Los cítricos son el cultivo frutal económicamente más importante tanto en España como en el resto de los países productores. La clave para mantener la competitividad de este sector consiste en obtener material vegetal de alta calidad, para lo cual son indispensables los programas de mejora. La mejora de cítricos por métodos clásicos es muy complicada, por lo que hay que recurrir a las nuevas tecnologías para intentar acelerar y optimizar el procedimiento. La reciente secuenciación del genoma de dos especies de cítricos ha permitido identificar una larga lista de genes candidatos a participar en determinados procesos biológicos. Sin embargo, son necesarios nuevos análisis para asociar cada gen a un fenotipo específico o función biológica. El empleo de vectores virales para determinar la función de genes mediante silenciamiento génico inducido por virus (VIGS) ha demostrado ser una herramienta muy útil para los estudios de genética reversa realizados en plantas. Este sistema presenta ventajas respecto a los métodos tradicionales para estudiar la función de genes como son la mutagénesis o la transformación genética, ya que permite ensayar la función de numerosos genes en un corto periodo de tiempo. Esto es especialmente crítico en el caso de los cítricos, que poseen largos periodos juveniles de entre 6 y 8 años y donde la transformación de plantas adultas es muy difícil. Además, permite estudiar la función de genes que son esenciales para el crecimiento o el desarrollo de la planta y cuyo análisis es inviable con los métodos tradicionales. Al comienzo de la tesis se había desarrollado un vector viral para cítricos basado en el virus de la tristeza de los cítricos (CTV) con el que se pueden expresar proteínas pero que no se ha ensayado para estudiar la función de genes mediante VIGS. En el laboratorio disponíamos de un clon infeccioso de cDNA del genoma completo del virus del manchado foliar de los cítricos (CLBV), un virus que infecta a todas las especies y variedades de cítricos ensayadas y es asintomático en la mayoría de ellas. Este clon infeccioso se ha modificado para obtener vectores virales basados en el genoma de CLBV que pueden servir tanto para expresar proteínas como para silenciar mediante VIGS genes de cítricos para la mejora genética de este cultivo. Para ello, se ha introducido un punto de corte único PmlI en dos zonas del genoma de CLBV: en el extremo 3¿ no traducible (vector clbv3¿) o en la zona intergénica localizada entre los genes de las proteínas de movimiento y cápsida (CP) (vector clbvIN). Para la expresión de secuencias foráneas mediante la formación de un nuevo RNA subgenómico (sgRNA) se delimitó la secuencia mínima promotora del sgRNA CP mediante clonación de fragmentos de distinta longitud en torno al origen de transcripción de dicho sgRNA en el vector clbv3'. El fragmento de 92 bases localizado entre los nt -42 y +50 respecto al inicio de transcripción del sgRNA CP contenía todos los elementos necesarios para la promoción de un nuevo sgRNA in vivo. Esta secuencia mínima promotora se clonó en los 2 vectores virales previamente desarrollados para generar los vectores clbv3¿pr y clbvINpr, respectivamente. Ambos vectores fueron capaces de producir un nuevo sgRNA y de expresar proteínas recombinantes. Para determinar la estabilidad de los vectores obtenidos se clonaron en ellos fragmentos de secuencias lineales de distinto tamaño, o en tándem invertido para la formación de una estructura en horquilla, y se inocularon en plantas de N. benthamiana y cítricos. Todas las construcciones derivadas del vector clbv3' se mostraron estables a lo largo de las diferentes brotaciones analizadas durante al menos 3 años, comprobándose la replicación viral e integridad del inserto. Sin embargo, no se detectó multiplicación viral con ninguna de las construcciones derivadas del vector clbvIN. La estabilidad de las construcciones derivadas de los vectores con el promotor duplicado dependía del tamaño del inserto. Con todas ellas se detectó replicación viral pero se observaron eventos de recombinación cuando se clonaban fragmentos superiores a 720 nt en el vector clbvINpr o 408 nt en el vector clbv3'pr. Un factor importante para determinar la eficiencia y funcionalidad de los vectores desarrollados es conocer cómo se mueve y se distribuye el virus en los distintos tejidos de la planta. Para ello se inocularon plantas de N. benthamiana y cítricos con la construcción clbv3¿pr-GFP, que expresa GFP en los tejidos donde se localiza el virus. En N. benthamiana, la observación de GFP permitió detectar la presencia de CLBV en la mayoría de tejidos, acumulándose preferentemente en óvulos y regiones meristemáticas. En cítricos no se pudo visualizar GFP pero el virus se detectó en regiones meristemáticas mediante RT-PCR a tiempo real e hibridación molecular. La acumulación de CLBV en tejidos meristemáticos explicaría la dificultad de eliminar este virus mediante microinjerto. Para evaluar la capacidad de los vectores clbv3'pr y clbvINpr para expresar proteínas se clonó en ellos la secuencia completa del gen gfp y se cuantificó la cantidad de proteína GFP sintetizada en las plantas infectadas. En N. benthamiana la cantidad de GFP estimada para el vector clbv3'pr fue de 16 µg de proteína por gramo de peso fresco, cantidad que resultó entre 5 y 6 veces superior a la estimada para el vector clbvINpr. Sin embargo, en cítricos, debido a la inestabilidad del vector clbv3'pr, sólo se pudo cuantificar la proteína expresada por la construcción del vector clbvINpr, estimándose en 0.6 µg de GFP por gramo de peso fresco. La efectividad de los vectores clbv3', clbv3'pr y clbvINpr para silenciar genes mediante VIGS se ensayó clonando fragmentos de genes tanto endógenos de plantas (pds, actina, sulfur) como el gen gfp introducido experimentalmente en plantas transgénicas. En cítricos todas las construcciones de los tres vectores indujeron fenotipo de silenciamiento del gen ensayado, aunque el vector clbv3' fue el más efectivo para el estudio de VIGS en este huésped. Sin embargo, en N. benthamiana sólo se desencadenó el silenciamiento en las plantas inoculadas con la construcción clbv3¿pr-hp58PDS, que expresa una horquilla de doble cadena de un fragmento de 58 nt del gen pds. En todas las plantas silenciadas se detectó una disminución del correspondiente mRNA del gen ensayado y una acumulación de siRNAs derivados tanto del mRNA del gen insertado como del RNA genómico del virus. Por otro lado, el fenotipo de silenciamiento de los genes ensayados se observó en sucesivas brotaciones, lo que confirma la gran estabilidad de los vectores basados en el genoma de CLBV. Los vectores virales desarrollados en esta tesis constituyen una herramienta eficiente para el estudio de la función de genes mediante genética reversa utilizando la técnica VIGS. También pueden ser útiles para estudio de genética directa mediante expresión de proteínas o para la protección del cultivo frente a enfermedades producidas por virus, bacterias y hongos o frente a plagas de invertebrados. / Agüero González, J. (2013). Desarrollo de vectores virales basados en el virus del manchado foliar de los cítricos (CLBV) [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/34342 / TESIS

Las giberelinas (GAs) son hormonas vegetales que regulan diversos procesos del desarrollo vegetativo y reproductivo de las plantas. Los niveles de GAs activas están regulados principalmente por enzimas de biosíntesis como las GA 20-oxidasas (GA20ox) y GA 3- oxidasas (GA3ox) y por enzimas de catabolismo como las GA 2-oxidasas (GA2oxs). En tomate (Solanum lycopersicum L.) las GA2oxs están codificadas por una familia multigénica de 5 miembros, SlGA2ox. El objetivo principal de nuestro trabajo es estudiar el papel de los genes SlGA2ox en el desarrollo de tomate. Para determinar como están regulados estos genes estudiamos su patrón de expresión en tejidos vegetativos y reproductivos de tomate y en respuesta a variaciones en los niveles endógenos de GAs. Se observó que los genes SlGA2ox tienen un alto grado de redundancia y que, en plántulas, no son inducibles por GAs. Los genes con mayores niveles de expresión en los tejidos vegetativos resultaron ser los genes SlGA2ox3, - 4 y -5 mientras que los genes SlGA2ox1 y SlGA2ox2 parecen ser importantes en el control del crecimiento del ovario ya que están reprimidos en ovarios polinizados en crecimiento y se inducen en ovarios no fertilizados. Para estudiar la función de estos genes en el desarrollo de la planta se empleó un abordaje de genética reversa usando silenciamiento génico post-transcripcional múltiple y simple. Para el silenciamiento múltiple se usó una construcción de tipo horquilla con una secuencia quimérica homóloga a los cinco genes (shRNA2ox) y para el silenciamiento del gen SlGA2ox1 se usó una construcción de tipo micro-RNA artificial (amiRNA2ox1). Ambas construcciones indujeron el silenciamiento, siendo éste más eficiente cuánto más abundante es el mensajero diana. El silenciamiento múltiple inducido por la construcción 35S::shRNA2ox provocó un incremento significativo de los niveles de la giberelina activa GA4 en ovarios. Además, los ovarios no fertilizados crecían mucho más en las plantas transgénicas que en las plantas silvestres (al menos 30 veces más) y presentaban cierto grado de capacidad partenocárpica que no poseían las plantas silvestres, desarrollando entre un 5 y un 37% de frutos partenocárpicos. Los ovarios polinizados de las plantas transgénicas se desarrollaban algo más rápido inicialmente, pero producían frutos del mismo tamaño a los silvestres. Estos resultados sugieren que el papel de las GAs en el crecimiento del fruto de tomate puede estar mediado, al menos en parte, por las GA 2-oxidasas. En el desarrollo vegetativo de estas plantas no se detectaron los efectos fenotípicos clásicos de la superproducción de GAs, ni se detectó ningún incremento en los niveles de GAs en tallos ni en ápices. Sin embargo se observó una inhibición significativa de la ramificación lateral que parecía deberse a un mayor contenido de GA4 detectado en las yemas axilares. Este fenotipo, no esperado, era suprimido eficientemente cuando se inhibía la síntesis de GAs mediante la aplicación del inhibidor paclobutrazol. Estos resultados sugieren un papel para las GAs como represores de la ramificación y que las GA 2-oxidasas son importantes en el control de la aparición de ramas laterales mediado por GAs. En las plantas 35S::amiRNA2ox1, donde solo se silenció el gen SlGA2ox1, a diferencia de lo que ocurre en las plantas de silenciamiento múltiple, no se detectaron cambios en los niveles de GAs activas, ni alteraciones en la ramificación, ni se mostraron efectos reproducibles sobre la partenocarpia. De estos resultados se deduce que el silenciamiento del gen SlGA2ox1 no es suficiente para inducir cambios significativos en el fenotipo de las plantas de tomate probablemente debido a la redundancia génica. En resumen, las GA 2-oxidasas parecen tener un papel en la regulación de los niveles de GAs en los ovarios y en las yemas axilares de tomate y su silenciamiento génico puede inducir crecimiento partenocárpico de los ovarios e inhibición de la ramificación. / Martínez Bello, L. (2014). Estudio del papel de los enzimas de catabolismo GA 2-oxidasas en el desarrollo de tomate (solanum lycopersicum L.) [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/37884 / TESIS

[EN] During viral infections, the outcome of the infective process is a net balance between the compatible and defence interactions. When a virus infects the eukaryotic cell, it must deal with different host defence mechanisms among which RNA silencing is part of the initial plant innate defence response. RNA silencing in plants has the role of restraining viral proliferation in the infected cell and therefore regulates the equilibrium between viral load and plant cell integrity that is key for the plant-virus compatibility. The virus itself is inductor, target and suppressor of the RNA silencing in plants. Viral silencing suppressor proteins (VSR) counteract host antiviral silencing and modify the host gene expression programme to generate a permissive environment for compatible infections. In this PhD thesis we have studied the interface between viral and plant RNA silencing in the context of a compatible infection. Using Tobacco rattle virus (TRV) as a model viral system and Nicotiana benthamiana and Arabidopsis thaliana as host model systems, we have dissected the role of endogenous small RNAs to promote gene silencing responses to viral sequences. Our results point to possible functional interactions between miRNAs and complementary sequences in viral genomes even though the role of those interactions as a viral proliferation controls mechanisms is not part of this thesis. We have found that TRV 16K silencing suppressor protein effects play a central role to dictate the way the TRV and plant RNA silencing interact. The 16K protein avoids, partially, the assembly of silencing effectors complexes and thus compromises the impact of antiviral vsiRNAs-mediated and endogenous small RNAs-mediated RNA silencing. The suppressor effect of TRV does not have a significant impact on the miRNAs content, relative composition and activity although we cannot discard an effect on the metabolisms of some particular miRNA species. / [ES] En las infecciones por virus, el desenlace del proceso infectivo debe entenderse como el resultado neto de las interacciones compatibles y de defensa entre el virus y la planta hospedadora. Cuando un virus entra en una célula eucariota debe lidiar con la activación de diferentes mecanismos de defensa del huésped. El silenciamiento génico mediado por RNA constituye una primera línea de defensa innata de la planta, siendo los propios virus inductores, dianas y supresores de este sistema de defensa. Las plantas a través del silenciamiento génico son capaces de limitar la proliferación viral en las células infectadas permitiendo un delicado equilibrio entre la multiplicación del virus y la integridad celular. Sobre este equilibrio se fundamenta la relación de compatibilidad en la interacción planta-virus. En este escenario, los virus utilizan sus proteínas supresoras de silenciamiento (VSR) para modular los efectos antivirales del silenciamiento y reprogramar la expresión génica del huésped proporcionando un entorno favorable para el desarrollo de la infección compatible Con este trabajo hemos abordado el modo en que los virus interaccionan con el silenciamiento génico en el contexto de una infección compatible. Empleando el virus del cascabeleo del tabaco (TRV) como sistema viral y Nicotiana. benthamiana y Arabidopsis thaliana como modelos de huésped, hemos indagado en el potencial de los pequeños RNAs (sRNAs) endógenos para guiar procesos de silenciamiento sobre secuencias virales. Nuestros resultados suLa manera en que TRV interacciona con la ruta de silenciamiento está condicionada gieren la posibilidad de interacciones funcionales entre microRNAs (miRNAs) y secuencias complementarias en el genoma del virus, si bien su relevancia como mecanismo de control de la proliferación viral no se ha estudiado en este trabajo. por el efecto supresor de la proteína 16K. Esta proteína impide, al menos parcialmente, el ensamblaje de los complejos efectores de silenciamiento y puede por tanto comprometer el efecto del silenciamiento antiviral dependiente de sRNAs tanto virales (vsiRNAs) como endógenos. El efecto supresor de TRV no parece perturbar globalmente el contenido, composición relativa y actividad de los miRNAs, si bien no es descartable que induzca alteraciones en el metabolismo de especies concretas. / [CAT] En les infeccions per virus, el desenllaç del procés infectiu ha d'entendre's com el resultat net de les interaccions compatibles i de defensa entre el virus i la planta hoste. Quan un virus entra a una cèl·lula eucariota ha de lluitar amb l'activació de diferents mecanisme de defensa de l'hoste. El silenciament gènic per RNA constitueix una primera línia de defensa innata de la planta, i els propis virus son inductors, dianes i supressors d'aquest sistema de defensa. Les plantes a través d'aquest silenciament, són capaces de limitar la proliferació viral a les cèl·lules infectades, permetent un delicat equilibri entre la multiplicació del virus i la integritat cel·lular. En aquest equilibri es fonamenta la relació de compatibilitat existent a la interacció planta-virus. En aquest escenari, els virus utilitzen les seues proteïnes supressores de silenciament (VSR) per tal de modular els efectes antivirals del silenciament i reprogramar l'expressió gènica de l'hoste, proporcionant un entorn favorable per al desenvolupament de la infecció compatible. Amb aquest treball hem abordat la manera en la que els virus interaccionen amb el silenciament gènic en el context d'una infecció compatible. Emprant el virus del cascavelleig del tabac (TRV) com a sistema viral i Nicotiana. benthamiana i Arabidopsis thaliana com a hostes models, hem indagat en el potencial dels RNAs endògens curts de doble cadena (sRNAs) per guiar processos de silenciament sobre seqüències virals. Els nostres resultats suggereixen la possibilitat de interaccions funcionals entre microRNAs (miRNAs) i seqüències complementàries al genoma del virus, tot i que la seua rellevància com a mecanisme de control de la proliferació viral no ha estat tractat en aquest treball. La manera en la que TRV interacciona amb les rutes de silenciament es troba condicionada per l'efecte supressor de la proteïna 16K. Aquesta proteïna impedeix, al menys parcialment, l'acoblament dels complexos efectors del silenciament i pot llavors comprometre l'efecte del silenciament antiviral depenent de sRNAs, tant virals (vsiRNAs) com endògens. L'efecte supressor de TRV no sembla pertorbar globalment el contingut, composició relativa i activitat dels miRNAs, tot i que no es pot descartar que induïsca alteracions en el metabolisme d'espècies concretes. / Martínez Priego, L. (2016). Actividad antiviral de pequeños RNAs endógenos y supresión de silenciamiento génico por la proteína 16K del virus del cascabeleo del tabaco (TRV) [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/61464 / TESIS

Esta dissertaÃÃo tem como proposta maior discutir parte da obra em prosa da escritora Hilda Hilst a partir da relaÃÃo escritura literÃria X loucura. As obras escolhidas para essa apreciaÃÃo foram Fluxo-Floema (1970), Tu nÃo te moves de ti (1980), A Obscena Senhora D (1982), O caderno rosa de Lori Lamby (1990), Contos DâescÃrnio / Textos grotescos (1990), Cartas de um sedutor (1991) e Estar Sendo, Ter Sido (1997). A justificativa para tal escolha passa, claro, por uma questÃo de maior recorrÃncia, nas obras citadas, ao tema principal da pesquisa. Assim, esta dissertaÃÃo se propÃe a problematizar esse conjunto de obras de Hilda Hilst a fim de levantar questÃes relativas à arte, à literatura brasileira e estrangeira, à escritura literÃria na sua condiÃÃo autodestrutiva e derrisÃria, e, por fim, ao itinerÃrio antropolÃgico ocidental atà a contemporaneidade. O pensamento teÃrico do qual esta pesquisa procura se aproximar, atravÃs de um gesto de diÃlogo, atende pelos nomes de Michel Foucault e Maurice Blanchot, principalmente. / Esta disertaciÃn tiene como propuesta mÃs larga discutir parte de la obra en prosa de la escritora Hilda Hilst a partir de la relaciÃn escritura literÃria X locura. Las obras eligidas para esa apreciaciÃn fueron Fluxo-Floema (1970), Tu nÃo te moves de ti (1980), A Obscena Senhora D (1982), O caderno rosa de Lori Lamby (1990), Contos DâescÃrnio / Textos grotescos (1990), Cartas de um sedutor (1991) e Estar Sendo, TerSido (1997). La justificativa para tal elecciÃn pasa, logicamente, por una questiÃn demÃs amplia y sugestiva recurrencia, en las obras apuntadas, al tema principal de la investigaciÃn. AsÃ, esta disertaciÃn se propone a problematizar ese conjunto de obras de Hilda Hilst con el objetivo de levantar cuestiones relativas al arte, a la literatura brasileÃa y extranjera, a la escritura literÃria en su condiciÃn auto-destructiva y sarcÃstica, y, finalmente, al itinerario antropolÃgico occidental hasta la contemporaneidad. El pensamiento teÃrico de lo cual esta investigaciÃn busca acercarse, a partir de un gesto de diÃlogo, tiene como nombres principales los siguientes pensadores: Michel Foucault y Maurice Blanchot.

Los viroides, los agentes infecciosos conocidos más simples, están constituidos por una molécula circular de RNA monocatenario. A pesar de su pequeño tamaño (246-401 nt) y de no codificar proteínas, son capaces de replicarse autónomamente, moverse sistémicamente, y causar enfermedades en ciertas plantas. En el presente trabajo hemos profundizado en el estudio de dos metodologías para el control de viroides basadas en ribozimas de cabeza de martillo con motivos de estabilización terciaria, y en RNAs interferentes que inducen en la planta una respuesta defensiva de silenciamiento génico mediado por RNA. Las ribozimas derivadas del viroide latente de la berenjena (Eggplant latent viroid, ELVd), que en su contexto natural median el autocorte de los RNAs multiméricos generados por un mecanismo de replicación de círculo rodante, son particularmente interesantes para adaptarlas a un formato trans. Hemos observado que la secuencia del trinucleótido que precede el sitio de autocorte de la ribozima de polaridad (+) del ELVd afecta a su actividad autocatalítica. Las constantes catalíticas de distintas variantes de este trinucleótido (AUA, AUC, GUA, GUC) determinadas in vitro a baja concentración de magnesio son diferentes en condiciones co- y postranscripcionales. Estos resultados sugieren que la ribozima de polaridad (+) del ELVd, y muy posiblemente otras ribozimas de cabeza de martillo naturales, han sido evolutivamente seleccionadas para actuar durante la transcripción de los RNAs viroidales, y que el trinucleótido AUC que precede al sitio de autocorte no se encuentra en la mayoría de las ribozimas de cabeza de martillo naturales por favorecer la adopción de estructuras metaestables catalíticamente inactivas durante la transcripción. La variante ELVd(+)-GUC, que presenta una constante catalítica alta e induce el corte de una amplia fracción del transcrito primario, fue seleccionada para diseñar variantes en trans frente al viroide del tubérculo fusiforme de la patata (Potat / Carbonell Olivares, A. (2008). Resistencia a viroides inducida por ribozimas de cabeza de martillo y RNAs interferentes [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/2005 / Palancia

Grado de magíster en fisiología / En el músculo esquelético, la función más estudiada del receptor de dihidropiridina o canal de calcio tipo L (Cav1.1), además de su función como canal de Ca+2 tipo L, ha sido el acoplamiento excitación-contracción (ECC). En los últimos años, se ha descrito una nueva función para el Cav1.1, relacionando su actividad al acoplamiento excitación-transcripción (ETC). En el ETC, el Cav1.1 es clave y participa regulando la activación del canal de Panexina 1 (Panx1), el cual permite la salida de ATP desde el interior hacia el exterior de la célula. En fibras musculares, nuestro grupo ha descrito que este proceso de liberación de ATP por parte de Panx1 puede activarse mediante un estímulo eléctrico. Aún más importante, este es un proceso dependiente de la frecuencia de estimulación eléctrica y que, en conjunto a otros intermediarios, genera señales de Ca+2 intracelulares regulando la expresión génica asociada a la plasticidad muscular. El control que ejerce el Cav1.1 sobre la actividad del Panx1 luego de estímulos eléctricos a frecuencias permisivas, demuestra una influencia unidireccional desde Cav1.1 hacia Panx1. Por otro lado, estas proteínas se encuentran a menos de 40 nm de distancia y co-inmunoprecipitan. A pesar de estos hallazgos, la estrecha regulación funcional entre Cav1.1 y Panx1 permanece poco explorada. Se ha descrito que el Cav1.1 en su rol en el ECC, ejerce una regulación unidireccional o anterógrada, en la cual, frente a la depolarización de la membrana plasmática sufre un cambio conformacional que activa al Receptor de Rianodina tipo 1 (RyR1) permitiendo la salida de Ca+2 desde el retículo sarcoplasmático y la contracción muscular. Sin embargo, en las últimas décadas se ha mostrado que existe también una regulación retrógrada desde RyR1 hacia Cav1.1, en la cual el RyR1 puede influenciar las características biofísicas del Cav1.1, como ocurre en modelos de inhibición o ausencia de RyR1, donde se encuentran alteraciones en la corriente de Ca+2 tipo L y en el “movimiento de carga” del Cav1.1. En relación a estos antecedentes, nuestra hipótesis es que existe una regulación retrógrada de Panx1 hacia Cav1.1. En este trabajo, evaluamos la influencia de Panx1 en la función de Cav1.1. Para esto, desarrollamos un modelo de knockdown para Panx1, con la técnica del RNA interferente, mediante la electroporación de un plasmidio shPanx1 en el músculo Flexor Digitorum Brevis (FDB). Medimos la corriente de Ca+2 tipo L y el movimiento de carga en condiciones de “potencial de membrana controlado, en célula completa” (Whole cell Voltage-Clamp) en fibras musculares aisladas del FDB. Observamos una disminución significativa en la amplitud de la corriente de Ca+2 tipo L durante los pulsos de potencial a 0 mV (p=0,023) y 10 mV (p=0,018) en las células que expresaban el plasmidio shPanx1 versus el control. Para el movimiento de carga, observamos una diferencia significativa en el parámetro V0.5, una de las variables de la distribución de Boltzmann para 2 estados, que representa el potencial de membrana al cual se desplaza la mitad de la carga máxima, mostrando una disminución de este valor en las fibras shPanx1 vs el control (p=0,047). De esta manera, podemos concluir que Panx1 cumple un rol en la regulación de la función de Cav1.1 por lo que la interacción funcional entre estas dos proteínas es bidireccional al igual que en el caso de Cav1.1 y RyR1. Esta interacción debe tenerse en cuenta en el desarrollo de futuros tratamientos farmacológicos que tengan como blanco a Panx1 y para condiciones patológicas donde la función de Cav1.1 se encuentre afectada, como la distrofia muscular, así como en aquellos procesos donde la adaptación muscular juega un rol vital, como son el envejecimiento y la diabetes. / In skeletal muscle, the most studied function of dihydropyridine receptor or L-type calcium channel (Cav1.1), in addition to its function as L-type Ca+2 channel, has been the excitation-contraction coupling (ECC). In recent years it has been described a new role for Cav1.1, linking their activity to the excitation-transcription coupling (ETC). In ETC, Cav1.1 is a key participant regulating the Pannexin 1 (Panx1) activation. This channel allows the outflow of ATP in a process dependent on the frequency of electrical stimulation and differents intermediaries, generates intracellular Ca+2 signals regulating gene expression associated with muscle plasticity. However, the close functional regulation between Cav1.1 and Panx1 remains little explored. In addition to this, for Cav1.1 in ECC, initially a unidirectional or anterograde regulation was described, in which Cav1.1 after cellular membrane depolarization undergoes a conformational change that activates ryanodine receptor type 1 (RyR1) allowing the Ca+2 release and muscle contraction. However, in recent decades a retrograde regulation from RyR1 to Cav1.1 has been described, evidenced as a change in the electrophysiology properties of Cav1.1 during blocking or absence of RyR1, with alterations in the L-type Ca+2 current and "Charge Movement", representatives of Cav1.1 function. Our hypothesis is that there is a retrograde regulation from Panx1 to Cav1.1. We evaluated the influence of Panx1 in Cav1.1 function. For this, we decreased the expression of Panx1 by electroporation of a shPanx1 plasmid, encoding an interference RNA against Panx1 in Flexor Digitorum Brevis (FDB). Then we measured the L-type Ca+2 current and the Charge Movement by the "whole cell control voltage" experiment (Voltage-Clamp) in isolated FDB muscle fibers. We observed a significant decrease in L-type Ca+2 current amplitude during the command pulses at 0 mV (p = 0.02297) and 10 mV (p = 0.01778) in shPanx1 vs control (mCherry). In Charge Movement we showed a significant difference in V0.5, a variable in two-state Boltzmann distribution, which represents the voltage at which there is a half maximum charge (Qmax) displacement, with a decrease in shPanx1 V0.5 vs control (p = 0.047). We can conclude that Panx1 has a role in the function of Cav1.1, so they have a bidirectional-relationship, the same that occurs between Cav1.1 and RyR1.

[EN] Pelargonium line pattern virus (PLPV) is one of the most frequent viral agents in geranium. It's an icosahedral virus, with a monopartite, positive-sense, single-stranded RNA genome, lacking a cap structure at the 5' end and poly(A) tail at its 3' end. Its genomic RNA (gRNA) contains five genes that encode two proteins involved in replication, two proteins involved in movement, (MP1 and MP2), and a coat protein (CP) that also acts as viral suppressor of RNA silencing. The first two genes are translated from the gRNA whereas the remaining three are translated from the single subgenomic RNA (sgRNA) that the virus produces during infection. The PLPV belongs to the family Tombusviridae and presents unique characteristics such as: i) production of a sole sgRNA that is structural and functionally tricistronic, ii) presence of a non-AUG start codon (CUG or GUG) initiating the MP2 ORF, iii) absence of AUG codons in any frame between the AUG initiation codons of MP1 and CP genes, and iv) sequence-based phylogenetic clustering of all encoded proteins in separate clades from those of other family members. In this doctoral thesis we have tried, on the one hand, to further study the regulation of PLPV gene expression and, on the other hand, to obtain information on degradation processes to which its genome is subjected, particularly on those related to the mechanism of RNA silencing. The first objective in this work was to determine the mechanism and the viral RNA elements involved in the generation of the sgRNA of PLPV. An RNA-RNA interaction involving distant segments of the gRNA of plus polarity has been identified. Such long-range interaction seems to act in cis and specifically mediates the production of the negative strand of the sgRNA, a type of molecule easily detectable in infected tissue. These results together with the possibility of uncoupling the synthesis of negative and positive strands of the sgRNA and with the observation of sequence similarity between the 5' ends of the gRNA and the sgRNA (with promoter function in their complementary strands), suggest that PLPV follows a model of premature termination for the formation of its unique sgRNA. The second objective of this work was to identify the elements of the viral genome that are involved in its translation through a cap-independent mechanism. Transfection of N. benthamiana protoplasts with PLPV-based reporter constructs has allowed us to corroborate the functionality of the CITE in the context of both the gRNA and the sgRNA. Additionally, it has been shown that this element establishes a long-distance RNA-RNA interaction with the 5'-region of the corresponding RNA which is essential for its activity. Moreover, data that support the relevance of the CITE during the infectious cycle of the virus have been obtained. Finally, in order to gain information on the role of PLPV as inducer and target of RNA silencing that the plant triggers as a defense against the virus, we have characterized the viral small RNAs (vsRNAs) present in PLPV-infected N. benthamiana plants. High-throughput sequencing, computational analysis and molecular hybridization assays have shown that: i) vsRNAs of the PLPV accumulate in extraordinarily high proportions in infected tissue, ii) 21 and 22 nt vsRNAs are the most frequent ones, iii) the vsRNAs of positive and negative polarities are in similar proportions, and, iv) there is variability in the vsRNAs 5'-proximal nucleotide. These results have provided clues on the viral molecules that must act as substrates for the formation of the vsRNAs and, also, about the components of the silencing machinery of the host that are likely involved in the response against the virus. / [ES] El virus del arabesco del Pelargonium (PLPV) es uno de los agentes virales más frecuentes en geranio. Se trata de un virus icosaédrico, con un genoma monopartito de RNA de simple cadena y de polaridad positiva que carece de estructura cap en su extremo 5' y de cola poli(A) en su extremo 3'. Su RNA genómico (gRNA) contiene 5 genes que codifican dos proteínas implicadas en replicación, dos proteínas implicadas en movimiento, (MP1 y MP2), y una proteína de cubierta (CP) que funciona además como supresor del silenciamiento por RNA. Las dos primeras se traducen a partir del gRNA y las tres restantes lo hacen a partir de un único RNA subgenómico (sgRNA) que el virus produce en el curso de la infección. El PLPV pertenece a la familia Tombusviridae y presenta características peculiares como son: a) la generación de un solo sgRNA estructural y funcionalmente tricistrónico, b) la presencia de un codón de iniciación no canónico (CUG o GUG) en el gen de la MP2, c) la ausencia de codones AUG en cualquier pauta de lectura entre los codones de inicio AUG de los genes MP1 y CP, y d) la agrupación filogenética en un clado separado de otros miembros de la familia Tombusviridae. En esta tesis se ha pretendido, por una parte, profundizar en el estudio de las estrategias de regulación de la expresión génica del PLPV y, por otra, recabar información sobre los procesos de degradación a los que se encuentra sometido su genoma, particularmente sobre aquellos relacionados con el mecanismo de silenciamiento por RNA. El primer objetivo abordado en este trabajo ha sido determinar el mecanismo y los elementos del RNA viral implicados en la generación del sgRNA del PLPV. Se ha identificado una interacción entre segmentos alejados del gRNA de polaridad positiva, que actúa en cis y que media la producción de la cadena negativa del sgRNA, un tipo de molécula fácilmente detectable en tejido infectado. Estos resultados junto con la posibilidad de desacoplar la síntesis de cadenas negativas y positivas del sgRNA y con la observación de similitud de secuencia entre el extremo 5' del gRNA y del sgRNA (con una función promotora en las cadenas complementarias), sugieren que el PLPV sigue un modelo de terminación prematura para la formación de su único sgRNA. El segundo objetivo de este trabajo ha sido identificar los elementos del genoma viral que están implicados en su traducción a través de un mecanismo independiente de cap. Mediante trasfección de protoplastos de N. benthamiana con construcciones delatoras, se ha corroborado la presencia de un estimulador traduccional (CITE) tanto en el contexto del gRNA como del sgRNA. Adicionalmente, se ha constatado que este elemento establece una interacción RNA-RNA a larga distancia con la región 5' del RNA correspondiente que es esencial para su actividad. Asimismo, se han obtenido datos que apoyan la relevancia del CITE durante el ciclo infeccioso del virus. Por último, para intentar recabar información sobre el papel del PLPV como inductor y diana de mecanismos de silenciamiento por RNA disparados por la planta como defensa frente al virus, se han caracterizado los pequeños RNAs virales (vsRNAs) presentes en plantas de N. benthamiana infectadas. Mediante secuenciación masiva, análisis computacionales e hibridación molecular, se ha podido determinar que: a) los vsRNAs del PLPV se acumulan en proporciones extraordinariamente elevadas en tejido infectado, b) los vsRNAs de 21 y 22 nt son los mayoritarios, c) los vsRNAs de polaridad positiva y negativa están en proporciones similares, y d) existe variabilidad en el nucleótido 5'-proximal de los vsRNAs. Estos resultados han permitido obtener pistas acerca de las moléculas virales que deben actuar cómo sustratos para la formación de los vsRNAs y, también, acerca de los componentes de la maquinaria de silenciamiento del huésped que deben participar en la respuesta del mismo frente al virus. / [CAT] El virus de l'arabesc del Pelargonium (PLPV) és un dels agents virals més freqüents en gerani. Es tracta d'un virus icosaèdric, amb un genoma monopartit de RNA de simple cadena i de polaritat positiva que manca d'estructura cap en el seu extrem 5', i de cua poli(A) en el seu extrem 3'. La seua RNA genòmic (gRNA) conté 5 gens que codifiquen dues proteïnes implicades en replicació, dues proteïnes implicades en moviment, (MP1 i MP2), i una proteïna de coberta (CP) que funciona a més com supresor del silenciamiento per RNA. Les dues primeres es tradueixen a partir del gRNA i les tres restants ho fan a partir d'un únic RNA subgenómico (sgRNA) que el virus produeix en el curs de la infecció. El PLPV pertany a la família Tombusviridae, i presenta característiques peculiars com són: a) la generació d'un sol sgRNA estructural i funcionalment tricistrònic, b) la presència d'un codó d'iniciació no canònic (CUG o GUG) en el gen de la MP2, c) l'absència de codons AUG en qualsevol pauta de lectura entre els codons d'inici AUG dels gens MP1 i CP, i d) l'agrupació filogenètica en un clade separat d'altres membres de la família Tombusviridae. En aquesta tesi s'ha pretès, d'una banda, aprofundir en l'estudi de les estratègies de regulació de l'expressió gènica del PLPV i, per una altra, recopilar informació sobre els processos de degradació als quals es troba sotmès el seu genoma, particularment sobre aquells relacionats amb el mecanisme de silenciament per RNA. El primer objectiu abordat en aquest treball ha sigut determinar el mecanisme i els elements del RNA viral implicats en la generació del sgRNA del PLPV. S'ha identificat una interacció entre segments allunyats del gRNA de polaritat positiva, que actua en cis i que intervé en la producció de la cadena negativa del sgRNA, un tipus de molècula fàcilment detectable en teixit infectat. Aquests resultats juntament amb la possibilitat de desacoblar la síntesi de cadenes negatives i positives del sgRNA i amb l'observació de similitud de seqüència entre l'extrem 5' del gRNA i del sgRNA (amb una funció promotora en les cadenes complementàries), suggereixen que el PLPV segueix un model de terminació prematura per a la formació del seu únic sgRNA. El segon objectiu d'aquest treball ha sigut identificar els elements del genoma viral que estan implicats en la seua traducció a través d'un mecanisme independent de cap. Mitjançant trasfección de protoplastos de N. benthamiana amb construccions delatores, s'ha corroborat la presència d'un estimulador traduccional (CITE) tant en el context del gRNA com del sgRNA. Addicionalment, s'ha constatat que aquest element estableix una interacció RNA-RNA a llarga distància amb la regió 5' del RNA corresponent que és essencial per a la seua activitat. Així mateix, s'han obtingut dades que recolzen la rellevància del CITE durant el cicle infecciós del virus. Finalment, per intentar recopilar informació sobre el paper del PLPV com inductor i diana de mecanismes de silenciament per RNA disparats per la planta com a defensa davant del virus, s'han caracteritzat els xicotets RNAs virals (vsRNAs) presents en plantes de N. benthamiana infectades. Mitjançant seqüenciació massiva, anàlisis computacionals i hibridació molecular, s'ha pogut determinar que: a) els vsRNAs del PLPV s'acumulen en proporcions extraordinàriament elevades en teixit infectat, b) els vsRNAs de 21 i 22 nt són els majoritaris, c) els vsRNAs de polaritat positiva i negativa estan en proporcions similars, i d) existeix variabilitat en el nucleòtid 5'-proximal dels vsRNAs. Aquests resultats han permès obtenir pistes sobre les molècules virals que han d'actuar com substrats per a la formació dels vsRNAs i, també, sobre els components de la maquinària de silenciament de l'hoste que han de participar en la resposta del mateix enfront del virus. / Blanco Pérez, M. (2016). Análisis de procesos de transcripción, traducción y degradación del virus del arabesco del Pelargonium [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/63452 / TESIS

Interés del estudio: Los viroides son patógenos exclusivos de plantas que infectan un gran número de especies de interés agronómico. Sin capacidad descrita para codificar proteínas, todas las fases de su ciclo vital son estrictamente dependientes de su interacción con factores del huésped. Históricamente se ha asumido que la patogénesis es consecuencia de la competencia huésped-patógeno por factores celulares implicados en el ciclo vital del viroide. En los últimos años se ha propuesto que la respuesta de silenciamiento de RNA (RNAi) del huésped frente a estos patógenos es la responsable de la respuesta patogénica de los viroides. En el presente trabajo se ha tratado de estudiar en profundidad la relación entre el mecanismo de silenciamiento de RNA y la patogénesis viroidal (en concreto del viroide del enanismo del lúpulo, HSVd). Objetivos: 1- Estudiar el proceso de patogénesis inducido por HSVd y la maquinaria de RNAi 2- Caracterizar mediante secuenciación masiva los sRNAs derivados de HSVd (vd-sRNAs). 4- Analizar la distribución diferencial de vd-sRNAs en distintos tejidos (hoja y floema). 5- Determinar las alteraciones inducidas por la infección en las vías endógenas de RNAi. Elementos de la metodología a destacar: - Uso de un sistema transgénico para estudiar el fenómeno de la patogénesis. - Uso de técnicas de secuenciación masiva para la caracterización de sRNAs. - Análisis bioinformático de los datos generados por la secuenciación masiva. Resultados logrados: - Primera publicación en la literatura de la relación de un componente de las rutas de RNAi en la patogénesis viroidal ocasionada por HSVd. - Publicación de una de las primeras secuenciaciones masivas de sRNAs derivados del HSVd. - Primera caracterización de las poblaciones de sRNAs endógenos de C.sativus, incluyendo la primera caracterización de microRNAs en esta especie. - Identificación y detección de nuevos microRNAs en C.sativus. / Martínez Arias, GE. (2011). Relación entre el silenciamiento de RNA y la patogénesis inducida por un viroide con replicación nuclear [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/11302 / Palancia

Citrus tristeza virus (CTV) is a viral species of the Closterovirus genus, having a ¿20 kb single-stranded and positive sense genomic RNA (gRNA) organized into 12 open reading frames (ORFs) potentially coding 17 protein products, some of which of unknown function. CTV proteins p25 and p27 belong to a gene block involved in virion assembly. It has been demonstrated that p25, along with p20 and p23, are RNA silencing suppressors in some species of Nicotiana, being the latter a pathogenesis determinant. CTV host range is very restricted and in nature viral infections are limited to the phloem cells of some citrus species. Consequently, working with this virus-host pathosystem requires an appropriate experimental host and an efficient CTV genetic system. In our laboratory we have developed a new CTV genetic system based on the agroinfection of Nicotiana benthamiana plants, a non-natural host, with infectious clones of the T36 isolate. That infection induces characteristic symptoms, some of which correlate with those caused by the virus in citrus plants. CTV-N. benthamiana interactions are very variable and genotype-dependent, so only some isolates can replicate in this species and T36 is unique causing systemic infections. In this work, we studied the function of CTV p20 and p25 proteins from three different isolates differing in its pathogenic characteristics. Transient expression of p20 and p25 fused to fluorescent proteins showed an identical subcellular localization for both N. benthamiana and citrus. The p20 protein of T36, T318A and T385 isolates localized in cytoplasm and nucleus forming amorphous aggregates associated with perinuclear regions, together with nuclear punctuate inclusions. On the other hand, subcellular localization of p25 differed depending on the CTV isolate. While p25 of T36 and T385 localized in the nucleus, that of T318A did it in cytoplasm. A detailed analysis of the protein regions involved in this subcellular localization unveiled a leucine-rich nuclear export signal (NES) in the N-terminus (Nt) of the protein. The pathogenic ability of CTV p20 and p25 in N. benthamiana was tested through a PVX heterologous viral infection, showing that p25 was not a pathogenicity determinant in this species, albeit p20 it was. Besides, the interactome of p25-T36 was more complex and diverse than that of p25-T318A, involving a greater number of metabolic processes, redox activities, homeostasis and cellular transport, biosynthesis and protein degradation, plastid and nucleic acid protein binding, biotic and oxidative stress, jasmonic-mediated defense, methylation, ROS signalling and HSP proteins. On the other hand, most p25-T318A potential interactors were related to transport/localization and stress response, like apoptosis, pathogenesis-related and HSP proteins, Ca+2-binding proteins and redoxins. Moreover, the experimental evolution of CTV in N. bethamiana was achieved through serial passages. The evolution process showed adaptative traits as the increase of graft survival, infectivity rates and viral titers, and a decreased time for the onset of symptom development in this species. Adaptive characteristics of evolved viral populations in N. bethamiana, were also correlated to their genetic variability and population structure. Two different evolved lineages showed convergent evolution processes reflected also at the molecular level. CTV viruses evolved in N. benthamiana were found to be less infectious at initial stages of infection when they were back-inoculated to citrus plants, and showed a decreased viral titer during the first year post-inoculation. This re-adaptation of N. benthamiana viral populations back to citrus was correlated, at a molecular level, with the progressive loss of the mutations appeared during its evolution process in N. benthamiana. / El virus de la tristeza de los cítricos (CTV) es un closterovirus con un RNA genómico (gRNA) de ssRNA (+) y ¿20 Kb organizado en 12 pautas de lectura abierta (ORFs) que codifican al menos 17 proteínas, algunas de función desconocida. Las proteínas p25 y p27 forman parte de un grupo de genes implicados en el ensamblaje del virión, y se ha demostrado que p25 junto con p20 y p23 son supresores de silenciamiento génico en algunas especies de Nicotiana, y la última es también un determinante de patogénesis. CTV tiene una gama de huéspedes muy restringida y de forma natural sólo infecta el floema de algunas especies de cítricos. Por ello, para trabajar con este patosistema virus-huésped, se requiere un huésped experimental adecuado y un sistema genético eficiente de CTV. Durante los últimos años hemos desarrollado un sistema genético de CTV basado en la agroinfección sistémica de Nicotiana benthamiana, una especie no-natural de este virus, con clones infecciosos del genotipo T36. Dicha infección va acompañada de síntomas característicos, algunos de los cuales son similares a los que el virus induce en cítricos. La interacción CTV-N. benthamiana es muy variable y genotipo-dependiente, sólo algunos aislados se replican en esta especie y únicamente T36 la infecta sistémicamente. En este trabajo, abordamos la función de las proteínas p20 y p25 de tres aislados de CTV que difieren en sus características patogénicas. La expresión transitoria de las p20 y p25 fusionadas a proteínas fluorescentes reveló su idéntica localización subcelular en N. benthamiana y cítricos. La proteína p20 se localizó en el citosol y el núcleo celular en agregados amorfos asociados a regiones perinucleares e inclusiones nucleares puntuales. En cambio, la expresión de la p25 de T36, T318A y T385 de CTV reveló una localización diferencial. Mientras la de T36 y T385 fue nuclear, la de T318A fue citosólica. Un análisis detallado de las regiones implicadas en dicha localización, reveló la existencia de una señal de exportación nuclear NES rica en leucinas en la región Nt de la proteína. Un análisis de la capacidad patogénica de p20 y p25 en N. benthamiana en un contexto de infección viral heterólogo a través de PVX, mostró que p25 no es un determinante de patogenicidad en esta especie, pero p20 sí. Por otra parte, el interactoma de la p25-T36 resultó mucho más complejo y diverso que el de la p25-T318A, interviniendo potencialmente en mayor número de procesos metabólicos de fotosíntesis, actividad redox, homeóstasis y transporte celular, biosíntesis y degradación de proteínas, unión a proteínas de los plastidios y ácidos nucleicos o de respuesta a estrés (biótico y oxidativo) o defensa mediada por la ruta del jasmónico, del ciclo de metilación, señalización por ROS y proteínas HSP. Las interacciones mayoritarias de la p25-T318A se relacionaron con transporte/localización y respuesta a estrés, principalmente con interactores implicados en procesos de apoptosis, patogénenis y proteínas HSP, de unión a calcio o redoxinas. También hemos conseguido la evolución experimental de CTV por pases seriados en N. benthamiana. Dicha evolución conlleva un conjunto de características adaptativas significativas como: el aumento del prendimiento de injertos, de la tasa neta de infectividad, del título viral y del adelanto de los síntomas causados en esta especie herbácea con el aumento de los pases. Las características adaptativas también se reflejaron a nivel molecular en la variabilidad genética y estructura de las poblaciones de los virus evolucionados en dos linajes independientes. Virus evolucionados en N. benthamiana resultaron menos infecciosos inicialmente por inoculación mecánica de regreso a cítricos, y se acumularon menos que el virus parental durante el primer año. Dicha re-adaptación de los virus evolucionados se reflejó a nivel molecular en la pérdida progresiva de las m / El virus de la tristesa dels cítrics (CTV) és un closterovirus amb un RNA genòmic de ssRNA(+) i 20 Kb organitzat en 12 pautes de lectura oberta (ORFs) que codifiquen, al menys, 17 proteïnes, algunes de les quals de funció desconeguda. Les proteïnes p25 i p27 formen part d'un grup de gens implicat en l'assemblatge del virió, i s'ha demostrat que p25, junt a p20 i p23, són supressors de silenciament gènic en algunes espècies de Nicotiana, i la última també és un determinant de patogènesi. La gama d'hostes de CTV és molt restringida i de forma natural sols infecta el floema d'algunes espècies de cítrics. Per això, per a treballar amb aquest patosistema virus-hoste, es requereix un hoste experimental adequat i un sistema genètic eficient de CTV. Durant els últims anys hem desenvolupat un sistema genètic de CTV basat en l'agroinfecció sistèmica de Nicotiana benthamiana, una espècie no-natural d'aquest virus, amb clons infecciosos del genotip T36. Aquesta infecció va acompanyada de símptomes característics, alguns dels quals són similars als que el virus indueix en cítrics. La interacció CTV-N. benthamiana és molt variable i genotip depenent, ja que sols alguns aïllats es repliquen en aquesta espècie i únicament T36 la infecta sistèmicament. En aquest treball hem abordat la funció de les proteïnes p20 i p25 de tres aïllats de CTV que difereixen en les seues característiques patogèniques. L'expressió transitòria de les p20 i p25 fusionades a proteïnes fluorescents va revelar la seua idèntica localització subcel·lular en N. benthamiana i cítrics. La proteïna p20 dels aïllats T36, T318A i T385 es va localitzar al citosol i al nucli cel·lular formant agregats amorfs associats a regions perinuclears, i inclusions nuclears puntuals. En canvi, l'expressió de la p25 de T36, T318A i T385 de CTV va revelar una localització diferencial. Mentre la de T36 i T385 fou nuclear, la de T318A fou citosòlica. Una anàlisi detallada de les regions implicades en eixa localització va revelar l'existència d'una senyal d'exportació nuclear (NES) rica en leucines a la regió Nt de la proteïna. L'anàlisi de la capacitat patogènica de p20 i p25 en N. benthamiana en un context d'infecció viral heteròloga a través de PVX, va mostrar que p25 no és un determinant de patogenicitat en aquesta espècie, però p20 sí. D'altra banda, l'interactoma de p25-T36 va resultar molt més complex i divers que el de p25-T318A, intervenint potencialment en un major nombre de processos metabòlics de fotosíntesi, activitat redox, homeòstasi i transport cel·lular, biosíntesi i degradació de proteïnes, unió a proteïnes dels plastidis i àcids nucleics o de resposta a estrés (biòtic i oxidatiu) o defensa mediada per la ruta del jasmònic, del cicle de metilació, senyalització per ROS i proteïnes HSP. Les interaccions majoritàries de la p25-T318A es relacionaren amb transport/localització i resposta a estrés, principalment amb interactors implicats en processos d'apoptosi, patogènesi i proteïnes HSP, d'unió a calci o redoxines. També hem aconseguit l'evolució experimental de CTV per passes seriats en N. benthamiana. Aquesta evolució comporta un conjunt de característiques adaptatives significatives com: l'augment de la supervivència dels empelts, de la taxa neta d'infectivitat, de la càrrega viral i de l'ajornament dels símptomes causats en aquesta espècie herbàcia amb l'augment dels passes. Les característiques adaptatives també es reflectiren a nivell molecular amb la variabilitat genètica i estructura de les poblacions dels virus evolucionats en dos llinatges independents. Virus evolucionats a N. benthamiana resultaren menys infecciosos inicialment per inoculació mecànica de tornada a cítrics, i s'acumularen menys que el virus parental durant el primer any. Aquesta re-adaptació dels virus evolucionats a N. benthamiana de tornada a cítrics es va reflectir a nivell molecular amb / Navarro López, JA. (2017). Estudio preliminar de las interacciones del virus de la tristeza de los cítricos (CTV) y su huésped [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/90468 / TESIS

[ES] En plantas, el silenciamiento por RNA constituye un potente mecanismo de defensa frente a virus. Los RNA virales de doble cadena activan este tipo de procesos y son digeridos por las enzimas DCL (Dicer-like), cuya acción genera pequeños RNA (sRNA) de entre 20 y 24 nt. Estos sRNA promueven la degradación de RNA de secuencia complementaria a través de un complejo multiproteico conocido como RISC (RNA-induced silencing complex), cuya molécula efectora es una proteína Argonauta (AGO). Con el fin de evadir esta barrera defensiva del huésped, la mayoría de los virus de plantas codifican supresores del silenciamiento por RNA (VSR), cuyos mecanismos de acción son diversos y en muchos casos no se comprenden del todo. Aunque todas las etapas de la ruta de silenciamiento pueden ser inhibidas por los VSR, los sRNA y las proteínas AGO parecen ser las dianas más frecuentes. Se ha postulado que motivos GW/WG podrían ser fundamentales para la actividad de algunos VSR, al intervenir en la interacción con proteínas AGO. En este trabajo se ha pretendido seguir profundizando en el estudio de la respuesta antiviral en plantas y de los mecanismos de acción de los supresores de silenciamiento. El primer objetivo abordado ha sido identificar el VSR codificado por el virus del arabesco del Pelargonium (Pelargonium line pattern virus, PLPV), un miembro del género Pelarspovirus dentro de la amplia familia Tombusviridae. Los resultados han mostrado que la proteína de cubierta del virus (p37) es capaz de inhibir de manera eficiente el silenciamiento inducido por RNA. La generación de un batería de variantes capaces e incapaces de actuar como VSR y/o de empaquetar el RNA viral mediante mutagénesis dirigida de distintos motivos de la proteína, incluido un motivo GW que está conservado en ortólogos, nos han permitido conocer que: (i) tanto la función de supresión del silenciamiento como la función de encapsidación son esenciales para que el PLPV alcance una infección sistémica y (ii) p37, a pesar de contener un motivo GW funcional e interaccionar con distintas AGO, emplea el secuestro de sRNA como estrategia principal para inhibir el silenciamiento. A pesar de que ambas funciones conocidas de p37 deben ser llevadas a cabo esencialmente en el citoplasma, esta proteína se localiza en citoplasma y núcleo, con gran acumulación en nucleolo, por lo que nos planteamos como segundo objetivo en este trabajo profundizar acerca de la localización nucleolar de p37. Además de mapear la región de la proteína que contiene la señal de localización nucleolar (NoLS) en los primeros 45 aminoácidos de la molécula, también hemos observado que p37 interacciona con diferentes miembros de la familia de las importinas ¿, adaptadores moleculares del transporte nucleocitoplasmático, y que esta interacción es esencial para la localización nucleolar de la proteína. Adicionalmente, la anulación de la localización nucleolar de p37 mediante el silenciamiento de importinas ¿ ha correlacionado con una disminución de acumulación del virus, lo que sugiere que dicha localización es ventajosa para la infección viral. Por último, para intentar conocer más datos acerca de las actividades de la ruta de silenciamiento que están implicados en la defensa frente al PLPV, analizamos la infección viral en líneas transgénicas de N. benthamiana con la expresión o actividad distintos componentes de la ruta comprometida. Los resultados han mostrado que DCL4 y, en menor medida, DCL2 afectan a la infección viral y que ambas tienen un efecto aditivo, tal y como se ha descrito en diversas interacciones virus-planta. Adicionalmente, AGO2 se ha revelado como un factor clave en la respuesta frente al PLPV, ampliando el número de virus que están afectados por esta endonucleasa particular. En conjunto, los resultados obtenidos muestran que tanto el procesamiento de dsRNA mediado por enzimas DCL como el corte de RNA mediado AGO, contribuyen a la defen / [CAT] En plantes, el silenciament per RNA constitueixen un potent mecanisme de defensa davant virus. Els RNA virals de doble cadena activen aquest tipus de processos, i són digerits per els enzims DCL (Dicer-like), donant lloc a xicotets RNA (sRNA) d'entre 20 i 24 nt. Estos sRNA promouen la degradació de RNA de seqüència complementària a través d'un complex multiproteic conegut com RISC (RNA-induced silencing complex), la molècula efectora del qual és una proteïna Argonauta (AGO). Per tal d'evadir aquesta barrera defensiva de l'hoste, la majoria dels virus de plantes codifiquen supressors del silenciament per RNA (VSR), els mecanismes d'acció dels quals són diversos i en molts casos no es comprenen del tot. Encara que totes les etapes de la ruta poden ser inhibides, els sRNA i les proteïnes AGO semblen ser les dianes més freqüents. S'ha postulat que els motius GW/WG podrien ser fonamentals per a l'activitat d'alguns VSR, en intervindre en la interacció amb proteïnes AGO. En aquest treball s'ha pretés continuar aprofundint en l'estudi de la resposta antiviral en plantes i dels mecanismes d'acció dels supressors de silenciament. El primer objectiu abordat ha sigut identificar l'VSR codificat pel virus de l'arabesc del Pelargonium (Pelargonium line pattern virus, PLPV), un membre del gènere Pelarspovirus dins de l'amplia família Tombusviridae. Els resultats han mostrat que la proteïna de coberta del virus (p37) és capaç d'inhibir de manera eficient el silenciament induït per RNA. La generació d'una bateria de variants capaces i incapaces d'actuar com VSR i/o d'empaquetar l'RNA viral mitjançant la mutagènesi dirigida de diferents motius de la proteïna, inclòs un motiu GW que està conservat en ortòlegs, ens ha permés conèixer que: (i) tant la funció de supressió del silenciament com la funció d'encapsidació són essencials per a que el PLPV aconseguisca una infecció sistèmica i (ii) p37, malgrat contindre un motiu GW funcional i interaccionar amb diferents AGO, empra el segrest de sRNA com a estratègia principal per a inhibir el silenciament. Malgrat que ambdues funcions conegudes de p37 han de ser dutes a terme essencialment en el citoplasma, esta proteïna localitza en citoplasma i nucli, amb gran acumulació en nuclèol, per la qual cosa ens hem plantejat com a segon objectiu en este treball aprofundir sobre la localització nucleolar de p37. Ademés de mapejar la senyal de localització nucleolar (NoLS) en els primers 45 aminoàcids de la molècula, també hem observat que p37 interacciona amb diferents membres de la família de les importines ¿, i que aquesta interacció és essencial per a la localització nucleolar de la proteïna. A més, l'anul¿lació de la localització nucleolar de p37 mitjançant el silenciament d'importines ¿ s'ha correlacionat amb una disminució d'acumulació del virus, la qual cosa suggereix que aquesta localització és avantatjosa per a la infecció viral. Finalment, per a intentar conéixer més dades sobre les activitats de la ruta de silenciament que estan implicats en la defensa front al PLPV, hem analitzat la infecció viral en línies transgèniques de N. benthamiana amb l'expressió o activitat diferents components de la ruta compromesa. Els resultats han mostrat que DCL4 i, en menor mesura, DCL2 afecten la infecció viral i que ambdues tenen un efecte additiu, tal com s'ha descrit en diverses interacciones virus-planta. Addicionalment, AGO2 s'ha revelat com un factor clau en la resposta front al PLPV, ampliant el nombre de virus que estan afectats per aquesta endonucleasa particular. En conjunt, els resultats obtinguts mostren que tant el processament de dsRNA mediat per enzims DCL com el tall d'RNA mediat AGO, contribueixen a la defensa de N. benthamiana front al PLPV. / [EN] n plants, RNA silencing functions as a potent antiviral mechanism. Viral-derived double-stranded RNAs trigger this type of processes, being digested by DCL (Dicer-like) enzymes into virus-derived small RNAs (vsRNAs) of 20-24 nt. These vsRNAs guide sequence-specific RNA degradation upon their incorporation into an RNA-induced silencing complex (RISC) that contains a slicer of the Argonaute (AGO) family. To counteract this host defence response, most plant viruses encode suppressors of RNA silencing (VSRs), whose mechanisms of action are diverse and often not well understood. Though virtually all stages of the antiviral silencing pathway can be blocked by VSRs, sRNAs and AGO proteins seem to be the most common targets. It has been postulated that GW/WG motifs could be fundamental for the activity of some VSRs by directing interaction with AGOs. In this work, we have pursued to get further insights into the antiviral silencing in plants and the mechanisms of action of silencing suppressors. The first objective has been to identify the VSR encoded by Pelargonium line pattern virus (PLPV), a member of the genus Pelarspovirus within family Tombusviridae. The results have shown that the viral coat protein (p37) is able to efficiently inhibit RNA silencing. Generation of suppressor-competent and incompetent molecules and uncoupling of the RSS and particle assembly capacities through site-directed mutagenesis of some p37 sequence traits, including a conserved GW motif, allowed us to know that: (i) the silencing suppression and encapsidation functions of p37 are both required for systemic PLPV infection and, (ii) p37, even though it has a functional GW motif and interacts with different AGOs, inhibits silencing most likely through vsRNA sequestration. Despite both p37 functions have to be executed essentially in the cytoplasm, this protein localizes in cytoplasm and nucleus, with high accumulation at the nucleolus, so the second objective of this work has been to gain further insights into the nucleolar localization of p37. Besides mapping the protein region containing the nucleolar localization signal (NoLS) in the first 45 amino acids of the molecule, we have found that p37 interacts with distinct members of the importin ¿ family, main cellular transporters for nucleo-cytoplasmic traffic of proteins, and that these interactions are crucial for nucleolar targeting of p37. In addition, impairment of p37 nucleolar localization through down-regulation of importin ¿ expression has been correlated with a reduction of viral accumulation, suggesting that sorting of the protein to the major subnuclear compartment is advantageous for the infection process. Finally, in order to obtain information on which activities of RNA silencing pathway are involved in the defense against PLPV, we analyzed the viral infection in N. benthamiana transgenic lines with the functions of distinct components of the pathway impaired. Results have shown that DCL4 and, to lesser extent, DCL2 contribute to restrict viral infection and that they have additive effects, in agreement with that observed in other plant-virus interactions. Additionally, AGO2 was found to be a key factor in the defense against PLPV, extending the number of viruses that are affected by this particular slicer. Altogether, the results supported that both dicing and slicing activities participate in the defense of N. benthamiana against PLPV. / Pérez Cañamás, M. (2019). Análisis de la interacción del virus del arabesco del Pelargonium con la ruta de silenciamiento por RNA del huésped [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/122297 / TESIS