Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, 2008. / Submitted by Suelen Silva dos Santos (suelenunb@yahoo.com.br) on 2009-09-25T18:14:03Z No. of bitstreams: 1 2008_SilviaAraujoAranha.pdf: 1817971 bytes, checksum: 639e1e78cac18089a3390daefc6d2605 (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Maia(luanna@bce.unb.br) on 2009-10-01T11:57:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_SilviaAraujoAranha.pdf: 1817971 bytes, checksum: 639e1e78cac18089a3390daefc6d2605 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-10-01T11:57:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_SilviaAraujoAranha.pdf: 1817971 bytes, checksum: 639e1e78cac18089a3390daefc6d2605 (MD5) Previous issue date: 2008 / O mosaico do quiabeiro era encontrado com certa freqüência durante a década de 1960 no Brasil, no entanto, sua importância diminuiu com a introdução da cultivar resistente Santa Cruz 47. Acreditava-se que este mosaico fosse causado por um begomovírus, contudo seu agente etiológico nunca foi confirmado. Visitas foram realizadas em lavouras de quiabeiro no cinturão verde do Distrito Federal e Goiás para avaliação de ocorrência de begomovírus na cultura. Amostras foliares de plantas foram coletadas ao acaso ou dirigidas para plantas com sintomas de infecção viral. DNA total foi extraído e utilizado em testes de detecção via PCR com primers universais para begomovírus. Cento e oito amostras sintomáticas ou assintomáticas foram avaliado, sendo que em três (#5157, 6319 e 6328) detectou-se a presença de begomovírus. DNA circular das três amostras foi amplificado por replicação via círculo rolante e introduzido em plantas de quiabo por bombardeamento de partículas. A infecção foi comprovada para as três amostras. O DNA-A e DNA-B dos três isolados foi clonado (exceto DNA-B da amostra #6328) e as seqüências nucleotídicas determinadas revelaram características típicas dos begomovírus bipartidos do novo mundo. Clones do DNA-A e DNA-B do isolado #5157 foram infectivos em quiabeiro, Sida santaremnensis e algumas hospedeiras da família Solanaceae quando realizada inoculação por biobalística. De acordo com os critérios taxonômicos atuais para o gênero Begomovirus, os clones do isolado #5157 pertencem à espécie Sida micrantha mosaic virus enquanto os clones dos outros dois isolados (# 6319 e # 6328) pertencem a uma nova espécie, cujo nome é tentativamente sugerido como Okra mottle virus. Esse é o primeiro relato de begomovírus infectando quiabeiro no Brasil. Até o presente, não se conhecia a real ocorrência de begomovírus em quiabeiro, porém nessa pequena busca foram encontradas duas espécies, o que sugere haver uma grande diversidade de espécies de begomovírus em quiabeiro no Brasil. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Okra mosaic disease was frequently observed in the 60’s in Brazil, but its importance decreased after the use of the resistant cultivar ‘Santa Cruz 47’. It was believed that this disease was caused by a begomovirus, but the etiology was never confirmed. Several okra production fields were visited in central Brazil (Federal District and Goiás state) for evaluation of occurrence of begomovirus. Samples from plants showing chlorotic spots, mosaic symptoms or asymptomatic ones were collected and tested by using begomovirus universal primers. Among one hundred and ninety eight collected sintomatic or assintomatic plants, begomovirus were detected in three samples (samples #5157, 6319 and 6328). Total DNA was subjected to rolling circle amplification (RCA) and introduced into okra seedlings by biobalistcs. All three DNA bombarded samples gave rise to infected okra plants, confirmed by PCR, demonstrating that they were infectious to okra plants. DNA-A and DNA-B of three isolates were cloned (except for sample DNA-B of #6328) and their nucleotide sequences exhibited typical properties of new world bipartite begomoviruses. Clones of DNA-A and DNA-B from isolate #5157 were infectious to okra, Sida santaremnensis and some Solanaceae plants when inoculated by biolistics. According to the new taxonomic criteria for the Begomovirus genus, clones of the isolate #5157 belong to Sida micrantha mosaic virus species, while clones of the isolates #6319 and 6328 belong to a new species, tentatively named Okra mottle virus. This is the first report of a begomovirus infecting okra in Brazil. Until recently, the presence of a begomovirus in okra plants was not recognized, but in the present small-scale survey, two species were found, suggesting a considerable diversity of okra infecting begomoviroses species within Brazil.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2015-03-24T20:05:33Z No. of bitstreams: 1 2014_KellyBarretoRodrigues.pdf: 3583484 bytes, checksum: 01cf3950732343dfd985e0d7fcb94d0d (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2015-05-04T12:43:36Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_KellyBarretoRodrigues.pdf: 3583484 bytes, checksum: 01cf3950732343dfd985e0d7fcb94d0d (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-04T12:43:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_KellyBarretoRodrigues.pdf: 3583484 bytes, checksum: 01cf3950732343dfd985e0d7fcb94d0d (MD5) / Pepper ringspot virus (PepRSV) é um tobravírus e foi originalmente isolado no Brasil de plantas de Capsicum spp., que apresentavam sintomas de manchas anelares. As partículas são alongadas e rígidas e o seu genoma possui dois segmentos de RNA fita simples e senso positivo. Uma particularidade que o distingue de outros vírus conhecidos é a associação constante de suas partículas com as mitocôndrias do hospedeiro. Estudos preliminares in silico da proteína viral p29 de PepRSV sugeriram ser esta a proteína candidata a apresentar alguma interação com mitocôndrias. A capa proteica (CP) é a segunda candidata, por também estar presente na superfície das partículas virais, que se associam com mitocôndrias. Baseando-se nestas premissas, a interação das proteínas virais p29 e CP com a mitocôndria foi estudada, utilizando a estratégia de fusão da proteína-alvo com proteínas fluorescentes GFP ou YFP (Green/Yellow Fluorescent Protein), respectivamente, em vetores binários. Estas construções foram agro-inoculadas em folhas de Nicotiana benthamiana e as localizações subcelulares destas proteínas foram observadas em microscópio confocal. P29-GFP mostrou localização na periferia das células, provavelmente nos plasmodesmas, e a CP possivelmente no núcleo. Para confirmar a localização de p29 nos plasmodesmas, um experimento de co-localização foi realizado com a proteína 30 K de TMV, conhecida por se localizar no plasmodesma, e a co-localização de p29 e 30 K foi detectada. O desenvolvimento de clones infecciosos é uma estratégia padrão para estudar funções gênicas de vírus de RNA e é de vital importância para a elucidação da interação das proteínas virais com as mitocôndrias. Sendo assim, este trabalho também apresenta como objetivo a obtenção do clone de cDNA infeccioso de PepRSV. Para tanto, o RNA 2 foi clonado em vetor binário obtido a partir de um vetor de silenciamento gênico induzido por vírus (VIGS) de TRV contendo o promotor 35S duplicado na região 5´ e da ribozima na extremidade 3´. Para a clonagem do RNA 1, o segmento genômico foi dividido em dois fragmentos, que foram clonados em vetores comerciais, sendo então ligados utilizando sítios de enzimas de restrição. Pretende-se que o fragmento correspondente ao RNA 1 seja substituído pelo RNA 2 previamente inserido no VIGS modificado. Este clone infeccioso também poderá ser utilizado como VIGS para estudo básico de funcionamento de genes da planta. __________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Pepper ringspot virus (PepRSV) is a tobravirus and was originally isolated from plants of Capsicum spp., with ringspot symptoms in Brazil. The particles are elongated and rigid and its genome has two segments of single stranded RNA and positive sense. Unique feature that distinguishes it from other known viruses is the specific and organized association of the virus particles with mitochondria of the host cell. Preliminary in silico studies of the viral protein p29 of PepRSV suggested that this is the candidate protein that has some interaction with mitochondria. The coat protein (CP) is the second candidate, since it is also present on the surface of viral particles, which associates with mitochondria. With these assumptions, the interaction of viral proteins p29 and CP with the mitochondria was studied, using the strategy of fusion of the target proteins with fluorescent proteins GFP or YFP (Green / Yellow Fluorescent Protein), respectively, using binary vectors. These constructions were agro-inoculated to Nicotiana benthamiana leaves and the location of both fused proteins was observed with confocal laser microscope. P29-GFP was located in periphery of cells, most likely in plasmodesmata, and CP was probably in nuclei. Aiming to confirm the localization of p29 in plasmodesmata, an experiment of co-localization was performed with 30 K protein of TMV, a movement protein well known to be located in plasmodesma, and colocalization of p29 and 30 K was detected. The development of infectious clones is a standard strategy for RNA viruses to study gene functions and will be critical for elucidating the interaction of viral proteins with the mitochondria. Thus, this work also had the objective of obtaining infectious cDNA clone PepRSV. To this end, the RNA 2 was cloned into binary vector obtained from a vector of virus-induced gene silencing (VIGS) of TRV, which contain the dual 35S promoter in the 5' region and the ribozyme in the 3' end. For cloning of RNA 1, the genome segment was divided into two fragments, which were cloned into commercial vectors and then ligated using restriction enzyme sites. Subsequently, the corresponding RNA fragment 1 will be replaced by the RNA 2 previously inserted in the modified VIGS. This infectious clone can also be used as a VIGS for basic studies of gene function in plants.

Dissertação (Mestrado)–Universidade de Brasília, Instituto de Biologia, Departamento de Biologia Celular, 2012. / Submitted by Sabrina Silva de Macedo (sabrinamacedo@bce.unb.br) on 2012-06-14T14:40:10Z No. of bitstreams: 1 2012_AndréGustavoMachadoBertran.pdf: 2482468 bytes, checksum: 19531b8165fbd2cb1c7d37578427d654 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2012-08-22T11:37:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_AndréGustavoMachadoBertran.pdf: 2482468 bytes, checksum: 19531b8165fbd2cb1c7d37578427d654 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-08-22T11:37:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_AndréGustavoMachadoBertran.pdf: 2482468 bytes, checksum: 19531b8165fbd2cb1c7d37578427d654 (MD5) / O gênero Tospovirus agrupa importantes vírus vegetais pertencentes à família Bunyaviridae. Estes são vírus de ssRNA(-) com genoma tripartido para o qual ainda não existe um sistema de estudo baseado em genética reversa. A genética reversa é uma ferramenta investigativa com aplicações importantes para o estudo da expressão gênica, evolução e interação vírus-hospedeiro através da manipulação do RNA viral por meio de seu DNA complementar (cDNA). O desenvolvimento de sistemas de genética reversa para vírus vegetais de ssRNA(-), no entanto, ainda precisa superar barreiras técnicas relativas à manutenção e cultivo de células vegetais e produção e transfecção de clones infecciosos, em contraste aos estudos desenvolvidos para vírus animais. O capítulo 1 discorre sobre sistemas de genética reversa e o conhecimento e aplicação dos RNAs defectivos-interferentes virais (DIs), enfatizando o estado da arte, em especial sob a perspectiva dos tospovírus. No capítulo 2, a busca por novos DIs a partir de um isolado brasileiro de tospovírus levou à publicação da sequência completa e caracterização molecular do RNA L de Tomato chlorotic spot virus (TCSV). Estudos de evolução molecular utilizando a proteína L como critério taxonômico indicam melhor poder de resolução e maior confiabilidade na descrição da evolução do gênero Tospovirus em comparação a filogenia baseada na proteína N. Portanto, o L RNA poderia ser usado como critério alternativo e/ou complementar ao gene N na taxonomia de tospovirus. O capítulo 3 apresenta os resultados preliminares do desenvolvimento de uma estratégia alternativa a construção de clones infecciosos para tospovírus baseada no estudo das propriedades replicativas e de expressão de mini-genomas derivados de RNAs defectivos-interferentes transcritos in planta pela expressão transiente da enzima T7 RNA Polimerase e incorporados ao ciclo de replicação de um vírus auxiliar livre de DIs, avaliados por Northern Blotting. Os resultados iniciais parecem demonstrar que esta estratégia é promissora, pois foi possível detectar transcrição de DIs in planta pelo sistema T7 Polimerase. No entanto, a estratégia deve ser otimizada para seu emprego com ferramenta para o estudo de genética reversa no gênero Tospovirus. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The genus Tospovirus comprises important plant pathogens belonging to the Bunyaviridae family of tripartite ssRNA(-) genome viruses for which a reverse genetics system is still unavailable. Reverse genetics is an important methodological tool for the study of gene expression, evolution and host-virus interactions based on the ability of manipulating viral RNA genomes through its DNA counterparts (cDNA). Though significant progress has been achieved for animal-infecting viruses, the same is not true to plant viruses since important technical barriers have not yet been overcome, such as the in vitro maintenance and growth of plant cells and the transfection efficiency of infectious clones. In chapter 1 a review of the acquired knowledge and state of the art of reverse genetics and defective-interfering RNAs/particles with further insight into the Tospovirus genus is presented. Chapter 2 describes how the search for new defective-interfering (DI) RNAs resulted in the publication of the complete sequence and molecular characterization of the L RNA of Tomato chlorotic spot virus (TCSV). In this chapter, the molecular evolution analysis of the Tospovirus genus based on L protein phylogeny is shown to provide higher resolution and confidence values for the evolutionary history of the Tospovirus, rather than N protein based analysis. Therefore, the L gene could be used as an alternative and/or additional parameter in the taxonomy of the Tospovirus genus. Chapter 3 presents the preliminary results on the development of a reverse genetics systems for the tospoviruses based not on the construction of infectious cDNA clones, but on the replication and expression of DI-derived mini-genomes via in planta T7 RNA Polymerase-dependent transcription and helper virus infectious cycle incorporation. The preliminary results showed that the T7 polymerase system was able to transcribe DI molecules. However, the strategy needs to be optimized to be employed as a tool for studying reverse genetics in the Tospovirus genus

Tese (doutorado)-Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, 2010 / Submitted by claudia teixeira (claudiadtx@gmail.com) on 2011-06-22T00:41:02Z No. of bitstreams: 1 2010_MichelledeSouzaFayadAndré.pdf: 2189113 bytes, checksum: 4432047fddc05f57223bc21a6ba9e232 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2011-06-22T13:50:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_MichelledeSouzaFayadAndré.pdf: 2189113 bytes, checksum: 4432047fddc05f57223bc21a6ba9e232 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-06-22T13:50:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_MichelledeSouzaFayadAndré.pdf: 2189113 bytes, checksum: 4432047fddc05f57223bc21a6ba9e232 (MD5) / A produção do alho em todo o mundo tem sido afetada por diversos patógenos, dentre eles destaca-se o complexo viral que infecta a cultura causando significativa redução na produção de alho no Brasil. Várias espécies foram identificadas no país, no entanto, os danos causados pelo complexo viral nas células e na fisiologia das plantas infectadas ainda é pouco estudado. São também escassas as informações sobre a ocorrência e prevalência desses patógenos nos diferentes sistemas produtivos de alho no país, estudo que demanda o desenvolvimento de um sistema de detecção viral específico e eficiente. Nesse contexto, o presente trabalho visou desenvolver e adaptar métodos de detecção específicos para as espécies virais do complexo do alho e determinar a ocorrência e prevalência desses patógenos nas regiões produtoras de alho no país. Também foram estudadas as principais alterações fisiológicas morfológicas, bioquímicas e citológicas causadas pelo complexo viral nas plantas infectadas, possibilitando a associação dessas informações com as perdas de produção causadas pela infecção viral. O Capítulo I apresenta uma revisão atualizada dos temas abordados no trabalho com o referencial teórico e as informações científicas disponíveis até o presente. O Capítulo II mostra o desenvolvimento de seis sondas não-radioativas espécie-específicas e uma gênero-específico confeccionadas para a detecção das espécies do complexo viral utilizando hibridização em “Dot-Blot” em membrana de nitrocelulose. Reações de PCR, utilizando primers específicos para as sequencias da CP de seis vírus detectados no país (Potyvirus: Onion yellow dwarf virus- OYDV, Leek yellow stripe virus- LYSV; Allexivirus: Garlic virus C- GarV-C, Garlic virus D- GarV-D e Garlic mite-borne filamentous virus- GarMbFv e Carlavirus: Garlic common latent virus- GarCLV), foram efetuadas para a síntese das sondas específicas marcadas com digoxigenina. Os resultados mostraram que as sondas foram específicas para a detecção do gene da capa protéica de cada espécie viral. Todas as sondas espécie-específicas foram sensíveis para detectar o cDNA do gene da capa protéica de suas respectivas espécies a uma concentração de 0,03 ng/ μL. Entretanto, as mesmas não permitiram a detecção de amostras provenientes de RNA total. Foi demonstrado também, que a técnica de hibridização aumentou a capacidade de visualização dos produtos da PCR auxiliando na maior sensibilidade de detecção dos vírus. Paralelamente ao desenvolvimento das sondas, a técnica de RT-PCR foi desenvolvida para a detecção de amostras provenientes de RNA total, sendo estes resultados, comparados com a detecção sorológica via ELISA. Os resultados obtidos indicaram a maior sensibilidade da RT-PCR na detecção de diversas espécies virais em plantas matrizes provenientes de limpeza clonal, que supostamente deveriam estar livres de vírus. No Capítulo III foi estudada a prevalência e a ocorrência das seis espécies virais em regiões produtoras de alho no Brasil sob diferentes sistemas produtivos. Para isso, amostras de alho foram coletadas nas regiões produtoras para análise via RT-PCR com primers específicos. Os resultados revelaram a ocorrência de Potyvirus (OYDV e LYSV) em todas as regiões. O Carlavirus (GarCLV) ficou restrito as regiões de produção de Cerrado (MG, BA e GO). Em todas as regiões amostradas foi observada, no mínimo, uma espécie de Allexivirus (GarMbFV, GarV-C e GarV-D). A prevalência desses vírus nas regiões produtoras foi relacionada principalmente ao tipo de sistema produtivo e as variedades de alho utilizadas pelos produtores rurais. Foram realizadas avaliações em planta de alho sadias (PS), livres de vírus, e infectadas (PI), com um complexo viral com a finalidade de estudar os efeitos fisiológicos, morfológicos, bioquímicos e citológicos causados pelos vírus. Bulbilhos foram semeados em vasos e 30, 60, 90 dias após plantio (DAP) foram realizadas as avaliações de várias variáveis fisiológicas e bioquímicas durante 3 anos e comparadas estatisticamente. As plantas sadias apresentaram desenvolvimento superior em relação às plantas infectadas. A análise fotossintética revelou que as plantas sadias assimilaram 20% a mais de CO2, do que as plantas infectadas, somente aos 30 DAP. Houve uma redução nos teores de clorofilas a e b, nas três épocas de avaliação, durante os três anos, mas não no teor de carotenóides, para as plantas infectadas. Não se observou diferença significativa na atividade da Rubisco, na produção de açúcares solúveis totais e proteínas totais. A avaliação de amido revelou que as plantas de alho não acumulam amido ou o fazem em baixas concentrações. Este resultado foi confirmado pelas análises citológicas em células de plantas sadias. Além disso, foi observada a presença de aglomerações de compostos lipídicos fora dos cloroplastos normais das células sadias. Em contrapartida, os cloroplastos das células infectadas apresentaram deformação estrutural, acúmulo de substâncias lipídicas, no interior dos mesmos e aumento de volume. Os estudos realizados permitiram desenvolver duas técnicas sensíveis e específicas para auxiliar na diagnose das espécies do complexo viral, determinar a distribuição das espécies do complexo viral prevalente nas regiões produtoras do Brasil em diferentes sistemas produtivos e auxiliar na compreensão das respostas das plantas de alho na ativação de processos metabólicos e possíveis mecanismos envolvidos na defesa contra infecções virais. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Garlic production worldwide is affected by several plant pathogens. Among them, viruses represent one of the main pathogens causing significant crop losses. Several virus species were identified infecting garlic in Brazil, however, the damages caused by the viral complex on the physiology of infected plant and on the host responses to virus infection is poorly understood. The occurrence and prevalence of these virus species in the different garlic-growing regions in Brazil is unknown. For this purpose an efficient and specific-detection method is necessary. Based on the lacking of information, this work aimed to develop a specific technique to detect the virus species infecting garlic, to determine the occurrence and prevalence of these species in the country. In addition, the main physiological, biochemical and cytological alterations caused by virus infection in diseased plants were investigated. The Chapter I present an up-to-date review and the state of the art on this topic. The Chapter II shows the development of six non-radioactive virus-specific probes and one potyvirus-specific probe to detect the virus complex by Dot-blot hybridization. PCR reactions using coat protein specific-primers to the viruses detect in Brazil (Potyvirus: Onion yellow dwarf virus- OYDV, Leek yellow stripe virus- LYSV; Allexivirus: Garlic virus C- GarV-C, Garlic virus D- GarV-D and Garlic mite-borne filamentous virus- GarMbFV and Carlavirus: Garlic common latent virus- GarCLV) were performed to obtain virus-specific Dig-labeled probes. The results showed that the probes were able to specifically detect the viruses (cDNA samples) at a concentration of 0,03 ng/μL. However, this efficiency was limited to detect viruses out of total RNA extracts. The hybridization technique was also able to increase the detection capacity of PCR products by gel-hybridization. Simultaneously, the PCR technique was develop to detect samples of total RNA extracts and these results were compared to serological detection by ELISA. PCR was able to detect several viruses even in tissue culture samples, presumable representing virus-free plants. In Chapter III, the prevalence and occurrence of the six virus species in different garlic-growing areas in Brazil were determined. Garlic bulbs were collected in different producing areas and analyzed by RT-PCR with specific primers. The results revealed the occurrence of Potyvirus (OYDV e LYSV) in all regions. The carlavirus (GarCLV) was restricted to the Cerrado area (MG, BA and GO). In all regions sampled at least one Allexivirus species (GarMbFV, GarV-C and GarV-D) was detected. The virus prevalence in the different regions of Brazil was related with the growing system and garlic varieties employed by the growers. Healthy (HP) and infected (IP) garlic plant were studied in order to elucidate the main physiological, biochemical and cytological alterations caused by virus infection. Plants were analyzed at 30, 60 and 90 days after plantio (DAP) and several physiological and biochemical characteristics were determined and compared. Healthy plants showed higher development than infected ones. The photosynthesis analyzes showed that healthy plants assimilated 20% more CO2, than infected plants only at 30 DAP.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, 2018. / Submitted by Fabiana Santos (fabianacamargo@bce.unb.br) on 2018-10-05T18:17:37Z No. of bitstreams: 1 2018_ThiagoMarquesCosta.pdf: 2214752 bytes, checksum: 27606d84195a210bc279e6daf9613382 (MD5) / Approved for entry into archive by Fabiana Santos (fabianacamargo@bce.unb.br) on 2018-10-09T20:22:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2018_ThiagoMarquesCosta.pdf: 2214752 bytes, checksum: 27606d84195a210bc279e6daf9613382 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-10-09T20:22:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2018_ThiagoMarquesCosta.pdf: 2214752 bytes, checksum: 27606d84195a210bc279e6daf9613382 (MD5) Previous issue date: 2018-10-09 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPQ). / A região Nordeste é a maior produtora de melão no Brasil, contribuindo com cerca de 90% da produção nacional. Os Estados do Rio Grande do Norte e Ceará juntos produzem desde 2010 cerca de 500 mil toneladas/ano em 21.000 ha de área plantada, sendo os maiores estados produtores do país. O Brasil ocupa o 11º lugar no ranking mundial de produção de melão, sendo este fruto um dos mais exportados nos últimos anos no país. No Brasil, as viroses destacam-se entre os principais problemas fitossanitários que afetam as cucurbitáceas, causando redução na qualidade dos frutos e perda significativa na produção. Os principais vírus que infectam o meloeiro são os potyvírus, comovírus, cucumovírus, tospovírus e carlavírus. O “Amarelão do meloeiro” é considerado a principal doença dessa cultura. Essa doença é caracterizada por apresentar forte clorose nas folhas mais velhas e é associada, até então, ao carlavírus Melon yellowing-associated virus (MYaV) como o agente causador. O objetivo deste trabalho foi caracterizar os vírus potenciais candidatos a agente causador do “Amarelão do meloeiro”. Um conjunto de amostras de meloeiro apresentando sintoma de “Amarelão do meloeiro” foi coletado em Mossoró (RN) e Juazeiro (BA) e os ácidos nucleicos purificados foram sequenciados utilizando a tecnologia de Sequenciamento de Nova Geração (NGS) pela plataforma Illumina HiSeq 2000. Foram identificadas em alta frequência sequências com alta identidade ao genoma do carlavírus Melon yellowing-associated virus (MYaV) e ao polerovírus Cucurbit aphid-borne yellows virus (CABYV). Foi elaborada a hipótese de que um desses dois vírus, ou ambos, seja o vírus causador da doença e, portanto, foram caracterizados neste estudo. O isolado de MYaV caracterizado molecularmente foi proveniente de Mossoró sendo denominado isolado M22-MYaV e os isolados de CABYV denominados CABYV-M3 e CABYV-JMB1, de Ceará (CE, perto da cidade de Mossoró) e Juazeiro (BA), respectivamente. A determinação do genoma completo foi realizada a partir de NGS e por sequenciamento pelo método Sanger. O genoma do MYaV possui 9073 bases e codifica seis proteínas: RdRp (ca. 6,2 kb), TGB1 (ca. 0,7 kb), TGB2 (ca. 0,3 kb), TGB3 (ca. 0,2 kb), CP (ca. 1 kb) e NaBp (ca. 0,4 kb). A análise filogenética utilizando a sequência da proteína de replicação (RdRp) do MYaV mostrou que o vírus apresenta maior relacionamento com o carlavírus Sweet potato yellow mottle virus (59,8%), confirmando a classificação do MYaV dentro do gênero Carlavirus. O genoma dos isolados M3 e JMB1 de CABYV é de cerca de 5,7 kbases, codificando sete ORFs: ORF0 (0,7 kb), ORF1 (ca. 1,8 kb), ORF2 (ca. 1,3 kb) , ORF3 (ca. 0,6 kb), ORF3a (ca. 0,1 kb), ORF4 (ca. 0,7 kb) e ORF5 (ca. 0,1 kb). O genoma dos dois isolados de CABYV apresenta 96,8% de identidade em nucleotídeo entre si e 73,7% com a sequência do isolado CABYV-N da França (X76931). A baixa identidade de sequência entre os isolados brasileiros e o francês se deve a uma região de recombinação na extremidade 3’ do genoma compreendendo as regiões que codificam a capa proteica (CP: ORF3 e ORF5) e proteína de movimento (MP: ORF4). O major parent do recombinante foi identificado como CABYV na análise, mas o minor parent não foi identificado dentro do conjunto de sequências de vírus utilizado. A análise filogenética e do relógio molecular sugere que os isolados M3 e JMB1 são possivelmente originários da França, tendo passado anteriormente pela Espanha e Taiwan. Um ensaio em condições controladas demonstrou que o isolado brasileiro de CABYV é eficientemente transmitido por moscas-brancas (Bemisia tabaci biótipo B), apesar de ser classificado como um polerovírus que é tipicamente transmitido por afídeos. Foi possível produzir antissoro específico ao isolado brasileiro de CABYV, que se mostrou útil para testes de detecção por DAS-ELISA. Este estudo apresenta o genoma completo do MYaV e a caracterização molecular e filogenética de novos isolados de CABYV em meloeiro no Brasil e mostra evidências que um membro da família Luteoviridae pode ser transmitido por Bemisia tabaci. / The Northeast region is the largest melon producer in Brazil, accounting for around 90% of the national production. Since 2010, together, the states of Rio Grande do Norte and Ceará have produced around 500,000 tons / year in 21,000 hectares of planted area, being the largest producing state in the country. Brazil occupies the 11th place in the world ranking of melon production, being one of the most exported fruit in recent years. In Brazil, viruses are among the main phytosanitary problems affecting cucurbits, causing a reduction in fruit quality and a significant loss of production. The major viruses that infect melon plants are potyviruses, cucumoviruses, tospoviruses and carlaviruses. "Amarelão do meloeiro”, meaning melon severe yellowing, is considered as the main disease of this crop. This disease is characterized by the occurrence of strong chlorosis in the older leaves of infected plants and is associated with Melon yellowing-associated virus (MYaV) as the causative agent. The objective of this work was to characterize potential virus candidates for the causative agent of "Amarelão do meloeiro". A set of melon samples showing "Amarelão do meloeiro" symptom was collected in Mossoró (state of Rio Grande do Norte) and Juazeiro (Bahia) and purified nucleic acids were sequenced using the Next Generation Sequencing (NGS) technology by the Illumina HiSeq 2000 platform. Sequences of the genome of the carlavirus Melon yellowing-associated virus (MYaV) and the polerovirus Cucurbit aphid-borne yellows virus (CABYV) were found in high frequency. It was hypothesized that one of these two viruses, or both, is the virus that causes the disease and, therefore, were characterized in this study. Molecular characterized MYaV isolate was derived from Mossoró being named M22-MYaV isolate and the CABYV isolates were named CABYVM3 and CABYV-JMB1, collected in Ceará (near the city of Mossoró) and Juazeiro (Bahia), respectively. Determination of the complete genome sequence was performed by NGS and by sequencing by the Sanger method. MYaV genome has 9073 bases and encodes six proteins: RdRp (ca. 6.2 kb), TGB1 (ca. 0.7 kb), TGB2 (ca. 0.3 kb), TGB3 (ca. 0.2 kb), CP (ca. 1 kb) and NaBp (ca. 0.4 kb). Phylogenetic analysis using the MYaV replication protein sequence (RdRp) showed that the virus was closely related to the carlavirus Sweet potato yellow mottle virus (59.8%), confirming the classification of MYaV within the genus Carlavirus. The genome of the CABYV M3 and JMB1 isolates is ~ 5.7 kbases, encoding seven ORFs: ORF0 (0.7 kb), ORF1 (ca. 1.8 kb), ORF2 (ca. ORF3 (ca. 0.6 kb), ORF3a (ca. 0.1 kb), ORF4 (ca. 0.7 kb) and ORF5 (ca. 0.1 kb). The genome of the two CABYV isolates shares 96.8% nucleotide identity to each other and 73.7% to the CABYV-N isolate from France (X76931). The low sequence identity between the Brazilian and French isolates is due to a region of recombination at the 3' end of the genome comprising the regions encoding the coat protein (CP: ORF3 and ORF5) and movement protein (MP: ORF4). The major parent of the recombinant was identified as CABYV in the analysis, but the minor parent was not identified within the set of virus sequences used. Phylogenetic and molecular clock analyses suggest that the M3 and JMB1 isolates are possibly from France, having previously passed through Spain and Taiwan. A transmission test performed under controlled conditions has demonstrated that CABYV Brazilian isolate is efficiently transmitted by whiteflies (Bemisia tabaci biotype B), although it is classified as a polerovirus, that is typically transmitted by aphids. It was possible to produce a specific antiserum to the Brazilian CABYV isolate, which proved useful for DAS-ELISA detection tests. This study presents the complete genome of MYaV and the molecular and phylogenetic characterization of new isolates of CABYV in melon in Brazil and shows evidence that a member of the family Luteoviridae can be transmitted by Bemisia tabaci.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2013 / Submitted by Cristiane Mendes (mcristianem@gmail.com) on 2014-11-20T15:57:11Z No. of bitstreams: 1 2013_AdrianaRibeiroSilvaBatista.pdf: 1047867 bytes, checksum: 12e3ae6bf0f048123f1ab86e90f87883 (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2014-11-25T11:23:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_AdrianaRibeiroSilvaBatista.pdf: 1047867 bytes, checksum: 12e3ae6bf0f048123f1ab86e90f87883 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-25T11:23:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_AdrianaRibeiroSilvaBatista.pdf: 1047867 bytes, checksum: 12e3ae6bf0f048123f1ab86e90f87883 (MD5) / Pepper ringspot virus (PepRSV) é um tobravírus, até o momento, detectado somente no Brasil, que destaca-se dentro do gênero por apresentar curiosa associação entre as partículas virais e mitocôndrias do hospedeiro. Os poucos avanços descritos desde a década de 60 aos dias atuais não foram suficientes para demonstrar o mecanismo físico-químico que explica essa relação. Na tentativa de ampliar o campo de estudo em PepRSV, buscou-se contruir um cDNA infeccioso visando o desenvolvimento de uma ferramenta capaz de expressar proteínas heterólogas ou induzir o silenciamento gênico: “virus induced gene silencing” (VIGS). Essa tecnologia visa a mesma aplicabilidade do cDNA infeccioso de Tobacco rattle virus (TRV), que já apresentou resultados significativos na indução de VIGS, contudo não pode ser utilizado livremente no Brasil, pois esse vírus é conhecido como praga quarentenária no País. Por essa razão, o uso de TRV em território brasileiro é restrito, principalmente pela dificuldade na obtenção de uma autorização de uso. O PepRSV apresenta genoma bipartido de RNA fita simples. Durante a obtenção do clone desse vírus a ser utilizado como ferramenta molecular, os dois segmentos completos do RNA genômico foram clonados em vetores plasmidiais comerciais (pGEM-T Easy; pCR4) e modificados, em seguida, com a adição do promotor 35S de Cauliflower mosaic virus (CaMV) na extremidade 5' e uma sequência de ribozima na região 3' do genoma de cada segmento. Além da construção dessa ferramenta, propõe-se avaliar a variabilidade do RNA2 de PepRSV, estudos que, atualmente, está restrito a um único isolado. Dois isolados de PepRSV (Pivo4 e Lavrinha) obtidos em campos de tomateiro no município de Luziânia do Estado de Goiás foram utilizados nesse estudo. O RNA2, segmento genômico destes isolados foi sequenciado. A análise filogenética baseada na comparação de sequências de aminoácidos (aa) da capa proteica dos três isolados (Pivo4, Lavrinha e CAM) de PepRSV não separou Pivo4 e Lavrinha do isolado CAM, pois a inferência do algoritmo correspondente bootstrap foi irrelevante. Os isolados obtidos foram semelhantes ao isolado CAM e apresentaram ORF para capa proteica (CP), mas não apresentaram homólogos das ORFs 2a e 2b presentes em isolados da espécie tipo TRV que pertence ao mesmo gênero. A comparação entre os três isolados sugere a presença de uma inserção a downstream a ORF do CP nos isolados Pivo4 e Lavrinha em relação ao isolado CAM e também uma recombinação na região 3' UTR entre as moléculas de RNA2 e RNA1 dessesisolados. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Pepper ringspot virus is a Tobravirus until now detected only in Brazil. It is a peculiar virus due to the occurrence of a curious association between viral particles and their host mitochondria. From the 60's to the present day, no studies have been able to demonstrate the physicochemical mechanism underlying this relationship. In an attempt to broaden the studies on PepRSV, it was planned to construct na infectious cDNA clone to be used as a viral vector for expression of heterologous proteins or a virus induced gene silencing (VIGS) vector. It is proposed the construction of an infectious cDNA of PepRSV with a similar applicability of the Tobacco rattle virus (TRV) vector. It is already shown that this vector is useful in the induction of VIGS. The TRV vector cannot be used in Brazil, because it is a quarantine pest. Hence the use of TRV in Brazil is extremely limited, mainly due to the difficulty of obtaining a permission to use in the Brazilian territory. The virus has a bipartite genome of single strand RNA components. During the construction development, the two complete segments of the genome of PepRSV were cloned in plasmid vectors (pGEM-T Easy; pCR4) and modified to contain a promoter 35 of Cauliflower mosaic virus in the 5' end and a ribozyme sequence in the 3' region of the genome of each segment. Additionally to this construction for infectious clones, we propose to assess the variability of the PepRSV RNA2, which was restricted to a single isolate. Two PepRSV isolates (Pivo4 and Lavrinha) obtained in tomato fields in the county of Luziânia, Goiás State. The genome segment (RNA 2) of these isolates was sequenced. Phylogenetic analysis based on the amino acid sequences of coat protein (CP) among three isolates did not separate those isolates in different ramifications due to lower bootstrap value. The isolates obtained were in agreement as CAM isolate for coat protein (CP) ORF feature, but do not showed homologous ORFs2a and 2b present in TRV isolates of the Tobravirus type species. By sequence comparison, Pivo4 and Lavrinha isolates had presentedlarge nucleotides insertion downstream of CP ORF as opposed to CAM isolate suggesting a recombination in 3'UTR between RNA1 and RNA2 of each isolate.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, 2013. / Submitted by Tania Milca Carvalho Malheiros (tania@bce.unb.br) on 2013-06-19T13:34:03Z No. of bitstreams: 0 / Rejected by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br), reason: on 2013-06-19T13:34:41Z (GMT) / Submitted by Tania Milca Carvalho Malheiros (tania@bce.unb.br) on 2013-06-19T13:39:53Z No. of bitstreams: 1 2013_DanielaDamascenoXavierFerro_Parcial.pdf: 1954850 bytes, checksum: 6f8527c2a0e9d045508e774284edb0f7 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-08-01T15:54:36Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_DanielaDamascenoXavierFerro_Parcial.pdf: 1954850 bytes, checksum: 6f8527c2a0e9d045508e774284edb0f7 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-08-01T15:54:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_DanielaDamascenoXavierFerro_Parcial.pdf: 1954850 bytes, checksum: 6f8527c2a0e9d045508e774284edb0f7 (MD5) / O tomateiro (Solanum lycopersicum L.) é uma das hortaliças mais importantes no Brasil, sendo também uma das culturas que mais sofrem danos pelo ataque de diversos patógenos, com especial destaque para as diferentes espécies do gênero Begomovirus (família Geminiviridae). Um dos métodos de controle mais promissores tem sido o uso de cultivares contendo genes de resistência. O locus dominante Ty-1 (introgredido da espécie selvagem S. chilense) tem sido a principal fonte de resistência empregada nos programas de melhoramento genético no mundo. Acessos e linhagens contendo o locus Ty-1 apresentam resistência/tolerância a begomovírus monopartidos do complexo do Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) e para alguns vírus do complexo de espécies de genoma bipartido presente no Brasil, incluindo o Tomato severe rugose virus (ToSRV). O presente trabalho teve como objetivo avaliar o efeito na expressão fenotípica da resistência em tomateiros com distintas dosagens/configurações alélicas do locus Ty-1 (homozigotas dominantes, heterozigotas e homozigotas recessivas) após inoculação com um isolado de ToSRV (Capítulo 2) e identificar em duas populações de mapeamento marcadores RAPD ( Random Amplified Polymorphic ) ( Sequence Characterized Amplified Region ) com ampla utilização em sistemas de seleção assistida de diferentes eventos de introgressão do locus Ty-1 (Capítulo 3). As notas de severidade atribuídas às plantas que continham o locus dominante Ty-1 em dupla dosagem (homozigotas resistentes) foram significativamente mais baixas do que as que continham apenas uma cópia do locus (heterozigotas). Por sua vez, plantas heterozigotas apresentaram notas mais baixas que as plantas duplo-recessivas (ty-1/ty-1). Os resultados indicam aos programas de melhoramento do tomateiro que híbridos com uma melhor expressão fenotípica da tolerância/resistência ao ToSRV devem, sempre que possível, apresentar o alelo dominante Ty-1 em homozigose. No Capítulo 3, seis primers RAPD foram selecionados gerando polimorfismos para a região contendo o locus Ty-1 exclusivamente para população #1; quatorze foram exclusivamente polimórficos na população #2 e nove detectaram polimorfismos nas duas populações. Um marcador SCAR codominante (heteroduplex) foi gerado a partir do marcador RAPD OPC-19. A análise de sequência e sua ancoragem no genoma do tomateiro confirmaram que esse marcador está localizado na mesma região do locus Ty-1 no cromossomo 6, recomendando o seu uso em sistemas de seleção assistida. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The tomato (Solanum lycopersicum L.) is one of the most important vegetable crops in Brazil and it is also the one that suffer the most with the attack of many pathogens, especially virus species from the genus Begomovirus (Geminiviridae family). The most promising control strategy has been the employment of cultivars with resistance/tolerance genes to this group of pathogens. The dominant locus Ty-1 (introgressed from the wild species S. chilense) has been one of the most important sources of resistance in tomato breeding programs throughout the world. Accessions and inbred lines carrying this locus display high levels of resistance to monopartite begomovirus species of the Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) complex and also against some viruses of the bipartite species complex from Brazil, including Tomato severe rugose virus (ToSRV). The objectives of the present work were to evaluate the effect on the phenotypic expression after inoculation with one ToSRV isolate in tomato plants carrying distinct dosages/allelic states of the locus Ty-1 (homozygous resistant, heterozygous, and homozygous recessive) (Chapter 2) and to identify in two mapping populations novel and robust RAPD ( Random Amplified Polymorphic DNA ) ( Sequence Characterized Amplified Region ) Ty-1 that would be suitable for employment in distinct assisted-selection programs (Chapter 3). The group of plants with double dominant locus dosage (homozygous resistant) had a disease grade significantly lower than that of heterozygous plants in both evaluations. Heterozygous plants had also superior performance when compared with plants displaying double recessive locus dosage (ty-1/ty-1). Our results indicate to breeding programs that F1 hybrids should have, whenever possible, both parental lines with the Ty-1 locus in homozygous condition in order to have the best phenotypic expression of tolerance/resistance against ToSRV isolates. In Chapter 3, six RAPD primers were selected due to the presence of polymorphic amplicons for the genomic region encompassing the locus Ty-1 exclusively for population #1; fourteen primers were able to detect polymorphic amplicons exclusively in population #2 and nine were able to detect polymorphic markers in both populations. One SCAR amplicon (derived from RAPD OPC-19) generated a marker with a peculiar heteroduplex and codominant pattern. The sequence analysis of the SCAR allowed us to anchor this marker in the physical map that corresponds iv to a region where the Ty-1 locus resides on tomato chromosome 6. Therefore, the use of this marker can be also recommended for employment in marker-assisted selection systems.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Departamento de Fitopatologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade de Brasília, Brasília, 2013. / Texto parcialmente liberado pelo autor. Conteúdo: foi restrito o capítulo 3. / Submitted by Tania Milca Carvalho Malheiros (tania@bce.unb.br) on 2013-08-09T15:31:10Z No. of bitstreams: 1 2013_MarianaResendeMachado_Parcial.pdf: 2324547 bytes, checksum: 8d0c6777ef4824c6ee8daf0bcf70851f (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-08-16T14:28:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_MarianaResendeMachado_Parcial.pdf: 2324547 bytes, checksum: 8d0c6777ef4824c6ee8daf0bcf70851f (MD5) / Made available in DSpace on 2013-08-16T14:28:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_MarianaResendeMachado_Parcial.pdf: 2324547 bytes, checksum: 8d0c6777ef4824c6ee8daf0bcf70851f (MD5) / A família Geminiviridae é caracterizada por espécies virais com partículas de morfologia geminada e genoma composto por DNA circular de fita simples, sendo o gênero Begomovirus o mais importante em termos de número de espécies e impacto econômico. Os begomovírus do Novo Mundo, em sua maioria, possuem dois componentes genômicos (DNA-A e DNA-B), são transmitidos por Bemisia tabaci (mosca-branca) e infectam plantas dicotiledôneas. A forma mais eficiente de controle tem sido o emprego de cultivares resistentes ao vírus e/ou ao vetor. No entanto, os dados referentes à eficiência e ao espectro da resposta das diferentes fontes de resistência para as espécies que compõe o complexo de begomovírus bipartidos do Brasil ainda são escassos. Os principais fatores de resistência empregados têm sido os loci Ty-1 e Ty-3 derivados de S. chilense. No entanto, a linhagem ‘TX-468-RG’ (portadora do gene recessivo tcm-1) derivada de ‘Tyking’ tem se destacado entre as diversas fontes por apresentar elevados níveis de resistência contra uma ampla gama de espécies de begomovírus de genoma bipartido do Brasil e monopartido da Europa. A estratégia de piramidização de genes de resistência aos begomovírus, para ser eficiente, requer o uso de marcadores moleculares em sistemas de melhoramento assistido para monitorar a incorporação de diferentes loci (dominantes e recessivos), especialmente por eles conferem idêntico fenótipo. No entanto, até o presente momento, não foram desenvolvidos trabalhos visando identificar a localização cromossômica ou desenvolver marcadores moleculares para monitorar a incorporação do locus tcm-1 em programas de seleção assistida. No Capítulo 2, a linhagem ‘TX-468-RG’(controle resistente) e cinco novas fontes/acessos de S. lycopersicum que se mostraram como promissoras fontes em ensaios conduzidos em telado e campo (‘LAM 100’, ‘LAM 156’, ‘LAI 132’, ‘H-24’ e ‘Ty-198’) foram inoculadas via bombardeamento de micropartículas com clones infectivos de quatro espécies do complexo de begomovírus bipartidos do Brasil: Tomato severe rugose virus (ToSRV); Tomato rugose mosaic virus (ToRMV); Tomato yellow vein streak virus (ToYVSV) e Tomato chlorotic mottle virus (ToCMoV). A cultivar ‘Viradoro’ foi utilizada como controle suscetível. A acumulação do DNA viral nos diferentes acessos foi monitorada via Southern Blot. ‘Viradoro’ apresentou sintomas severos e alto acúmulo de DNA para todos os vírus. O acesso ‘H-24’ (fonte do locus Ty-2 introgredido de S. habrochaites) se mostrou suscetível ao ToSRV e ToRMV. A linhagem ‘LAI 132’ mostrou resistência efetiva apenas contra ToCMoV. ‘TX-468-RG’ e os acessos ‘LAM 100’, ‘LAM 156’ e ‘Ty-198’ foram resistentes a todas as espécies virais, sendo, portanto, recomendados como fontes preferenciais em programas de melhoramento, para incorporar fatores de resistência de mais amplo espectro. Uma análise foi conduzida com um painel de marcadores moleculares ligados aos principais loci de resistência a begomovírus caracterizados em tomateiro (Ty-1, Ty-2, Ty-3, Ty-4 e Ty-5/ty-5). Os resultados indicaram que os acessos ‘LAI 132’, ‘LAM 100’, ‘LAM 156’ e ‘Ty-198’ representam fontes de novos genes e/ou alelos de resistência. No Capítulo 3 o objetivo foi identificar e ancorar marcadores moleculares associados com o gene/locus tcm-1 no genoma-referência do tomateiro, permitindo a localização física desse fator de resistência. Os resultados da análise de uma população F2 segregando para reação a um isolado do ToSRV e da caracterização molecular de um painel de marcadores do tipo SCAR e CAPS associados com a resistência indicaram que o gene tcm-1 está localizado no topo do cromossomo 6. O locus tcm-1 se encontra em ligação estreita com um grupamento (‘cluster’) de genes de resistência que engloba a região genômica contendo os genes Ty-1 e Mi. Recentemente, um locus recessivo no cromossomo 4 controlando resistência a isolados da espécie de genoma monopartido Tomato yellow leaf curl virus foi reportado na Flórida. Essa região genômica contem o gene dominante Ty-5 e uma provável variante alélica de natureza recessiva (também derivada do híbrido ‘Tyking’) nomeada como ty-5. Embora polimórficos na população de mapeamento utilizada no presente trabalho, os marcadores moleculares para o locus Ty-5/ty-5 não se mostraram associados com a resposta de resistência ao ToSRV. Desta forma, nossos resultados indicam que tcm-1 e Ty-5/ty-5 são fatores genéticos distintos e que o híbrido ‘Tyking’ (fonte original do locus tcm-1) pode representar uma pirâmide de diferentes genes recessivos do tipo espécie-específico que, quando em associação, se mostram efetivos contra uma ampla gama de espécies de Begomovirus de genoma monopartido e bipartido de diferentes continentes. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The Geminiviridae family is composed by virus species with geminated particles and circular, single-stranded DNA genome. The genus Begomovirus is the most important within this family in terms of number of species as well as in economic impact. The majority of begomoviruses from the New World has two genomic components (DNA-A and DNA-B), and they are transmitted to dicotyledonous plants by the whitefly Bemisia tabaci. The most efficient disease control strategy is the employment of cultivars with genetic resistance to either the virus or its vector. However, the amount of information available about the phenotypic expression, as well as the spectrum of efficiency of the distinct Solanum (section Lycopersicon) resistance sources to Brazilian begomovirus is still limited. So far, the Ty-1 and Ty-3 loci (introgressed from accessions of the wild species S. chilense) are the most employed resistance factors. The inbred line ‘TX-468-RG’ derived from the hybrid S. lycopersicum ‘Tyking’ is one of the most important sources of wide-spectrum resistance, being effective against a wide range of begomovirus isolates from both bipartite species from Brazil and monopartite species from Europe. To increase the efficiency of the pyramidization process, the establishment of a marker assisted selection system to all known (dominant and recessive) begomovirus resistance loci is necessary. However, molecular markers are still not available for the tcm-1 locus and even its genomic location is yet unknown. In Chapter 2, ‘TX-468-RG’ (resistant control due to presence of the recessive locus tcm-1) and five new accessions identified as promising sources of resistance in assays conducted under either greenhouse orfield conditions (named as ‘LAM 100’, ‘LAM 156’, ‘LAI 132’, ‘H-24’ and ‘Ty-198’), were evaluated in biolistic assays with infective clones of four begomovirus of the Brazilian complex virus: Tomato severe rugose virus (ToSRV); Tomato rugose mosaic virus (ToRMV); Tomato yellow vein streak virus (ToYVSV) and Tomato chlorotic mottle virus (ToCMoV). The tomato cultivar ‘Viradoro’ was employed as susceptible control. Virus accumulation was monitored in all accessions via Southern Blot assays using a universal probe. ‘Viradoro’ displayed severe symptoms and high viral DNA accumulation in all assays. The line ‘H-24’ (source of Ty-2 locus introgressed from S. habrochaites) displayed a susceptible reaction to ToSRV and ToRMV. The accession ‘LAI 132’ displayed a peculiar species-specific resistant reaction only to ToCMoV. The ‘TX-468-RG’ as well as the accessions ‘LAM 100’, ‘LAM 156’ and ‘Ty-198’ were resistant to all virus species, being, therefore, recommended for preferential use in breeding programs aiming to develop lines with wider spectrum of resistance. Analyses conducted with a panel of molecular markers linked to all currently characterized begomovirus resistance loci in tomato (Ty-1, Ty-2, Ty-3, Ty-4 e Ty-5/ty-5) indicated that ‘LAI 132’, ‘LAM 100’, ‘LAM 156’ and ‘Ty-198’ are sources of either new genes or alleles for begomovirus resistance. In Chapter 3, molecular markers were developed in association with tcm-1 and were anchored in the reference tomato genome, aiming to develop efficient marker-assisted selection systems for this locus. Co-segregation analyses of an F2 population inoculated with an ToSRV isolate and the molecular characterization of a panel of SCAR and CAPS markers linked to the resistant reaction indicated that tcm-1 is located on the top of the chromosome 6 in linkage with a the well-characterized cluster of resistance genes, encompassing the Ty-1 and Mi loci. More recently, a recessive resistance to Florida isolates of the monopartite Tomato yellow leaf curl virus was also was characterized in inbred lines derived from the hybrid ‘Tyking’. This gene and its putative allelic variant (located in chromosome 4) have been tentatively named as Ty-5/ty-5. Even though polymorphic in our mapping population, the molecular marker linked with the Ty-5/ty-5 genomic region segregated independently from the resistant reaction to ToSRV. Therefore, our results indicated that tcm-1 and Ty-5/ty-5 are distinct resistance factors, and that ‘Tyking’ (the original source of the locus tcm-1) might represent a pyramid of distinct Begomovirus species-specific recessive genes, that in association might confer effective reaction observed against a range of monopartite and bipartite species in distinct continents.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, 2009. / Submitted by Allan Wanick Motta (allan_wanick@hotmail.com) on 2010-03-10T15:40:01Z No. of bitstreams: 1 2009_CristianeLopesdeOliveira.pdf: 723424 bytes, checksum: 1df9631ff7757bb5507a5df1735a30ad (MD5) / Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2010-04-29T22:19:01Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_CristianeLopesdeOliveira.pdf: 723424 bytes, checksum: 1df9631ff7757bb5507a5df1735a30ad (MD5) / Made available in DSpace on 2010-04-29T22:19:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_CristianeLopesdeOliveira.pdf: 723424 bytes, checksum: 1df9631ff7757bb5507a5df1735a30ad (MD5) Previous issue date: 2009 / O amendoim-bravo (Euphorbia heterophylla) é uma importante planta daninha em diversos países por interferir na produção de plantas cultiváveis e por servir como reservatório de vírus de plantas. O objetivo desse trabalho foi estudar a diversidade dos begomovírus coletados em amendoim-bravo e caracterizar molecular e biologicamente um isolado permitindo a sua completa identificação. Sete amostras de amendoim-bravo foram coletadas apresentando sintomas de mosaico amarelo em diferentes cidades do estado de Goiás e Distrito Federal. Elas foram avaliadas por PCR usando primers universais para begomovírus, que confirmou que todas as sete amostras estavam infectadas. As amostras de DNA foram utilizadas para a realização da amplificação via círculo rolante (RCA) utilizando a enzima phi-29 DNA polimerase. Cada produto amplificado foi digerido com uma enzima de restrição que cortou o DNA em apenas um único ponto e foi clonado no vetor pBluescript (Stratagene). As sequências completas de ambos os componentes (oito clones de DNA-A e três clones de DNA-B) foram obtidas usando primers para o vetor e primers internos em seqüenciador automático. Para a caracterização biológica, clones infecciosos foram preparados e inoculados através de bombardeamento de partículas em plantas cultivadas e daninhas. A infecção foi confirmada por PCR em plantas de Capsicum annuum, Datura stramonium, Nicotiana benthamiana e Euphorbia heterophylla. Todas as oito sequências do DNA-A compartilham uma identidade 86,9% com o Euphorbia mosaic virus Peru (acesso AM886131; sequência de begomovírus mais próxima ao vírus), enquanto que o DNA-B compartilha uma identidade nucleotídica 61,6% com o Tomato commom mosaic virus (acesso NC_010836). De acordo com o Comitê Internacional de Taxonomia de Vírus (ICTV), um vírus é considerado como uma nova espécie quando a identidade de sequência do DNA-A com outro vírus é menor que 89%, sugerindo que esse vírus é distinto do Euphorbia mosaic virus Peru. Portanto, de acordo com os critérios estabelecidos pelo ICTV, o vírus caracterizado nesse trabalho pode ser considerado uma nova espécie do gênero Begomovirus, sendo o nome Euphorbia yellow mosaic virus proposto. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The “amendoim-bravo” (Euphorbia heterophylla; also known as painted euphorbia) is an important weed in several countries, interferes in the production of cultivated plants, and has a great potential as a reservoir of plant viruses. The objective of this study was to study the diversity of begomoviruses that infect “amendoim-bravo” plants, and characterize molecular and biologically one isolate enabling its complete identification. Seven samples were collected of “amendoim-bravo” showing yellow mosaic at distinct localities in Goiás State and Federal District/Brazil. They were tested by PCR using universal begomovirus primers and it was confirmed that all seven samples were positively infected. These DNA samples were used as template for rolling circle amplification (RCA) using the enzyme phi-29 DNA polymerase. Each amplified product was digested with a single-cutting restriction enzyme and cloned into pBluescript vector (Statagene). The complete sequence of both components (eight DNA-A clones and three DNA-B clones) were obtained using internal and vector primers. For the biological characterization, infectious clones were prepared and inoculated by particle bombardment to cultivated plants and weeds. The infection was confirmed by PCR in plants of Capsicum annuum, Datura stramonium, Nicotiana benthamiana and Euphorbia heterophylla. All eight DNA-A sequences shared 86,9% nucleotide identity with Euphorbia mosaic virus Peru (accession AM886131, the most closely related begomovirus sequence), while DNA-B shared 61,6% nucleotide identity with Tomato commom mosaic virus (accession NC_010836). According to the International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV) a virus is considered as a new species when the sequence identity with another virus is less than 89%, suggesting that it is distinct from Euphorbia mosaic virus Peru. Therefore, according to the criteria established by the ICTV, the viruses characterized in this work can be considered as a new species within the genus Begomovirus, and the name Euphorbia yellow mosaic virus is proposed.

Orientador: Renate Krause-Sakate / Coorientador: Julio Massaharu Marubayashi / Banca: Marcelo Agenor Pavan / Banca: Valdir Atsushi Yuki / Resumo: A mosca-branca, Bemisia tabaci Gennadius (Hemiptera: Aleyrodidae) é uma das mais importantes pragas e, além disso, é vetora de vírus de plantas. B. tabaci é comumente classificada como um complexo de espécies crípticas, das quais se destacam as duas espécies invasivas, Middle East-Asia Minor 1 (MEAM1), predominante no Brasil, e a espécie Mediterranean (MED), recentemente detectada no país. Para a espécie MED se desconhece sua habilidade na transmissão de vírus encontrados no Brasil. Diante disso, o objetivo desse trabalho foi avaliar o potencial de transmissão do carlavírus Cowpea mild mottle virus (CpMMV); do crinivírus Tomato chlorosis virus (ToCV) e dos begomovírus Tomato severe rugose virus (ToSRV) e Bean golden mosaic virus (BGMV). Para aquisição do vírus pela espécie MED e MEAM1, o período de acesso de aquisição (PAA) e o período de acesso de inoculação (PAI) foram de 24h no escuro a 30°C, utilizando-se dez insetos por planta testada. Os ensaios de transmissão demonstram que a população da espécie MED abrigando 97 % de Hamiltonella, 33 % de Rickettsia e 12 % de Arsenophonus de endossibiontes secundários, denominada de MED2, transmitiu o BGMV e o CpMMV com 100 % de eficiência, enquanto que a população de MED ( MED1) contendo 14 % de Hamiltonella e 29 % de Rickettsia transmitiu o BGMV e o CpMMV com 56,6 % e 53,3 % de eficiência, respectivamente. Comparativamente a espécie MEAM1 com 98 % deHamiltonella e 91 % de Rickettsia transmitiu o BGMV e o CpMMV com 90% de eficiênci... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The whitefly, Bemisia tabaci Gennadius (Hemiptera: Aleyrodidae) is one of the most important agriculture pests and also is a virus vector. B. tabaci is considered a complex of criptic species, and Middle East-Asia Minor 1 (MEAM1, formerly known as biotype B) and Mediterranean (MED, biotype Q), are highlighted as the most invasive in world. The ability of MED species, to transmit Brazilian viruses was investigated in this work. The transmission of the carlavirus Cowpea mild mottle virus (CpMMV), the crinivirus Tomato chlorosis virus (ToCV) and the begomovirus Tomato severe rugose virus (ToSRV) and Bean golden mosaic virus (BGMV) was tested by MEAM1 and MED, comparatively. The acquisition access period (AAP) and the inoculation access peiod (IAP) used were of 24h, in the dark conditions at 30°C, using 10 insects per plant tested. The transmission assays demonstred that the population of the MED speciesthat harbor 97 % of Hamiltonella, 33 % of Rickettsia and 12 % of Arsenophonus secondary endosymbionts, denominated MED2, transmitted the BGMV and the CpMMV with 100 % efficiency, while the MED (MED1) population with 14 % of Hamiltonella and 29 % of Rickettsia transmitted the BGMV and the CpMMV with 56,6 % and 53,3 % efficiency, respectively. Comparatively, the MEAM1 species with 98 % ofHamiltonella and 91 % of Rickettsia transmitted the BGMV and the CpMMV with 90% of efficacy.In relation to the ToSRV, both MED populations tested transmitted this begomovirus with 83,3 % efficiency, while the MEAM1 species transmitted with 80 % efficiency. The crinivirus ToCV was transmitted by MED1 and MED2 with 93,3 % and 83,3 % efficiency, respectively, and with 80% efficiency by MEAM1. The transmission assays showed that the Mediterranean species, detected recently in Brazil, is an excelent vector of the whitefly transmitted viruses found in Brazil. / Mestre