajo ha estado enfocado en la implicación de los diferentes mecanismos epigenéticos de PML-RARa en la inducción de la leucemia promielocítica aguda (APL).En particular yo estudié el rol de MBD1, un miembro de la conservada familia de proteinas capaces de unirse al DNA metilado, demostrando que desempeña un papel importante en la progresión de la leucemia. De hecho, mostré que MBD1 es recruida por PML-RARa a sus promotores diana a través de los mecanismos mediados por HDAC3, participando por tanto en la represión transcripcional. Además, investigué hasta donde la metilación de la H3K27 mediada por Polycomb contribuye a la tumorgénesis mediada por PML-RARa. Demostré que PML-RARa dirige al PRC2 hacia el locus del tumor supresor causando la metilación de la H3K27. Fue interesante ser capaz de mostrar que tanto la metilación del DNA como la de las histonas era requerida para mantener el aberrante silencio génico. Esto apuntaba hacia una intercomunicación entre estos diferentes marcadores epigenéticos contribuyendo a la patología molecular de la leucemia. Resumiendo, estos resultados nos proporcionan elementos nuevos para comprender los mecanismos moleculares esenciales en la tumorgénesis y progresión de la APL. / My work was focused on the involvement of different epigenetic mechanisms in PML-RARa-induced acute promyelocytic leukemia (APL). In particular, I studied the role of MBD1, a member of a conserved family of proteins able to bind methylated DNA, demonstrating that has an important function in leukemia progression. Indeed, I showed that MBD1 is recruited by PML-RARa to its target promoters through an HDAC3-mediated mechanism, thus participating in transcriptional repression.. Furthermore, I investigated how far Polycomb-mediated H3K27 methylation contributes to PML-RARa mediated tumorigenesis. I demonstrated that PML-RARa targets the PRC2 to tumor suppressor loci causing H3K27 methylation. Interestingly, I was able to show that both DNA and histone methylation are required to maintain PML-RARa aberrant gene silencing, pointing towards a crosstalk among these different epigenetic layers that contributes to the molecular pathology of leukemia. In summary these results provide new insights into the molecular mechanisms underlying APL tumorigenesis and progression.

Disruptions in cardiac development cause congenital heart disease, the most prevalent and deadly congenital malformation. Genetic and environmental factors are thought to contribute to these defects, however molecular mechanisms remain largely undefined. Recent work highlighted potential roles of chromatin- modifying enzymes in congenital heart disease pathogenesis. Histone deacetylases, a class of chromatin-modifying enzymes, have developmental importance and recognized roles in the mature heart. This thesis aimed to characterize functions of Hdac3 in cardiac development. We found loss of Hdac3 in the primary heart field causes precocious progenitor cell differentiation, resulting in hypoplastic ventricular walls, ventricular septal defect, and mid- gestational lethality. In primary heart field progenitors, Hdac3 interacts with, deacetylates, and functionally suppresses transcription factor Tbx5. Furthermore, a disease-associated Tbx5 mutation disrupts this interaction, rendering Tbx5 hyperacetylated and hyperactive. By contrast, deletion of Hdac3 in second heart field progenitors bypasses these defects, instead causing malformations in the outflow tract and semilunar valves, with lethality prior to birth. Affected semilunar valves and outflow tract vessels exhibit extracellular matrix and EndMT defects and activation of the Tgfβ1 signaling pathway. In normal second heart field development, Hdac3 represses Tgfβ1 transcription, independent of its deacetylase activity, by recruiting the PRC2 methyltransferase complex to methylate the Tgfβ1 promoter. Importantly, knockouts of Hdac3 in differentiated cardiac cells do not fully recapitulate the progenitor-specific knockout phenotypes. These results illustrate spatiotemporal roles of Hdac3, both deacetylase-dependent and deacetylase-independent, in cardiac development, suggesting that dysregulation of Hdac3 in cardiac progenitor cells could be a contributing factor in congenital heart disease pathogenesis.