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ABSTRACT There are more than 2000 serotypes in the typhoid, septic and enteritidis Salmonella strains. This has long been a perplexity for the differentiation of Salmonella and discrimination from other food poisoning bacteria. In this research, we used polymerase chain reaction method ¡]PCR¡^ to develop a molecular technique for the detection of Salmonella. An invasion factor invA gene had been used to design the PCR primers. The results showed that under specific PCR conditions, many related bacterias such as Shigella, Yersinia, Serratia, Enterobacter, Vibrio and E. coli could be detected only with the primer annealing temperature ranging from 56¢J~66¢J. However, all tested Salmonella strains could be detected above 69¢J. This is potential of being developed into a rapid method for detecting Salmonella strains in food or clinical specimens. In the future, it can be further increased the accuracy of detection in coordination with multi-primer PCR technique or developed into a biochip for the detection of Salmonella.

De todas las infecciones, las del tracto urinario (ITU) son después de las infecciones de las vías respiratorias, las más frecuentes en la atención primaria. Los patógenos que causan estas infecciones son varios, pero el más común es Escherichia coli. Entre los antibióticos usados en el Perú para la terapia de las infecciones urinarias destacan las cefalosporinas y el mecanismo más importante de resistencia a estos antibióticos en las enterobacterias es la producción de betalactamasas de espectro extendido (BLEE). Hay varios tipos de BLEE, entre ellas las TEM, SHV y OXA, pero en 1989 se encontró un aislado clínico de Escherichia coli que producía una encima diferente a éstas a la que se le denominó CTX-M por su actividad hidrolítica preferente sobre cefotaxima. Las BLEE de tipo CTX-M han requerido relevancia epidemiológica por su dispersión intra y extrahospitalaria. Se han hecho investigaciones que demuestran que los aislados de E. coli productores de BLEE tipo CTX-M son prevalentes en Sudamérica, sin embargo en el Perú son pocos los estudios realizados al respecto. El objetivo de este estudio fue determinar a nivel fenotípico y molecular la presencia y frecuencia de genes que codifica BLEE del tipo CTX-M en cepas de E. coli provenientes de urocultivos. En un estudio observacional. Se colectaron 50 cepas de E. coli provenientes de urocultivos del Hospital Guillermo Almenara Irigoyen (HNGAI) entre marzo y mayo del 2012. Se confirmó la identificación de los aislados y se realizó el antibiograma mediante la técnica de Kirby - Bauer. La determinación de la producción de BLEE se hizo siguiendo los criterios del CLSI así como el método de Jarlier. Las plásmidos se extrajeron con el kit Pure Yield ™ Plasmid Miniprep System, Novagen. El gen blaCTX-M se evidenció mediante amplificación por PCR, visualizándose mediante electroforesis horizontal en gel de agarosa al 1%. Se determinó que el 58.3% de E. coli aisladas de urocultivos eran productoras de BLEE, de las cuales el 85.7% presentaron el gen de resistencia blaCTX-M en plásmidos. Se concluye que el principal mecanismo de resistencia en Escherichia coli aisladas de urocultivos del HNGAI, entre marzo y mayo del 2012, es la producción de BLEE, siendo el tipo CTX-M de elevada frecuencia (85.7%). Esto concuerda con lo reportado en otros países y es un conocimiento que aporta información valiosa que debe tomarse en cuenta para vigilar el progreso de la resistencia a los antibióticos en nuestro país. Palabras clave: BLEE, blaCTX-M, ITU, PCR y UPEC. / --- Of all infections, urinary tract infection (UTI) are after the infections of the respiratory tract, the most common in primary care. The pathogens that cause these infections are several, but the most common is Escherichia coli. Among the antibiotics used in Peru for therapy of urinary tract infections include cephalosporins and the most important mechanism of resistance to these antibiotics in enterobacteria is the production of extended-spectrum betalactamases (ESBLs). Several types of ESBL, including TEM, SHV and OXA, but in 1989 a clinical isolate of Escherichia coli producing a different enzyme which these was called CTX-M for its preferential hydrolytic activity on cefotaxime was found. The CTX-M type ESBLs have acquired its epidemiological relevance and intra-hospital spread. Research has been done showing that isolates of E. coli producing CTX-M type ESBLs are prevalent in South America, but in Peru are few studies about it. The objective of this study was to determine phenotypic and molecular level the presence and frequency of genes encoding ESBL CTX-M type strains of E. coli from urine cultures. In an observational study. 50 strains of E. coli from urine cultures of the Hospital Guillermo Almenara Irigoyen (HNGAI) between March and May 2012 were collected. Identification of isolates is confirmed and sensitivity is performed by the technique of Kirby - Bauer. The determination of ESBL production was made following CLSI criteria and the method of Jarlier. The plasmids were extracted with the kit Pureyield ™ Plasmid Miniprep System, Novagen. The blaCTX-M gene evidenced by PCR amplification, displayed by horizontal electrophoresis in agarose gel 1%. It was determined that 58.3% of E. coli isolated from urine cultures were ESBL producers, 85.7% of which presented resistance gene in plasmids blaCTX-M. It is concluded that the main mechanism of resistance in Escherichia coli isolated from urine cultures of HNGAI between March and May 2012, is the production of ESBL, the CTX-M being high frequency (85.7%) type. This is consistent with those reported in other countries and is knowledge that provides valuable information that should be considered to monitor the progress of antibiotic resistance in our country. Keywords: ESBL, blaCTX-M, ITU, PCR and UPEC. / Tesis

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Made available in DSpace on 2014-06-12T18:06:32Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo6313_1.pdf: 1481990 bytes, checksum: 994600fb8e4272b6f803e8477c45a54d (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2005 / Pseudomonas aeruginosa é uma bacteria Gram-negativa ubíqua e oportunista. Na rotina hospitalar, os marcadores fenotípicos nem sempre revelam a diversidade das bactérias distribuídas nos diversos setores, assim, aplicamos três métodos moleculares baseados na amplificação por PCR do locus de rDNA e tDNA para caracterizar a diversidade genética de linhagens de P. aeruginosa isoladas em um hospital público em Recife-PE, Brasil. O rDNA-PCR detectou 15% de variabilidade genética, contra 23% do tDNA-PCR e 23% do Duplex-PCR. O setor com maior diversidade genética foi a Unidade de Tratamento Intensivo do hospital, o qual apresentou quatro genótipos bacterianos diferentes. A ocorrência de linhagens de P. aeruginosa pertencentes ao mesmo genótipo e mesmo perfil de resistência a múltiplas drogas (MDR), em diferentes setores do hospital, sugere que há infecção cruzada entre pacientes. Os dados apresentados pelo rDNA-PCR, tDNA-PCR e Duplex-PCR, em associação ao perfil de susceptibilidade antimicrobiana provêem valiosas informações epidemiológicas para o controle de infecções hospitalares causadas por P. aeruginosa

Considerando a crescente importância econômica da exportação de carne de peru e os desafios sanitários que surgem com o aumento da produção desta espécie, o presente projeto propõe a detecção dos agentes bacterianos em perus apresentando quadro de aerossaculite, através da reação em cadeia pela polimerase (PCR). Um total de 201 suabes de sacos aéreos foram coletados a partir das carcaças de perus em um abatedouro comercial localizado no Centro Oeste do Brasil. Os suabes foram submetidos a PCR para detecção de Bordetela avium, Pasteurela multocida, Ornithobacterium rhinotracheale, Mycolplasma. gallisepticum, M. iowae, M. meleagridis e M. synoviae. B. avium foi detectada através da PCR em 58 animais, representando 28,8% dos suabes analisados. Os 201 suabes foram negativos para detecção de todos os outros agentes pesquisados. B. avium está presente nas criações de peru do país, e pode ter importante impacto sobre as doenças respiratórias desta espécie em condições intensivas de produção. / Considering the increasing economic importance of exports of turkey meat and sanitary challenges that come with increased production of this species, this project proposes the detection of bacterial agents involved in airsacculitis of turkeys, through polymerase chain reaction (PCR). A total of 201 air sacs swabs were collected from turkey carcasses at a commercial slaughterhouse located in the Midwest of Brazil. These swabs were submitted to PCR for detection of Bordetela avium, Pasteurela multocida, Ornithobacterium rhinotracheale, Mycolplasma. gallisepticum, M. iowae, M. meleagridis e M. synoviae. B. avium was detected in 58 animals, representing 28.8% of the swabs analyzed. All 201 swabs were negative to detection of other six agents tested. B. avium is disseminated in Brazilians turkey herds and may have important impact in respiratory diseases in this specie under intensive production systems.

Cryptosporidium spp são protozoários cosmopolita que acometem peixes, répteis, anfíbios, aves e mamíferos. Mais de 20 espécies são reconhecidas dentro deste gênero. Os roedores, grupos de organismos abundantes e ubíquos, têm sido considerados reservatórios de Cryptosporidium para humanos e animais de produção. As seqüências codificadoras da menor unidade ribossômica (18S rRNA) de Cryptosporidium spp caracterizam-se por intercalações entre regiões conservadas e polimórficas ao longo dos seus 1700 pares de bases. O objetivo deste estudo foi desenhar primers específicos para o gene 18S rRNA, potencialmente capazes de amplificar qualquer espécie ou genótipo de Cryptosporidium spp. e avaliar os atributos diagnósticos da nested-PCR baseadas em tais sondas. O desenho dos primers foi realizado de forma a amplificar um segmento de menor dimensão possível para se maximizar a sensibilidade do ensaio molecular e preservando o potencial discriminatório das seqüências amplificadas. A nestedPCR padronizada neste estudo (nPCR-SH) foi comparada com outro ensaio similar que vem sendo largamente utilizado para detecção e identificação de Cryptosporidium spp. no mundo todo (nPCR-XIAO). Também se objetivou caracterizar molecularmente amostras de Cryptosporidum spp. isoladas de roedores sinantrópicos, empregando-se estas sondas e sondas moleculares direcionadas. Foram capturados 45 roedores em áreas públicas da região urbana da cidade de Umuarama, Paraná. As amostras foram submetidas a três provas moleculares, sendo duas direcionadas ao gene18S rRNA (nPCR-SH e nPCR-XIAO) e outra, ao gene codificador da actina. A nPCR-SH foi testada com as amostras de Cryptosporidum parvum, Cryptosporidum andersoni, Cryptosporidum meleagridis, Cryptosporidum hominis, Cryptosporidum canis, Cryptosporidum serpentis e todas foram positivas. Dezesseis amostras de roedores foram positivas para a nPCR-SH, seis pela nPCR-XIAO e cinco pela nPCR dirigida ao gene codificador da actina. O sequenciamento dos fragmentos amplificados possibilitou a identificação de Cryptosporidum muris em três amostras de Rattus rattus, e dois novos genótipos de Cryptosporidium, os genótipos rato II e III. Genótipo rato II foi encontrado em uma amostra de Mus musculus e o genótipo III em doze amostras, sendo cinco Rattus rattus e sete Mus musculus. Os resultados deste estudo demonstraram que os primers desenhados para detecção do Cryptosporidium spp em amostras de fezes foram mais eficientes em amplificar regiões que permitem a distinção entre as espécies do parasito do que aqueles usados na PCR-XIAO. Nas amostras estudadas não foram encontrados genótipos ou espécies de Cryptosporidium que podem ser transmitidos a outras espécies como os zoonóticos, o que sugere que a importância destes animais na transmissão zoonótica de criptosporidiose é pouco relevante. / Cryptosporidium spp are cosmopolitan protozoan that infect fish, reptiles, amphibians, birds and mammals. More than 20 species are recognized within this genus. Rodents are groups of abundant and ubiquitous organisms that have been considered reservoirs of Cryptosporidium for infection of humans and livestock. The coding sequences of the smallest unit ribosomal (18S rRNA) of Cryptosporidium spp are characterized by intercalations amongst polymorphic and conserved regions along its 1700 base pairs. The aim of this study was to design primers specific for the 18S rRNA gene, potentially capable of amplifying any species or genotype of Cryptosporidium spp., and evaluate the attributes of the nested-PCR diagnosis based on such probes. The design of primers was performed to amplify a smaller segment as possible to maximize the sensitivity of molecular testing and preserving the discriminatory potential of the sequences amplified. The nested-PCR standardized in this study (nPCR-SH) was compared with another similar assay that has been widely used for detection and identification of Cryptosporidium spp. worldwide (nPCR-XIAO). It also aimed to characterize molecularly Cryptosporidum spp. isolated from synanthropic rodents, using these probes and targeted molecular probes. Forty five rodents were captured in public areas of the urban area of Umuarama, Paraná. The samples were subjected to three molecular tests, two targeted to gene18S rRNA (nPCR-SH and nPCR-XIAO) and another targeted to the gene encoding actin. The nPCR-SH was tested with strains of Cryptosporidum parvum, Cryptosporidum andersoni, Cryptosporidum meleagridis, Cryptosporidum hominis Cryptosporidum canis, Cryptosporidum serpentis and all were positive. Sixteen samples of rodents were positive by nPCR-SH, six by nPCR-XIAO and five by nPCR targeted to the gene encoding actin. The sequencing of the amplified fragments allowed the identification of Cryptosporidum Muris in three samples of Rattus rattus, and two new genotypes of Cryptosporidium rat genotype II and III. It was found rat genotype II in a sample of Mus musculus and genotype III in twelve samples, five from Rattus rattus and seven from Mus Musculus.The results showed that the primers designed for detection of Cryptosporidium spp in fecal samples were more efficient in amplifying regions that allow the distinction amongst the parasite species than those used in the PCR-XIAO. Cryptosporidium species or genotypes transmitted to other species such as zoonotic were not found in the studied samples, which suggest that the importance of these animals in the zoonotic transmission of cryptosporidiosis is very limited.

Cryptosporidium spp são protozoários cosmopolita que acometem peixes, répteis, anfíbios, aves e mamíferos. Mais de 20 espécies são reconhecidas dentro deste gênero. Os roedores, grupos de organismos abundantes e ubíquos, têm sido considerados reservatórios de Cryptosporidium para humanos e animais de produção. As seqüências codificadoras da menor unidade ribossômica (18S rRNA) de Cryptosporidium spp caracterizam-se por intercalações entre regiões conservadas e polimórficas ao longo dos seus 1700 pares de bases. O objetivo deste estudo foi desenhar primers específicos para o gene 18S rRNA, potencialmente capazes de amplificar qualquer espécie ou genótipo de Cryptosporidium spp. e avaliar os atributos diagnósticos da nested-PCR baseadas em tais sondas. O desenho dos primers foi realizado de forma a amplificar um segmento de menor dimensão possível para se maximizar a sensibilidade do ensaio molecular e preservando o potencial discriminatório das seqüências amplificadas. A nestedPCR padronizada neste estudo (nPCR-SH) foi comparada com outro ensaio similar que vem sendo largamente utilizado para detecção e identificação de Cryptosporidium spp. no mundo todo (nPCR-XIAO). Também se objetivou caracterizar molecularmente amostras de Cryptosporidum spp. isoladas de roedores sinantrópicos, empregando-se estas sondas e sondas moleculares direcionadas. Foram capturados 45 roedores em áreas públicas da região urbana da cidade de Umuarama, Paraná. As amostras foram submetidas a três provas moleculares, sendo duas direcionadas ao gene18S rRNA (nPCR-SH e nPCR-XIAO) e outra, ao gene codificador da actina. A nPCR-SH foi testada com as amostras de Cryptosporidum parvum, Cryptosporidum andersoni, Cryptosporidum meleagridis, Cryptosporidum hominis, Cryptosporidum canis, Cryptosporidum serpentis e todas foram positivas. Dezesseis amostras de roedores foram positivas para a nPCR-SH, seis pela nPCR-XIAO e cinco pela nPCR dirigida ao gene codificador da actina. O sequenciamento dos fragmentos amplificados possibilitou a identificação de Cryptosporidum muris em três amostras de Rattus rattus, e dois novos genótipos de Cryptosporidium, os genótipos rato II e III. Genótipo rato II foi encontrado em uma amostra de Mus musculus e o genótipo III em doze amostras, sendo cinco Rattus rattus e sete Mus musculus. Os resultados deste estudo demonstraram que os primers desenhados para detecção do Cryptosporidium spp em amostras de fezes foram mais eficientes em amplificar regiões que permitem a distinção entre as espécies do parasito do que aqueles usados na PCR-XIAO. Nas amostras estudadas não foram encontrados genótipos ou espécies de Cryptosporidium que podem ser transmitidos a outras espécies como os zoonóticos, o que sugere que a importância destes animais na transmissão zoonótica de criptosporidiose é pouco relevante. / Cryptosporidium spp are cosmopolitan protozoan that infect fish, reptiles, amphibians, birds and mammals. More than 20 species are recognized within this genus. Rodents are groups of abundant and ubiquitous organisms that have been considered reservoirs of Cryptosporidium for infection of humans and livestock. The coding sequences of the smallest unit ribosomal (18S rRNA) of Cryptosporidium spp are characterized by intercalations amongst polymorphic and conserved regions along its 1700 base pairs. The aim of this study was to design primers specific for the 18S rRNA gene, potentially capable of amplifying any species or genotype of Cryptosporidium spp., and evaluate the attributes of the nested-PCR diagnosis based on such probes. The design of primers was performed to amplify a smaller segment as possible to maximize the sensitivity of molecular testing and preserving the discriminatory potential of the sequences amplified. The nested-PCR standardized in this study (nPCR-SH) was compared with another similar assay that has been widely used for detection and identification of Cryptosporidium spp. worldwide (nPCR-XIAO). It also aimed to characterize molecularly Cryptosporidum spp. isolated from synanthropic rodents, using these probes and targeted molecular probes. Forty five rodents were captured in public areas of the urban area of Umuarama, Paraná. The samples were subjected to three molecular tests, two targeted to gene18S rRNA (nPCR-SH and nPCR-XIAO) and another targeted to the gene encoding actin. The nPCR-SH was tested with strains of Cryptosporidum parvum, Cryptosporidum andersoni, Cryptosporidum meleagridis, Cryptosporidum hominis Cryptosporidum canis, Cryptosporidum serpentis and all were positive. Sixteen samples of rodents were positive by nPCR-SH, six by nPCR-XIAO and five by nPCR targeted to the gene encoding actin. The sequencing of the amplified fragments allowed the identification of Cryptosporidum Muris in three samples of Rattus rattus, and two new genotypes of Cryptosporidium rat genotype II and III. It was found rat genotype II in a sample of Mus musculus and genotype III in twelve samples, five from Rattus rattus and seven from Mus Musculus.The results showed that the primers designed for detection of Cryptosporidium spp in fecal samples were more efficient in amplifying regions that allow the distinction amongst the parasite species than those used in the PCR-XIAO. Cryptosporidium species or genotypes transmitted to other species such as zoonotic were not found in the studied samples, which suggest that the importance of these animals in the zoonotic transmission of cryptosporidiosis is very limited.