Introducción y objetivos: El cáncer colorrectal (CCR) constituye el tumor más frecuente en el mundo occidental. Así mismo, posee una historia natural conocida, con lesiones precursoras establecidas, y se disponen de procedimientos de cribado eficaces y costo-efectivos, siendo la colonoscopia de cribado el principal de ellos. Por todo ello, es fundamental conocer qué factores relacionados con la calidad de la colonoscopia o las lesiones halladas en la misma se asocian con un mayor riesgo de CCR metacrónico. Los objetivos de los artículos que componen la presente tesis doctoral son: en primer lugar, evaluar la eficacia de una preparación colónica con 1L de polietilenglicol (PEG) en pacientes con alto riesgo para limpieza colónica inadecuada; en segundo lugar, determinar la rentabilidad diagnóstica de la colonoscopia de revisión precoz en pacientes con limpieza colónica subóptima; en tercer lugar, establecer qué características de riesgo de los adenomas se asocian con un mayor riesgo de CCR o adenomas avanzados (AA) metacrónicos; y por último, describir las tasas y características del CCR post-colonoscopia (CCRPC), así como qué factores de la colonoscopia basal podrían relacionarse con su aparición. Métodos: En primer lugar, se realizó un estudio observacional retrospectivo mediante un análisis post-hoc de 2 ensayos clínicos aleatorizados (MORA y NOCT). Se describió la eficacia del régimen de limpieza con PEG 1L y se realizó un estudio comparativo de PEG 1L respecto a otros regímenes en pacientes con un riesgo máximo de limpieza inadecuada (varones obesos >60 años), tanto en tasas de limpieza adecuada como de detección de lesiones. La limpieza colónica se evaluó por endoscopistas y lectores centrales mediante la escala Harefield (HCS). El segundo artículo es un estudio observacional retrospectivo de pacientes con limpieza subóptima en la colonoscopia de cribado y una colonoscopia de revisión precoz en 1 año. La limpieza subóptima se definió como una puntuación en la escala de Boston (BBPS) de 1 en cualquier segmento. Se excluyeron pacientes con BBPS=0 o colonoscopia incompleta. Se describieron las tasas de detección de adenomas (TDA) y AA (TDAA) en la colonoscopia índice y de revisión, así como los cambios en las recomendaciones de vigilancia post-polipectomía. El tercer artículo es una revisión sistemática y metaanálisis de estudios de cohortes y ensayos clínicos que describieran la incidencia de AA o CCR en la vigilancia estratificados según las características de riesgo de los adenomas basales (tamaño, histología y multiplicidad). Se calcularon las incidencias por 1,000 personas-año (p-a) para cada característica de riesgo, así como los riesgos relativos (RR) y sus intervalos de confianza (IC) 95% usando un modelo de efectos aleatorios, en comparación con adenomas no avanzados (ANA) o colonoscopia normal. En el último estudio, observacional retrospectivo, se calcularon las tasas de CCR que aparecen hasta 10 años tras una colonoscopia (CCRPC) y se clasificaron según su explicación más plausible con la metodología de la World Endoscopy Organization (WEO). Finalmente se comparó la población con CCRPC con una cohorte control sin CCR apareada 1:4 por sexo, edad, fecha, indicación, endoscopista y centro de la colonoscopia basal. Resultados: En el primer estudio, se evidenciaron altas tasas de limpieza adecuada en 551 pacientes preparados con PEG 1L, entre el 87% y el 94%, incluso en pacientes añosos, obesos, o diabéticos. En el subgrupo de mayor riesgo para limpieza inadecuada, PEG 1L consiguió mayores tasas de limpieza adecuada respecto a otras preparaciones (73% vs 50%, p=0.033) según la valoración de los endoscopistas, sin diferencias según los lectores centrales. Así mismo, se evidenciaron unas mayores tasas de adenoma por paciente (p=0.041) y detección de >5 adenomas (p=0.047) con PEG 1L, sin diferencias en la TDA. En el segundo estudio, 259 pacientes presentaron limpieza subóptima en la colonoscopia de cribado y se realizaron la colonoscopia de revisión precoz, con una TDA de 38.7%, TDAA de 14.9%. La tasa de adenomas y AA perdidos fue 27.7%, y 17.6%, respectivamente. Tras la revisión, la recomendación de vigilancia cambió de 10 a 3 años en el 14.7% de los pacientes con recomendación previa a 10 años. Respecto al tercer estudio, se incluyeron 55 estudios y 936,540 pacientes, con un seguimiento medio de 5.4 años. La incidencia de CCR por 1000 p-a fue 2.6 (2.1–3.0) para adenomas >20 mm, 2.7 (2.2–3.2) para displasia de alto grado (DAG), 2.0 (1.8–2.3) para componente velloso, 0.8 (0.1-1.4) para >5 adenomas, 1.0 (0.7–1.2) para >3 adenomas. El riesgo de CCR metacrónico fue mayor para adenomas >20mmvs 10-19mm (RR, 2.08; IC 95% 1.20–3.61), DAG vs displasia de bajo grado (RR, 2.89; IC 95% 1.88–4.44), velloso vs tubular (RR, 1.75; IC 95% 1.33–2.31), sin diferencias significativas al comparar >3 adenomas vs 1-2 (RR, 1.24; IC 95%, 0.84–1.83), ni >5 vs 3-4 (RR, 0.79; 95%, 0.30–2.11). Tendencias similares se evidenciaron en el riesgo de AA metacrónico. Finalmente, en el cuarto estudio, se detectaron 107 CCRPC en 101,524 colonoscopias (0.1%), con tasas del 0.4%, 2.2%, 3.1% y 4.1% a 1, 3, 5 y 10 años, respectivamente. Según la WEO, 20.3% se clasificaron como resección incompleta, 5.4% como lesiones visualizadas no resecadas, 25.7% como lesiones no visualizadas en una colonoscopia previa inadecuada y 48.6% como lesiones no visualizadas en una colonoscopia previa adecuada. La preparación inadecuada [Odds Ratio (OR) 3.05, IC 95% 1.73-5.36] y resección fragmentada previa (OR 19.89, IC 95% 8.67-45.61) se asociaron de forma independiente con el desarrollo de CCRPC. Conclusiones: De los estudios que componen la presente tesis se puede concluir que la preparación con PEG 1L ofrece altas tasas de limpieza adecuada incluso en subgrupos con alto riesgo de limpieza inadecuada, mejorando la detección de lesiones; que los pacientes con limpieza subóptima en la colonoscopia de cribado presentan altas TDA y TDAA en la colonoscopia de revisión precoz, con importantes cambios en las recomendaciones de vigilancia post-polipectomía; que los pacientes con adenomas basales >20mm o con DAG tienen un riesgo elevado de CCR metacrónico, mientras que la multiplicidad no impacta en el riesgo de CCR a corto plazo; y que la mayoría de CCRPC se deben a lesiones no visualizadas en una colonoscopia previa adecuada, relacionándose estas lesiones con la limpieza inadecuada y la resección fragmentada.

Seminario de Título para optar al Título de Ingeniera en Biotecnología Molecular. / La enzima convertidora de endotelina-1 (ECE-1) es una metaloproteasa de membrana encargada de la conversión del péptido Endotelina-1 a su forma activa. Presenta cuatro isoformas, las cuales solo difieren en sus extremos citoplasmáticos N-terminales. Elevados niveles de expresión de ECE-1 han sido reportados en diferentes cánceres, siendo solo la isoforma ECE-1c asociada a características malignas en líneas celulares de cáncer de próstata y de colon. Resultados de nuestro grupo señalan que la fosforilación de ECE-1c en sus residuos Thr-9, Ser-18 y Ser-20, promueve la estabilidad al evitar su degradación proteasomal, aumentando además la capacidad invasiva de células de cáncer colorrectal DLD-1 de manera dependiente de la caseína kinasa-2 (CK2). Pese a que solo se comprobó la fosforilación de Ser-18 y Ser-20 por CK2, resultados obtenidos usando mutantes fosfo miméticas de estos dos residuos y una mutante súper estable de ECE-1c, hacen sospechar que el residuo Thr-9 estaría involucrado en el aumento de la estabilidad y sus efectos celulares. De esta manera, el objetivo general fue determinar el efecto de la fosforilación del residuo Thr-9 en la estabilidad proteica de ECE-1c y su participación en el potencial migratorio y tumorigénico de células de cáncer de colon DLD-1. Mediante ensayos de estabilidad proteica se determinó que la fosforilación en Thr-9 aumenta la estabilidad de ECE-1c incluso en presencia de un inhibidor de CK2. Además, se observó que la fosforilación en Thr-9 promueve la capacidad migratoria y tumorigénica de células DLD-1. Los resultados funcionales obtenidos en este trabajo constituyen el primer paso xiii en el estudio del mecanismo mediante el cual ECE-1c promueve proliferación, invasión y tumorigénesis en células de cáncer colorrectal DLD-1.

El cáncer colorrectal representa una de las patologías neoplásicas más frecuentes en nuestro medio. La afectación de los ganglios linfáticos es el factor pronóstico más importante de esta enfermedad. Alrededor de un 30 % de pacientes tratados quirúrgicamente con intención curativa y sin afectación ganglionar, presentarán recurrencia de su enfermedad. Las metástasis no detectadas en el estudio histopatológico convencional pueden ser la explicación de estos fallos terapéuticos. Los objetivos de esta tesis son:1. Identificar micrometástasis en ganglios linfáticos de pacientes con cáncer colorrectal sometidos a cirugía resectiva con intención curativa, mediante técnicas de inmunohistoquimia y RT-PCR, determinando la existencia de citokeratina 20 por ambas técnicas. 2. Evaluar el estadiaje de los pacientes con cada una de las técnicas, la convencional con tinción de hematoxilina eosina, y el obtenido mediante las técnicas de inmunohistoquimia y RT-PCR3. Determinar la implicación clínica del re-estadiaje con las nuevas técnicas, respecto al periodo libre de enfermedad y a la tasa de recurrencias de la misma durante el seguimiento a los cinco años. Se incluyeron 100 pacientes intervenidos de forma electiva por cáncer colorrectal en el Servicio de Cirugía General del Hospital Universitario Mútua de Terrassa, en Terrassa, Barcelona. Se excluyeron los pacientes intervenidos de urgencias, aquellos que presentaron metástasis a distancia en el momento del diagnóstico y a los que no se practicó cirugía con criterio oncológico. Se han incluido dos pacientes control (sin patología colónica maligna) para estudio específico de micrometástasis en ganglio linfático mediante inmunohistoquimia y RT-PCR.En el apartado de método se describe la técnica de linfadenectomía ultilizada así como el procesamiento del material linfático para la obtención del estadio ganglionar por las tres técnicas antes mencionadas. El tratamiento complementario de los pacientes se decidió en base al estadiaje fijado por el estudio histopatológico convencional con hematoxilina-Eosina. Se describe la batería de pruebas y programación de visitas efectuadas durante el control postoperatorio de los pacientes estudiados.La histopatología convencional, no clasificó correctamente el 37,5% de los pacientes que posteriormente fallecieron a causa de su enfermedad y el 50% de los pacientes que presentaron recidiva durante el seguimiento. La utilización de técnicas específicas para la identificación de micrometástasis puso de manifiesto la existencia de células neoplásicas en ganglios linfáticos clasificados como libres de enfermedad por la histopatología convencional. Mediante inmunohistoquimia se produjo un re-estadiaje del 13% de los pacientes. Por RT-PCR se alcanzó una re-estadificación del 41% de los pacientes.La determinación de micrometástasis mediante inmunohistoquimia no orientó en la identificación de pacientes a riesgo de sufrir recidiva de su enfermedad o muerte por cáncer colorrectal. Sin embargo, la detección de micrometástasis mediante RT-PCR fue positiva en el 88% (14 pacientes) de los pacientes que posteriormente desarrollaron una recidiva y en el 100% de los pacientes que presentaron muerte a causa de la evolución de su enfermedad.Según los resultados derivados de este estudio, se podría considerar la detección de micrometástasis por RT-PCR, una buena herramienta para la identificación de pacientes afectos de cáncer colorrectal en estadio II con factores de riesgo de mala evolución de su enfermedad. / Colorectal cancer is one of the most frequent malignant pathologies in our media. Lymph node involvement is the most important prognostic factor of this illness. Around 30 % of patients submitted to surgical procedures with curative intention and without lymph node involvement, will have recurrence of their neoplasm. Metastatic illness no detected in the former hystopathological study could be the explanation of these therapeutic mistakes.The objectives of this thesis are:1. To identify lymph node micrometastases in colorrectal cancers from patients submitted to oncologic resections with curative intention, by immunohistochemical and RT-PCR technique, determining cytokeratin 20 by both techniques2. To evaluate the new stage obtained by each technique, the conventional hematoxylin-eosin staining and the staging obtained with the specific techniques: immunohistochemestry and RT-PCR3. To determine if re-staging with specific techniques has clinical relevance in relation to free illness period and to relapse index during a follow up of five years. One hundred patients submitted to elective surgery for colorectal cancer were included. The study was developed in the Colorrectal Unit from General Surgery Department, Hospital Universitario Mútua Terrassa, in Terrassa, Barcelona. Patients with non-elective surgery, those with metastases at the moment of diagnostic and patients with a non-oncological resection (R0) were excluded. Two control patients (without malignant colorectal pathology) were included for specific study of micrometastases in lymph node by mean immunohistochemestry and RT-PCR. The methodology for lymphadenectomy is described as well as the hole process to get staging by the three techniques. Complementary treatment with chemotherapy was establish by hematoxylin-eosin hystopathological study. The follow up control during the study was describedHystopathological study didn't classify 37,5% of patients who lately will die because colorectal cancer progression during follow up and 50% of patients with recurrence o the illness.The use of specific techniques for micrometastases identification showed malignant cells in lymph nodes classify as free of illness by hematoxylin-eosin. Immunohistochemestry reclassified 13% of patients and RT-PCR 41% of patients.Micrometastases detection by immunohistochemestry didn't help top identify those patients with high risk of recurrence or who died because of colorrectal cancer. However, micrometastases detection by RT-PCR was positive in 88% (14 patients) of patients who will develop recurrence and in 100% of patients who will die because colorrectal cancer.The results of these study suggests that micrometastases detection by RT-PCR technique, could be in the future a promising method to identify patients with hystopathological stage II colorectal cancer with risk factors of poor prognosis.

Durante más de 40 años el 5-Fluorouracilo (5-FU), inhibidor de la Timidilato Sintasa (TS), ha sido la terapia estándar en el tratamiento del cáncer colorrectal (CCR). Uno de los principales obstáculos en el tratamiento es la resistencia a quimioterapia. Numerosos estudios demuestran que la resistencia a 5-FU es un evento multifactorial que incluye alteraciones en el transporte, el metabolismo, la diana terapéutica, el ciclo celular y los mecanismos de apoptosis. La sobreexpresión del gen TS correlaciona clínicamente con la resistencia a 5-FU. En el presente estudio se generaron dos líneas resistentes a 5-FU (HT29-5FUR y LoVo-5FUR) por exposición continuada a dosis creciente del fármaco. Dichas líneas presentaron un patrón del ciclo celular y tiempos de duplicación comparables a los de sus homólogas sensibles (HT29 y LoVo, respectivamente). Mostraron entre 5 y 3 veces más resistencia a 5-FU que sus correspondientes homólogas sensibles. No se hallaron diferencias en la sensibilidad de estas líneas al Oxaliplatino (OXA). En cambio, la línea LoVo-5FUR mostró un patrón de resistencia cruzada a Inhibidores de la Topoisomerasa I (TPT, C PT-11 y SN38). La adaptación de las líneas al 5-FU no alteró el estado de la p53 ni el fenotipo de errores de replicación (RER). El fenotipo de resistencia a 5-FU en estas líneas correlacionó con la sobreexpresión de TS (ARNm y proteína) aunque no se observó un proceso de amplificación génica. El análisis genómico comparativo (CGH) mostró la existencia de anormalidades genéticas (ganancias/pérdidas) en las líneas resistentes a 5-FU comparadas a sus respectivas homólogas sensibles que podrían estar potencialmente implicadas en la adquisición de la resistencia a 5-FU.El Oxaliplatino y los inhibidores de Topoisomerasa I (TPT y CPT-11) son agentes citotóxicos con actividad antitumoral en el CCR. En el presente estudio, también se evaluó la citotoxicidad de las asociaciones entre OXA y 5-FU o TPT en un panel de líneas celulares derivadas de tumores colorrectales sensibles (HT29, LoVo, DLD-1 y LS-513) y resistentes a 5-FU (HT29-5FUR y LoVo-5FUR). Asimismo se analizó la expresión de TS (ARNm y proteína) y Topoisomerasa I (Topo I; ARNm) tras la exposición a OXA como parámetros directamente relacionados con la sensibilidad al 5-FU e inhibidores de Topo I respectivamente, en las parejas sensibles/resistentes. Los esquemas secuenciales analizados fueron: OXA(4h)®5-FU(24h); 5-FU(24h)®OXA(4h); OXA(4h)®TPT(24h); TPT(24h)®OXA(4h) y OXA(4h)®5-FU (5 días a las dosis a las que se indujo la resistencia en las parejas sensible/resistente). Todas las combinaciones resultaron sinérgicas a dosis moderadas de ambos fármacos, únicamente la asociación 5-FU®OXA en la línea LoVo-5FUR resultó aditiva para cualquier fracción de inhibición. La sinergia fue además independiente del fenotipo de resistencia a 5-FU, del estado del sistema reparador del ADN y/o del estado de p53. La exposición previa a OXA en los esquemas OXA®5-FU y OXA®TPT permitió reducir las dosis de 5-FU y TPT en combinación en las líneas resistentes hasta niveles similares a los requeridos por las correspondientes líneas sensibles, revirtiendo el fenotipo de resistencia a 5-FU y permitiendo en el caso de la línea LoVo-5FUR sobrepasar el fenotipo de resistencia cruzada a Inhibidores de Topo I. La exposición a OXA, administrado como agente único provoca una caída de los niveles de TS (ARNm y proteína) en todas las líneas celulares analizadas. Durante la exposición a 5-FU se observó una sobreexpresión de los niveles de TS en todas las líneas celulares, aunque este incremento fue mucho menor en el esquema OXA®5-FU (entre 3 y 5 veces) comparado con el obtenido para la exposición a 5-FU como agente único. Estos resultados correlacionaron con la actividad sinérgica observada para la asociación OXA®5-FU. La exposición previa a OXA también indujo una disminución en los niveles de expresión de Topo I que correlacionó con la disminución en la dosis de TPT en la combinación OXA®TPT. Estos resultados también sugieren que la administración de los inhibidores de Topo I debe ser previa al OXA ya que los niveles disminuidos de Topo I es uno de los principales mecanismos de resistencia a este tipo de fármacos. Finalmente demostramos que la citotoxicidad observada en las asociaciones entre OXA y 5-FU no correlaciona con un incremento en los procesos apoptóticos. En conclusión, el presente estudio in vitro permite ampliar el conocimiento de las bases moleculares de la actividad de las asociaciones de 5-FU e inhibidores de Topo I y derivados platinados. La disminución en los niveles de TS tras la exposición a OXA en el esquema OXA/5-FU proporciona una nueva interpretación al sinergismo observado en esta asociación tanto en tumores sensibles como resistentes a 5-FU. Por otro lado, la combinación OXA/Inhibidores de Topo I representa una alternativa para el tratamiento del CCR avanzado. / Over more than 40 years, 5-Fluorouracil-based chemotherapy has been the standard treatment of colorectal cancer (CRC). Chemotherapy resistance is an important cause of cancer treatment failure. 5-Fluorouracil (5-FU) inhibits Thymidylate Synthase (TS) enzyme. Overexpression of Thymidylate Synthase (TS) has been correlated to 5-FU-resistance Several studies have also indicated that 5-FU resistance may be due to a multiple genetic pathways which includes transport mechanisms, metabolism, molecular mechanism, cell cycle kinetics and protection from apoptosis. At the present work, two 5-FU-resistant cell lines (HT29-5FUR and LoVo-5FUR) were established from sensitive parental cell lines (HT29 and LoVo, respectively) by stepwise with increasing concentrations of 5-FU. Cell cycle distributions and doubling times were barely equivalent in both, sensitive and 5-FU-resistant cell lines. 5FU-resistant cell lines exhibit about a 5-fold and 3-fold increase in resistance to the drug as compared to parental cell lines. No differences in sensitivity towards Oxaliplatin were found between sensitive/5-FU-resistant cells. Interestingly, LoVo-5FUR cell line show a cross-resistance pattern to Topoisomerase I inhibitors (TPT, CPT-11 and SN38). 5-FU adaptation does not alter p53 status or RER phenotype in these cell lines. Cellular resistance to 5-FU correlated with an increase in TS gene expression (ARNm and protein), although no gene amplification was observed. Comparative genomic hybridisation (CGH) analysis revealed several genetic abnormalities (gains/loss) in 5-FU-resistant cells as compared to corresponding parental cell lines that could be potentially related with 5-FU resistance phenotype. Oxaliplatin (OXA) and DNA Topoisomerase I inhibitors (TPT, CPT-11) are cytotoxic agents with proven clinical antitumor activity in CRC. At the present work, we also studied the cellular pharmacology of OXA in combination with 5-FU or TPT in a panel of sensitive (HT29, LoVo, DLD-1 and LS-513) and 5-FU-resistant human colon cancer cells (HT29-5FUR and LoVo-5FUR). Moreover, we evaluated TS (mRNA and protein) and Topoisomerase I (Topo I; mRNA) expression after OXA exposure as parameters directly related to sensitivity to 5-FU and Topo I inhibitors respectively, in sensitive/resistant cell lines. Sequential combination schedules used were: OXA(4h)®5-FU(24h); 5-FU(24h)®OXA(4h); OXA(4h)®TPT(24h); TPT(24h)®OXA(4h) and OXA(4h)®5-FU(5-days exposure at the 5FU dose used for the induction of 5FU-resistance phenotype). All sequential associations were synergistic at moderate doses of both drugs in all cell lines tested, only 5-FU®OXA combination was additive in LoVo-5FUR cells to all inhibition fraction. The synergism found was independent from 5-FU-resistant phenotype, mismatch repair system or p53 status. Previous exposure to OXA in OXA®5-FU and OXA®TPT schedules reduced doses of 5FU and TPT given in combination at the resistant cell lines until levels similar to that obtained in corresponding sensitive cell lines suggesting the role of Oxaliplatin in the overcoming of 5-FU resistance phenotype and in the abrogation of the cross-resistance pattern to Topo I inhibitors showed by LoVo-5FUR cells. The exposure to OXA as single agent induced a significant decrease in TS levels (mRNA and protein) in all cell lines. We have also observed that sequential administration of OXA/5-FU induced a significant decrease in TS mRNA expression (between 3 and 5-fold) as compared to exposure to 5-FU as a single agent in both, sensitive and 5FU-resistant cell lines. These results correlated with the synergistic activity observed in sequential OXA/5-FU administration schedule. Previous exposure to OXA also induced a down-regulation of Topo I gene expression that correlates with the decrease of TPT doses in OXA®TPT combination schedule. These results also suggest that Topo I inhibitors should to be administered previous to OXA, as diminished Topo I levels is one of the most important cause of resistance to these agents. Finally, we demonstrated that despite the high level of cytotoxicity found in the associations between OXA and 5-FU, no increases in apoptosis were observed. In conclusion, our in vitro findings contribute to a better knowledge of the combination of 5-FU or Topo I inhibitors and platinum derivatives, contributing to a rationale for the optimal clinical development of the association between these agents. Down-regulation of TS due to OXA exposure in OXA/5-FU schedules promote a new interpretation of the synergistic activity observed in sensitive and 5-FU-refractory tumours. By other hand, combination of OXA/Topoisomerase I inhibitors represent an alternative for the treatment of advanced colorectal cancer.

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El cáncer colorrectal (CCR) constituye en la actualidad la neoplasia más frecuente en España. Hasta un 30% de los casos de CCR se incluyen dentro del CCR familiar y alrededor de un 3-5% se deben a mutaciones en genes de elevada penetrancia que siguen una herencia mendeliana Éstos últimos incluyen al CCR hereditario no polipósico: principalmente el Síndrome de Lynch (SL), debido a mutaciones germinales en los genes de sistema reparador de errores (MMR) MLH1, MSH2, MSH6 y PMS2; y varios síndromes polipósicos, como la poliposis adenomatosa familiar, asociada al gen APC y la poliposis asociada al gen MUTYH. En aproximadamente un 70% de los casos analizados de pacientes con sospecha de SL no se encuentran mutaciones germinales y en torno a un 10% de estos casos, con pérdida de expresión de MLH1 e hipermetilación del promotor de dicho gen en su tumor, se explican por epimutaciones constitucionales en MLH1. No obstante, la prevalencia de este fenómeno en la población general es desconocida. También existen casos de CCR con elevada carga familiar, pero sin alteración del sistema MMR, de los que se desconoce su origen genético (CCR familiar tipo X). Lo mismo ocurre para algunos casos de poliposis adenomatosa con agregación familiar, que no se explican por mutaciones en los genes APC o MUTYH. Recientemente se han descrito dos mutaciones recurrentes en los genes POLE y POLD1 (p.Leu424Val y p.Ser478Asn respectivamente) como responsables de un pequeño porcentaje de estos casos de CCR y poliposis no clasificados pero, debido a la escasez de casos descritos hasta la fecha, fenotipo clínico exacto no se ha definido. Así, los objetivos de este trabajo han sido: en primer lugar, determinar la prevalencia de las epimutaciones constitucionales en MLH1 como una causa de SL en una serie no seleccionada de CCR y compararla con la prevalencia de este fenómeno en una serie seleccionada; y en segundo lugar, analizar la prevalencia de las mutaciones recurrentes en los genes POLE y POLD1 en casos de CCR y poliposis familiar de aparición temprana, sin mutación en los genes responsables de los síndromes de sospecha, y así contribuir a definir el fenotipo clínico asociado a las mutaciones en dichos genes. Se evaluó la prevalencia de epimutaciones constitucionales de MLH1 en una cohorte de CCR no seleccionado, y se comparó con una cohorte de CCR familiar seleccionado. Así, no se detectaron epimutaciones constitucionales en MLH1 en la población no seleccionada. No obstante, el 15,6% de la serie seleccionada fueron positivos para epimutaciones en MLH1. Por otro lado, se realizó la búsqueda de mutaciones recurrentes en POLE y POLD1 en casos de CCR y/o poliposis familiar mediante ensayos de genotipado KASPar y/o secuenciación Sanger. Se identificó la mutación POLE_p.Leu424Val como mutación de novo, ningún caso presentó la mutación POLD1_p.Ser478Asn, pero se identificó una nueva mutación en POLD1: p.Leu474Pro, con patogenicidad sustentada mediante diversas aproximaciones, en una familia de CCR familiar tipo X con también casos de cáncer de endometrio. Así, estos resultados sugieren una prevalencia insignificante de epimutaciones constitucionales en MLH1 en cohortes no seleccionadas de CCR. Así, el análisis de epimutación constitucional en MLH1 debería dirigirse exclusivamente a pacientes que cumplen los criterios revisados de Bethesda y cuyo tumor presente pérdida de expresión y metilación de MLH1. Por otro lado, las mutaciones en POLE y POLD1 explican una pequeña proporción de casos de CCR y poliposis familiar. La secuenciación de al menos estas mutaciones recurrentes debería considerarse en el diagnóstico genético rutinario de los casos con sospecha de CCR o poliposis hereditarios, sin mutaciones en los genes de sospecha clásicos.

Se realizó un estudio prospectivo de casos y controles de base hospitalaria para estimar el riesgo de padecer cáncer colorrectal en función de diversos factores ambientales, entre los que se realizó un énfasis especial en la exposición a medicamentos, y para explorar la posible interacción de los factores ambientales entre sí y con determinadas alteraciones genéticas. De un total de 436 casos de cáncer colorrectal y 416 controles estudiados, 345 (79.13%) casos y 346 (83.17%) controles refirieron haber utilizado medicamentos con anterioridad a su ingreso y de forma continua durante 6 o más meses. De estos 691 sujetos se recogieron datos sobre el uso de un total de 2547 medicamentos (1376 entre los casos y 1171 entre los controles). Se codificaron los medicamentos para describir la frecuencia de uso de los diversos tipos de fármacos y grupos terapéuticos. A partir de los datos se exploró la asociación entre la presencia de cáncer y el uso de los distintos tipos de fármacos, agrupados según los niveles descritos, considerando la duración y la secuencia temporal de la exposición respecto al cáncer, las características clínicas y genéticas de los tumores y ajustando los riesgos por edad y sexo. Se observaron asociaciones significativas entre el uso crónico de laxantes, antianémicos e hipouricemiantes y un incremento de riesgo de cáncer colorrectal, así como asociaciones entre un menor riesgo de cáncer colorrectal y el uso crónico de antiinflamatorios no esteroides, fármacos para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares e insulina. Varias de las observaciones estudiadas sugieren mecanismos carcinogénicos comunes en los que de una forma u otra se implica la desregulación de la insulina y/o la alteración de factores de crecimiento relacionados con la insulina. La confluencia de varias observaciones en un mismo mecanismo probablemente está reflejando que las principales causas de morbimortalidad en la cultura occidental son de origen ambiental y por lo tanto modificables en una gran proporción. / A prospective case-control hospital-based study was conducted to estimate the risk of colorectal cancer as a function of several enviromental factors, including drug exposure. An special attention was paid to drug use, and also to explore any interaction between drugs and enviromental factors and/or some genetical abnormalities. Overall, 436 colorectal cancer cases and 416 controls were studied, of which 345 cases (79.13%) and 346 controls (83.17%) referred the use of at least one medication continuously for at least 6 months prior to admission. Data on a total of 2547 exposures (1376 from case subjects and 1171 from control subjects) was collected from these 691 subjects. Medications were coded in order to describe frequencies of exposure to different drug types and therapeutic groups. The association between exposures and disease was explored to assess colorectal cancer risk, using drug exposure data, adjusting by age and sex, considering the lenght of the exposure and the temporal sequence with the cancer, as well as some clinical anf genetical features of the disease. Significant associations were observed suggesting an increased risk amongst chronic users of laxatives, of iron supplements and of treatments for hyperuricaemia, as well as reduced risk estimates for patients with chronic exposure to non-steroidal anti-inflammatory drugs, cardiovascular drugs and insulin.Several of the observed associations suggested common carcinogenic mechanisms involving to different degrees features of insulin disregulation and/or affecting insulin-related growth factors. Confluence of several observations into a common mechanism were probably reflecting that the main causes for morbimortality in occidental cultures can be attributed to enviromental factors, and thus could be potentially modifiable to a wide extent.

La hormona paratiroidea (PTH) es un importante mediador de la remodelación ósea y actúa junto al calcitriol (1α,25(OH)2vitamina D3), como regulador esencial de la homeostasis del calcio y fósforo. El péptido relacionado con la hormona paratiroidea (PTHrP) es una poli hormona que tiene un papel importante en el desarrollo del feto y en la homeostasis de tejidos adultos actuando principalmente en forma parácrina. Puede ser expresada y secretada por varios tumores y es responsable de la hipercalcemia humoral maligna, siendo éste un signo de mal pronóstico en las neoplasias malignas. Al momento de comenzar este Trabajo de Tesis había poca información acerca del rol de PTHrP actuando como factor parácrino sobre células derivadas del cáncer colorrectal (CCR). En el presente Trabajo se evidencia que PTHrP es capaz de inducir un aumento en la proliferación celular de dos líneas celulares derivadas de CCR, las células Caco-2 y las células HCT116. Además, este efecto inducido por la hormona está modulado por las cascadas de señalización PKC, Src, Akt, ERK MAPK y β-catenina. Se observó que en las células tumorales intestinales la hormona mediante ERK MAPK desencadena el aumento de la expresión y/o activación por fosforilación de CREB/ATF-1, c-myc y ciclina D1, que son moléculas relevantes en la proliferación celular. Acorde con lo observado in vitro, los experimentos desarrollados en el modelo murino revelan que la administración continua de la hormona en forma intra-tumoral modula la expresión de los marcadores claves en la progresión del CCR ERK, ciclina D1 y CREB/ATF-1. Tanto las células tumorales intestinales normales como aquellas que sobre-expresan PTHrP responden a la acción de las hormonas calciotrópicas PTH y calcitriol, al menos a nivel transcripcional, disminuyendo la expresión de PTHrP. PTHrP no sólo favorece la activación de vías mitogénicas y la proliferación de las células Caco-2 y HCT116, sino que también es capaz de disminuir la sensibilidad de estas células al Irinotecán (que es una droga comúnmente utilizada para la quimioterapia del CCR) mediante las vías de ERK MAPK y β-catenina. Este trabajo aporta información original respecto al rol del análogo tumoral de PTH en células tumorales intestinales y los mecanismos moleculares involucrados en la respuesta hormonal de estas células tanto in vitro como in vivo. Además, profundiza el conocimiento respecto de los mecanismos moleculares modulados por las hormonas calciotrópicas PTH y calcitriol en células tumorales intestinales. Un aporte de este Trabajo de Tesis es que al elucidar las vías de señalización que regulan los procesos inducidos por PTHrP y que favorecen la proliferación y/o quimiorresistencia, se podrían generar estrategias terapéuticas alternativas en el tratamiento del CCR cuya finalidad es inhibir la expresión de PTHrP o su mecanismo de acción en estas células tumorales. / Parathyroid hormone (PTH) is an important mediator of bone remodeling and acts together with calcitriol (1α, 25 (OH)2vitamin D3), as an essential regulator of calcium and phosphorus homeostasis. The parathyroid hormone related peptide (PTHrP) is a poly hormone that has an important role in the development of the fetus and in the homeostasis of adult tissues acting mainly through paracrine pathways. It can be expressed and secreted by several tumors and is responsible for malignant humoral hypercalcemia, which is a sign of poor prognosis in malignant neoplasms. When this Thesis Work started, there was little information about the role of PTHrP acting as a paracrine factor on cells derived from colorectal cancer (CRC). In the present work it is demonstrated that PTHrP is able to induce an increase in the cellular proliferation of two cell lines derived from CRC, Caco-2 cells and HCT116 cells. In addition, this effect is modulated by PKC, Src, Akt, ERK MAPK and β-catenin. It was observed that in the intestinal tumor cells, the hormone triggers the increase of the expression and/or activation by phosphorylation of CREB/ATF-1, c-myc and cyclin D1, which are relevant molecules in the cell proliferation, through ERK MAPK. In agreement with the observed in vitro, the experiments developed in the murine model revealed that the continuous administration of the hormone in an intra-tumoral manner modulates the expression of ERK, cyclin D1 and CREB / ATF-1, which are key markers in the progression of CRC. Both, normal intestinal tumor cells and those that over-express PTHrP respond to the action of the calcitropic hormones PTH and calcitriol, at least at the transcriptional level, by decreasing the expression of PTHrP. PTHrP not only activates mitogenic pathways and induces the proliferation of Caco-2 and HCT116 cells, but it is also capable of decreasing the sensitivity of these cells to Irinotecan (which is a drug commonly used for CRC chemotherapy) through ERK MAPK and β-catenin pathways. This work provides original information about the role of the tumor analog of PTH in intestinal tumor cells and the molecular mechanisms involved in the hormonal response of these cells, both in vitro and in vivo. In addition, this work expands the knowledge regarding the molecular mechanisms modulated by the calcitropic hormones PTH and calcitriol in intestinal tumor cells. The contribution of this Thesis work is that by elucidating the signaling pathways that regulate the processes induced by PTHrP and that contribute to the proliferation and/or chemoresistance, alternative therapeutic strategies could be generated in the treatment of CRC whose purpose is to inhibit the expression of PTHrP or its mechanism of action in these tumor cells.

Introducción:Fuera de toda duda la utilidad de los programas de screening del Cáncer Colo Rectal (CCR) basados en la detección de sangre oculta en heces en su misión de conseguir una disminución de la mortalidad por ésta patología, los esfuerzos deben ahora dirigirse hacia la forma de aumentar la participación de la población general en éstos estudios.Objetivos:El objetivo de éste estudio ha sido demostrar si es posible conseguir un aumento significativo de la participación mediante la invitación a la población diana por medio del contacto directo comparado frente al método estándar de invitación por carta. Pacientes y Método: Se ha realizado un ensayo controlado con dos grupos. Como sujetos de estudio se han utilizado a todas las personas de ambos sexos de edad comprendida entre los 50-74 años integradas en un Centro de Asistencia Primaria, pertenecientes a una mútua de empleados municipales de Barcelona (PAMEM) . Como criterio de exclusión solo ha sido utilizado la existencia de antecedentes personales de CCR (n=2026). Un grupo ha recibido la invitación y dos receptáculos para la recogida de muestras de heces a través del correo (Grupo Estándar, n=1060), mientras que el otro grupo (Grupo de Contacto Directo, n=966), ha recibido la visita de una persona no sanitaria que le ha entregado la misma documentación que al Grupo Estándar. La prueba de cribado ha consistido en un método inmunológico para la detección de sangre oculta en heces ("Hexagon Obti test"-Human H.), que no precisa dieta previa. Se han recogido muestras en dos dias sucesivos. Se ha realizado una llamada telefónica de refuerzo. Se han determinado la tasa de participación y el nivel de cumplimiento de la prueba de cribado, y posterior análisis de éstas variables principales en función de la forma de invitación (dieferencias entre grupos), sexo, y edad.Resultados: Ha existido un aumento significativo de la participación en el Grupo de Contacto Directo (558/966, 57,8%) en relación con el Grupo Estándar (387/1060, 36,5%) con una p<0,005.. El cumplimiento de la prueba de cribado, también ha sido mayor en el Grupo de Contacto Directo (417/556), 75,1%) en relación con el Grupo Estándar (263/387, 68%) con una p<0,014. No ha habido diferencias por grupo de edad ni sexo, ni en la participación ni en el cumplimiento.Conclusiones: Es posible aumentar la participación y el cumplimiento de la prueba de cribado en los programas de detección precoz del CCR, mediante la invitación por contacto directo efectuada por una persona no sanitaria. / Purpose of the Study: The reduction in mortality associated with Colo Rectal Cancer (CRC) provides scientific evidence for the effectiveness of CRC screening programs based on the detection of faecal occult blood. However, participation in such populational screening programs must be increased in order to obtain the desirable levels of effectiveness.The objective of the present study was to analyze participation through the invitation of the target population by means of direct contact compared with the standard method of invitation by letter.Method: A controlled trial with two groups was carried out. All individuals of both sexes aged between 50 and 74 years enlisted in one Primary Health Care Centre affiliated to a private health insurance scheme for municipal employees in Barcelona (PAMEM) were included. Subjects were excluded if they had a clinical history of CRC (n=2026).One group received the invitation and two containers for the collection of faecal specimens by post (the Standard group, n=1060), while the other group (Direct Contact group, n=966) were visited by a non-health professional (previously trained to transmit the required message) who supplied them with the same documentation as the Standard group. A reminder telephone call was made to subjects who did not respond to the initial contact.The screening test consisted of an immunological method for the detection of faecal blood which does not require any prior specific dietary measures (the "Hexagon Obti test" - Human H). Specimens were collect on two successive days.Participation rates and the level of compliance with the screening test were determined, and these variables subsequently analyzed as a functions of the method of invitation (group differences), sex and age.Results: A significantly higher participation was observed in the Direct Contact group (558/966, 57.8%) compared to the Standard group (387/1060, 36,5%) with a p<0.005. Compliance with the screening test was also higher in the Direct Contact group (417/556, 75.1%) compared to the Standard group (263/387, 68%) with a p<0.014. There were no differences in terms of either age group or sex for the participation, nor for level of compliance.Conclusions: Participation and level of screening test compliance can be raised in CRC screening programs, by means of an invitation made through direct contact by a non-health professional.

La Estadificación Laparoscópica de los tumores previa a su tratamiento quirúrgico con el abdomen abierto, sólo debería usarse en aquellos casos en que sus resultados cambien el curso del tratamiento a realizar a los pacientes, y por lo tanto su pronóstico. Como en la mayoría de los portadores de Cáncer Colorrectal (CCR) la conducta terapéutica indicada es resecar el tumor primitivo en cualquier estadio en que se encuentre, y para extirparlo es necesario hacer una laparotomía, durante la cual se puede realizar la exploración con el abdomen abierto, el uso de la Estadificación Laparoscópica preoperatoria fue juzgada “a priori”como innecesaria.