Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2013 / Submitted by Cristiane Mendes (mcristianem@gmail.com) on 2014-11-20T15:57:11Z No. of bitstreams: 1 2013_AdrianaRibeiroSilvaBatista.pdf: 1047867 bytes, checksum: 12e3ae6bf0f048123f1ab86e90f87883 (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2014-11-25T11:23:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_AdrianaRibeiroSilvaBatista.pdf: 1047867 bytes, checksum: 12e3ae6bf0f048123f1ab86e90f87883 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-25T11:23:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_AdrianaRibeiroSilvaBatista.pdf: 1047867 bytes, checksum: 12e3ae6bf0f048123f1ab86e90f87883 (MD5) / Pepper ringspot virus (PepRSV) é um tobravírus, até o momento, detectado somente no Brasil, que destaca-se dentro do gênero por apresentar curiosa associação entre as partículas virais e mitocôndrias do hospedeiro. Os poucos avanços descritos desde a década de 60 aos dias atuais não foram suficientes para demonstrar o mecanismo físico-químico que explica essa relação. Na tentativa de ampliar o campo de estudo em PepRSV, buscou-se contruir um cDNA infeccioso visando o desenvolvimento de uma ferramenta capaz de expressar proteínas heterólogas ou induzir o silenciamento gênico: “virus induced gene silencing” (VIGS). Essa tecnologia visa a mesma aplicabilidade do cDNA infeccioso de Tobacco rattle virus (TRV), que já apresentou resultados significativos na indução de VIGS, contudo não pode ser utilizado livremente no Brasil, pois esse vírus é conhecido como praga quarentenária no País. Por essa razão, o uso de TRV em território brasileiro é restrito, principalmente pela dificuldade na obtenção de uma autorização de uso. O PepRSV apresenta genoma bipartido de RNA fita simples. Durante a obtenção do clone desse vírus a ser utilizado como ferramenta molecular, os dois segmentos completos do RNA genômico foram clonados em vetores plasmidiais comerciais (pGEM-T Easy; pCR4) e modificados, em seguida, com a adição do promotor 35S de Cauliflower mosaic virus (CaMV) na extremidade 5' e uma sequência de ribozima na região 3' do genoma de cada segmento. Além da construção dessa ferramenta, propõe-se avaliar a variabilidade do RNA2 de PepRSV, estudos que, atualmente, está restrito a um único isolado. Dois isolados de PepRSV (Pivo4 e Lavrinha) obtidos em campos de tomateiro no município de Luziânia do Estado de Goiás foram utilizados nesse estudo. O RNA2, segmento genômico destes isolados foi sequenciado. A análise filogenética baseada na comparação de sequências de aminoácidos (aa) da capa proteica dos três isolados (Pivo4, Lavrinha e CAM) de PepRSV não separou Pivo4 e Lavrinha do isolado CAM, pois a inferência do algoritmo correspondente bootstrap foi irrelevante. Os isolados obtidos foram semelhantes ao isolado CAM e apresentaram ORF para capa proteica (CP), mas não apresentaram homólogos das ORFs 2a e 2b presentes em isolados da espécie tipo TRV que pertence ao mesmo gênero. A comparação entre os três isolados sugere a presença de uma inserção a downstream a ORF do CP nos isolados Pivo4 e Lavrinha em relação ao isolado CAM e também uma recombinação na região 3' UTR entre as moléculas de RNA2 e RNA1 dessesisolados. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Pepper ringspot virus is a Tobravirus until now detected only in Brazil. It is a peculiar virus due to the occurrence of a curious association between viral particles and their host mitochondria. From the 60's to the present day, no studies have been able to demonstrate the physicochemical mechanism underlying this relationship. In an attempt to broaden the studies on PepRSV, it was planned to construct na infectious cDNA clone to be used as a viral vector for expression of heterologous proteins or a virus induced gene silencing (VIGS) vector. It is proposed the construction of an infectious cDNA of PepRSV with a similar applicability of the Tobacco rattle virus (TRV) vector. It is already shown that this vector is useful in the induction of VIGS. The TRV vector cannot be used in Brazil, because it is a quarantine pest. Hence the use of TRV in Brazil is extremely limited, mainly due to the difficulty of obtaining a permission to use in the Brazilian territory. The virus has a bipartite genome of single strand RNA components. During the construction development, the two complete segments of the genome of PepRSV were cloned in plasmid vectors (pGEM-T Easy; pCR4) and modified to contain a promoter 35 of Cauliflower mosaic virus in the 5' end and a ribozyme sequence in the 3' region of the genome of each segment. Additionally to this construction for infectious clones, we propose to assess the variability of the PepRSV RNA2, which was restricted to a single isolate. Two PepRSV isolates (Pivo4 and Lavrinha) obtained in tomato fields in the county of Luziânia, Goiás State. The genome segment (RNA 2) of these isolates was sequenced. Phylogenetic analysis based on the amino acid sequences of coat protein (CP) among three isolates did not separate those isolates in different ramifications due to lower bootstrap value. The isolates obtained were in agreement as CAM isolate for coat protein (CP) ORF feature, but do not showed homologous ORFs2a and 2b present in TRV isolates of the Tobravirus type species. By sequence comparison, Pivo4 and Lavrinha isolates had presentedlarge nucleotides insertion downstream of CP ORF as opposed to CAM isolate suggesting a recombination in 3'UTR between RNA1 and RNA2 of each isolate.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, 2010. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2011-04-19T13:46:22Z No. of bitstreams: 1 2010_NataliaLucinda.pdf: 1450579 bytes, checksum: c6ffe1b291f24b75bbf847a37c4df803 (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2011-05-25T00:23:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_NataliaLucinda.pdf: 1450579 bytes, checksum: c6ffe1b291f24b75bbf847a37c4df803 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-05-25T00:23:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_NataliaLucinda.pdf: 1450579 bytes, checksum: c6ffe1b291f24b75bbf847a37c4df803 (MD5) / O vírus Brugmansia suaveolens mottle virus (BsMoV) foi isolado da solanácea Brugmansia suaveolens (conhecida como trombeteira, saia-branca) da coleção de plantas medicinais do Instituto Agronômico, Campinas-SP, Brasil, sendo o isolado nomeado Bs-Campinas. Um trabalho anterior mostrou que o isolado Bs-Campinas foi transmitido por afídeos, induziu sintomas visíveis em algumas solanáceas e em duas espécies de Chenopodium sob condições experimentais, apresentando partículas e inclusões típicas de potyvírus em folhas sintomáticas, quando observadas por microscopia eletrônica de transmissão. Apenas parte do genoma do vírus era conhecida, uma região compreendendo a extremidade 3‟, o que o distinguiu suficientemente dos outros vírus para ser classificado como uma espécie nova de potyvírus. O vírus apresenta características distintas de outros potyvírus conhecidos, induzindo uma alta severidade de sintomas em diversas plantas susceptíveis, além da capacidade de infectar o tomateiro, uma cultura de alta importância econômica e social no Brasil. Essas características o tornam um excelente alvo para estudo dos genes relacionados à patogenicidade e para o desenvolvimento futuro de vetores virais. Neste sentido, o objetivo deste trabalho foi realizar a caracterização molecular do isolado Bs-Campinas através da determinação de sua sequência genômica completa e determinar o seu relacionamento filogenético com os diferentes potyvírus já relatados no mundo. Para tanto, procedeu-se o emprego de várias técnicas para o completo resgate do genoma viral e posterior determinação de sua sequência. O RNA total foi extraído e o cDNA sintetizado foi obtido pela técnica de 3‟ RACE usando primers universais para potyvírus, resultando na amplificação de um fragmento de 8,3kb. A tentativa de clonagem deste fragmento, contudo, resultou em clones que apresentavam uma deleção interna neste fragmento. Dessa forma, o segundo fragmento obtido resultou da amplificação por RT-PCR utilizando-se primers específicos desenhados com base nas sequências das extremidades do fragmento de 8,3kb com o intuito de resgatar a região interna do genoma gerando um fragmento de aproximadamente 4,7kb. Primers específicos foram também desenhados baseados na sequência da extremidade 5‟ do clone de 8kb obtido e a estratégia 5‟ RACE foi usada para amplificar e clonar a extremidade 5‟ do genoma do vírus, um fragmento de 1,8kb. As amplificações por PCR resultaram no resgate de três fragmentos de cDNA, os quais totalizam a sequência completa do genoma do BsMoV. O RNA genômico consistiu de 9870 nt sem a cauda de poli-A, codificando uma poliproteína típica dos potyvírus de 3090 aa. As análises da sequência de aminoácidos possibilitaram a dedução dos sítios de clivagem, bem como, a identificação das sequências e motivos conservados dentro da sequência de cada proteína, tendo o isolado Bs-Campinas exibido perfil típico de potyvírus. As análises filogenéticas, assim como, comparações com outras espécies de Potyvirus do banco de dados online revelaram que esta sequência tem uma identidade nucleotídica de 63,7% com Pepper mottle virus (PepMoV), a qual foi a sequência de potyvírus de maior identidade e, portanto, o mais estreitamente relacionado. Uma vez que este valor de identidade é inferior ao limiar (76% de identidade nucleotídica) atualmente usado para discriminar espécies de Potyvirus, foi confirmado que Brugmansia suaveolens mottle virus representa uma nova espécie dentro do gênero Potyvirus. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Brugmansia suaveolens mottle virus (BsMoV) was isolated from a Brugmansia suaveolens plant (known as "angel trumpet") in the collection of medicinal plants of the Instituto Agronômico, Campinas-SP, Brazil, being the isolate named Bs-Campinas. A previous study showed that the isolate Bs- Campinas was transmitted by aphids and induced visible symptom on some Solanaceous plants and two Chenopodium species under the experimental conditions, showing typical potyvirus particles and inclusions in symptomatic leaves, when observed by transmission electron microscopy. Only part of the virus genome was known, a region comprising the 3' terminal region of the genome, which distinguished it sufficiently from other viruses to be classified as a new potvvirus species. The virus showed characteristics that were distinct from other known potyviruses, such as the high symptom severity in many plants and the ability to infect tomato plants, a crop of high economic and social importance in Brazil. These findings showed that it can be an excellent target for the study of genes related to pathogenicity and for the future development of viral vectors. Therefore, the objective of this study was the molecular characterization of the isolate Bs-Campinas through the determination of its complete genomic sequence and its phylogenetic analysis, when compared with different potyviruses previously reported in the world. For this purpose, some techniques were attempted to enable the rescue of the viral genome and subsequent determination of its sequence. Total RNA was extracted and cDNA synthesis was done by 3 'RACE using universal primers for potyviruses, resulting in the amplification of a fragment of ca. 8,3 kb. However, the cloning of this fragment resulted in clones that presented an internal deletion in this fragment. Therefore, a second fragment using specific primers designed based on the sequence ends of the deleted clones, was amplified by PCR and cloned in order to rescue inner region of the genome by generating a fragment of approximately 4.7 kb. Specific primers were also designed based on the 5‟ end region of the 8,3 kb clone to enable cloning of the 5‟ terminal region of the genome by 5' RACE, a fragment of 1.8 kb. PCR amplifications resulted in three cDNA fragments, comprising the complete genome of BsMoV. The RNA genome consisted of 9870 nt without a poly-A tail, encoding a putative typical potyviral polyprotein of 3090 aa. Analysis of the amino acid sequence allowed the deduction of the cleavage sites, as well as the identification of conserved sequences and motifs within the sequence of each protein, in which the Bs-Campinas isolate displayed typical potyvirus genome strategy. Phylogenetic analysis, as well as comparisons with other species of the Potyvirus genus obtained on online databases revealed that this BsMoV sequence shared 63.7% nucleotide sequence with Pepper mottle virus (PepMoV), which was the best matched potyvirus sequence and, thus the most closely related species. Since this identity value is below the threshold of 76% nt identity presently used to discriminate Potyvirus species, it was confirmed that Brugmansia suaveolens mottle virus represents a new Potyvirus species.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, 2009. / Submitted by Allan Wanick Motta (allan_wanick@hotmail.com) on 2010-03-10T15:40:01Z No. of bitstreams: 1 2009_CristianeLopesdeOliveira.pdf: 723424 bytes, checksum: 1df9631ff7757bb5507a5df1735a30ad (MD5) / Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2010-04-29T22:19:01Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_CristianeLopesdeOliveira.pdf: 723424 bytes, checksum: 1df9631ff7757bb5507a5df1735a30ad (MD5) / Made available in DSpace on 2010-04-29T22:19:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_CristianeLopesdeOliveira.pdf: 723424 bytes, checksum: 1df9631ff7757bb5507a5df1735a30ad (MD5) Previous issue date: 2009 / O amendoim-bravo (Euphorbia heterophylla) é uma importante planta daninha em diversos países por interferir na produção de plantas cultiváveis e por servir como reservatório de vírus de plantas. O objetivo desse trabalho foi estudar a diversidade dos begomovírus coletados em amendoim-bravo e caracterizar molecular e biologicamente um isolado permitindo a sua completa identificação. Sete amostras de amendoim-bravo foram coletadas apresentando sintomas de mosaico amarelo em diferentes cidades do estado de Goiás e Distrito Federal. Elas foram avaliadas por PCR usando primers universais para begomovírus, que confirmou que todas as sete amostras estavam infectadas. As amostras de DNA foram utilizadas para a realização da amplificação via círculo rolante (RCA) utilizando a enzima phi-29 DNA polimerase. Cada produto amplificado foi digerido com uma enzima de restrição que cortou o DNA em apenas um único ponto e foi clonado no vetor pBluescript (Stratagene). As sequências completas de ambos os componentes (oito clones de DNA-A e três clones de DNA-B) foram obtidas usando primers para o vetor e primers internos em seqüenciador automático. Para a caracterização biológica, clones infecciosos foram preparados e inoculados através de bombardeamento de partículas em plantas cultivadas e daninhas. A infecção foi confirmada por PCR em plantas de Capsicum annuum, Datura stramonium, Nicotiana benthamiana e Euphorbia heterophylla. Todas as oito sequências do DNA-A compartilham uma identidade 86,9% com o Euphorbia mosaic virus Peru (acesso AM886131; sequência de begomovírus mais próxima ao vírus), enquanto que o DNA-B compartilha uma identidade nucleotídica 61,6% com o Tomato commom mosaic virus (acesso NC_010836). De acordo com o Comitê Internacional de Taxonomia de Vírus (ICTV), um vírus é considerado como uma nova espécie quando a identidade de sequência do DNA-A com outro vírus é menor que 89%, sugerindo que esse vírus é distinto do Euphorbia mosaic virus Peru. Portanto, de acordo com os critérios estabelecidos pelo ICTV, o vírus caracterizado nesse trabalho pode ser considerado uma nova espécie do gênero Begomovirus, sendo o nome Euphorbia yellow mosaic virus proposto. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The “amendoim-bravo” (Euphorbia heterophylla; also known as painted euphorbia) is an important weed in several countries, interferes in the production of cultivated plants, and has a great potential as a reservoir of plant viruses. The objective of this study was to study the diversity of begomoviruses that infect “amendoim-bravo” plants, and characterize molecular and biologically one isolate enabling its complete identification. Seven samples were collected of “amendoim-bravo” showing yellow mosaic at distinct localities in Goiás State and Federal District/Brazil. They were tested by PCR using universal begomovirus primers and it was confirmed that all seven samples were positively infected. These DNA samples were used as template for rolling circle amplification (RCA) using the enzyme phi-29 DNA polymerase. Each amplified product was digested with a single-cutting restriction enzyme and cloned into pBluescript vector (Statagene). The complete sequence of both components (eight DNA-A clones and three DNA-B clones) were obtained using internal and vector primers. For the biological characterization, infectious clones were prepared and inoculated by particle bombardment to cultivated plants and weeds. The infection was confirmed by PCR in plants of Capsicum annuum, Datura stramonium, Nicotiana benthamiana and Euphorbia heterophylla. All eight DNA-A sequences shared 86,9% nucleotide identity with Euphorbia mosaic virus Peru (accession AM886131, the most closely related begomovirus sequence), while DNA-B shared 61,6% nucleotide identity with Tomato commom mosaic virus (accession NC_010836). According to the International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV) a virus is considered as a new species when the sequence identity with another virus is less than 89%, suggesting that it is distinct from Euphorbia mosaic virus Peru. Therefore, according to the criteria established by the ICTV, the viruses characterized in this work can be considered as a new species within the genus Begomovirus, and the name Euphorbia yellow mosaic virus is proposed.