Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, 2018. / Submitted by Fabiana Santos (fabianacamargo@bce.unb.br) on 2018-10-05T18:17:37Z No. of bitstreams: 1 2018_ThiagoMarquesCosta.pdf: 2214752 bytes, checksum: 27606d84195a210bc279e6daf9613382 (MD5) / Approved for entry into archive by Fabiana Santos (fabianacamargo@bce.unb.br) on 2018-10-09T20:22:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2018_ThiagoMarquesCosta.pdf: 2214752 bytes, checksum: 27606d84195a210bc279e6daf9613382 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-10-09T20:22:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2018_ThiagoMarquesCosta.pdf: 2214752 bytes, checksum: 27606d84195a210bc279e6daf9613382 (MD5) Previous issue date: 2018-10-09 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPQ). / A região Nordeste é a maior produtora de melão no Brasil, contribuindo com cerca de 90% da produção nacional. Os Estados do Rio Grande do Norte e Ceará juntos produzem desde 2010 cerca de 500 mil toneladas/ano em 21.000 ha de área plantada, sendo os maiores estados produtores do país. O Brasil ocupa o 11º lugar no ranking mundial de produção de melão, sendo este fruto um dos mais exportados nos últimos anos no país. No Brasil, as viroses destacam-se entre os principais problemas fitossanitários que afetam as cucurbitáceas, causando redução na qualidade dos frutos e perda significativa na produção. Os principais vírus que infectam o meloeiro são os potyvírus, comovírus, cucumovírus, tospovírus e carlavírus. O “Amarelão do meloeiro” é considerado a principal doença dessa cultura. Essa doença é caracterizada por apresentar forte clorose nas folhas mais velhas e é associada, até então, ao carlavírus Melon yellowing-associated virus (MYaV) como o agente causador. O objetivo deste trabalho foi caracterizar os vírus potenciais candidatos a agente causador do “Amarelão do meloeiro”. Um conjunto de amostras de meloeiro apresentando sintoma de “Amarelão do meloeiro” foi coletado em Mossoró (RN) e Juazeiro (BA) e os ácidos nucleicos purificados foram sequenciados utilizando a tecnologia de Sequenciamento de Nova Geração (NGS) pela plataforma Illumina HiSeq 2000. Foram identificadas em alta frequência sequências com alta identidade ao genoma do carlavírus Melon yellowing-associated virus (MYaV) e ao polerovírus Cucurbit aphid-borne yellows virus (CABYV). Foi elaborada a hipótese de que um desses dois vírus, ou ambos, seja o vírus causador da doença e, portanto, foram caracterizados neste estudo. O isolado de MYaV caracterizado molecularmente foi proveniente de Mossoró sendo denominado isolado M22-MYaV e os isolados de CABYV denominados CABYV-M3 e CABYV-JMB1, de Ceará (CE, perto da cidade de Mossoró) e Juazeiro (BA), respectivamente. A determinação do genoma completo foi realizada a partir de NGS e por sequenciamento pelo método Sanger. O genoma do MYaV possui 9073 bases e codifica seis proteínas: RdRp (ca. 6,2 kb), TGB1 (ca. 0,7 kb), TGB2 (ca. 0,3 kb), TGB3 (ca. 0,2 kb), CP (ca. 1 kb) e NaBp (ca. 0,4 kb). A análise filogenética utilizando a sequência da proteína de replicação (RdRp) do MYaV mostrou que o vírus apresenta maior relacionamento com o carlavírus Sweet potato yellow mottle virus (59,8%), confirmando a classificação do MYaV dentro do gênero Carlavirus. O genoma dos isolados M3 e JMB1 de CABYV é de cerca de 5,7 kbases, codificando sete ORFs: ORF0 (0,7 kb), ORF1 (ca. 1,8 kb), ORF2 (ca. 1,3 kb) , ORF3 (ca. 0,6 kb), ORF3a (ca. 0,1 kb), ORF4 (ca. 0,7 kb) e ORF5 (ca. 0,1 kb). O genoma dos dois isolados de CABYV apresenta 96,8% de identidade em nucleotídeo entre si e 73,7% com a sequência do isolado CABYV-N da França (X76931). A baixa identidade de sequência entre os isolados brasileiros e o francês se deve a uma região de recombinação na extremidade 3’ do genoma compreendendo as regiões que codificam a capa proteica (CP: ORF3 e ORF5) e proteína de movimento (MP: ORF4). O major parent do recombinante foi identificado como CABYV na análise, mas o minor parent não foi identificado dentro do conjunto de sequências de vírus utilizado. A análise filogenética e do relógio molecular sugere que os isolados M3 e JMB1 são possivelmente originários da França, tendo passado anteriormente pela Espanha e Taiwan. Um ensaio em condições controladas demonstrou que o isolado brasileiro de CABYV é eficientemente transmitido por moscas-brancas (Bemisia tabaci biótipo B), apesar de ser classificado como um polerovírus que é tipicamente transmitido por afídeos. Foi possível produzir antissoro específico ao isolado brasileiro de CABYV, que se mostrou útil para testes de detecção por DAS-ELISA. Este estudo apresenta o genoma completo do MYaV e a caracterização molecular e filogenética de novos isolados de CABYV em meloeiro no Brasil e mostra evidências que um membro da família Luteoviridae pode ser transmitido por Bemisia tabaci. / The Northeast region is the largest melon producer in Brazil, accounting for around 90% of the national production. Since 2010, together, the states of Rio Grande do Norte and Ceará have produced around 500,000 tons / year in 21,000 hectares of planted area, being the largest producing state in the country. Brazil occupies the 11th place in the world ranking of melon production, being one of the most exported fruit in recent years. In Brazil, viruses are among the main phytosanitary problems affecting cucurbits, causing a reduction in fruit quality and a significant loss of production. The major viruses that infect melon plants are potyviruses, cucumoviruses, tospoviruses and carlaviruses. "Amarelão do meloeiro”, meaning melon severe yellowing, is considered as the main disease of this crop. This disease is characterized by the occurrence of strong chlorosis in the older leaves of infected plants and is associated with Melon yellowing-associated virus (MYaV) as the causative agent. The objective of this work was to characterize potential virus candidates for the causative agent of "Amarelão do meloeiro". A set of melon samples showing "Amarelão do meloeiro" symptom was collected in Mossoró (state of Rio Grande do Norte) and Juazeiro (Bahia) and purified nucleic acids were sequenced using the Next Generation Sequencing (NGS) technology by the Illumina HiSeq 2000 platform. Sequences of the genome of the carlavirus Melon yellowing-associated virus (MYaV) and the polerovirus Cucurbit aphid-borne yellows virus (CABYV) were found in high frequency. It was hypothesized that one of these two viruses, or both, is the virus that causes the disease and, therefore, were characterized in this study. Molecular characterized MYaV isolate was derived from Mossoró being named M22-MYaV isolate and the CABYV isolates were named CABYVM3 and CABYV-JMB1, collected in Ceará (near the city of Mossoró) and Juazeiro (Bahia), respectively. Determination of the complete genome sequence was performed by NGS and by sequencing by the Sanger method. MYaV genome has 9073 bases and encodes six proteins: RdRp (ca. 6.2 kb), TGB1 (ca. 0.7 kb), TGB2 (ca. 0.3 kb), TGB3 (ca. 0.2 kb), CP (ca. 1 kb) and NaBp (ca. 0.4 kb). Phylogenetic analysis using the MYaV replication protein sequence (RdRp) showed that the virus was closely related to the carlavirus Sweet potato yellow mottle virus (59.8%), confirming the classification of MYaV within the genus Carlavirus. The genome of the CABYV M3 and JMB1 isolates is ~ 5.7 kbases, encoding seven ORFs: ORF0 (0.7 kb), ORF1 (ca. 1.8 kb), ORF2 (ca. ORF3 (ca. 0.6 kb), ORF3a (ca. 0.1 kb), ORF4 (ca. 0.7 kb) and ORF5 (ca. 0.1 kb). The genome of the two CABYV isolates shares 96.8% nucleotide identity to each other and 73.7% to the CABYV-N isolate from France (X76931). The low sequence identity between the Brazilian and French isolates is due to a region of recombination at the 3' end of the genome comprising the regions encoding the coat protein (CP: ORF3 and ORF5) and movement protein (MP: ORF4). The major parent of the recombinant was identified as CABYV in the analysis, but the minor parent was not identified within the set of virus sequences used. Phylogenetic and molecular clock analyses suggest that the M3 and JMB1 isolates are possibly from France, having previously passed through Spain and Taiwan. A transmission test performed under controlled conditions has demonstrated that CABYV Brazilian isolate is efficiently transmitted by whiteflies (Bemisia tabaci biotype B), although it is classified as a polerovirus, that is typically transmitted by aphids. It was possible to produce a specific antiserum to the Brazilian CABYV isolate, which proved useful for DAS-ELISA detection tests. This study presents the complete genome of MYaV and the molecular and phylogenetic characterization of new isolates of CABYV in melon in Brazil and shows evidence that a member of the family Luteoviridae can be transmitted by Bemisia tabaci.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2015. / Submitted by Kathryn Cardim Araujo (kathryn.cardim@gmail.com) on 2016-04-27T13:05:16Z No. of bitstreams: 1 2016_MarianaSennaQuirino.pdf: 4546958 bytes, checksum: 7d7bc37fcf79d63d378011f3efea44d6 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2016-04-27T14:34:47Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_MarianaSennaQuirino.pdf: 4546958 bytes, checksum: 7d7bc37fcf79d63d378011f3efea44d6 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-27T14:34:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_MarianaSennaQuirino.pdf: 4546958 bytes, checksum: 7d7bc37fcf79d63d378011f3efea44d6 (MD5) / No capítulo I avaliamos a presença e análise filogenética de vírus de melancia no estado do Tocantins. Folhas com sintomas de infecção viral foram coletadas em 2013 eparticulas virais foram parcialmente purificadas e o RNA total dessas partículas foi purificado e sequenciado usando a plataforma Ilumina HiSeq 2000. As sequências obtidas foram analisadas com o programa CLC Genomics Workbench, e fases abertas de leitura (ORFs) foram procuradas usando o programa Blast x. Os 4.912 contigs que obtiveram hits com vírus de plantas foram analisados e comparados com o auxílio do programa Geneious. A presença dos vírus foi confirmada por diferentes métodos. Foram identificados genomas completos de vírus pertencentes às famílias Potyviridae,BunyaviridaeePartitiviridae. No capítulo II foi realizado estudo biotecnológico na tentativa de construção de um vetor de expressão de proteínas heterólogas com o genoma do baculovírusAnticarsiagemmatalismultilenucleopolyhedrovirus(AgMNPV), baseado no sistema de transposição sítio-específica comercialmente disponível para o baculovírus Autographacalifornicamultiplenucleopolyhedrovirus(AcMNPV). Foram utilizadas três metodologias: i) Recombinação homóloga em células de inseto; ii) Recombinação homóloga em células de E. coli (cepa BJ5183); iii) Digestão e ligação em sítio único Bsu36I e FseI no DNA genômico de AgMNPV. Foi construído um vetor de transferência p2100-KLM, para recombinação homóloga e/ou ligação em sítio único do baculovírus, porém, as tentativas para construção do vetor de expressão não foram efetivas. ______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / In chapter I we analized the presence and phylogeny of viruses found in watermelon in Tocatinsstate. Watermelon leaves with viral symptoms were collected in 2013, and viral particles were partialy purified and total RNA was extracted and sequenced using the Illumina HiSeq 2000 platform. The sequences obtained were analyzed using the CLC Genomics Workbench program, and used for ORF search with theBlastx program. The 4.912 contigs who got hits with plant viruses were analyzed and compared with the help of Geneious program. The presence of viruses in leaves with viral symptoms was confirmed using different methods. Possible complete viral genomes were identified and were related to viruses belonging to the families Potyviridae,Bunyaviridae, Partitiviridae. In chapter II we tried to construct a vector for expression of heterologous proteins using the baculovirusAnticarsiagemmatalismultiple nucleopolyhedrovirus(AgMNPV). This vector was based on site specific transposition system commercially available for the baculovirusAutographacalifornica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV). Three methodologies were used: i) Homologous recombination in insect cells; ii) Homologous recombination in E. coli cells (strain BJ5183); iii) Direct ligation in Bsu36I and FseI unique restriction sites in the genomic DNA of AgMNPV. One transfer vector (p2100-KLM) was constructed for homologous recombination and / or ligation in the baculovirus single site. However, all the different strategies were not effective.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2018. / Submitted by Fabiana Santos (fabianacamargo@bce.unb.br) on 2018-09-04T20:45:35Z No. of bitstreams: 1 2018_RayaneNunesLima.pdf: 6996950 bytes, checksum: 2e6db0e375cb5a8815dab21b4f9cf1c0 (MD5) / Approved for entry into archive by Fabiana Santos (fabianacamargo@bce.unb.br) on 2018-09-11T18:44:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2018_RayaneNunesLima.pdf: 6996950 bytes, checksum: 2e6db0e375cb5a8815dab21b4f9cf1c0 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-11T18:44:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2018_RayaneNunesLima.pdf: 6996950 bytes, checksum: 2e6db0e375cb5a8815dab21b4f9cf1c0 (MD5) Previous issue date: 2018-09-04 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPQ). / O rápido progresso na compreensão dos mecanismos de enovelamento de proteínas e os avanços no campo da bioinformática forneceram ferramentas confiáveis para predizer as estruturas tridimensionais de proteínas de vírus de plantas. Por meio de Modelagem Estrutural por Homologia, foi possível obter um modelo tridimensional para a proteína do nucleocapsídeo (NP) e a proteína não estrutural do segmento S (NSs) de GRSV (Groundnut ringspot orthotospovirus) e para a NP de ZLCV (Zucchini lethal chlorosis orthotospovirus). Verificou-se que os monômeros GRSV NP e ZLCV NP são organizadas em um domínio globular (33-223 aa) contendo uma cavidade carregada positivamente para interação com RNA e com as duas cadeias terminais, formando um braço N-terminal (1-32 aa) e um braço C-terminal (224-258 aa). Além disso, a análise da estrutura tridimensional da proteína NSs de GRSV sugeriu uma possível atividade enzimática de fosfatase, para o metabolismo de nucleotídeos assim como um possível domínio de interação com a proteína Argonauta 1. A proteína NSs foi expressa de forma nativa e purificada para futuros ensaios de cristalização. Assim, as estruturas das NP e NSs podem lançar luz sobre os mecanismos de formação de RNP e silenciamento gênico e podem permitir a identificação de resíduos essenciais de aminoácidos como possíveis alvos para estratégias de controle das doenças causadas pelos orthotospovírus. Por fim, por meio da técnica de duplo híbrido em levedura, foi encontrada uma possível interação entre a proteína AtCSN5a e as proteínas NP e NSs de GRSV, e a relevância dessas interações para o sistema planta-vírus ainda serão investigadas. / The rapid progress in the understanding of protein folding mechanisms and the advances in the bioinformatics field have provided reliable tools for modeling and predict three-dimensional structures of plant virus proteins. Using Homology modeling technique, it was possible to obtain three-dimensional models for both NP and NSs of GRSV (Groundnut ringspot orthotospovirus) and for ZLCV NP (Zucchini lethal chlorosis orthotospovirus). GRSV NP and ZLCV NP monomers have been organized into a globular domain (33-223 aa) containing a positively charged cavity for RNA interactions, and two terminal chains forming an N-terminal arm (1-32 aa) and a C-terminal arm (224-258 aa). In addition, a three-dimensional structure of the GRSV NSs protein revealed a possible phosphatase enzymatic activity for nucleotide metabolism and a possible interaction domain with an Argonaute 1. Moreover, the NSS protein was natively expressed and purified for future crystallization assay. Thus, the proposed models can shed light on the mechanisms of RNP formation and gene silencing and may allow the identification of essential amino acid residues as possible targets for the orthotospovirus control strategy. Finally, using yeast two-hybrid technique, a possible interaction between the AtCSN5a protein and the NP and NSS of GRSV was found; however, the relevance of these interactions for the plant-virus system remains to be investigated.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, 2009. / Submitted by Allan Wanick Motta (allan_wanick@hotmail.com) on 2010-03-10T15:40:01Z No. of bitstreams: 1 2009_CristianeLopesdeOliveira.pdf: 723424 bytes, checksum: 1df9631ff7757bb5507a5df1735a30ad (MD5) / Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2010-04-29T22:19:01Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_CristianeLopesdeOliveira.pdf: 723424 bytes, checksum: 1df9631ff7757bb5507a5df1735a30ad (MD5) / Made available in DSpace on 2010-04-29T22:19:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_CristianeLopesdeOliveira.pdf: 723424 bytes, checksum: 1df9631ff7757bb5507a5df1735a30ad (MD5) Previous issue date: 2009 / O amendoim-bravo (Euphorbia heterophylla) é uma importante planta daninha em diversos países por interferir na produção de plantas cultiváveis e por servir como reservatório de vírus de plantas. O objetivo desse trabalho foi estudar a diversidade dos begomovírus coletados em amendoim-bravo e caracterizar molecular e biologicamente um isolado permitindo a sua completa identificação. Sete amostras de amendoim-bravo foram coletadas apresentando sintomas de mosaico amarelo em diferentes cidades do estado de Goiás e Distrito Federal. Elas foram avaliadas por PCR usando primers universais para begomovírus, que confirmou que todas as sete amostras estavam infectadas. As amostras de DNA foram utilizadas para a realização da amplificação via círculo rolante (RCA) utilizando a enzima phi-29 DNA polimerase. Cada produto amplificado foi digerido com uma enzima de restrição que cortou o DNA em apenas um único ponto e foi clonado no vetor pBluescript (Stratagene). As sequências completas de ambos os componentes (oito clones de DNA-A e três clones de DNA-B) foram obtidas usando primers para o vetor e primers internos em seqüenciador automático. Para a caracterização biológica, clones infecciosos foram preparados e inoculados através de bombardeamento de partículas em plantas cultivadas e daninhas. A infecção foi confirmada por PCR em plantas de Capsicum annuum, Datura stramonium, Nicotiana benthamiana e Euphorbia heterophylla. Todas as oito sequências do DNA-A compartilham uma identidade 86,9% com o Euphorbia mosaic virus Peru (acesso AM886131; sequência de begomovírus mais próxima ao vírus), enquanto que o DNA-B compartilha uma identidade nucleotídica 61,6% com o Tomato commom mosaic virus (acesso NC_010836). De acordo com o Comitê Internacional de Taxonomia de Vírus (ICTV), um vírus é considerado como uma nova espécie quando a identidade de sequência do DNA-A com outro vírus é menor que 89%, sugerindo que esse vírus é distinto do Euphorbia mosaic virus Peru. Portanto, de acordo com os critérios estabelecidos pelo ICTV, o vírus caracterizado nesse trabalho pode ser considerado uma nova espécie do gênero Begomovirus, sendo o nome Euphorbia yellow mosaic virus proposto. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The “amendoim-bravo” (Euphorbia heterophylla; also known as painted euphorbia) is an important weed in several countries, interferes in the production of cultivated plants, and has a great potential as a reservoir of plant viruses. The objective of this study was to study the diversity of begomoviruses that infect “amendoim-bravo” plants, and characterize molecular and biologically one isolate enabling its complete identification. Seven samples were collected of “amendoim-bravo” showing yellow mosaic at distinct localities in Goiás State and Federal District/Brazil. They were tested by PCR using universal begomovirus primers and it was confirmed that all seven samples were positively infected. These DNA samples were used as template for rolling circle amplification (RCA) using the enzyme phi-29 DNA polymerase. Each amplified product was digested with a single-cutting restriction enzyme and cloned into pBluescript vector (Statagene). The complete sequence of both components (eight DNA-A clones and three DNA-B clones) were obtained using internal and vector primers. For the biological characterization, infectious clones were prepared and inoculated by particle bombardment to cultivated plants and weeds. The infection was confirmed by PCR in plants of Capsicum annuum, Datura stramonium, Nicotiana benthamiana and Euphorbia heterophylla. All eight DNA-A sequences shared 86,9% nucleotide identity with Euphorbia mosaic virus Peru (accession AM886131, the most closely related begomovirus sequence), while DNA-B shared 61,6% nucleotide identity with Tomato commom mosaic virus (accession NC_010836). According to the International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV) a virus is considered as a new species when the sequence identity with another virus is less than 89%, suggesting that it is distinct from Euphorbia mosaic virus Peru. Therefore, according to the criteria established by the ICTV, the viruses characterized in this work can be considered as a new species within the genus Begomovirus, and the name Euphorbia yellow mosaic virus is proposed.