O vírus da tristeza dos citros (CTV) é uma das maiores ameaças à citricultura mundial. No Brasil, mesmo com a pré-imunização e com a substituição de porta-enxertos, estirpes fortes de CTV ainda causam prejuízos consideráveis. Com o aparecimento da Morte Súbita dos Citros em 1999 e a possível relação desta doença com o CTV, este vírus voltou a figurar como patógeno de importância no cenário da citricultura brasileira. Uma das possíveis soluções para o controle de viroses em fruteiras é a obtenção de plantas transgênicas resistentes ou imunes. O objetivo deste trabalho foi avaliar a resistência ao CTV de plantas transgênicas de laranja \'Hamlin\' contendo três construções gênicas oriundas de seqüências do genoma do CTV. Estas construções gênicas visaram ativar rotas de RNAi (hairpin da capa protéica e seqüência conservada antisenso do CTV) e mecanismos de defesa relacionados à expressão da capa protéica do CTV. As plantas transgênicas foram desafiadas com uma estirpe fraca de CTV (CTV-IAC) por meio de borbulhas e pulgões pretos (Toxoptera citricida Kirkaldy) contendo o vírus. A avaliação da resistênica à replicação viral foi feita por análises de ELISA. As plantas transgênicas foram consideradas não resistentes à infecção e translocação viral quando inoculadas com borbulhas. Entretanto algumas plantas mostraram retardamento da infecção. Não foi possível determinar se houve resistência à transmissão de CTV por pulgões já que a técnica utilizada não foi capaz de infectar os controles de maneira uniforme. / The Citrus tristeza virus (CTV) is one of the greatest threats to the citrus industry worldwide. In Brazil, CTV continues to cause damage through strong strains despite the use of techniques like cross-protection and substitution of intolerant rootstocks. With the appearance and spread of the Citrus Sudden Death disease in 1999 and its possible relation to CTV, this virus was again among important pathogens within the Brazilian citrus industry. One of the possible solutions for controlling virus diseases in fruit crops is the development of immune or resistant transgenic plants. The objective of this work was to evaluate the resistance to CTV of transgenic \'Hamlin\' sweet orange plants containing three transgenic constructs obtained from CTV genomic sequences. The genetic constructs used aimed to activate RNAi defense routes (coat protein hairpin and a conserved sequence from CTV) and resistance mechanisms related to the coat protein expression. The transgenic plants were challenged with a weak strain of CTV, CTV-IAC, by bud and aphid (Toxoptera citricida Kirkaldy) inoculation. The evaluation of viral replication was done by ELISA analysis. The transgenic plants were considered susceptible to viral replication and translocation when bud inoculated. However, a few plants showed retardation of infection. It was not possible to determine resistance in the aphid transmission assay since the controls were not uniformly inoculated.

O vírus da tristeza dos citros (CTV) é uma das maiores ameaças à citricultura mundial. No Brasil, mesmo com a pré-imunização e com a substituição de porta-enxertos, estirpes fortes de CTV ainda causam prejuízos consideráveis. Com o aparecimento da Morte Súbita dos Citros em 1999 e a possível relação desta doença com o CTV, este vírus voltou a figurar como patógeno de importância no cenário da citricultura brasileira. Uma das possíveis soluções para o controle de viroses em fruteiras é a obtenção de plantas transgênicas resistentes ou imunes. O objetivo deste trabalho foi avaliar a resistência ao CTV de plantas transgênicas de laranja \'Hamlin\' contendo três construções gênicas oriundas de seqüências do genoma do CTV. Estas construções gênicas visaram ativar rotas de RNAi (hairpin da capa protéica e seqüência conservada antisenso do CTV) e mecanismos de defesa relacionados à expressão da capa protéica do CTV. As plantas transgênicas foram desafiadas com uma estirpe fraca de CTV (CTV-IAC) por meio de borbulhas e pulgões pretos (Toxoptera citricida Kirkaldy) contendo o vírus. A avaliação da resistênica à replicação viral foi feita por análises de ELISA. As plantas transgênicas foram consideradas não resistentes à infecção e translocação viral quando inoculadas com borbulhas. Entretanto algumas plantas mostraram retardamento da infecção. Não foi possível determinar se houve resistência à transmissão de CTV por pulgões já que a técnica utilizada não foi capaz de infectar os controles de maneira uniforme. / The Citrus tristeza virus (CTV) is one of the greatest threats to the citrus industry worldwide. In Brazil, CTV continues to cause damage through strong strains despite the use of techniques like cross-protection and substitution of intolerant rootstocks. With the appearance and spread of the Citrus Sudden Death disease in 1999 and its possible relation to CTV, this virus was again among important pathogens within the Brazilian citrus industry. One of the possible solutions for controlling virus diseases in fruit crops is the development of immune or resistant transgenic plants. The objective of this work was to evaluate the resistance to CTV of transgenic \'Hamlin\' sweet orange plants containing three transgenic constructs obtained from CTV genomic sequences. The genetic constructs used aimed to activate RNAi defense routes (coat protein hairpin and a conserved sequence from CTV) and resistance mechanisms related to the coat protein expression. The transgenic plants were challenged with a weak strain of CTV, CTV-IAC, by bud and aphid (Toxoptera citricida Kirkaldy) inoculation. The evaluation of viral replication was done by ELISA analysis. The transgenic plants were considered susceptible to viral replication and translocation when bud inoculated. However, a few plants showed retardation of infection. It was not possible to determine resistance in the aphid transmission assay since the controls were not uniformly inoculated.

A morte súbita dos citros (MSC) foi identificada em 2001, no município de Comendador Gomes, Minas Gerais, e desde então foi responsável pela perda de 4 milhões de plantas na região sul do Triângulo Mineiro, e no norte e noroeste do estado de São Paulo. É uma doença de combinação copa/porta-enxerto, afetando principalmente laranjeira doce enxertada em limoeiro Cravo, e que culmina na morte das plantas. Passados dez anos do seu relato, até hoje não se tem conhecimento exato do agente causal e dos possíveis vetores. Sabe-se, todavia, que em todas as plantas com morte súbita encontram-se o vírus da tristeza dos citros (Citrus tristeza virus - CTV) e um vírus do Gênero Marafivirus, Família Tymoviridae, denominado Citrus sudden death associated virus (CSDaV). Devido esse fato, há a necessidade de separá-los para testar os postulados de Koch para o CSDaV. O principal objetivo deste trabalho foi tentar isolar o CSDaV para verificar o seu real envolvimento com a MSC. Também se procurou purificar esse vírus para a produção de antissoro policlonal para trabalhos de diagnose da doença. Para a purificação do CSDaV foi utilizado o protocolo de purificação do Potato leaf roll virus, porém os resultados não foram satisfatórios devido a constante presença do CTV. Tentativas de remoção do CTV por meio de imunoprecipitação com antissoro homólogo não foram satisfatórias. O antissoro produzido reagiu indistintamente com extratos de plantas infectadas com o CSDaV e o CTV. O CSDaV foi transmitido mecanicamente para plantas de Nicotiana sp., N. clevelandii, Chenopodium amaranticolor e C. quinoa, causando principalmente infecção localizada. A presença do vírus foi confirmada por RT-PCR e a sua identidade por meio do sequenciamento de nucleotídeos do produto da amplificação. Tentativas de transmissão do CSDaV usando inóculo de extrato de folhas de plantas do campo , por meio da Cuscuta sp., através de cortes no tronco das plantas com lâmina embebida no inóculo, com pulgões Toxoptera citricida aparentemente virulíferos somente para o tymovirus e por meio da inoculação de sementes de citros deram resultados negativos. / Citrus sudden death (CSD) disease was identified in 2001, at Comendador Comes County, State of Minas Gerais, Brazil. Since then the disease has caused the death of 4 million trees in Southwestern Minas Gerais State and Northern São Paulo State. This new and destructive disease affects sweet orange as well as other species, varieties, and hybrids when grafted on Rangpur (Citrus limonia). Then years after the first report on CSD, the causal agent and possible vector(s) have not been precisely identified. It is known, however, that all disease trees are infected with Citrus tristeza virus (CTV) and Citrus sudden death associate virus (CSDaV), which is a member of the Genus Marafivirus, Famíly Tymoviridae. Due to this, it is necessary to separate these pathogens, in order to complete Kochs postulated for the CSDaV. The main purpose of the present work was to try to isolate the CSDaV to verify its role on CSD disease. In addition, attempts were done to purify the virus and produce polyclonal antiserum for disease diagnosis. Purification was carried out as described for Potato leaf roll virus, but results were not suitable due to the constant presence of CTV. Efforts to remove CTV by immunoprecipitation with homologous antiserum did not succeed. The produced antiserum reacted indistinctly with extracts of plants infected with both viruses. SCDaV was mechanically transmitted to Nicotiana sp., N. clevelandii, Chenopodium amaranticolor, and C. quinoa, causing mainly local infection. Infection was confirmed by RT-PCR and virus identity was determined by nucleotide sequence of the amplified fragment. Efforts to transmit CSDaV, using as inoculum extract from field infected plants, by means of Cucucuta sp., by incisions on the trunk of the test-plants, with Toxoptera citricida apparently viruliferous only for the tymovirus, and by means of citrus seed inoculation gave negative results.

Laranjeiras ‘Valência’ enxertadas em citrandarins e outros híbridos de trifoliata foram plantadas em 1988, em Itirapina (SP), num Latossolo Vermelho-amarelo-textura arenosa e conduzidas sem irrigação. Os citrandarins Sunki x English (1.628), Cleópatra x Rubidoux (1.660) e Cleópatra x English (710), induziram as maiores produções de frutos nas cinco e nas treze colheitas. Os citranges ‘Troyer’ e ‘Carrizo’ foram significativamente menos produtivos que o Sunki x English (1.628) nas cinco primeiras e no total das treze colheitas. Os citrandarins Clementina x Trifoliata (1.615), Cleópatra x Swingle, seleções (715) e (1.614), Cleópatra x Rubidoux (1.600) e Cleópatra x Christian (712) induziram plantas nanicas. Sunki x English (1.628), ‘Troyer’ e ‘Carrizo’ proporcionaram as maiores plantas e lideraram a produção de frutos e de sólidos solúveis no período 2001-2003. Nenhuma planta mostrou sintomas de suscetibilidade à tristeza ou ao declínio. As plantas enxertadas no trangpur Cravo x Carrizo (717), mostraram sintoma de incompatibilidade na região de enxertia. "Seedlings" dos citrandarins Cleópatra x Swingle (1.587), Cleópatra x Trifoliata (1.574) e Cleópatra x Rubidoux (1.600) foram mais resistentes à gomose de Phytophthora parasitica que os demais porta-enxertos. / ‘Valência’ sweet orange trees budded onto citrandarins and others trifoliate hybrids rootstocks were planted in 1988 on a sandy textured Oxisol in São Paulo state, Brazil, and managed without irrigation. Tristeza and blight diseases are endemic in the area. Trees on Sunki x English (1628), Cleopatra x Rubidoux (1660) and Cleopatra x English (710), produced the highest cumulative yields in the first five and in the thirteen crops. ‘Carrizo’ and ‘Troyer’ citranges gave the lowest productions in the first five yields but were similar to Sunki x English (1628) in 13-years cumulative yields. Clementine x Trifoliate (1615), Cleopatra x Swingle (715) and (1614) selections, Cleopatra x Rubidoux (1600) and Cleopatra x Christian (712) induced dwarfed trees. Sunki x English (1628) and ‘Troyer’ and ‘Carrizo’ citranges induced the largest trees and fruit and soluble solids production by tree in the 2001-2003 period. None tree showed symptoms of tristeza or declinio. Trees on Cravo x Carrizo (717) showed bud-union-ring symptom of incompatibility. Seedlings of Cleopatra x Swingle (1587), Cleopatra x Trifoliate (1574) and Cleopatra x Rubidoux (1600) were more resistent to Phytophthora parasitica infections than the others rootstocks.

A morte súbita dos citros (MSC) foi identificada em 2001, no município de Comendador Gomes, Minas Gerais, e desde então foi responsável pela perda de 4 milhões de plantas na região sul do Triângulo Mineiro, e no norte e noroeste do estado de São Paulo. É uma doença de combinação copa/porta-enxerto, afetando principalmente laranjeira doce enxertada em limoeiro Cravo, e que culmina na morte das plantas. Passados dez anos do seu relato, até hoje não se tem conhecimento exato do agente causal e dos possíveis vetores. Sabe-se, todavia, que em todas as plantas com morte súbita encontram-se o vírus da tristeza dos citros (Citrus tristeza virus - CTV) e um vírus do Gênero Marafivirus, Família Tymoviridae, denominado Citrus sudden death associated virus (CSDaV). Devido esse fato, há a necessidade de separá-los para testar os postulados de Koch para o CSDaV. O principal objetivo deste trabalho foi tentar isolar o CSDaV para verificar o seu real envolvimento com a MSC. Também se procurou purificar esse vírus para a produção de antissoro policlonal para trabalhos de diagnose da doença. Para a purificação do CSDaV foi utilizado o protocolo de purificação do Potato leaf roll virus, porém os resultados não foram satisfatórios devido a constante presença do CTV. Tentativas de remoção do CTV por meio de imunoprecipitação com antissoro homólogo não foram satisfatórias. O antissoro produzido reagiu indistintamente com extratos de plantas infectadas com o CSDaV e o CTV. O CSDaV foi transmitido mecanicamente para plantas de Nicotiana sp., N. clevelandii, Chenopodium amaranticolor e C. quinoa, causando principalmente infecção localizada. A presença do vírus foi confirmada por RT-PCR e a sua identidade por meio do sequenciamento de nucleotídeos do produto da amplificação. Tentativas de transmissão do CSDaV usando inóculo de extrato de folhas de plantas do campo , por meio da Cuscuta sp., através de cortes no tronco das plantas com lâmina embebida no inóculo, com pulgões Toxoptera citricida aparentemente virulíferos somente para o tymovirus e por meio da inoculação de sementes de citros deram resultados negativos. / Citrus sudden death (CSD) disease was identified in 2001, at Comendador Comes County, State of Minas Gerais, Brazil. Since then the disease has caused the death of 4 million trees in Southwestern Minas Gerais State and Northern São Paulo State. This new and destructive disease affects sweet orange as well as other species, varieties, and hybrids when grafted on Rangpur (Citrus limonia). Then years after the first report on CSD, the causal agent and possible vector(s) have not been precisely identified. It is known, however, that all disease trees are infected with Citrus tristeza virus (CTV) and Citrus sudden death associate virus (CSDaV), which is a member of the Genus Marafivirus, Famíly Tymoviridae. Due to this, it is necessary to separate these pathogens, in order to complete Kochs postulated for the CSDaV. The main purpose of the present work was to try to isolate the CSDaV to verify its role on CSD disease. In addition, attempts were done to purify the virus and produce polyclonal antiserum for disease diagnosis. Purification was carried out as described for Potato leaf roll virus, but results were not suitable due to the constant presence of CTV. Efforts to remove CTV by immunoprecipitation with homologous antiserum did not succeed. The produced antiserum reacted indistinctly with extracts of plants infected with both viruses. SCDaV was mechanically transmitted to Nicotiana sp., N. clevelandii, Chenopodium amaranticolor, and C. quinoa, causing mainly local infection. Infection was confirmed by RT-PCR and virus identity was determined by nucleotide sequence of the amplified fragment. Efforts to transmit CSDaV, using as inoculum extract from field infected plants, by means of Cucucuta sp., by incisions on the trunk of the test-plants, with Toxoptera citricida apparently viruliferous only for the tymovirus, and by means of citrus seed inoculation gave negative results.

Laranjeiras ‘Valência’ enxertadas em citrandarins e outros híbridos de trifoliata foram plantadas em 1988, em Itirapina (SP), num Latossolo Vermelho-amarelo-textura arenosa e conduzidas sem irrigação. Os citrandarins Sunki x English (1.628), Cleópatra x Rubidoux (1.660) e Cleópatra x English (710), induziram as maiores produções de frutos nas cinco e nas treze colheitas. Os citranges ‘Troyer’ e ‘Carrizo’ foram significativamente menos produtivos que o Sunki x English (1.628) nas cinco primeiras e no total das treze colheitas. Os citrandarins Clementina x Trifoliata (1.615), Cleópatra x Swingle, seleções (715) e (1.614), Cleópatra x Rubidoux (1.600) e Cleópatra x Christian (712) induziram plantas nanicas. Sunki x English (1.628), ‘Troyer’ e ‘Carrizo’ proporcionaram as maiores plantas e lideraram a produção de frutos e de sólidos solúveis no período 2001-2003. Nenhuma planta mostrou sintomas de suscetibilidade à tristeza ou ao declínio. As plantas enxertadas no trangpur Cravo x Carrizo (717), mostraram sintoma de incompatibilidade na região de enxertia. “Seedlings” dos citrandarins Cleópatra x Swingle (1.587), Cleópatra x Trifoliata (1.574) e Cleópatra x Rubidoux (1.600) foram mais resistentes à gomose de Phytophthora parasitica que os demais porta-enxertos. / ‘Valência’ sweet orange trees budded onto citrandarins and others trifoliate hybrids rootstocks were planted in 1988 on a sandy textured Oxisol in São Paulo state, Brazil, and managed without irrigation. Tristeza and blight diseases are endemic in the area. Trees on Sunki x English (1628), Cleopatra x Rubidoux (1660) and Cleopatra x English (710), produced the highest cumulative yields in the first five and in the thirteen crops. ‘Carrizo’ and ‘Troyer’ citranges gave the lowest productions in the first five yields but were similar to Sunki x English (1628) in 13-years cumulative yields. Clementine x Trifoliate (1615), Cleopatra x Swingle (715) and (1614) selections, Cleopatra x Rubidoux (1600) and Cleopatra x Christian (712) induced dwarfed trees. Sunki x English (1628) and ‘Troyer’ and ‘Carrizo’ citranges induced the largest trees and fruit and soluble solids production by tree in the 2001-2003 period. None tree showed symptoms of tristeza or declinio. Trees on Cravo x Carrizo (717) showed bud-union-ring symptom of incompatibility. Seedlings of Cleopatra x Swingle (1587), Cleopatra x Trifoliate (1574) and Cleopatra x Rubidoux (1600) were more resistent to Phytophthora parasitica infections than the others rootstocks.

No Brasil a citricultura está entre as culturas de maior importância. A produtividade dessa cultura no país ainda é considerada baixa e esse fato se deve, em parte, a diversas pragas e doenças. Dentre as doenças, tem-se a tristeza, causada pelo Citrus tristeza virus (CTV). Esse patógeno também pode estar relacionado com outra importante doença da cultura, a morte súbita dos citros (MSC). Com isso, o CTV ganhou ainda maior expressão. Uma alternativa para controlar viroses de plantas é a obtenção de plantas transgênicas resistentes a esses patógenos. Este trabalho objetivou caracterizar com análise molecular e avaliar a resistência ao CTV de plantas transgênicas de laranja Valência (Citrus sinensis L. Osbeck), contendo fragmentos do genoma do CTV, em três construções gênicas diferentes. A transgenia das plantas foi confirmada por análises de Southern blot. A transcrição do transgene foi avaliada por RT-PCR. O material foi inoculado com duas borbulhas infectadas pelo isolado Pêra- IAC, enxertadas no porta-enxerto abaixo do ponto de enxertia da copa transgênica, e pelo vetor Toxoptera citricida infectado. Após quatro semanas da inoculação, para avaliar a resistência ao vírus, brotações da copa transgênica foram submetidas ao teste de ELISA sanduíche indireto com anticorpo monoclonal contra a proteína da capa protéica do CTV. Os resultados indicaram variação na resistência à translocação do vírus nas diferentes construções transgênicas utilizadas e entre clones de uma mesma planta. Todas as linhagens transgênicas inoculadas indicaram a presença do vírus em pelo menos uma das três repetições avaliadas, quando inoculadas por enxertia. Quando inoculadas pelo vetor algumas plantas apresentaram todos os seus clones com baixos valores de absorbância, indicando uma possível resistência ao patógeno. / In Brazil, citrus is one of the most important cultures. The productivity of this culture in the country is still considered low and this fact is due to several pests and diseases that affect the crop. Among the diseases there is the tristeza, caused by Citrus tristeza virus (CTV). This pathogen can also be related with another important disease, the citrus sudden death. Therefore, CTV acquired much more significance. This work aimed to characterize with molecular analysis and to evaluate the resistance to CTV of transgenic Valência plants (Citrus sinensis L. Osbeck), containing genomic fragments of CTV, in three different transgenic constructs. The plants were confirmed as transgenic by Southern blot. The transcription of the transgene was evaluated by RT-PCR. The transgenic plants were challenged with a weak strain of CTV, CTV-IAC, by bud inoculation with two infected bubbles, and by the infected vector Toxoptera citricida. After four weeks of inoculation, the evaluation of viral replication in the transgenic seious was done by ELISA indirect sandwich with monoclonal antibody against the CTV coat protein. The results indicated variation of the resistance to the translocation of the virus between the different transgenic constructs used and between clones of the same plant. All the inoculated plants indicated the presence of the virus in, at least, one of the three evaluated clones, when inoculated by grafting. When inoculated by the vector some plants had all their clones with low values of virus, indicating a possible resistance to the pathogen.

No Brasil a citricultura está entre as culturas de maior importância. A produtividade dessa cultura no país ainda é considerada baixa e esse fato se deve, em parte, a diversas pragas e doenças. Dentre as doenças, tem-se a tristeza, causada pelo Citrus tristeza virus (CTV). Esse patógeno também pode estar relacionado com outra importante doença da cultura, a morte súbita dos citros (MSC). Com isso, o CTV ganhou ainda maior expressão. Uma alternativa para controlar viroses de plantas é a obtenção de plantas transgênicas resistentes a esses patógenos. Este trabalho objetivou caracterizar com análise molecular e avaliar a resistência ao CTV de plantas transgênicas de laranja Valência (Citrus sinensis L. Osbeck), contendo fragmentos do genoma do CTV, em três construções gênicas diferentes. A transgenia das plantas foi confirmada por análises de Southern blot. A transcrição do transgene foi avaliada por RT-PCR. O material foi inoculado com duas borbulhas infectadas pelo isolado Pêra- IAC, enxertadas no porta-enxerto abaixo do ponto de enxertia da copa transgênica, e pelo vetor Toxoptera citricida infectado. Após quatro semanas da inoculação, para avaliar a resistência ao vírus, brotações da copa transgênica foram submetidas ao teste de ELISA sanduíche indireto com anticorpo monoclonal contra a proteína da capa protéica do CTV. Os resultados indicaram variação na resistência à translocação do vírus nas diferentes construções transgênicas utilizadas e entre clones de uma mesma planta. Todas as linhagens transgênicas inoculadas indicaram a presença do vírus em pelo menos uma das três repetições avaliadas, quando inoculadas por enxertia. Quando inoculadas pelo vetor algumas plantas apresentaram todos os seus clones com baixos valores de absorbância, indicando uma possível resistência ao patógeno. / In Brazil, citrus is one of the most important cultures. The productivity of this culture in the country is still considered low and this fact is due to several pests and diseases that affect the crop. Among the diseases there is the tristeza, caused by Citrus tristeza virus (CTV). This pathogen can also be related with another important disease, the citrus sudden death. Therefore, CTV acquired much more significance. This work aimed to characterize with molecular analysis and to evaluate the resistance to CTV of transgenic Valência plants (Citrus sinensis L. Osbeck), containing genomic fragments of CTV, in three different transgenic constructs. The plants were confirmed as transgenic by Southern blot. The transcription of the transgene was evaluated by RT-PCR. The transgenic plants were challenged with a weak strain of CTV, CTV-IAC, by bud inoculation with two infected bubbles, and by the infected vector Toxoptera citricida. After four weeks of inoculation, the evaluation of viral replication in the transgenic seious was done by ELISA indirect sandwich with monoclonal antibody against the CTV coat protein. The results indicated variation of the resistance to the translocation of the virus between the different transgenic constructs used and between clones of the same plant. All the inoculated plants indicated the presence of the virus in, at least, one of the three evaluated clones, when inoculated by grafting. When inoculated by the vector some plants had all their clones with low values of virus, indicating a possible resistance to the pathogen.

O presente trabalho teve como principal objetivo obter plantas transgênicas, dos cultivares porta-enxerto limão \'Cravo\' e laranja azeda e de cultivares copa de laranja doce, expressando genes que possam influenciar no nível de resistência ao vírus da tristeza dos citros (CTV) e, possivelmente à morte súbita dos citros. Buscou-se ainda estudar a organogênese in vitro de espécies cítricas. Experimentos para a indução da organogênese in vitro foram realizados a partir de segmentos de epicótilos de plântulas germinadas in vitro de espécies cítricas avaliando-se: a resposta organogênica de três diferentes regiões do epicótilo, na presença (1,0 mg.L-1) ou ausência de BAP, em meio MT, e a regeneração em diferentes concentrações de BAP (0; 0,5; 1,0; 1,5 e 2,0 mg.L-1) adicionadas ao meio MT. Também avaliou-se a regeneração de segmentos internodais de limão ?Cravo? e laranja azeda em diferentes concentrações de BAP (0; 0,5; 1,0; 2,0 e 4,0 mg.L-1) em meio MT; e de laranja azeda em meio de cultura MT e DBA3, suplementados com diferentes concentrações de BAP (0; 1,0 e 2,0 mg.L-1) e ANA (0; 0,3 e 0,5 mg.L-1). Foi utilizado o método de transformação genética mediado por Agrobacterium tumefaciens utilizando-se tecido juvenil coletado de plantas cultivadas in vitro (segmentos de epicótilo) ou em casa de vegetação (segmentos internodais) como explantes. Utilizou-se a estirpe EHA105 de A. tumefaciens, contendo os plasmídeos: a) pCTV-CP: contendo o gene da capa protéica do CTV; b) pCTV-dsCP: contendo repetições invertidas do gene da capa protéica do CTV, interligadas pelo intron do gene da quitinase de citros; c) pCTVcons: contendo uma seqüência conservada antisense do CTV. As construções gênicas foram elaboradas a partir do plasmídeo pCAMBIA 2201, dirigidas pelo promotor 35S e o terminador NOS. Foram utilizados também os genes de seleção nptII e o repórter GUS. As gemas adventícias desenvolvidas foram identificadas como transgênicas pelo teste histoquímico GUS e por PCR e a confirmação da transformação genética foi feita por Southern Blot. A expressão da proteína do CTV foi verificada pelo teste serológico de PTA-ELISA. A resposta morfogênica em função da região do epicótilo e das concentrações da citocinina BAP é dependente do cultivar de citros. A suplementação do meio de cultura com a citocinina BAP proporcionou um maior número de gemas adventícias regeneradas por explante, tanto em segmentos de epicótilo como em segmentos internodais dos cultivares de citros estudados. A suplementação do meio de cultura com a citocinina BAP é essencial na regeneração de gemas adventícias em segmentos internodais de laranja azeda. Foi possível regenerar plantas transgênicas, pelo protocolo de transformação genética mediado por Agrobacterium tumefaciens de limão \'Cravo\' contendo o gene da capa protéica do vírus da tristeza dos citros (pCTV-CP) utilizando-se segmentos de epicótilo e segmentos internodais como fonte de explante, e com uma seqüência conservada antisense do CTV, utilizando-se segmentos internodias; e de laranja \'Hamlin\' contendo o gene da capa protéica do CTV, com as construções gênicas pCTV-dsCP e pCTV-CP, e com uma seqüência conservada antisense do CTV, utilizando-se segmentos de epicótilo como fonte de explante. / The objective of the present work was to obtain transgenic plants of rootstocks Rangpur lime and sour orange as well as sweet orange scion varieties, expressing genes that would possibly influence the levels of resistance to the Citrus tristeza virus (CTV) and Citrus sudden death disease. The in vitro organogenesis of Citrus species was also studied. In vitro organogenesis experiments were conducted with epicotyl segments obtained from in vitro germinated seedlings of different Citrus species in order to evaluate: organogenic response of three epicotyl regions, in the presence (1,0 mg.L-1) or absence of BAP, in MT medium, and the regeneration using different BAP concentrations (0; 0,5; 1,0; 1,5 e 2,0 mg.L-1) added to MT medium. The regeneration of internodal segments of Rangpur lime and sour orange was evaluated in MT medium with different BAP concentrations (0; 0,5; 1,0; 2,0 e 4,0 mg.L-1) as well as sour orange regeneration in MT and DBA3 mediums, supplemented with different concentrations of BAP (0; 1,0 e 2,0 mg.L-1) and NAA (0; 0,3 e 0,5 mg.L-1). The Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium tumefaciens mediated genetic transformation method of juvenile tissue obtained from in vitro (epicotyls) or green house cultivated plants (internodal segments) was used in this work. The EHA 105 strain was used with the following plasmids: a) pCTV-CP: containing the coat protein gene from CTV; b) pCTV-dsCP: containing inverted repeats of the coat protein gene from CTV interconnected by the Citrus quitinase gene intron; c) pCTVcons: containing an antisense sequence of CTV untranslated region. The gene constructs were built from the pCAMBIA 2201 plasmid, and contained the 35S promoter and the NOS terminator. The nptII selection gene and the GUS reporter gene were also used. The adventitious buds developed were identified as transgenic by GUS histochemical test and PCR, these results were later confirmed by Southern Blot. The transgenic coat protein expression was detected by the serological test PTA-ELISA. The morphogenic response related to the epicotyl region and BAP cytokinin were dependent on the Citrus varieties. The addition of BAP cytokinin to the culture medium showed a greater number of adventitious buds regenerated per explant in both epicotyl and internodal segments of the Citrus varieties studied. The addition of BAP to the culture medium is essential for the regeneration of adventitious buds in sour orange internodal segments. Using the Agrobacterium mediated genetic transformation protocol it was possible to regenerate transgenic plants of different varieties and gene constructs: Rangpur lime containing the coat protein gene of CTV (pCTV-CP) using epicotyl and internodal segments as explant source, and an antisense sequence of CTV untranslated region using internodal segments as explant source; Hamlin sweet orange containing the coat protein gene of CTV in constructions pCTV-CP and pCTV-dsCP, and an antisense sequence of CTV untranslated region using epicotyl segments as explant source.

A hibridação somática é uma nova opção em programas de melhoramento de espécies cítricas, obtendo-se híbridos somáticos que podem manter integralmente a combinação genética de ambos os progenitores envolvidos na hibridação. Assim, o objetivo desse trabalho foi estudar a propagação e crescimento de combinações parentais de híbridos somáticos com potencial para serem utilizados como porta-enxertos e verificar possíveis resistências/tolerâncias à infecção de tronco e raízes por Phytophthora nicotianae e ao vírus da tristeza dos citros (CTV). Os híbridos somáticos utilizados nos trabalhos foram: limão 'Cravo' + laranja azeda, laranja 'Caipira' + limão 'Cravo', laranja 'Caipira' + tangerina 'Cleópatra', laranja 'Caipira' + limão 'Volkameriano', laranja 'Caipira' + limão 'Rugoso', tangerina 'Cleópatra' + limão 'Volkameriano', tangerina 'Cleópatra' + laranja azeda, limão 'Cravo' + tangerina 'Sunki', laranja 'Ruby Blood' + limão 'Volkameriano', laranja 'Rohde Red' + limão 'Volkameriano' e laranja 'Valência' + Fortunella obovata. Na propagação dos híbridos, estacas de 15 cm de comprimento foram retiradas de plantas matrizes dos respectivos híbridos somáticos e submetidas ao enraizamento em câmara de nebulização intermitente por 100 dias. Posteriormente, foram analisadas o sistema radicular das estacas e parte aérea. Em seguida, foram transplantadas para sacos plásticos, conduzidas em haste única e mantidas em casa-de-vegetação por 210 dias, realizando-se avaliações mensais em relação à parte aérea e ao final avaliações do sistema radicular. Para os ensaios de infecção por Phytophthora nicotianae e CTV, foram utilizadas mudas dos respectivos híbridos somáticos oriundos de estacas e ainda a inclusão de plantas testemunhas. Para os testes de resistência/tolerância a P. nicotianae, utilizou-se o método da agulha para o teste de infecção de tronco, sendo as lesões quantificadas após 25 dias da inoculação. Para o teste de podridão das raízes e radicelas, o substrato foi infectado com estruturas do patógeno, sendo analisados a parte aérea das plantas quinzenalmente e o sistema radicular após 60 dias da instalação do ensaio. Para o teste de tolerância dos híbridos somáticos ao CTV, adotou-se o método de união dos tecidos (enxertia), analisando-se a parte aérea das plantas mensalmente em três avaliações. No enraizamento das estacas, os híbridos laranja 'Caipira' + tangerina 'Cleópatra', laranja 'Caipira' + limão 'Volkameriano', limão 'Cravo' + tangerina 'Sunki' e laranja 'Rohde Red' + limão 'Volkameriano' apresentaram melhores resultados, sendo que os híbridos laranja 'Caipira' + limão 'Volkameriano' e laranja 'Rohde Red' + limão 'Volkameriano' se destacaram em relação ao desenvolvimento das estacas após o tranplantio. Os híbridos somáticos tangerina 'Cleópatra' + laranja azeda, limão 'Cravo' + tangerina 'Sunki', tangerina 'Cleópatra' + limão 'Volkameriano', laranja 'Ruby Blood' + limão 'Volkameriano', laranja 'Rohde Red' + limão 'Volkameriano' e laranja 'Caipira' + limão 'Volkameriano' apresentaram bons resultados em relação à redução da podridão do tronco e os híbridos somáticos tangerina 'Cleópatra' + limão 'Volkameriano', tangerina 'Cleópatra' + laranja azeda, laranja 'Caipira' + limão 'Volkameriano' e laranja 'Caipira' + limão 'Cravo' apresentaram tolerância a podridão das raízes e radicelas ocasionado por P. nicotianae. Os híbridos tangerina 'Cleópatra' + laranja azeda e laranja 'Valência' + Fortunella obovata apresentaram intolerância ao vírus da tristeza dos citros. / Somatic hybridization is a new alternative in citric species breeding, yielding somatic hybrids which may integrally keep the genetic combination of both progenitors involved in the hybridization. Thus, the objective of this work was to study the propagation and growth of somatic hybrids parental combinations with potential to be used as rootstock and to verify possible resistance/tolerance to trunk and roots infection by Phytophthora nicotianae and citrus tristeza virus (CTV). This work applied the following somatic hybrids: 'Cravo' lemon + sour orange, 'Caipira' orange + 'Cravo' lemon, 'Caipira' orange + 'Cleopatra' tangerine, 'Caipira' orange + 'Volkamerian' lemon, 'Caipira' orange + 'Rough' lemon, 'Cleopatra' tangerine + 'Volkamerian' lemon, 'Cleopatra' tangerine + sour orange, 'Cravo' lemon + 'Sunki' tangerine, 'Ruby Blood' orange + 'Volkamerian' lemon, 'Rohde Red' orange + 'Volkamerian' lemon and 'Valência' orange + Fortunella obovata. In hybrids propagation, stem cuttings of approximately 15 cm length were excised from matrix plants of respective somatic hybrids and submmited to rooting in intermitent nebulization chamber for 100 days. Later, the stem cuttings root system and air part were analyzed. In sequence, they were transplanted to plastic bags, conduced in only one hast and kept in greenhouse during 210 days, when monthly evaluations were performed concerning the air part and, in the end, root system evaluations. For the Phytophthora nicotianae and CTV infection essays, plants derived from the respective somatic hybrids originated from stem cuttings were used, as well as control plants. For the resistance/tolerance to P. nicotianae analysis, the needle method for the trunk infection test was applied, being the lesions quantified after 25 days post-inoculation. For the roots and radicels flashening test, substrate was infected with pathogen structures and the air part of the plants was analyzed at every 15 days; roots were analyzed 60 days after the essay implementation. To evaluate the somatic hybrids tolerance to CTV, it was adopted the method of tissues union (grafting), where the air part of the plants was analyzed once a month in three evaluations. On the stem cuttings rooting, the hybrids of 'Caipira' orange + 'Cleopatra' tangerine, 'Caipira' orange + 'Volkamerian' lemon, 'Cravo' lemon + 'Sunki' tangerine and 'Rohde Red' orange + 'Volkamerian' lemon presented the best results, with the hybrids of 'Caipira' orange + 'Volkamerian' lemon and 'Rohde Red' orange + 'Volkamerian' lemon being the top concerning the stem cuttings development after transplanting. The somatic hybrids of 'Cleopatra' tangerine + sour orange, 'Cravo' lemon + 'Sunki' tangerine, 'Cleopatra' tangerine + 'Volkamerian' lemon, 'Ruby Blood' orange + 'Volkamerian' lemon, 'Rohde Red' orange + 'Volkamerian' lemon and 'Caipira' orange + 'Volkamerian' lemon showed good results related to reducing the trunk flashening, and the somatic hybrids of 'Cleopatra' tangerine + 'Volkamerian' lemon, 'Cleopatra' tangerine + sour orange, 'Caipira' orange + 'Volkamerian' lemon and 'Caipira' orange + 'Cravo' lemon presented tolerance to roots and radicels flashening caused by P. nicotianae. The hybrids of 'Cleopatra' tangerine + sour orange and 'Valência' orange + Fortunella obovata showed to be intolerant to citrus tristeza virus.