Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2015-03-24T20:05:33Z No. of bitstreams: 1 2014_KellyBarretoRodrigues.pdf: 3583484 bytes, checksum: 01cf3950732343dfd985e0d7fcb94d0d (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2015-05-04T12:43:36Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_KellyBarretoRodrigues.pdf: 3583484 bytes, checksum: 01cf3950732343dfd985e0d7fcb94d0d (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-04T12:43:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_KellyBarretoRodrigues.pdf: 3583484 bytes, checksum: 01cf3950732343dfd985e0d7fcb94d0d (MD5) / Pepper ringspot virus (PepRSV) é um tobravírus e foi originalmente isolado no Brasil de plantas de Capsicum spp., que apresentavam sintomas de manchas anelares. As partículas são alongadas e rígidas e o seu genoma possui dois segmentos de RNA fita simples e senso positivo. Uma particularidade que o distingue de outros vírus conhecidos é a associação constante de suas partículas com as mitocôndrias do hospedeiro. Estudos preliminares in silico da proteína viral p29 de PepRSV sugeriram ser esta a proteína candidata a apresentar alguma interação com mitocôndrias. A capa proteica (CP) é a segunda candidata, por também estar presente na superfície das partículas virais, que se associam com mitocôndrias. Baseando-se nestas premissas, a interação das proteínas virais p29 e CP com a mitocôndria foi estudada, utilizando a estratégia de fusão da proteína-alvo com proteínas fluorescentes GFP ou YFP (Green/Yellow Fluorescent Protein), respectivamente, em vetores binários. Estas construções foram agro-inoculadas em folhas de Nicotiana benthamiana e as localizações subcelulares destas proteínas foram observadas em microscópio confocal. P29-GFP mostrou localização na periferia das células, provavelmente nos plasmodesmas, e a CP possivelmente no núcleo. Para confirmar a localização de p29 nos plasmodesmas, um experimento de co-localização foi realizado com a proteína 30 K de TMV, conhecida por se localizar no plasmodesma, e a co-localização de p29 e 30 K foi detectada. O desenvolvimento de clones infecciosos é uma estratégia padrão para estudar funções gênicas de vírus de RNA e é de vital importância para a elucidação da interação das proteínas virais com as mitocôndrias. Sendo assim, este trabalho também apresenta como objetivo a obtenção do clone de cDNA infeccioso de PepRSV. Para tanto, o RNA 2 foi clonado em vetor binário obtido a partir de um vetor de silenciamento gênico induzido por vírus (VIGS) de TRV contendo o promotor 35S duplicado na região 5´ e da ribozima na extremidade 3´. Para a clonagem do RNA 1, o segmento genômico foi dividido em dois fragmentos, que foram clonados em vetores comerciais, sendo então ligados utilizando sítios de enzimas de restrição. Pretende-se que o fragmento correspondente ao RNA 1 seja substituído pelo RNA 2 previamente inserido no VIGS modificado. Este clone infeccioso também poderá ser utilizado como VIGS para estudo básico de funcionamento de genes da planta. __________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Pepper ringspot virus (PepRSV) is a tobravirus and was originally isolated from plants of Capsicum spp., with ringspot symptoms in Brazil. The particles are elongated and rigid and its genome has two segments of single stranded RNA and positive sense. Unique feature that distinguishes it from other known viruses is the specific and organized association of the virus particles with mitochondria of the host cell. Preliminary in silico studies of the viral protein p29 of PepRSV suggested that this is the candidate protein that has some interaction with mitochondria. The coat protein (CP) is the second candidate, since it is also present on the surface of viral particles, which associates with mitochondria. With these assumptions, the interaction of viral proteins p29 and CP with the mitochondria was studied, using the strategy of fusion of the target proteins with fluorescent proteins GFP or YFP (Green / Yellow Fluorescent Protein), respectively, using binary vectors. These constructions were agro-inoculated to Nicotiana benthamiana leaves and the location of both fused proteins was observed with confocal laser microscope. P29-GFP was located in periphery of cells, most likely in plasmodesmata, and CP was probably in nuclei. Aiming to confirm the localization of p29 in plasmodesmata, an experiment of co-localization was performed with 30 K protein of TMV, a movement protein well known to be located in plasmodesma, and colocalization of p29 and 30 K was detected. The development of infectious clones is a standard strategy for RNA viruses to study gene functions and will be critical for elucidating the interaction of viral proteins with the mitochondria. Thus, this work also had the objective of obtaining infectious cDNA clone PepRSV. To this end, the RNA 2 was cloned into binary vector obtained from a vector of virus-induced gene silencing (VIGS) of TRV, which contain the dual 35S promoter in the 5' region and the ribozyme in the 3' end. For cloning of RNA 1, the genome segment was divided into two fragments, which were cloned into commercial vectors and then ligated using restriction enzyme sites. Subsequently, the corresponding RNA fragment 1 will be replaced by the RNA 2 previously inserted in the modified VIGS. This infectious clone can also be used as a VIGS for basic studies of gene function in plants.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2013 / Submitted by Cristiane Mendes (mcristianem@gmail.com) on 2014-11-20T15:57:11Z No. of bitstreams: 1 2013_AdrianaRibeiroSilvaBatista.pdf: 1047867 bytes, checksum: 12e3ae6bf0f048123f1ab86e90f87883 (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2014-11-25T11:23:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_AdrianaRibeiroSilvaBatista.pdf: 1047867 bytes, checksum: 12e3ae6bf0f048123f1ab86e90f87883 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-25T11:23:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_AdrianaRibeiroSilvaBatista.pdf: 1047867 bytes, checksum: 12e3ae6bf0f048123f1ab86e90f87883 (MD5) / Pepper ringspot virus (PepRSV) é um tobravírus, até o momento, detectado somente no Brasil, que destaca-se dentro do gênero por apresentar curiosa associação entre as partículas virais e mitocôndrias do hospedeiro. Os poucos avanços descritos desde a década de 60 aos dias atuais não foram suficientes para demonstrar o mecanismo físico-químico que explica essa relação. Na tentativa de ampliar o campo de estudo em PepRSV, buscou-se contruir um cDNA infeccioso visando o desenvolvimento de uma ferramenta capaz de expressar proteínas heterólogas ou induzir o silenciamento gênico: “virus induced gene silencing” (VIGS). Essa tecnologia visa a mesma aplicabilidade do cDNA infeccioso de Tobacco rattle virus (TRV), que já apresentou resultados significativos na indução de VIGS, contudo não pode ser utilizado livremente no Brasil, pois esse vírus é conhecido como praga quarentenária no País. Por essa razão, o uso de TRV em território brasileiro é restrito, principalmente pela dificuldade na obtenção de uma autorização de uso. O PepRSV apresenta genoma bipartido de RNA fita simples. Durante a obtenção do clone desse vírus a ser utilizado como ferramenta molecular, os dois segmentos completos do RNA genômico foram clonados em vetores plasmidiais comerciais (pGEM-T Easy; pCR4) e modificados, em seguida, com a adição do promotor 35S de Cauliflower mosaic virus (CaMV) na extremidade 5' e uma sequência de ribozima na região 3' do genoma de cada segmento. Além da construção dessa ferramenta, propõe-se avaliar a variabilidade do RNA2 de PepRSV, estudos que, atualmente, está restrito a um único isolado. Dois isolados de PepRSV (Pivo4 e Lavrinha) obtidos em campos de tomateiro no município de Luziânia do Estado de Goiás foram utilizados nesse estudo. O RNA2, segmento genômico destes isolados foi sequenciado. A análise filogenética baseada na comparação de sequências de aminoácidos (aa) da capa proteica dos três isolados (Pivo4, Lavrinha e CAM) de PepRSV não separou Pivo4 e Lavrinha do isolado CAM, pois a inferência do algoritmo correspondente bootstrap foi irrelevante. Os isolados obtidos foram semelhantes ao isolado CAM e apresentaram ORF para capa proteica (CP), mas não apresentaram homólogos das ORFs 2a e 2b presentes em isolados da espécie tipo TRV que pertence ao mesmo gênero. A comparação entre os três isolados sugere a presença de uma inserção a downstream a ORF do CP nos isolados Pivo4 e Lavrinha em relação ao isolado CAM e também uma recombinação na região 3' UTR entre as moléculas de RNA2 e RNA1 dessesisolados. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Pepper ringspot virus is a Tobravirus until now detected only in Brazil. It is a peculiar virus due to the occurrence of a curious association between viral particles and their host mitochondria. From the 60's to the present day, no studies have been able to demonstrate the physicochemical mechanism underlying this relationship. In an attempt to broaden the studies on PepRSV, it was planned to construct na infectious cDNA clone to be used as a viral vector for expression of heterologous proteins or a virus induced gene silencing (VIGS) vector. It is proposed the construction of an infectious cDNA of PepRSV with a similar applicability of the Tobacco rattle virus (TRV) vector. It is already shown that this vector is useful in the induction of VIGS. The TRV vector cannot be used in Brazil, because it is a quarantine pest. Hence the use of TRV in Brazil is extremely limited, mainly due to the difficulty of obtaining a permission to use in the Brazilian territory. The virus has a bipartite genome of single strand RNA components. During the construction development, the two complete segments of the genome of PepRSV were cloned in plasmid vectors (pGEM-T Easy; pCR4) and modified to contain a promoter 35 of Cauliflower mosaic virus in the 5' end and a ribozyme sequence in the 3' region of the genome of each segment. Additionally to this construction for infectious clones, we propose to assess the variability of the PepRSV RNA2, which was restricted to a single isolate. Two PepRSV isolates (Pivo4 and Lavrinha) obtained in tomato fields in the county of Luziânia, Goiás State. The genome segment (RNA 2) of these isolates was sequenced. Phylogenetic analysis based on the amino acid sequences of coat protein (CP) among three isolates did not separate those isolates in different ramifications due to lower bootstrap value. The isolates obtained were in agreement as CAM isolate for coat protein (CP) ORF feature, but do not showed homologous ORFs2a and 2b present in TRV isolates of the Tobravirus type species. By sequence comparison, Pivo4 and Lavrinha isolates had presentedlarge nucleotides insertion downstream of CP ORF as opposed to CAM isolate suggesting a recombination in 3'UTR between RNA1 and RNA2 of each isolate.