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La tristeza es la enfermedad viral más grave del cultivo de los cítricos y su agente causal es el virus de la tristeza de los cí­tricos (CTV). CTV induce uno o más de los siguientes sí­ndromes: I) decaimiento y muerte de los naranjos dulces (ND), pomelos y mandarinos injertados sobre el patrón naranjo amargo (NA), sí­ndrome conocido como "tristeza", II) enanismo, acanaladuras en la madera y fruta de pequeño calibre (stem pitting, SP), y III) enanismo y amarillamiento de plantas de semilla de limonero, pomelo y NA (seedling yellows, SY). La gama de huéspedes de CTV es muy restringida y hasta hace poco no se conocí­a ningún huésped herbáceo experimental. Actualmente, se sabe que la agroinfiltración de Nicotiana benthamiana, con clones de DNA complemantario (cDNA) del aislado T36 de CTV produce la infección sistémica de la planta, acompañada de sí­ntomas similares a los inducidos en cí­tricos, si bien la infección no queda limitada al floema. El aislado T36 induce SY y SP de lima Mejicana (LM), pero no en otros huéspedes como pomelo o ND. El estudio de los determinantes genéticos responsables de la inducción del sí­ndrome de SP requerí­a desarrollar un sistema genético basado en clones agroinfecciosos de un aislado inductor de estos sí­ntomas, como el aislado español T318A. Para ello, se partió de clones de cDNA de longitud completa de T318A previamente desarrollados en el laboratorio, capaces de replicarse en hojas de N. benthamiana pero incapaces de inducir infección sistémica y que presentaban varias mutaciones en su proteína de cápsida minoritaria p27. La corrección de dichas mutaciones y la construcción de nuevos clones de longitud completa de T318A marcados con el gen gfp, mostraron una correcta replicación en hojas agroinfiltradas de N. benthamiana, pero resultaron incapaces de inducir infección sistémica en este huésped experimental. La respuesta diferencial de N. benthamiana frente a distintas cepas de CTV permite estudiar los factores implicados en la interacción virus-huésped. Se analizó la interacción de las proteí­nas virales p20 y p25 de los aislados T36 y T318A con proteí­nas de N. benthamiana utilizando un abordaje consistente en: i) la expresión transitoria de p20/p25 marcadas con una etiqueta Strep-Tag en hojas de N. benthamiana, ii) purificación de los complejos proteí­na CTV-proteína huésped y análisis interactómico de los datos, y iii) estudio de la interacción directa entre p20/p25 y proteínas seleccionadas del huésped mediante análisis del doble hibrido en levadura y complementación bimolecular de fluorescencia (BIFC). Este abordaje proteómico mostró claras diferencias entre aislados que pueden explicar, en parte, el comportamiento diferencial de los aislados T36 y T318A en dicho huésped experimental. La inducción el síndrome de decaimiento por parte de CTV ha obligado a utilizar patrones tolerantes al decaimiento. Dichos patrones son menos adecuados. Las plantas de cí­tricos propagadas sobre NA e infectadas por CTV muestran necrosis en los tubos cribosos y disminución del floema funcional. Éstos desórdenes podrí­an ser consecuencia de la activación de los mecanismos de defensa como la reacción de hipersensibilidad desencadenada por la ruta del ácido salicí­lico o el silenciamiento génico mediado por RNA (post-transcriptional gene silencing, PTGS). Con el objetivo de avanzar en el mecanismo molecular de la resistencia del NA a la infección por CTV, se estudió el papel de diferentes genes de la planta implicados en las rutas mediante el uso de un vector viral basado en el genoma del virus del manchado foliar de los cítricos (citrus leaf blotch virus, CLBV). El silenciamiento génico de las rutas del AS o del PTGS en plantas NA y la inoculación de tres aislados de CTV patogénicamente diferentes mostró la implicación de ambas rutas en la defensa del NA frente a CTV. / Tristeza is the most important viral disease affecting citrus plants and Citrus tristeza virus (CTV) is the causal agent of this disease. CTV induces at least one of this syndromes: I) decline and death of sweet orange (SwO), grapefruits and mandarin trees grafted on sour orange (SO) rootstock, this syndromes is known as "tristeza", II) stunting, stem pitting (SP) and small fruits, and III) stunting and leaf chlorosis of lemon, grapefruit and SO seedlings (seedling yellows, SY). The host range of CTV is restricted and until recently no experimental herbaceous host was known. The agroinoculation Nicotiana benthamiana with clones of complementary DNA (cDNA) from the CTV isolate T36 cause the systemic infection of the plant and similar symptoms to those observed in citrus, although the infection is not limited to the phloem. T36 isolate induces SY and SP of Mexican lime (ML), but not in other hosts such as grapefruit and SwO. Therefore, to study the genetic determinants responsible of the SP syndrome induction was necessary to develop a genetic system based on agroinoculated clones from an isolate able to induce these symptoms, such as the Spanish isolate T318A. To do this, full length cDNA clones from T318A were obtained. They are able to replicate in N. benthamiana leaves but unable to induce systemic infection and showed several mutations in their protein of the minor coat, p27. The correction of these mutations and the construction of new clones of complete length from T318A labeled with the gfp gene, showed a proper replication in agroinoculated leaves of N. benthamiana, but they were still unable to induce systemic infection in this experimental host. The differential response of N. benthamiana to different CTV strains allows the study of the potential factors involved in the virus-host interaction. The aim of this work was study the interaction between the viral proteins p20 and p25 from the isolates T36 and T318A with N. benthamiana proteins with an analysis consisted in: I) the transitory expression of p20/p25 fused to Strep-Tag in N. benthamiana leaves, II) purification of the CTV protein-host protein complex and interatomic analysis of the data, and III) the study of the direct interaction between p20/p25 and selected plant proteins by the analysis of the double hybrid in yeast and bimolecular complementation of fluorescence (BIFC). The proteomic analysis showed strong differences between isolates that may partially explain the differential behavior of the T36 and T318A isolates in this experimental host. The induction of decline syndrome by CTV in citrus has leaded the use of tolerant rootstocks to decline. However, the use of such rootstocks is less suitable. Citrus plants propagated on SO rootstock and infected by CTV show phloem necrosis below the bud union that reduces the flow of carbohydrates to the roots. These symptoms may be a consequence of the activation of defense pathways in the plant, such as the hypersensitive reaction, hormone salicylic acid (SA) pathways or the RNA mediated post-transcriptional gene silencing (PTGS). Their relation is essential to know their implication in the decline. Therefore, the role of different genes involved in SA and PTGS has been studied by the silencing of plant genes using a viral vector (VIGS) based in the genome of the citrus leaf blotch virus (CLBV). The gene silencing of the SA and PTGS in SO and the inoculation of three different pathogenicity CTV isolates showed that both pathways are involved in the SO defense against CTV. The analysis of the proteins p20, p23 and p25 as possible suppressors of the AS indicating that the more virulent CTV isolates possess the more powerful suppressors. / La Tristesa és la malaltia viral més greu del cultiu dels cítrics. CTV induïx un o més de les sí­ndromes següents: I) decaïment i mort de taronger dolç§ (ND), pomelo i mandariner empeltats sobre el patró taronger amarg (NA), sí­ndrome conegut com "Tristesa", II) nanisme, estries en la fusta i fruita de xicotet calibre (SP) i III) nanisme i tonalitat groguenta de plantes de llavor de llimera, pomelo i taronger amarg (SY). El rang d'hostes de CTV és molt restringit i fins fa poc no es coneixia cap hoste herbaci experimental. Actualment es sap que la infecciò sistèmica en Nicotiana benthamiana amb clons de DNA complementari (cDNA) de l`aïllat de T36 provoca la infecció sistemàtica de la planta, acompanyada de síntomes similars als induïts en cí­trics, si be la infecció no queda llimitada al floema. L' aïllat T36 induïx SY i estries en la fusta de Llima Mexicana (LM), però no en altres hostes com a pomelo, ND o NA, l'estudi dels determinants genètics responsables de la inducció de la síndrome de SP requeria desenvolupar un sistema genètic basat en clons agroinfecciosos d'un aïllat inductor d'estos sí­mptomes, com l'aïllat espanyol T318A. Per a això, es va partir de clons de cDNA longitud completa de T318A prèviament desenvolupats al laboratori, capaços de replicar-se en fulls de N. benthamiana però incapaços d'induir infecció sistèmica i que presentaven varies mutacions en la seua proteïna de càpsida minoritatia p27. La correcció d`aquestes mutacions i la construcció de nous clons T318A de longitud completa marcats amb el gen gfp, van mostrar una correcta replicació en fulls agroinfiltradas de N. benthamiana però van resultar incapaços d'induir infecció sistèmica en aquest hoste experimental. La resposta diferencial dependent d'aïllat en N. benthamiana front CTV permet estudiar els possibles factors de la interacció virus- hoste. Es va dur a terme l'estudi de la funció de les proteínes virals p20 i p25 dels aïllats T36 i T318A amb proteïnes de N. benthamiana utilitzant un abordatge consistent en: i) l' expressió transitòria de les dues proteïnes p20/p25 marcades amb una etiqueta Strep-Tag en fulls de N. benthamiana, ii) purificació dels complexos proteïna CTV-proteïna hoste i anàlisi interactómic de les dades, i iii) estudi de la interacció directa per mitjà  de doble híbrid en llevat i complementació bimolecular de fluorescència (BIFC) de les proteïnes virals i determinades proteïnes de N. benthamiana. Aquest abordatge proteòmic va mostrar clares diferències entre aïllats que poden explicar el comportament diferencial dels aïllats T36 i T318A en aquest hoste experimental. La inducció de la sí­ndrome de decaïment per part de CTV en cí­trics ha obligat la utilització de patrons tolerants al decaïment. No obstant, aquestos patrons són agronòmicament menys adequats. Les plantes de cítrics propagades sobre NA i infectades por CTV mostren necrosi als tubs cribosos i disminució del floema funcional. Aquestos sí­mptomes poden ser conseqüència de l'activació de les rutes de defensa de la planta com la reacció d'hipersensibilitat, desencadenada per la ruta de l'àcid salicí­lic o el silenciamient gènic mediat per RNA (PTGS). Amb l'objectiu d'analitzar la implicació d¿aquestes rutes en la defensa, es va estudiar el paper de diferents gens implicats en la ruta de l'AS i del PTGS per mitjà  del silenciamient gènic induït per virus basat en el genoma del tacat foliar dels cítrics (CLBV). El silenciamient gènic de les rutes AS o PTGS en plantes NA i la inoculació de tres aïllats de CTV patogènicament diferents va mostrar la implicació de les dues rutes en la defensa del NA front CTV. L'analisis de les proteïnes p20, p23 i p25 com a possibles supressors de la ruta de l'AS va indicar que els aïllats més virulents de CTV posseïxen supressors més potents. / Gómez Muñoz, N. (2017). ESTUDIO DE LA INTERACCIÓN DIFERENCIAL ENTRE AISLADOS DEL VIRUS DE LA TRISTEZA DE LOS CÍTRICOS (CTV) Y SUS HUÉSPEDES [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/94624 / TESIS

O vírus da tristeza dos citros (CTV) é uma das maiores ameaças à citricultura mundial. No Brasil, mesmo com a pré-imunização e com a substituição de porta-enxertos, estirpes fortes de CTV ainda causam prejuízos consideráveis. Com o aparecimento da Morte Súbita dos Citros em 1999 e a possível relação desta doença com o CTV, este vírus voltou a figurar como patógeno de importância no cenário da citricultura brasileira. Uma das possíveis soluções para o controle de viroses em fruteiras é a obtenção de plantas transgênicas resistentes ou imunes. O objetivo deste trabalho foi avaliar a resistência ao CTV de plantas transgênicas de laranja \'Hamlin\' contendo três construções gênicas oriundas de seqüências do genoma do CTV. Estas construções gênicas visaram ativar rotas de RNAi (hairpin da capa protéica e seqüência conservada antisenso do CTV) e mecanismos de defesa relacionados à expressão da capa protéica do CTV. As plantas transgênicas foram desafiadas com uma estirpe fraca de CTV (CTV-IAC) por meio de borbulhas e pulgões pretos (Toxoptera citricida Kirkaldy) contendo o vírus. A avaliação da resistênica à replicação viral foi feita por análises de ELISA. As plantas transgênicas foram consideradas não resistentes à infecção e translocação viral quando inoculadas com borbulhas. Entretanto algumas plantas mostraram retardamento da infecção. Não foi possível determinar se houve resistência à transmissão de CTV por pulgões já que a técnica utilizada não foi capaz de infectar os controles de maneira uniforme. / The Citrus tristeza virus (CTV) is one of the greatest threats to the citrus industry worldwide. In Brazil, CTV continues to cause damage through strong strains despite the use of techniques like cross-protection and substitution of intolerant rootstocks. With the appearance and spread of the Citrus Sudden Death disease in 1999 and its possible relation to CTV, this virus was again among important pathogens within the Brazilian citrus industry. One of the possible solutions for controlling virus diseases in fruit crops is the development of immune or resistant transgenic plants. The objective of this work was to evaluate the resistance to CTV of transgenic \'Hamlin\' sweet orange plants containing three transgenic constructs obtained from CTV genomic sequences. The genetic constructs used aimed to activate RNAi defense routes (coat protein hairpin and a conserved sequence from CTV) and resistance mechanisms related to the coat protein expression. The transgenic plants were challenged with a weak strain of CTV, CTV-IAC, by bud and aphid (Toxoptera citricida Kirkaldy) inoculation. The evaluation of viral replication was done by ELISA analysis. The transgenic plants were considered susceptible to viral replication and translocation when bud inoculated. However, a few plants showed retardation of infection. It was not possible to determine resistance in the aphid transmission assay since the controls were not uniformly inoculated.

O vírus da tristeza dos citros (CTV) é uma das maiores ameaças à citricultura mundial. No Brasil, mesmo com a pré-imunização e com a substituição de porta-enxertos, estirpes fortes de CTV ainda causam prejuízos consideráveis. Com o aparecimento da Morte Súbita dos Citros em 1999 e a possível relação desta doença com o CTV, este vírus voltou a figurar como patógeno de importância no cenário da citricultura brasileira. Uma das possíveis soluções para o controle de viroses em fruteiras é a obtenção de plantas transgênicas resistentes ou imunes. O objetivo deste trabalho foi avaliar a resistência ao CTV de plantas transgênicas de laranja \'Hamlin\' contendo três construções gênicas oriundas de seqüências do genoma do CTV. Estas construções gênicas visaram ativar rotas de RNAi (hairpin da capa protéica e seqüência conservada antisenso do CTV) e mecanismos de defesa relacionados à expressão da capa protéica do CTV. As plantas transgênicas foram desafiadas com uma estirpe fraca de CTV (CTV-IAC) por meio de borbulhas e pulgões pretos (Toxoptera citricida Kirkaldy) contendo o vírus. A avaliação da resistênica à replicação viral foi feita por análises de ELISA. As plantas transgênicas foram consideradas não resistentes à infecção e translocação viral quando inoculadas com borbulhas. Entretanto algumas plantas mostraram retardamento da infecção. Não foi possível determinar se houve resistência à transmissão de CTV por pulgões já que a técnica utilizada não foi capaz de infectar os controles de maneira uniforme. / The Citrus tristeza virus (CTV) is one of the greatest threats to the citrus industry worldwide. In Brazil, CTV continues to cause damage through strong strains despite the use of techniques like cross-protection and substitution of intolerant rootstocks. With the appearance and spread of the Citrus Sudden Death disease in 1999 and its possible relation to CTV, this virus was again among important pathogens within the Brazilian citrus industry. One of the possible solutions for controlling virus diseases in fruit crops is the development of immune or resistant transgenic plants. The objective of this work was to evaluate the resistance to CTV of transgenic \'Hamlin\' sweet orange plants containing three transgenic constructs obtained from CTV genomic sequences. The genetic constructs used aimed to activate RNAi defense routes (coat protein hairpin and a conserved sequence from CTV) and resistance mechanisms related to the coat protein expression. The transgenic plants were challenged with a weak strain of CTV, CTV-IAC, by bud and aphid (Toxoptera citricida Kirkaldy) inoculation. The evaluation of viral replication was done by ELISA analysis. The transgenic plants were considered susceptible to viral replication and translocation when bud inoculated. However, a few plants showed retardation of infection. It was not possible to determine resistance in the aphid transmission assay since the controls were not uniformly inoculated.

This dissertation profiles the children's television industry in Australia; examines the relationship between government cultural policy objectives and television industry production practices; and explores the complexities of regulating and producing cultural content for child audiences. The research conducted between 1997 and 2002 confirms that children's television is a highly competitive business dependent on government regulatory mechanisms and support for its existence. For example, the Australian Broadcasting Authority's retaining of mandatory program standards for children's programs to date, is evidence of the government's continued recognition of the conflict between broadcasters' commercial imperatives and the public-interest. As a consequence, the industry is on the one hand insistent on the government continuing to play a role in ensuring and sustaining CTV - however, on the other hand, CTV producers resent the restrictions on creativity and innovation they believe result from the use of regulatory instruments such as the Children's Television Standards (CTS). In fact, as this dissertation details, the ABA's intended policy outcomes are inevitably coupled with unintended outcomes and little new or innovative policy development has occurred. The dissertation begins with an investigation into the social, cultural and ideological construction of childhood within an historical and institutional context. I do this in order to explore how children have been defined, constructed and managed as a cultural group and television audience. From this investigation, I then map the development of children television policy and provide examples of how 'the child' is a consistent and controversial site of tension within policy debate. I then introduce and analyse a selection of established, establishing and aspiring CTV production companies and producers. Drawing on interviews conducted, production companies profiled and policy documents analysed, I conclude by identit~'ing ten key issues that have impacted, and continue to impact, on the production of children's television programming in Australia. In addressing issues of industry development, the question this dissertation confronts is not whether to continue to regulate or not, but rather, how best to regulate. That is, it explores the complexities of supporting, sustaining and developing the CTV industry in ways which also allows innovative and creative programming. This exploration is done within the context of a broadcasting industry currently in transition from analogue to digital. As communications and broadcasting technologies converge, instruments of regulation - such as quotas designed around the characteristics of analogue systems of broadcasting - are being compromised. The ways in which children use television, and the ways in which the CTV producers create content, are being transformed. The ten key issues identified in this dissertation, I propose, are crucial to industry development and policy debate about the future of children's television in Australia. In integrating the study of policy with the study of production, I have given prominence to the opinions and experiences of those working in the industry. In doing so, this dissertation contributes to the growing body of work in Australia which incorporates industry with cultural analysis, and which includes the voices of the content providers.

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El virus de la tristeza de los cítricos (CTV) ha causado millonarias pérdidas a la citricultura a nivel mundial. En Chile, la situación real era desconocida aunque se había reportado su presencia en limoneros Meyer, los que fueron erradicados. El objetivo de esta tesis fue analizar la situación actual de CTV en Chile, realizar una amplia prospección y estimar su incidencia, estudiar su epidemiología y realizar una caracterización biológica, serológica y molecular de 100 aislados chilenos de CTV representativos. Se realizó un estudio epidemiológico en seis parcelas experimentales y dos ensayos de trasnsmisión con 10 aislados representativos. CTV fue detectado en casi todas las zonas citrícolas de Chile, con una incidencia media del 0,38%. En el oasis de Pica (I Región), se observaron acanaladuras en la madera en árboles de pomelo y lima mejicana. Se detectan todas las especies vectoras de CTV, a excepción de Toxoptera citricida. En la zona central de Chile se determina la presencia mayoritaria de aislados atenuados (MCA13 negativos). En la I Región (oasis de Pica y Malilla) la presencia de aislados agresivos, siendo todos MCA13 positivos y características moleculares asociadas al tipo VT. Se demostró un aumento en la incidencia de CTV en las parcelas experimentales, salvo en un huerto de limonero. En ensayos de transmisión sólo un aislado de CTV fue transmitido con una eficiencia baja de transmisión. En base a los resultados obtenidos se dan recomencaciones para la citricultura chilena. / Besoain Canales, JA. (2008). Incidencia, caracterización y epidemiología del virus de la tristeza de los cítricos en Chile [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/2009 / Palancia

Citrus tristeza virus (CTV) is a viral species of the Closterovirus genus, having a ¿20 kb single-stranded and positive sense genomic RNA (gRNA) organized into 12 open reading frames (ORFs) potentially coding 17 protein products, some of which of unknown function. CTV proteins p25 and p27 belong to a gene block involved in virion assembly. It has been demonstrated that p25, along with p20 and p23, are RNA silencing suppressors in some species of Nicotiana, being the latter a pathogenesis determinant. CTV host range is very restricted and in nature viral infections are limited to the phloem cells of some citrus species. Consequently, working with this virus-host pathosystem requires an appropriate experimental host and an efficient CTV genetic system. In our laboratory we have developed a new CTV genetic system based on the agroinfection of Nicotiana benthamiana plants, a non-natural host, with infectious clones of the T36 isolate. That infection induces characteristic symptoms, some of which correlate with those caused by the virus in citrus plants. CTV-N. benthamiana interactions are very variable and genotype-dependent, so only some isolates can replicate in this species and T36 is unique causing systemic infections. In this work, we studied the function of CTV p20 and p25 proteins from three different isolates differing in its pathogenic characteristics. Transient expression of p20 and p25 fused to fluorescent proteins showed an identical subcellular localization for both N. benthamiana and citrus. The p20 protein of T36, T318A and T385 isolates localized in cytoplasm and nucleus forming amorphous aggregates associated with perinuclear regions, together with nuclear punctuate inclusions. On the other hand, subcellular localization of p25 differed depending on the CTV isolate. While p25 of T36 and T385 localized in the nucleus, that of T318A did it in cytoplasm. A detailed analysis of the protein regions involved in this subcellular localization unveiled a leucine-rich nuclear export signal (NES) in the N-terminus (Nt) of the protein. The pathogenic ability of CTV p20 and p25 in N. benthamiana was tested through a PVX heterologous viral infection, showing that p25 was not a pathogenicity determinant in this species, albeit p20 it was. Besides, the interactome of p25-T36 was more complex and diverse than that of p25-T318A, involving a greater number of metabolic processes, redox activities, homeostasis and cellular transport, biosynthesis and protein degradation, plastid and nucleic acid protein binding, biotic and oxidative stress, jasmonic-mediated defense, methylation, ROS signalling and HSP proteins. On the other hand, most p25-T318A potential interactors were related to transport/localization and stress response, like apoptosis, pathogenesis-related and HSP proteins, Ca+2-binding proteins and redoxins. Moreover, the experimental evolution of CTV in N. bethamiana was achieved through serial passages. The evolution process showed adaptative traits as the increase of graft survival, infectivity rates and viral titers, and a decreased time for the onset of symptom development in this species. Adaptive characteristics of evolved viral populations in N. bethamiana, were also correlated to their genetic variability and population structure. Two different evolved lineages showed convergent evolution processes reflected also at the molecular level. CTV viruses evolved in N. benthamiana were found to be less infectious at initial stages of infection when they were back-inoculated to citrus plants, and showed a decreased viral titer during the first year post-inoculation. This re-adaptation of N. benthamiana viral populations back to citrus was correlated, at a molecular level, with the progressive loss of the mutations appeared during its evolution process in N. benthamiana. / El virus de la tristeza de los cítricos (CTV) es un closterovirus con un RNA genómico (gRNA) de ssRNA (+) y ¿20 Kb organizado en 12 pautas de lectura abierta (ORFs) que codifican al menos 17 proteínas, algunas de función desconocida. Las proteínas p25 y p27 forman parte de un grupo de genes implicados en el ensamblaje del virión, y se ha demostrado que p25 junto con p20 y p23 son supresores de silenciamiento génico en algunas especies de Nicotiana, y la última es también un determinante de patogénesis. CTV tiene una gama de huéspedes muy restringida y de forma natural sólo infecta el floema de algunas especies de cítricos. Por ello, para trabajar con este patosistema virus-huésped, se requiere un huésped experimental adecuado y un sistema genético eficiente de CTV. Durante los últimos años hemos desarrollado un sistema genético de CTV basado en la agroinfección sistémica de Nicotiana benthamiana, una especie no-natural de este virus, con clones infecciosos del genotipo T36. Dicha infección va acompañada de síntomas característicos, algunos de los cuales son similares a los que el virus induce en cítricos. La interacción CTV-N. benthamiana es muy variable y genotipo-dependiente, sólo algunos aislados se replican en esta especie y únicamente T36 la infecta sistémicamente. En este trabajo, abordamos la función de las proteínas p20 y p25 de tres aislados de CTV que difieren en sus características patogénicas. La expresión transitoria de las p20 y p25 fusionadas a proteínas fluorescentes reveló su idéntica localización subcelular en N. benthamiana y cítricos. La proteína p20 se localizó en el citosol y el núcleo celular en agregados amorfos asociados a regiones perinucleares e inclusiones nucleares puntuales. En cambio, la expresión de la p25 de T36, T318A y T385 de CTV reveló una localización diferencial. Mientras la de T36 y T385 fue nuclear, la de T318A fue citosólica. Un análisis detallado de las regiones implicadas en dicha localización, reveló la existencia de una señal de exportación nuclear NES rica en leucinas en la región Nt de la proteína. Un análisis de la capacidad patogénica de p20 y p25 en N. benthamiana en un contexto de infección viral heterólogo a través de PVX, mostró que p25 no es un determinante de patogenicidad en esta especie, pero p20 sí. Por otra parte, el interactoma de la p25-T36 resultó mucho más complejo y diverso que el de la p25-T318A, interviniendo potencialmente en mayor número de procesos metabólicos de fotosíntesis, actividad redox, homeóstasis y transporte celular, biosíntesis y degradación de proteínas, unión a proteínas de los plastidios y ácidos nucleicos o de respuesta a estrés (biótico y oxidativo) o defensa mediada por la ruta del jasmónico, del ciclo de metilación, señalización por ROS y proteínas HSP. Las interacciones mayoritarias de la p25-T318A se relacionaron con transporte/localización y respuesta a estrés, principalmente con interactores implicados en procesos de apoptosis, patogénenis y proteínas HSP, de unión a calcio o redoxinas. También hemos conseguido la evolución experimental de CTV por pases seriados en N. benthamiana. Dicha evolución conlleva un conjunto de características adaptativas significativas como: el aumento del prendimiento de injertos, de la tasa neta de infectividad, del título viral y del adelanto de los síntomas causados en esta especie herbácea con el aumento de los pases. Las características adaptativas también se reflejaron a nivel molecular en la variabilidad genética y estructura de las poblaciones de los virus evolucionados en dos linajes independientes. Virus evolucionados en N. benthamiana resultaron menos infecciosos inicialmente por inoculación mecánica de regreso a cítricos, y se acumularon menos que el virus parental durante el primer año. Dicha re-adaptación de los virus evolucionados se reflejó a nivel molecular en la pérdida progresiva de las m / El virus de la tristesa dels cítrics (CTV) és un closterovirus amb un RNA genòmic de ssRNA(+) i 20 Kb organitzat en 12 pautes de lectura oberta (ORFs) que codifiquen, al menys, 17 proteïnes, algunes de les quals de funció desconeguda. Les proteïnes p25 i p27 formen part d'un grup de gens implicat en l'assemblatge del virió, i s'ha demostrat que p25, junt a p20 i p23, són supressors de silenciament gènic en algunes espècies de Nicotiana, i la última també és un determinant de patogènesi. La gama d'hostes de CTV és molt restringida i de forma natural sols infecta el floema d'algunes espècies de cítrics. Per això, per a treballar amb aquest patosistema virus-hoste, es requereix un hoste experimental adequat i un sistema genètic eficient de CTV. Durant els últims anys hem desenvolupat un sistema genètic de CTV basat en l'agroinfecció sistèmica de Nicotiana benthamiana, una espècie no-natural d'aquest virus, amb clons infecciosos del genotip T36. Aquesta infecció va acompanyada de símptomes característics, alguns dels quals són similars als que el virus indueix en cítrics. La interacció CTV-N. benthamiana és molt variable i genotip depenent, ja que sols alguns aïllats es repliquen en aquesta espècie i únicament T36 la infecta sistèmicament. En aquest treball hem abordat la funció de les proteïnes p20 i p25 de tres aïllats de CTV que difereixen en les seues característiques patogèniques. L'expressió transitòria de les p20 i p25 fusionades a proteïnes fluorescents va revelar la seua idèntica localització subcel·lular en N. benthamiana i cítrics. La proteïna p20 dels aïllats T36, T318A i T385 es va localitzar al citosol i al nucli cel·lular formant agregats amorfs associats a regions perinuclears, i inclusions nuclears puntuals. En canvi, l'expressió de la p25 de T36, T318A i T385 de CTV va revelar una localització diferencial. Mentre la de T36 i T385 fou nuclear, la de T318A fou citosòlica. Una anàlisi detallada de les regions implicades en eixa localització va revelar l'existència d'una senyal d'exportació nuclear (NES) rica en leucines a la regió Nt de la proteïna. L'anàlisi de la capacitat patogènica de p20 i p25 en N. benthamiana en un context d'infecció viral heteròloga a través de PVX, va mostrar que p25 no és un determinant de patogenicitat en aquesta espècie, però p20 sí. D'altra banda, l'interactoma de p25-T36 va resultar molt més complex i divers que el de p25-T318A, intervenint potencialment en un major nombre de processos metabòlics de fotosíntesi, activitat redox, homeòstasi i transport cel·lular, biosíntesi i degradació de proteïnes, unió a proteïnes dels plastidis i àcids nucleics o de resposta a estrés (biòtic i oxidatiu) o defensa mediada per la ruta del jasmònic, del cicle de metilació, senyalització per ROS i proteïnes HSP. Les interaccions majoritàries de la p25-T318A es relacionaren amb transport/localització i resposta a estrés, principalment amb interactors implicats en processos d'apoptosi, patogènesi i proteïnes HSP, d'unió a calci o redoxines. També hem aconseguit l'evolució experimental de CTV per passes seriats en N. benthamiana. Aquesta evolució comporta un conjunt de característiques adaptatives significatives com: l'augment de la supervivència dels empelts, de la taxa neta d'infectivitat, de la càrrega viral i de l'ajornament dels símptomes causats en aquesta espècie herbàcia amb l'augment dels passes. Les característiques adaptatives també es reflectiren a nivell molecular amb la variabilitat genètica i estructura de les poblacions dels virus evolucionats en dos llinatges independents. Virus evolucionats a N. benthamiana resultaren menys infecciosos inicialment per inoculació mecànica de tornada a cítrics, i s'acumularen menys que el virus parental durant el primer any. Aquesta re-adaptació dels virus evolucionats a N. benthamiana de tornada a cítrics es va reflectir a nivell molecular amb / Navarro López, JA. (2017). Estudio preliminar de las interacciones del virus de la tristeza de los cítricos (CTV) y su huésped [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/90468 / TESIS