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Expressão e analise do gene do capsideo de isolados do virus da tristeza de diferentes especies e variedades de citros

Targon, Maria Luisa Penteado Natividade 12 September 1997 (has links)
Orientador: Marcos A. Machado / (Tese doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-22T21:50:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Targon_MariaLuisaPenteadoNatividade_D.pdf: 6263544 bytes, checksum: fc6bcef3ec00b19dbb7a60841e7d7717 (MD5) Previous issue date: 1997 / Doutorado / Genetica Vegetal / Doutor em Ciências Biológicas
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Detecção e investigação de algumas propriedades de dois inibidores de fitovirus

Figueira, Antonia dos Reis 15 July 2018 (has links)
Orientador: Alvaro Santos Costa / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-15T00:06:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Figueira_AntoniadosReis_D.pdf: 5723352 bytes, checksum: 05d1b0ff6cd856f8737ab8693ebb4e0c (MD5) Previous issue date: 1983 / Resumo: Foram detectados dois fortes inibidores da transmissão mecânica do vírus do mosaico do mamoeiro em uma triagem efetuada entre diferentes substâncias químicas e sucos de diferentes espécies de plantas. Foram eles o detergente comercial ODD, utilizado na limpeza doméstica, e o suco de Turnera ulmifolia L. Foi estudado o mecanismo de ação desses inibidores sobre a transmissão do vírus do mosaico do mamoeiro e do fumo, porém alguns outros testes realizados mostraram que eles foram capazes de inibir a transmissão mecânica de outros vírus como o do mosaico da alfafa, Y de Piracicaba e acro-necrose. A inibição pela aplicação previa do suco de T. ulmifolia em mamoeiro mostrou efeito positivo quando feita um dia antes, mas não 4 ou mais dias antes da inoculação mecânica. O ODD mostrou boa inibição quando aplicado 8 dias antes (76,6%) e mesmo aplicado 12 dias antes induziu inibição de 40%. Com o vírus do mosaico do fumo (TMV) o inibidor de T. ulmifolia exerceu algum efeito positivo aplicado até 8 dias antes da inoculação (35,9%); o ODD teve efeito inibidor razoável mesmo quando aplicado 12 dias antes (60,7%). Quando esses inibidores foram misturados com o inoculo ou aplicados imediatamente após a inoculação do TMV em plandas de fumo TNN, houve bom efeito inibidor. ...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Exploratory screening of a number of chemical substances and of plant juices from many species permitted the detection of two effective plant virus inhibitors; ODD, a comercial household detergent sold in Brasil, and the leaf juice of the Turneraceae, Turnera ulmifolia L. Both inhibitors were tried against tobacco mosaic and papaya ring spot viruses in the majority of tests, but they were also active against two potyviruses that infect bean and alfafa mosaic virus. Seedlings of papaya (Carica papaya L.), Turkish necrotic tobacco (Nicotiana tabacum L.), and bean (Phaseolus vulgaris L.) were used as test plants. The inhibitory present in the leaf juice of T.ulmifolia, as well as that in ODD, are inhibitors of virus infections and not of virus replication. Both were effective when applied prior or immediaately after inoculation, although ODD was still effective when treatment was 4 hr afterwards. These results were interpreted as indicating the leaf juice inhibitor was an impediment in the initial interaction virus-host cell, whereas that in the detergent could act likewise or after it had occurred. The virus inhibitory effect of ODD is attributed to its main constituint, sodium alkylbenzenesulfonate, a component of most commercial brands of detergents. ...Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Doutorado / Doutor em Ciências Biológicas
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Caracterização parcial do luteovirus associado ao amarelecimento foliar da cana-de-açucar e aspectos fisiopatologicos na planta hospedeira

Gonçalves, Marcos Cesar 10 June 1998 (has links)
Orientador: Jorge Vega / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-23T23:57:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Goncalves_MarcosCesar_M.pdf: 5087409 bytes, checksum: 9ec4108068877391da39bff0cb2ca417 (MD5) Previous issue date: 1998 / Resumo: A síndrome do amarelecimento foliar da cana-de-açúcar constitui hoje uma preocupação mundial para a produtividade da cultura. Contudo, controvérsias ainda são levantadas sobre a sua origem e principalmente sobre a natureza do agente causal da moléstia. Visando contribuir para o estabelecimento da etiologia da doença, o presente trabalho apresenta a purificação do luteovirus identificado em plantas com sintomas e a tentativa de produção de um anti-soro policlonal para o estabelecimento de um método seguro de diagnóstico. As alterações na fisiologia da planta provocadas pelo patógeno, refletindo ou não em sintomas visíveis, foram estudadas por monitoramento da eficiência fotossintética e dos conteúdos de pigmentos fotossintetizantes e carboidratos fotoassimilados. O método de purificação avaliado ofereceu uma boa eficiência, sendo obtidas razões A260/A280=1, 8 e concentrações de 100µg/ml de partículas virais de formato isométrico de ca. 25nm. Os anti-soros policlonais produzidos, porém, não foram úteis para detecção serológica do vírus, sendo constatada uma forte reação cruzada com plantas sadias em testes PTA-ELISA, DASI-ELISA e "Tissue-Blotting". Foram encontradas reduções nos teores de pigmentos fotossintetizantes e na razão Cla/Clb, indicando alterações na estrutura e função dos cloroplastos em plantas infectadas. Ocorreu diminuição da atividade fotossintética, em termos da taxa de troca líquida de CO2, principalmente sob altos níveis de radiação fotossinteticamente ativa. As plantas infectadas também apresentaram fotoinibição e alterações em algumas etapas do transporte eletrônico no PSII durante o preenchimento do "pool" de PQ. Houve acúmulo de açúcares nas folhas de plantas infectadas, provavelmente devido à presença do vírus nas células do floema foliar. O açúcar de maior acúmulo foi a sacarose, devido à interferência no seu carregamento e/ou transporte no floema. Essas alterações nas relações fonte dreno aliadas à queda na eficiência fotossintética foram interpretadas como os principais responsáveis pela quebra de produção da cultura / Abstract: PARTIAL CHARACTERIZATION OF SUGARCANE LEAF YELLOWING ASSOCIATED LUTEOVIRUS AND PHYSIOPATHOLOGICAL ASPECTS OF THE HOST PLANT. The sugarcane yeIIow Ieaf disease has become a serlous problem in most sugarcane growing countries. In recent studies, Iuteovirus-like particIes present in the phIoem companion cells have been found in symptomatic paints (VEGA et al., 1997). This work was intended to obtain adequate amounts of purified particIes to immunize animaIs against the virus, aIong with additional studies for its characterization. Polyclonal antisera were obtained by injecting rabbits and chickens with purified virus. Physiological aspects of the infected plants were also studied by monitoring photosynthetic processes using chIorophyll fIuorescence and gas exchange analysis, changes in photosynthetic pigment levels and carbohydrate determinations in the Ieaves. The best purifications were obtained using a final centrifugation for 3 hours at 35000 rpm in density gradients of 5 and 10% sucrose, 5,10,15 and 20% CS2SO4 in a 10% sucrose solution. Concentration of particles were around 100µg/ml and the 260/280 ratio of 1,8. Absorbance spectra at UV, after fractionating, presented curves characteristic of polyhedral particles with peaks at 260nm. Electron microscopy of fractions with higher A260 showed a great number of isometric isometric particles of ca. 25nm. Antisera obtained did not offer a good tool for diagnosis, since cross-reaction against healthy plants were frequently found in PTA-ELISA, DASI-ELISA and Tissue-Blotting. Levels of chlorophylls a and b, and carotenoids were reduced in infected plants as well as the ratio chla/chlb. It seems likely that these alterations are partially responsible for the reductions found in net rates of gas exchanges, by the photoinhibition and modifications on redox state of primary and secondary electron acceptors of photosystem II, QA and QB, during the filling up of the plastoquinone pool , (PQ) . Accumulations of carbohydrates, especially sucrose, were found in the leaves. The presence of the virus in phloem cells is thought to impair the loading and/or transport of sugars in the phloem, inducing their accumulations in the leaves / Mestrado / Mestre em Ciências Biológicas
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Efeito terapeutico de virazole sobre os virus causadores do enrolamento da folha, anel do pimentão e tristeza dos citros

Baptista, Celia Regina 27 July 1995 (has links)
Orientador: Jorge Vega / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-20T18:10:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Baptista_CeliaRegina_M.pdf: 10046267 bytes, checksum: 9f4cdc2c74acd2b3cc7ebea8e3d6983b (MD5) Previous issue date: 1995 / Resumo: Com o objetivo de estudar o efeito quimioterápico de Virazole (1-ß-Dribofuranosil -1,2,4 - triazol-3 - carboxamida) in vitro sobre vírus de plantas, dois modelos de estudo foram realizados. No primeiro utilizou-se calos de videira Vitis vinifera, Seibel 2, infectados com o vírus do enrolamento da folha da videira (VEFV), e calos de fumo Nicotiana tabacum "TNN" e Gomphrena globosa L. infectados com o vírus do anel do pimentão (VAP). No segundo, foi utilizado um modelo aplicado, visando a obtenção de plantas de limoeiro Galego Citrus aurantifolia (Christm.) Swing) livres do vírus da tristeza dos citros "citrus tristeza virus" (CTV). Os objetivos específicos foram: 1) Testar o efeito do Virazole em calos cultivados in vitro, comparando: a) diferentes tipos de vírus (closterovirus e tobravirus) e b) efeito do. Virazole sobre um mesmo vírus em duas espécies de plantas hospedeiras. 2) Avaliar a possibilidade do uso de Virazole para obtenção de plantas cítricas livres do CTV por minienxertia realizada in vitro. Os resultados mostraram que o Virazole inibiu a multiplicação dos 3 vírus em estudo (VEFV, VAP e CTV), pertencentes a dois grupos distintos: closterovirus (VEFV e CTV) e tobravirus (V AP). A utilização de calos infectados com vírus e tratados com Virazole in vitro, mostrou ser um modelo de estudo eficiente para avaliar o efeito desse composto quimioterápico sobre vírus de planta. A indexação serológica; das amostras coletadas a cada subcultura dos calos permitiu acompanhar a evolução do conteúdo de vírus no decorrer de várias subculturas sucessivas. Os resultados mostraram de modo geral, que a quantidade de vírus presente varia muito pouco nas culturas de calos mantidas em ausência de Virazole. As concentrações mais baixas utilizadas não inibiram a multiplicação dos vírus, ao passo que concentrações mais altas do produto provocaram uma diminuição progressiva da concentração de vírus a cada subcultura até que as partículas virais não foram mais detectadas nos testes serológicos. O desenvolvimento da cultura foi afetado por concentrações altas de Virazole, sendo que algumas concentrações foram fitotóxicas, dependendo da planta e do tecido tratado. Em calos de videira infectados com VEFV o significativa a replicação do vírus. A inibição foi proporcional Virazole inibiu de maneira à concentração do produto utilizada. À 50 ppm não foram detectadas partículas virais nos testes serológicos. O Virazole atuou rapidamente em diminuir a concentração do VEFV à um nível baixo em calos em proliferação, porém, um longo período de incubação foi necessário para obter completa supressão dos vírus. Esses resultados são consistentes com a possibilidade de que a atividade antiviral do Virazole se manifesta por sua ação na síntese de novas partículas mais do que uma inativação direta dos vírus existentes. O Virazole foi capaz de inibir a multiplicação do V AP em calos de fumo, mas não em calos de G. globosa. Em fumo a concentração de 200 ppm eliminou os vírus presentes nos calos, enquanto que em calos de G. globosa o Virazole não foi efetivo em nenhuma das concentrações testadas. Possivelmente essas plantas apresentam vias metabólicas alternativas para a replicação do RNA viral ( e não aquela inibida pelo Virazole). A eficiência do Virazole em eliminar o V AP foi também dependente do estágio de desenvolvimento dos tecidos tratados. O Virazole inibiu a multiplicação de vírus quando pedaços de folhas foram utilizados como explantes, porém, ocorreu pouca ou nenhuma inibição quando células de calos não organizados foram tratadas com Virazole. O Virazole inibiu a multiplicação do CTV à concentração de 200 ppm. Essa inibição foi verificada pela ausência de sintomas específicos do vírus da tristeza nas plantas obtidas. As plantas cresceram tão bem quanto as plantas sadias. O Virazole não foi efetivo à 100 ppm. Nessa concentração o vírus provocou paralisação do crescimento das plantas e as folhas apresentaram sintomas de palidez das nervuras, específicos da doença. Esses resultados foram confirmados por ELISA e "Western-blot". Com bases nesses resultados, conclui-se que o Virazole é um quimioterápico eficiente para a obtenção de plantas livres de vírus, dependendo da espécie vegetal, do vírus envolvido e das condições de tratamento / Mestrado / Fisiologia Vegetal / Mestre em Ciências Biológicas
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Purificação e serologia do virus do mosaico dourado do tomateiro (VMDT)

Garcia, Sara Polido 18 December 1980 (has links)
Orientador : Avelino Rodrigues de Oliveira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-15T17:34:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Garcia_SaraPolido_M.pdf: 2495523 bytes, checksum: abc0b1d0f7ad966722417f684c3d617d (MD5) Previous issue date: 1980 / Resumo: Cinco técnicas de purificação do vírus do mosaico dourado do tomateiro (VMDT) foram testadas, visando obter antígenos para o preparo de antissoros específicos. As técnicas empregadas foram xilol, tetracloreto de carbono, eliminação dos cloroplastos e polietilenoglicol. A avaliação da eficiência dessas técnicas, através de testes de infectividade das frações finais, observações ao microscópio eletrônico e testes serológicos comos antissoros preparados, mostrou que polietilenoglicol é técnica adequada para os fins propostos. Frações do VMDT purificado segundo a técnica do polietilenglicol mostraram-se ativas biologicamente nos testes de inoculação mecânica em plantas de Nicotiana glutinosa L. e N. tabacum L. e exibiram alta concentração de partículas com diâmetro em torno de 14 nm. Antissoros preparados com essa fração apresentaram, em testes de dupla difusão em agar, linha de precipitação que permite diagnosticar a presença do VMDT em hospedeiras de N. glutinosa e N. tabacum / Abstract: In order to prepare specific antisera to the tomato golden mosaic virus (TGMV), a whytefly-transmitted agent, five purification methods were tried. The techiques used in this work were: xylol, carbon tetrachloride, butanol, chloroplasts elimination, and polyethylene glycol. Bio-assays and serological tests have shown that the polyethylene glycol technique was the best for purification. It was carried out, as follows: infected leaves of Nicotiana glutinosa L. And N. Tabacum L. Were homogenized in 0.02M potassium phosphate buffer at pH 7.0 plus 0.02M Na2SO3; the clarification was carried out with 7% chloroform combined with n-butanol and TGMV precipitated with 10% PEG (Carbowax-6.000)-0.25M NaC1, followed by low-speed centrifugation. TCMV is an immunogenic virus type and double diffusion tests performed with purified preparations against their antisera showed a precipitin line (line b), seen in Fig. 5,6 / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Ciências Biológicas
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Estudos sobre um inibidor de virus fitopatogenicos presente em extratos de abutilon striatum dicks

Moraes, Walkyria Bueno de Camargo 18 July 2018 (has links)
Orientador: Avelino Rodrigues de Oliveira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-18T01:59:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Moraes_WalkyriaBuenodeCamargo_D.pdf: 6399767 bytes, checksum: ceb637122aeabfe9f1048e27d1ba4a8e (MD5) Previous issue date: 1973 / Resumo: Uma substância extraída de folhas de Abutilon striatum Dicks. Inibe a infecção causada pelo vírus do mosaico do fumo *TMV), quando inculado em folhas de glutinosa ( Nicotiana glutinosa L. ). A substância termoestável, não dialisável e de alto peso molecular (5000-10000) é de natureza polissacarídica, podendo ser retida pelo carvão ativo, não se alterando em pH alcalino ou quando submetida a tratamento para desproteinização. Não é degradada pelos tratamentos com diastase ou pectinase. Possue duas bandas características de absorção a ultravioleta, nas regiões compreendidas entre 260-276nm e 320 nm. A presença do inibidor não altera a capacidade de reação do TMV com seu antissoro específico, em testes de dupla- difusão em Agar. O inibidor forma complexo instável com TMV, podendo ser separado deste por ultracentrifugação. As eletromicrografias sugerem que o inibidor recubra as partículas de vírus, além de promover o agregamento, fragmentação e deformações das mesmas. Mantendo-se constante a concentração do TMV a porcentagem de inibição da infectividade deste é função logarítmica da concentração do inibidor. A redução da infectividade do vírus, quando empregado em diferentes concentrações, é inversamente proporcional às concentrações do mesmo, sob ação de uma determinada concentração do inibidor.O inibidor reduz a infectividade do TMV inoculado em N. glutinosa ...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Na inhibitory substance present in leaves of Abutilon striatum reduced the infectivity of tobacco mosaic vírus (TMV) when assayed on leaves of Nicotiana glutinosa. The inhibitory substance presented the following characteristics: it was not dialyzable, it was stable in high temperature and high pH (11). It was retained by active charcoal. The substance was unaffected by treatments to inactivate proteins, and seemed to be a polysaccharide of high molecular weight (5000-10000). It was unaffected by enzymatic preparations of diastase and pectinase. The ultraviolet spectra showed two characteristic bands: I (260-276nm) and II (310-320nm). In serological agar double-diffusion tests, the presence of the inhibitor did not interfere with the capacity of reaction between the TMV and its specific antisserum. The TMV- inhibitor bounds could be disrupted by ultracentrifuging the mixture without loss of activity of any of the components.Studies on the fine-structure of the complex virus-inhibitor suggested that the virus particles were recovered by the inhibitor which promoted their aggregation, fagmentation and distortion. At constant TMV-concentration, the percentage of reduction of infectivity was a logarithmic function of inhibitor concentration.Under the action of a constant inhibitor concentration the reduction of TMV infectivity was inversely proportional to the virus concentration.The infectivity of TMV was inhibited when inoculated on N...Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Doutorado / Doutor em Ciências Biológicas
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Avaliação de epitopos na proteina do capsideo de isolados do virus da tristeza dos citros (CTV)

Justino-Kuga, Elaine Aparecida 14 December 1999 (has links)
Orientador: Marcos Antonio Machado / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-25T23:46:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Justino-Kuga_ElaineAparecida_M.pdf: 5500665 bytes, checksum: 5d07026a0dc49cbeb174c82abd0c0995 (MD5) Previous issue date: 1999 / Resumo: Estudos preliminares sobre a localização de epítopos na proteína do capsídeo (CP) de três isolados de CTV ('Pêra IAC', 'Pêra CB-22' e 'Pêra CB-104') foram realizados em três etapas. Na primeira, foi realizada a amplificação de oito regiões distintas do gene da CP, codificantes para três regiões Nterminais (aa 1 até 70; aa 1 até 120; aa 1 até 170), três regiões C-terminais (aa 70 até 223; aa 120 até223; aa 170 até 223) e duas regiões internas da CP (aa 37 até 67 e aa 64 até 94) onde haviam sido determinadas diferenças significativas entre as CPs dos três isolados. Na segunda etapa, foram avaliadas duas estratégias para expressão dos peptídeos de interesse: clonagem em vetor de expressão através de ligação AT (vetor Pinpoint TM Xa-1 T, Promega) e clonagem das seqüências alvo em vetores do sistema de expressão pET. O vetor Pinpoint TM Xa-1 T, carreando como inserto o gene inteiro da CPCTV, obtido como produto de PCR após amplificação do cDNA dos três isolados, transformou células competentes de E. coli JM109, mas após indução com IPTG, não houve expressão da proteína de fusão esperada. Os vetores do sistema pET, após ligação das seqüências alvo, não transformaram células competentes de E. coli BL21(DE3)pLysS. Na terceira etapa, três proteínas recombinantes (MBP-CPCTV, CB-22 e CB-104) produzidas a partir da expressão do gene da CP-CTV dos três isolados, foram clivadas com brometo de cianogênio. Os produtos de clivagem foram avaliados através de '¿Western Blotting¿ contra anticorpos monoclonais específicos para CTV. O monoclonal IC-04.6, desenvolvido contra a proteína recombinante CB-22 detectou epítopos, numa reação intensa, em peptídeos com massa estimada em 27 kDa e 18 kDa, originários da CB-22; o monoclonal 39-08, desenvolvido contra a proteína recombinante CB-104 detectou epítopos, numa reação moderada, em peptídeos com massa estimada de 28 kDa e 14 kDa, originários qa CB-104; o monoclonal MCA-13, desenvolvido contra um isolado da Florida, detectou epítopos em peptídeos originários das proteínas recombinantes MBP-CPCTV e CB-104; o monoclonal 3DF1, desenvolvido contra isolados de CTV espanhóis, detectou epítopos em peptídeos originários da CB-22 e CB-104 e o monoclonal 3CA5, desenvolvido contra isolados espanhóis de CTV, detectou epítopos apenas num peptídeo com massa estimada de 18 kDa presente na CB-22. Estes resultados sugerem que diferentes epítopos são reconhecidos pelos cinco monoclonais avaliados e que serão necessárias novas estratégias para avaliá-los / Abstract: Preliminary studies about the epitopes location in the capside protein of the isolates of the citrus tristeza virus of three isolate ('Pêra IAC', 'Pêra CB-22' and 'Pêra CB-104') were accomplished. In the first phase, the amplification was accomplished with specific direct and reverse primers of eight different regions of the CP gene, coding for three N-terminal peptides (aa 1 to 70, aa 1 to 120 and aa 1 to 170), three C-terminal peptides (aa 70 to 223, aa 120 to 223 and aa 170 to 223) and two internal peptides of CP (aa 37 to 64 and aa 64 to 90). In the second phase they were appraised two strategies for expression of the peptides: cloning in expression vector through AT cloning site (vector Pinpoint TM Xa-1 T promega), and cloning of the coding sequences in vectors of the system pET. Vector Pinpoint TM Xa-1, containing as insert the whole gene of CP, obtained as PCR's product after amplification of the three isolates' cDNA, transformed competent cells E. coli JM109, but after induction with IPTG there was not expression of the peptides of interest. The vectors of the pET system didn't transform competent cells E. coli BL21 (DE3)pLysS. In the third phase, three recombinant proteins (MBP-CPC1V, CB-22 and CB-104), produced from the expression of the CP-C1V gene of the three isolates, they were broken with cyanogen bromide. The break products were evaluated through "Western Blotting" against monoclonal antibodies specific for CTV. The monoclonal IC-04.6, developed against the recombinant protein CB-22 detected epitopes, in an intense reaction, in peptides with mass esteemed in 27 kDa and 18 kDa, original of CB-22; the monoclonal 39-08, developed against the recombinant protein CB-104 detected epitopes, in a moderate reaction, in peptides with esteemed mass of 28 kDa and 14 kDa, original of CB-104; the monoclonal MCA-13, developed against the T-36 isolate from Florida, detected epitopes in original peptides of the recombinants proteins MBP-CPCTV and CB-104; the monoclonal 3DF1, developed against Spanish isolates of CTV, detected epitopes in original peptides of CB-22 and CB-104 and the monoclonal 3CA5, developed against Spanish isolates of C1V, just detected epitopes in a peptide with esteemed mass of 18 kDa present in CB-22. These results suggest that the five monoclonal recognizes different epitopes and that will be necessary new strategies to evaluate them / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular
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Caracterização molecular do Sugarcane yellow leaf virus, desenvolvimento de um metodo de diagnostico altamente sensivel e aspectos moleculares da interação luteovirus/vetor

Gonçalves, Marcos Cesar 02 June 2002 (has links)
Orientador: Jorge Vega / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-31T18:41:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Goncalves_MarcosCesar_D.pdf: 7477372 bytes, checksum: 67894da464a7b2387385005c386575c0 (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: O vírus do amarelecimento foliar da cana-de-açúcar, Sugarcane yellow leaf vírus (ScYL V) constitui atualmente um grande problema nos principais países produtores de cana-de-açúcar. Este vírus possui diversas características físicas e biológicas, como tamanho e morfologia da partícula, reações serológicas, alterações morfológicas no hospedeiro e aspectos de transmissão, comuns aos membros da família Luteovírídae. As informações da sequência genõmica do isolado brasileiro obtidas nesse trabalho, referentes às regiões codificantes para capa protéica do vírus (CP), proteína de movimento (17 kOa ou MP) e parte da RNA polimerase dependente de RNA (RdRp), mostram um alto grau de identidade e similaridade de aminoácidos com sequências de luteovirus conhecidos. Isso permite estabelecer o ScYLV como um membro definitivo da família Luteovíridae. Análises filogenéticas empregando as sequências deduzidas de aminoácidos da CP e da região C-terminal da RdRp do ScYL V sugerem diferentes afinidades taxonõmicas desse vírus dentro da família Luteovírídae, de maneira similar ao que acontece com o Soybean dwarf vírus (SOV). Análises comparativas de seqüência entre o isolado brasileiro e um isolado norte-americano revelaram diferenças de apenas dois nucleotídeos nas posições 4201(G por T) e 4232 (A por C) do genoma do ScYLV, correspondentesrespectivamente à região codificadora da proteína P17 e CP. Os dados de seqüência obtidos neste trabalho foram usados no desenvolvimento de um método sensível de diagnóstico baseado na combinação da técnica de amplificação isotérmica de ácidos nucléicos NASBA (nucleic acid sequence based amplification) e "molecular beacons", denominado AmpliOet RNA. Esse sistema de detecção foi altamente específico e ofereceu uma sensibilidade de aproximadamente 100 fg de vírus purificado, permitindo a detecção em plantas com baixos níveis de infecção viral e em um único pulgão virulífero. Os membros da família Luteoviridae são transmitidos por afídeos de uma maneira circulativa e não-propagativa. Após a aquisição, o vírus permanece no corpo do inseto por várias semanas, graças a associação com a proteína GroEL, produzida por um endossimbionte primário do pulgão. As partículas de vírus purificadas apresentam dois tipos de proteína, a proteína principal da capa protéica de 22 kDa e menores quantidades de outro componente do capsídeo, a proteína de transleitura ou "readthrough" (RTD) de 54 kDa. A protéina RTD contém determinantes responsáveis pela transmissão e acúmulo do vírus em plantas agroinfectadas. O Potato leafroll vírus (PLRV) é uma espécie do gênero Polerovirus dentro da família /,..uteoviridae. Clones infectivos de cDNA do PLRV e um mutante deletério da proteína RTD foram usados para estudar as interações moleculares entre esse luteoviruse seu afídeo vetor Myzus persicae. O mutante do PLRV, no qual a proteína RTD estava inteiramente ausente, não foi transmissível por M. persicae e não se ligou a proteína GroEL. Adicionalmente, esse mutante mostrou-se significativamente menos persistente na hemolinfa do afídeo do que as partículas não modificadas do vírus / Abstract: Sugarcane yellow leaf vírus (ScYL V) is widely distributed in Brazil and other sugarcane producing countries causing significant yield losses. This virus shares biological features typical of the luteovirids. Comparisons of the coat protein (CP), 17 kDa protein and C-terminus of the RNA-dependent RNA polymerase coding regions showed that the deduced amino acid sequences of the Brazilian isolate share a considerable degree of identity and similarity with corresponding sequences of known luteovirids, thus clearly establishing ScYL V as a member of the family Luteovíridae. Phylogenetic analyses also suggest that the 5' and 3' coding blocks of the ScYLV genome possess different taxonomic affinities within the Luteovíridae family, as for the genome of Soybean dwarf vírus (SDV). Our results were published simultaneously as the sequence of a North American strain of ScYL V. Comparative analyses between the deduced peptides of Brazilian and North American strains revealed two nucleotide substitutions at positions 4201 (G_ T) and 4232 (A_C) of the ScYLV genome, corresponding to P17 and CP proteins coding regions, respectively. Our sequence data were used to develop a highly sensitive detection method based on the combination of isothermic nucleic acid sequence based amplification (NASBA) and molecular beacons, named AmpliDet RNA. This system offered a sensitivity of about 100 fg of purified virus and could detect ScYL V in plant samples with low virus titer and in one single aphid. Members in the Luteovírídae are transmitted by aphids in a circulative, nonreplicative manner. After acquisiton, luteovirus particles persist in the aphid's hemolymph for several weeks in association with a GroEL homolog, produced by the primary endosymbiont of the aphid. Luteovirus purified particles contain two types of proteins; a major 22 kDa coat protein (CP) and the minor capsid component of 54 kDa, the readthrough protein (RTD). The RTD contains determinants responsible for virus transmission and accumulation in agroinfected plants. Potato leafroll virus (PLRV) is a member of the genus Po/erovírus in the family Luteovíridae. An infectious cDNA fuI! length clone of PLRV and a mutant devoid of the RTD were used to study and better understanding the molecular interactions between this luteovirus and its aphid vector Myzus persícae. The PLRV mutant lacking the entire RTD protein was not transmissible by M. persícae and did not bind to Buchnera GroEL. Furthermore, the mutant was significantly less persistent in the aphid's hemolymph than the wild type virus. These data corroborate previous observations with Beet westem yellow vírus (BWYV) and Bar/ey ye//ow dwarf vírus (BYDV) that the RTD domain is involvedin luteovirus transmission and persistence in the aphid's body / Doutorado / Doutor em Biologia Vegetal
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Virus do enrolamento da folha da videira no Brasil : caracterização atraves de estudos serologicos e de microscopia eletronica

Scagliusi, Sandra Maria Mansur 31 July 1995 (has links)
Orientador: Jorge Vega / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-20T18:44:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Scagliusi_SandraMariaMansur_M.pdf: 9937858 bytes, checksum: d6a4ace430ba8b53884c9790fac917a1 (MD5) Previous issue date: 1995 / Resumo: Este trabalho teve como objetivo contribuir a um melhor conhecimento da moléstia do Enrolamento da Folha da Videira (EFV) presente no Brasil, e em todos os países vitícolas. Diversas evidências indicam a etiologia viral do EFV, entre elas a capacidade de transmissão por enxertia e a sensibilidade do patógeno à termoterapia. Além dessas características, diferentes partículas de vírus (alongadas e isométricas) têm sido isoladas de plantas de videira afetadas pelo EFV. o método aceito para diagnosticar a moléstia, consiste na enxertia do material a ser testado em variedades indicadoras para o enrolamento da folha, porém a leitura confiável dos sintomas induzidos na planta indicadora é realizada num período de 2-3 anos após a enxertia. Usando técnicas ligadas à serologia, pode-se melhorar as condições para o diagnóstico deste vírus, por testes mais rápidos que os de indexação por enxertia em variedades indicadoras. Durante o desenvolvimento deste trabalho, observou-se através de testes de microscopia eletrônica, uma maior concentração do vírus em tecido caloso de videira, obtido in vitro, em relação à concentração encontrada nas folhas e hastes da própria planta. A fim de se obter dados que contribuíssem para um melhor conhecimento da moléstia do EFV presente no Brasil e facilitar as condições de diagnóstico, foram estudados os seguintes aspectos: 1) possibilidade do uso de tecido caloso obtido in vitro a partir de tecidos de videira com EFV, como modelo, para estudo e manutenção do vírus; 2) citopatologia do tecido caloso à nível de microscopia eletrônica; 3) avaliação da relação serológica existente entre as partículas virais do tipo closterovirus detectadas em calos de videira com enrolamento da folha através de testes de microscopia eletrônica de imunoadsorção utilizando anti-soros preparados para o Vírus do Enrolamento da Folha da Videira (VEFV) e para o Vírus da Tristeza dos Citros (VTC); 4) detecção de partículas virais do tipo closterovirus em amostras semipurificadas de folhas de videira em variedades indicadoras (Pinot Noir e LN-33) e não-indicadora do EFV (Seibel 2) e 5) tentativas de transmissão mecânica do vírus do enrolamento da folha da videira para a hospedeira herbácea Nicotiana benthamiana. Outro aspecto estudado neste trabalho se refere à perpetuação do vírus através da cultura in vitro ao longo de várias repicagens do calo. Condições diferentes de temperatura e luminosidade também foram avaliadas, visando estabelecer diferenças no desenvolvimento do calo e na concentração do vírus. Os resultados deste estudo mostraram que o vírus detectado, associado ao EFV, se multiplica ativamente nas células do tecido caloso de videira. A citopatologia observada nos calos de videira afetadas pelo EFV é característica de infecção por closterovirus. O estudo das partículas virais associadas ao EFV pela técnica de tecido caloso in vitro mostrou-se útil devido à rapidez da formação do tecido caloso, diminuição do risco de contaminação das amostras, e especialmente pela baixa atividade de oxidases das células do calo. Para manutenção do vírus por períodos prolongados não se mostrou eficiente. Com relação ao efeito da luminosidade e temperatura, não foram observadas diferenças significativas no desenvolvimento do calo e na concentração do vírus. Os testes de transmissão mecânica para hospedeira herbácea Nicotiana benthamiana foram negativos. A técnica de ISEM feita com materiais semipurificados de folhas, mostrou ser um teste adequado e rápido para o diagnóstico da doença, quando comparada com a indexação por enxertia em variedades indicadoras. Os resultados das técnicas de ISEM, decoração e do teste de F(ab')2 ELISA, mostraram que o isolado do VEFV estudado neste trabalho é predominantemente do tipo IH. Os anti-soros preparados para os isolados tipos I e H somente reagiram nos testes de ISEM e decoração, indicando uma relação serológica muito fraca com o vírus estudado. Pôde-se concluir que o EFV é uma doença complexa, onde parecem estar envolvidos vários componentes virais, sendo que um deles mostrou relação serológica com o VTC, como observado nos testes de ISEM com decoração / Mestrado / Biologia Vegetal / Mestre em Ciências Biológicas
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Seleção genetica e interação de baculovirus em Diatraea saccharalis (F,1794)

Ribeiro, Helena Camarão Telles 17 July 2018 (has links)
Orientador : Octavio Henrique de Oliveira Pavan / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-17T00:01:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ribeiro_HelenaCamaraoTelles_M.pdf: 3742191 bytes, checksum: 9ba6fd8c1c7e1a0c672a81eb9e798a90 (MD5) Previous issue date: 1985 / Resumo: Neste estudo verificaram-se os efeitos de passagens seriadas do Virus de poliedrose Nuclear de Anticarsia gemmalis (VPNAg) e do Vírus de poliedrose Nuclear de Trichoplusiani (VPNTn) sobre o hospedeiro alternativo, Diatraea saccharalis, uma das principais pragas da cana-de-açúcar em toda a América. Para cada um desses experimentos foram analisados individualmente mais de 5000 largatas de D. saccharalis. Pode-se observar através dos valores de DL50 que ocorreu um aumento substancial na virulência destes dois baculovírus após terem sido submetidos ao processo de passagem seriada nas brocas de cana. Na 1ª passagem seriada do VPNag o valor de DL50 foi de 7,87 X 105 cristais/largata enquanto que na 10ª passagem esse valor foi reduzido a 6,65 X 103 cristais/lagarta mostrando que o vírus após ter sido submetido a dez passagens seriadas tornou-se cerca de cem vezes mais virulento para es-ses insetos. O VPNTn apresentou na 1ª passagem seriada o valor de DL50 de 9,68 X 104 cristais/lagarta ao passo que na 11ª passagem seriada o valor de DL50 foi reduzido a 1,20 X 102 cristais/lagarta. Após onze passagens seriadas o VPNTn teve sua virulência aumentada em cerca de oitocentas vezes para as lagartas de D.saccharalis. Verificou-se que o isolado do VPNAg adaptado ao no-vo hospedeiro exibiu uma redução da virulência no hospedeiro original, Anticapvia gemmatalic.Os resultados do presente trabalho não representa-ram o limite das possibilidades de seleção desses vírus (VPNAg e VPNTn) mas demonstraram claramente seu potencial e a necessidade de continuação destes estudos visando uma melhor compreensão do problema. O VPNAg e o VPNTn melhoraram significativamente a sua eficiência através do método de passagem seriada que além de ser um método simples apresenta um baixo custo. Por outro lado, verificou-se ainda nesse trabalho o efeito da inoculação do Vírus de Granulose de Diatraea saccharalis (VGDs) associado aos dois VPN acima referidos. Foram utilizados três tipos de inóculos mistos: 1) VPNAg + VPNAg 2) VPNAg + VGDs e 3) VPNTn + VGDs nas lagartas de D. saccharalis Para esses experimentos foram usadas _ais de 3500 lagar-tas de D. saccharalis. Observou-se que apesar do VPNAg e do VPNTn isoladamente inoculados terem exibidos picos de mortalidade ao redor de 10 dias, o inoculo misto resultante da mistura desses dois vírus (VPNAg e VPNTn) mostrou uma nítida dispersão por volta de 10 a 50 dias. Os dois inóculos mistos resultantes da associação de um VPN e um VG (VPNAg + VGDs e VPNTn + VGDs) apresentaram um nítido pico de mortalidade ao redor de 10 dias e picos menores após 20 dias, com picos principais em torno de 30 e 40 dias. O primeiro pico pode ser relacionado ao efeito do VPNAg e do VPNTn e os picos de mortalidade após 20 dias ao efeito do VGDs. Pode-se observar que o inóculo de VGDs foi mais vi-rulento do que o inóculo de VPNTn que por sua vez foi mais virulento do que o in6culo de VPNAg para as lagartas de D. saccharalis e verificou-se que o mesmo quando em associação essa ordem de patogenicidade foi mantida. Os resultados desse estudo demonstraram de modo quantitativo que ocorreu o fenômeno de interferência ou anta-gonismo nos três tipos de inóculos mistos, visto que, nas várias doses utilizadas, a resposta de mortalidade resultante dos inóculos mistos não foi maior do que essa produzida pela ação de um só vírus nas lagartas de D. saccharalis dos mostram que o VPNAg, VPNTn e o VGDs não podem ser consor-ciados em um mesmo inóculo misto para fins práticos. De modo geral observamos, que os Baculovírus aqui analisados podem ser manipulados geneticamente e que ao serem associados há uma interferência recíproca como se estivessem competindo por mesmos tecidos e recursos no inseto. Essa interferência indicaria uma homologia de sistemas que se manifesta com vírus diferentes e procedentes de famílias diferentes. Podemos concluir que nossos dados sugerem haver uma homologia muito grande nesse grupo de vírus de inseto e que através de métodos relativamente simples tais como de passagem seriada podemos manipular geneticamente estes importantes patógenos / Abstract: The effects of serial passages of the Nuclear Polyhedrosys Virus of Anticarsia gemmalis (AgNPV) and the Nuclear Polyhedrosys Virus of Trichoplusia ni (VPNTn) through the alternate host, Diatraea saccharalis one of the main pests of sugar cane throughout America, was studied. For each of these experiments more than 5000 larvae of D. saccharalis were individually analysed. It was noted through the reduction of DL50 values that a substantial increase in the virulence of these two baculovírus occurred after being submitted to serial passages through the D. saccharalis. On the first serial passage of the AgNPV the DL50 value was 7,87 X 105) PIBS/larva whereas on the thent passage that value was reduced to 6,65 X 103 PIBs/larva showing that the virus became about one hundred times more virulent to these insects after being submitted times more virulent to these insects after being submitted to ten serial passages. The TnNPV presented in the first serial passage the DL50 value of 9,68 x 104 PIBs/larva whereas in the eleventh serial passages the TnNPV had its virulence increased about eight hundred times when comparted to the original isolate. It was noted that the isolate of the AgNPV adapted to the new host exhibited a reduction of its virulence to the original host, Anticarsia gemmatalis. The isolate of the TnNPV was not tested against its original host, Trichoplusia ni. The results of the present work do not represent the limit of possibilities of selection of these virus (AgNPV and TnNPV), in fact they gave clear evidence of their potential and of the necessity of continuation of these studies aiming a better comprehension of the subject. The AgNPV and the TnNPV had and an expressive improvement of its efficiency by the serial passage method, which represents a simple and low cost method. A study of the effect of the inoculation of the Granulosis Virus of Diatraea aacaharalin (DsGV) associated to both NPV above mentioned was also object of this work. Three types of mixed inocula were used: 1) AgNPV + TnNPV 2) AgNPV + DsGV and 3) TnNPV + DSGV on D. saccharalis larvae. For these experiments more than 3500 larvae of D. saccharalis were individually analysed. Its was observed that, when individually inoculated AgNPV and TnNPV exhibited peaks at around 10 days after ingestion. The inoculum resulting from association of these two viruses (AgNPV + TnNPV) showed a clear dispersion of these peaks from to 10 to 50 days after the inoculation. The two mixed inocula resulting from the association of one NPV and one GV (AgNPV + DsGV and TnNPV + DsGV) presented a clear mortality peak at around 10 days, and other peaks after 20 days with main peaks present at around 30 and 40 days after inoculation. The first mortality peak can be related to the effect of the AgNPV and TnNPV and the peaks after 20 days of inoculation to the effect of DsGV. It was observed that the DsGV is more virulent that TnNPV which, in turn, is more virulent to the larvae of D. saccharalis than the AgNPV; and it was verified that even when in association this pathogenicity order was maintained. The resu1ts of this study demonstrated in a quantitative manner that the interference or antagonism phenomenon occurred in the three types of mixed inocula. For the various combinations of virus and dosagens the resulting mortality response from the associated virus was not higher than that produced on the larvae of D. saccharalis from the action of a single virus. This demonstrates that for practical purposes the AnNPV, TnNPV and the DsGV should not be associated for this type of pest control. Our results showed that the baculovirus here analysed can be genetically manipulated and once associated they show a reciprocal interference as if they were competing for the same tissues and resources of the insect. This interference indicates a homology of systems manifesting in different viruses originated from hosts coming from different Families. In conclusion, our data sugest the existence of great homology in this insect virus group, and that probably due to this fact we can genetically manipulate these important pathogens through relatively simple methods / Mestrado / Mestre em Biologia

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