Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2016. / Submitted by Marianna Gomes (mariannasouza@bce.unb.br) on 2016-12-15T16:36:06Z No. of bitstreams: 1 2016_MarianaMartinsSeverodeAlmeida.pdf: 5032281 bytes, checksum: 753d5c2b37f354aec4c29431c366943a (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-01-31T16:54:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_MarianaMartinsSeverodeAlmeida.pdf: 5032281 bytes, checksum: 753d5c2b37f354aec4c29431c366943a (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-31T16:54:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_MarianaMartinsSeverodeAlmeida.pdf: 5032281 bytes, checksum: 753d5c2b37f354aec4c29431c366943a (MD5) / Os vírus do gênero Tospovirus pertencem à família Bunyaviridae e possuem o material genético composto por três segmentos de RNA, denominados RNA L, RNA M e RNA S. O Groundnut ringspot virus (GRSV) e o Tomato spotted wilt virus (TSWV) são as espécies de tospovírus mais importantes no Brasil, causando prejuízos principalmente em cultivos de tomateiro e pimenteiras. Tomato chlorotic spot virus (TCSV) eventualmente é encontrado em ciclo de hospedeiras similar ao de GRSV e TSWV e tem ocorrência restrita a alguns estados no Brasil, onde foi descrito pela primeira vez. Vírus compostos por genoma segmentado podem sofrer frequentes recombinações ou rearranjos. Com a finalidade de buscar rearranjos naturais entre espécies de tospovírus, foi verificada a ocorrência de GRSV, TCSV e TSWV em amostras com sintomas de vírus coletadas no Brasil e na República Dominicana. Neste levantamento não foram detectados rearranjos genéticos e a incidência de infecção mista foi de apenas 7%. Contudo, mais de 50% das amostras coletadas estavam infectadas com tospovírus, reforçando a importância econômica desses vírus. No Brasil houve a prevalência de GRSV, mantendo o cenário observado no último estudo de detecção de tospovírus em amostras de campo, no qual também se verificou a prevalência de GRSV em regiões produtoras no Nordeste e no Distrito federal. Comparando-se os dados do levantamento anterior com aquele realizado nesse estudo, pode-se perceber que TSWV está perdendo espaço no campo, deixando de ser a espécie de maior relevância econômica. Na República Dominicana, região onde os tospovírus foram introduzidos recentemente, observou-se que o TCSV tem se disseminado de forma rápida e severa em importantes culturas como tomateiro, pimenteiras, fumo e feijoeiro, em contraste com o GRSV que ainda não foi detectado no país e o TSWV que foi encontrado em uma proporção maior do que a observada no Brasil. A crescente disseminação de TCSV não está restrita à República Dominicana e pode ser justificada pelo ‘fitness’ mais eficiente desta espécie. Relatos recentes têm ocorrido em outros países do Caribe e nos Estados Unidos, onde foi caracterizado o primeiro isolado proveniente de rearranjo intraespecífico de tospovírus composto por segmentos genômicos não cognatos. Este isolado heterogêneo possui os RNAs S e L de GRSV e o RNA M de TCSV (SGRSVMTCSVLGRSV). Pela diversidade biológica e devido aos critérios taxonômicos estabelecidos, foi pressuposto que a detecção de rearranjos nas condições brasileiras havia sido negligenciada ao longo dos anos. Contudo, após a análise de mais de cento e sessenta amostras, coletadas em dois países com históricos de infecções de tospovirus bem distintos (Brasil e República Dominicana), não foi possível detectar rearranjos genéticos. Neste trabalho foram sequenciados e comparados isolados de TCSV e de GRSV coletados no final dos anos 80, com isolados sequenciados recentemente e/ou armazenados em bancos de dados genômicos. As análises de filogenia do RNA M de TCSV e GRSV permitiram concluir que, provavelmente, essas duas espécies compartilham o mesmo segmento M, ou seja, caso tenha ocorrido algum evento definitivo de rearranjo entre as espécies de GRSV e TCSV, este foi em um passado distante, não sendo possível detectar o segmento parental por falta de dados suficientes para as análises. Neste trabalho, a distribuição mundial de TCSV, TSWV e de Iris yellow spot virus (IYSV) também foi verificada por meio de estudos de filogeografia, com a finalidade de compreender a dispersão de espécies de tospovirus e possibilitar a agregação de dados para implementação de medidas quarentenárias e o aperfeiçoamento de programas de melhoramento, para a obtenção de resistência genética a espécies de tospovírus. Nestas análises foi possível verificar que a distribuição dos isolados é local e não global e que a disseminação mundial dos tospovírus parece estar relacionada com as atividades econômicas e intercâmbios comerciais realizadas pelos países. / The viruses on the genus Tospovirus belong to the family Bunyaviridae and have their genome comprised by trisegmented RNA, named L RNA, M RNA and S RNAS. The Groundnut ringspot virus (GRSV) and Tomato spotted wilt virus (TSWV) are the most important tospovirus in Brazil, causing severe losses mainly in tomato and pepper crops. Tomato chlorotic spot virus (TCSV) is often found infecting similar hosts range as GRSV and TSWV. TCSV occurrence is restricted to some states in Brazil, where it was described for the first time. Viruses having segmented genomes can undertake frequent recombinations and/or reassortants. With the aim to seek for natural reassortants among GRSV, TCSV and TSWV an extensive survey was carried out in Brazil and Dominican Republic. In this survey, any genetic reassortant was detected and the incidence of mixed infection was significantly low. However, more than 50% of the samples collected were infected with tospoviruses, reinforcing the economic importance of these viruses. In Brazil there was a prevalence of GRSV, the same scenario observed in the last tospoviruses survey in the field, which has also verified the prevalence of the GRSV in horticultural producing areas located in the Northeast and in the Federal District. As we bring together the old and the new database, we can notice that the importance of TSWV is decreasing in agriculture, since this specie is not the most economically relevance. In Dominican Republic, the TCSV has been recently reported and have been spreading over important cultivated crops, such as tomato crops, pepper crops, tobacco and bean crops. The survey in Dominican Republic showed that GRSV was not detected yet in the country and TSWV has been found in higher percentages compared to those found in Brazil. The remarkably dissemination of the TCSV is not restricted to the Dominican Republic and may be due to an efficient fitness of this species. Recent reports showed occurrence of TCSV in others Caribbean countries and in the south of USA, where it was reported the first interspecific reassortant isolate among tospoviruses. This reassortant isolate has the S and L RNA genomic segments of the GRSV and the M RNA of the TCSV (denoted as SGRSVMTCSVLGRSV). Up to now, due to the biologic diversity, associate with the taxonomic criteria established, we assumed that the reassortant detection in the Brazilian conditions was neglected. However, after the analysis of more than one hundred and sixty samples, collected in two countries (Brazil and Dominican Republic), which have different tospoviruses history, genetic rearrangements were not detected. To understand the nature of the natural reassortant SGRSVMTCSVLGRSV between GRSV and TCSV, recently reported in USA, in this work, we sequenced and compared the first GRSV and TCSV isolates reported in the world, which were isolated in the 1980’s, with all GRSV and TCSV available in GenBank and/or sequenced in our Lab. After a stringent analysis of the M RNA of the TCSV and GRSV phylogeny, we were able to conclude that, probably, these two species share the same M segment. In this case, we hyptothesize that the reassortant event between GRSV and TCSV occurred in a distant past (at least 30 years ago), and not recently, as reported in USA. However, it is not possible to detect the parental segment due to the lack of sequence information in the database. The world distribution of TCSV, TSWV and Iris yellow spot virus (IYSV) were also studied in this work verified by phylogeography analysis. The results aimed to gather information in order to improve the effiency of breeding programs searching for resistant or tolerant genotypes to tospovirus infection and to implement quarantine procedures. In this analysis, we could verify that the distribution of the isolates seems to be local and not global and the world dissemination of the topoviruses was related to economic activities among the countries.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, 2015. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2015-04-24T19:10:51Z No. of bitstreams: 1 2015_MikhailOliveiraLeastro.pdf: 92814410 bytes, checksum: eb021fb7d64694c4b40e528ee3fdb818 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2015-04-28T17:56:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_MikhailOliveiraLeastro.pdf: 92814410 bytes, checksum: eb021fb7d64694c4b40e528ee3fdb818 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-28T17:56:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_MikhailOliveiraLeastro.pdf: 92814410 bytes, checksum: eb021fb7d64694c4b40e528ee3fdb818 (MD5) / Vírus de planta desenvolveram uma classe de proteínas responsáveis por garantir a infecção e disseminação viral. Estudos vêm demonstrando que essa classe de proteínas de movimento (MPs), interage com o plasmodesma (PD), aumentando o seu limite de exclusão (LEP), possibilitando a passagem dos vírus. Várias estratégias são utilizadas para o estudo de movimento viral. Alguns sistemas baseiam-se na utilização de clones infecciosos que possibilitam a inserção de genes heterólogos de MPs. Para o estudo do movimento célula à célula e sistêmico utilizamos o vetor viral Alfalfa mosaic virus (AMV). O sistema consiste na utilização de transgênicos P12 em combinação com transcritos do RNA 3 adaptados para a inserção de genes heterólogos. Com base neste sistema, demonstramos que a proteína de movimento NSm, pode ter relação com a limitação ou amplitude no espectro de infecção viral devido às diferenças significativas observadas no movimento célula à célula e sistêmico de tospovírus que apresentam características moleculares e biológicas distintas (Capítulo II). Concluímos que a movimentação das espécies do gênero tospovírus é dependente da formação de vírions baseado no contexto AMV de infecção e movimentação (Capítulo II). Também concluímos que as MPs de 4 espécies de tospovírus estudadas, são eficientes na formação de túbulos. Em ensaios de truncamento das MPs observamos que para o BeNMV, o extremo C-terminal não é essencial para o movimento, a partir da identificação do limite de aminoácidos que poderiam ser deletados da MP sem inibição do movimento célula à célula. Contrastantemente, as MPs dos vírus CSNV, TCSV e TSWV demonstraram a necessidade da integridade da proteína para garantia do movimento (Capítulo II). Com a utilização das metodologias de “biomolecular fluorescence complementation” (BiFC) e tratamentos químicos com Na2CO3 e Ureia, a partir das MPs, sugerimos que as NSm se associam a membrana de forma periférica. Baseado em predições de hidrofobicidade e orientação topológicas (BiFC topology) sugerimos o modelo de interação da NSm com membrana celular, onde a região central hidrofóbica está mergulhada na periferia das membranas lipídicas e os extremos C e N-terminal livres apontados ao citoplasma (Capítulo III). Finalmente, com a metodologia de BiFC de interação, a partir de ensaios de dímeros, heterodímeros, intra-associação e inter-associação de homólogos e heterólogos de MP e NP (nucleoproteína) observamos que: i) todas NSm e N são eficientes na formação de dímeros ii) as NSm interagem com a sua N cognata e iii) nós observamos interação entre NSm, N e NSm-N entre espécies distintas de tospovírus. Estes resultados podem facilitar uma melhor interpretação das interações de proteína viral com especial ênfase na compreensão das questões de infecção mista. Além do uso de transgênicos na expressão de proteínas heterólogas para geração de resistência, abordagens através do uso de resistência natural também vem sendo exploradas contra espécies do gênero Tospovirus. O presente estudo avaliou o envolvimento de 4 NSm de distintos tospovírus com a resposta de resistência (reação de hipersensibilidade e necrose) mediada pelo gene Sw5-b inserido em plantas de Nicotiana benthamiana. Substituições dos aminoácidos de posição C118Y e T120N da proteína NSm, caracterizados como cruciais para resistência foram realizados. BeNMV, CSNV, TCSV e TSWV NSm wt fusionadas a HA (Hemagglutinin), em processo de agroinfiltração, foram desafiadas contra plantas de N. benthamiana transformadas com gene Sw5-b. Observamos a possível quebra de resistência a partir da NSm do BeNMV, onde não observou-se reação necrótica. Plantas infiltradas com as demais NSm reagiram com resposta necrótica (Capítulo IV). Novo ensaio com vetores contendo as NSm com modificação dos aminoácidos C118 por Y e T120 por N foi desenvolvido. Baseado no resultado do ensaio anterior, as MPs que continham os aminoácidos essenciais para ruptura da resistência, foram modificadas por aminoácidos que não garantem a ruptura e o contrário foi feito para aquelas MPs que não ultrapassaram a resistência. Com base nessa abordagem observamos que CSNV, TCSV e TSWV NSm superaram a resistência sem a formação de necrose foliar, resultado que difere do observado com as mesmas MPs sem mutação, e intrigantemente, a BeNMV NSm aparentemente também superou a resistência sem a formação de lesões locais e necrose foliar após a modificação dos aminoácidos, dado contrastante. No contexto de infecção viral utilizando o sistema AMV, não obtivemos resultados satisfatórios de manutenção ou ruptura da resistência. (Capítulo V). No gênero Tospovirus, pouco se sabe sobre o sítio de replicação ou sobre envolvimento de organelas celulares com o processo de infecção. Existem apenas evidências de expressão isolada das proteínas virais co-localizando com filamentos de Actina e miosina, Membrana, ER e Complexo de Golgi. No presente estudo, com auxílio de metodologia de BiFC, além de ensaio com expressão heteróloga da NSm no contexto de infecção do vírus Potato virus X (PVX), visualizamos a associação da NSm de tospovírus com cloroplatos. Hipotetizamos o possível envolvimento dessa organela com processo de infecção dos tospovírus (Capítulo IV).

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2015. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-09-16T15:51:30Z No. of bitstreams: 1 2015_AthosSilvadeOliveira.pdf: 12748933 bytes, checksum: 9219eb4b52c4419292e5b3c66c671f0e (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-11-24T15:34:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_AthosSilvadeOliveira.pdf: 12748933 bytes, checksum: 9219eb4b52c4419292e5b3c66c671f0e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-11-24T15:34:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_AthosSilvadeOliveira.pdf: 12748933 bytes, checksum: 9219eb4b52c4419292e5b3c66c671f0e (MD5) / Tomato spotted wilt virus (TSWV) bem como outras espécies de tospovírus (Família Bunyaviridae) é responsável por perdas substanciais na produção de vegetais ao redor do mundo. Tospovírus são transmitidos de maneira circulativa e propagativa por tripes (Ordem Thysanoptera). Como para outros patógenos, ações contra tospovírus exigem um olhar holístico, envolvendo uma combinação de táticas culturais, fitosanitárias, químicas e biológicas, quando apropriadas, além do uso de cultivares resistentes. Entretanto, o controle de doenças causadas por tospovírus tem se mostrado difícil, dado o grande espectro de hospedeiros desses vírus e a grande eficiência dos tripes vetores em transmiti-los. Além disso, a dependência e o aumento no uso de inseticidas de baixo custo tem exacerbado a presença de tospovírus pela forte pressão de seleção sobre os tripes vetores que se tornam resistentes a diferentes inseticidas. Para solucionar de forma simples todas as questões financeiras e ambientais associadas ao uso abusivo de inseticidas para o controle de tripes, esforços têm aumentado para a obtenção de cultivares geneticamente resistentes como um componente integral das estratégias de controle de doenças. Até o momento existem duas fontes de resistência disponíveis para o melhoramento genético de hortaliças à TSWV. Uma dessas fontes é o cluster genético Sw-5, o qual foi encontrado em Solanum peruvianum L., uma espécie de tomate selvagem do Peru, e tem sido introduzido em cultivares de S. lycopersicum L. (tomate comercial). Após mapeamento gênico, pelo menos cinco parálogos compõem o cluster genético Sw-5 em S. peruvianum, os quais foram nomeados de Sw-5a a Sw-5e. Esses parálogos codificam receptores do tipo NB-LRR, uma classe de proteínas citoplasmática que ativam resistência após reconhecimento direto ou indireto de patógenos que tenham ultrapassado as primeiras barreiras de defesa do sistema imune vegetal. Transformação de plantas de tabaco com os parálogos Sw-a e Sw-5b revelou que somente o último ativa resistência contra isolados de TSWV. Com a disponibilidade do genoma do tomate, genes ortólogos também foram mapeados em S. lycopersicum. Esta tese inicia-se com uma descrição detalhada do sistema imune vegetal e descobertas anteriores sobre o cluster genético Sw-5 (Capítulo 1). Como parte da introdução, os problemas causados por tospovírus e suas características são descritas. Tendo essas informações como ponto de partida, esta tese focou no entendimento de pontos-chaves da resistência mediada pela proteína Sw-5b contra tospovírus com uma atenção especial nos eventos moleculares e celulares envolvidos atrás desse mecanismo de resistência. Análises funcionais foram realizadas para esclarecer as delimitações genéticas entre os ortólogos funcionais e não funcionais do cluster Sw-5 no reconhecimento de tospovírus e ativação de resistência. Já que transformantes de N. tabacum com o gene Sw-5b feitos anteriormente não apresentaram resposta hipersensitiva (HR) após inoculação com TSWV, plantas de N. benthamiana foram transformadas com o gene Sw-5b buscando linhas transgênicas que poderiam responder com HR e assim facilitar a identificação do determinante de avirulência (Avr) de TSWV (Capítulo 2). Enquanto N. tabacum foi transformada com o gene Sw-5b sob controle de seus próprios elementos regulatórios, N. benthamiana foi transformada com o gene Sw-5b sob controle do promotor 35S do Cauliflower mosaic virus (CaMV). De forma interessante, as plantas transformadas de N. benthamiana apresentaram forte HR após inoculação de suas folhas com TSWV e outras quatro espécies de tospovírus: Alstroemeria necrotic streak virus (ANSV), Tomato chlorotic spot virus (TCSV), Groundnut ringspot virus (GRSV) and Impatiens necrotic spot virus (INSV) (Capítulos 2 e 7). Para identificação do Avr, os genes de TSWV foram clonados e expressos individualmente em folhas de N. benthamiana expressando Sw-5b e em isolinhas de tomate resistentes (contendo Sw-5) para monitoramento de HR. Como resultado, HR foi induzida após expressão da proteína não-estrutural NSM do isolado BR-01 de TSWV que induz resistência, mas não do isolado GRAU de TSWV que quebra resistência (Capítulo 2). Foco sobre a proteína NSM seguiu no capítulo 3. Versões truncadas dessa proteína foram transientemente co-expressas com Sw-5b em folhas de N. benthamiana (wild type). Tais versões truncadas excluíam domínios anteriormente associados com formação de túbulos, movimento viral célula-célula e sistêmico. Proteínas NSM truncadas faltando até 50 aminoácidos (aa) de ambos N e C terminais (NSM inteira contém 301 aa) ainda induziram HR, sugerindo que funções associadas ao movimento viral e comportamento como Avr são características independentes para NSM. No capítulo 4 experimentos foram realizados para caracterizar uma nova espécie de tospovírus observado em plantas de feijão que apresentavam sintomas de mosaico necrótico em São Paulo, Brasil (2006). Microscopia eletrônica de folhas sintomáticas revelou partículas pleiomórficas agrupadas em vesículas. Devido ao fato de feijão ser um hospedeiro não usual e pelo resultado negativo em testes de ELISA para outras espécies já conhecidas por circular no Brasil, testes biológicos, sorológicos e moleculares foram realizados para caracterização de uma provável nova espécie de tospovírus. Este vírus apresentou um estreito espectro de hospedeiros, infectando sistemicamente três de vintes espécies de plantas indicadoras e apresentou propriedades sorológicas únicas quando comparado com outras espécies de tospovírus encontradas no Brasil. O sequenciamento do genoma deste tospovírus revelou uma nova espécie que, junto com Soybean vein necrosis-associated virus (SVNaV), representa uma nova linhagem evolutiva de tospovírus circulando no continente americano. Este tospovírus foi tentativamente chamado Bean necrotic mosaic virus (BeNMV). Já que a proteína Sw-5b reconhece pelo menos cinco espécies de tospovírus de origem “americana”, a proteína NSM do BeNMV também foi testada para monitoramento de HR através de sua co-expressão com Sw- 5b em folhas de N. benthamiana. O resultado, entretanto, mostrou que a proteína NSM do BeNMV não é um Avr cognato da proteína Sw-5b. No capítulo 5 é mostrado que a proteína Sw-5b induz HR dependentemente e independentemente da presença de NSM. A forma independente foi observada através da coexpressão da proteína Sw-5b com supressores de silenciamento gênico (p19 e NSS), os quais aumentaram a acumulação celular da proteína Sw-5b, induzindo auto-HR. Esta observação permitiu o screening de indução de HR e reconhecimento de NSM como eventos independentes para as outras proteínas Sw-5. Enquanto Sw-5a induziu auto-HR, ela não foi capaz de reconhecer NSM como Avr. De forma diferente, o ortólogo mais conservado das proteínas Sw- 5a e Sw-5b de S. lycopersicum susceptível a TSWV, nomeado Sw-5aS, não induziu qualquer tipo de HR. Através da co-expressão dos domínios individuais de Sw-5b, CC, NB-ARC, LRR ou de versões combinadas (CC-NB-ARC e NB-ARC-LRR) com NSM e com o supressor de silenciamento gênico p19, o papel desses domínios na indução de HR e no reconhecimento de NSM foram determinados. Enquanto NB-ARC foi suficiente para induzir auto-HR, NB-ARC-LRR induziu tanto auto quanto HR dependente de NSM, indicando que o domínio LRR especifica o reconhecimento do Avr. Já o domínio CC suprimiu HR induzida por NB-ARC em cis e trans, apontando para uma função regulatória de CC. A superexpressão do domínio NB-ARC de Sw- 5aS não resultou em HR, similar ao resultado da proteína Sw-5aS completa. Após alinhamento dos domínios NB-ARC, três variações de aminoácidos (aa) foram encontradas entre as proteínas Sw-5a, Sw-5b e Sw-5aS, os quais foram revertidos no último. Quando a glutamina da posição 599 foi convertida em uma arginina (Q599R), igual a proteína Sw-5b nesta posição, o domínio NB-ARC da proteína Sw-5aS tornou-se funcional para indução de HR. Modelagem deste domínio revelou que esta mutação encontra-se fora do domínio de ligação de ADP/ATP, o qual é importante para o switching entre os estados on e off dos domínios NB-ARC. Finalmente, a fusão do domínio LRR da proteína Sw-5b na variante Q599R do domínio NBARC de Sw-5aS resultou em auto-HR e HR dependente de NSM. Os construtos codificando os domínios da proteína Sw-5b também foram usados para estudos subcelulares no capítulo 6. Para este propósito, todas as proteínas estavam fusionadas a Green Fluorescence Protein (GFP) na porção N-terminal para tornar possível a visualização por microscopia confocal em tecido folhear. Enquanto a proteína Sw-5b inteira, os domínios CC, NB-ARC e LRR e o combinado CC-NB-ARC apresentaram distribuição nucleocitoplasmática, NB-ARC-LRR localizou-se somente no citoplasma, sugerindo que CC sinaliza o importe nuclear. Os domínios NB-ARC e LRR também foram investigados para uma possível interação direta com NSM através da técnica Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC). Enquanto interação direta não foi observada entre LRR e NSM, o domínio NB-ARC aparentou interagir com NSM. As especificidades para o reconhecimento de NSM como Avr são discutidas no capítulo 7, levando em consideração aspectos evolutivos de tomates e tospovírus. Um modelo da ativação da proteína Sw-5b é postulado no texto tendo como base a dissecção desta proteína e os ensaios de localização subcelular, além de sua putativa interação direta com NSM. / Tomato spotted wilt virus (TSWV) along with other tospovirus species (family Bunyaviridae) is responsible for substantial losses in crop production around the world. Tospoviruses are transmitted in a propagative and circulative manner by thrips vectors (Order Thysanoptera). As for other pathogens, disease management against tospoviruses pursues a holistic approach involving a combination of cultural, phytosanitary, chemical, and biological tactics, when suitable in addition to the use of resistant crops. Nevertheless, successful control has proven difficult given the broad host range of these viruses and their effective spread by thrips vectors. More importantly, increased reliance on the use of low-cost insecticides has exacerbated tospovirus spread by causing thrips resistance. To ease the financial and environmental constraints associated with insecticide abuse to control thrips, efforts have been increased to obtain genetically resistant cultivars as an integral component of disease management strategies. So far there are two resistance sources available for commercial breeding of vegetables against TSWV. One of these sources is the Sw-5 gene cluster, which has been found in Solanum peruvianum L., a wild species of tomato from Peru, and has been introgressed in S. lycopersicum L. cultivars (commercial tomatoes). After gene mapping, it has been reported that at least five paralogs compose the Sw-5 gene cluster in S. peruvianum, which were named Sw- 5a to Sw-5e. These paralogs encode NB-LRR receptors, a class of cytoplasmic proteins that activate disease resistance upon direct or indirect recognition of pathogens that have overcome the first lines of defense of the plant immune system. Transformation of tobacco plants with the paralogs Sw-5a and Sw-5b, revealed that only the latter triggers resistance against TSWV isolates. With the availability of the tomato genome, highly conserved orthologs have been mapped in S. lycopersicum as well. This thesis started off with a detailed description of the plant immune system and previous findings about the Sw-5 gene cluster (Chapter 1). As part of this introduction, the problems caused by tospoviruses, to which Sw-5b locus confers resistance and the characteristics of these viruses have been described. With this knowledge as a starting point, this thesis focused on unraveling the key features of Sw-5b-mediated resistance against TSWV with special attention to the molecular and cellular events underlying the resistance mechanism. Functional analyses have been performed towards clarification of the genetic delimitations between functional and non-functional Sw-5 orthologs considering tospovirus recognition and resistance triggering. Since earlier made N. tabacum transformants containing Sw-5b did not show a hypersensitive response (HR) upon challenging with TSWV, N. benthamiana have been transformed with Sw-5b aiming to obtain transgenic lines that would respond with a visual HR and thereby facilitate the identification of the avirulence determinant (Avr) from TSWV (Chapter 2). While N. tabacum plants were transformed with Sw-5b gene under control of its own regulatory elements, the N. benthamiana plants were transformed with the Sw-5b gene under control of the Cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter. Interestingly, the Sw-5btransformed N. benthamiana plants presented a strong HR upon challenging with TSWV and four other tospoviruses: Alstroemeria necrotic streak virus (ANSV), Tomato chlorotic spot virus (TCSV), Groundnut ringspot virus (GRSV) and Impatiens necrotic spot virus (INSV) (Chapter 2 and 7). To identify the Avr, TSWV genes were cloned and expressed individually in leaves of Sw-5b-transformed N. benthamiana plants and Sw-5-resistant tomato isolines for HR monitoring. As a result, HR was triggered upon expression of the non-structural protein NSM from the resistance-inducing TSWV isolate BR-01, but not from the resistance-breaking TSWV isolate GRAU (Chapter 2). The research on NSM was continued in Chapter 3, in which truncated versions of this protein were transiently co-expressed with Sw-5b in wild type N. benthamiana leaves. These truncations lacked domains previously associated with tubule formation, cell-tocell and systemic viral movement. Truncated NSM proteins lacking up to 50 amino acids (aa) from either the N- or C-terminus (full NSM is 301 aa in size) still triggered Sw-5b-mediated HR, suggesting that viral movement functions of NSM and its fate as Avr are independent from each other. Chapter 4 described experiments to characterize a new tospovirus collected from bean plants showing necrotic mosaic symptoms during a field survey in São Paulo, Brazil (2006). Electron microscopy of symptomatic leaves revealed pleomorphic particles packed in vesicles. Due to its unusual natural host for a “Brazilian” tospovirus and being negative in ELISA for tospovirus species known to be circulating in Brazil, biological, serological, and molecular tests were performed to further characterize this putatively new tospovirus species. The virus appeared to have a narrow host-range, systemically infecting only three out of twenty test-plants of various species and presented unique serological properties when compared to other known tospovirus species. The genome sequencing of this tospovirus revealed a completely new species, which, together with Soybean vein necrosis-associated virus (SVNaV), represents a second evolutionary lineage of tospoviruses circulating in the American continent. This new tospovirus was tentatively named Bean necrotic mosaic virus (BeNMV). Since the Sw-5b protein recognizes at least five tospovirus species of “American” origin, the NSM protein of BeNMV was also tested for HR-triggering through co-expression with Sw-5b in N. benthamiana leaves. The outcome, however, indicated that the NSM protein of BeNMV is not a cognate Avr of the Sw-5b protein. In Chapter 5 it is shown that the Sw-5b protein triggers both NSM-dependent and - independent HR. The latter was achieved by co-expression of Sw-5b with RNA silencing suppressors (p19 and NSS), which increased the Sw-5b cellular accumulation and lead to auto- HR. This observation allowed the screening of HR-triggering and NSM-recognition as uncoupled events for other Sw-5 proteins as well. While Sw-5a could trigger auto-HR, it lacked the ability to recognize NSM as Avr. On the other hand, the highest conserved ortholog of Sw-5a and Sw-5b from susceptible S. lycopersicum, named here as Sw-5aS, lacked both auto-HR and NSMdependent HR. By co-expression of the individual Sw-5b domains CC, NB-ARC, LRR or combined versions (CC-NB-ARC and NB-ARC-LRR) with NSM and the silencing suppressor p19, the role of these domains in HR-triggering and NSM-recognition was determined. While NBARC was sufficient for auto-HR, NB-ARC-LRR triggered both auto- and NSM-dependent HR, indicating that LRR specifies the Avr recognition. The CC domain suppressed HR triggered by NB-ARC in cis and trans, pointing towards a regulatory function for CC. The overexpression of the NB-ARC domain from Sw-5aS did not result in HR, similar to the outcome with the full-length Sw-5aS protein. After alignment of the NB-ARC domain, three mismatches were found between Sw-5a, Sw-5b, and Sw-5aS which were reverted in the latter. When the glutamine at position 599 was converted into an arginine (Q599R), to mimic the situation in the Sw-5b protein at this position, the Sw-5aS NB-ARC domain became functional for auto-HR triggering. Modeling of this domain revealed that this mutation was outside of the ADP/ATP binding site, which is important for the switching between “on” and “off” states of NB-ARC domains. Finally, the fusion of the LRR domain of Sw-5b to the Q599R variant of the Sw-5aS NB-ARC domain resulted in both auto- and NSM-dependent HR. The constructs encoding the various Sw-5b domains were used for subcellular studies in Chapter 6. To this end, all constructs encoded proteins were fused with Green Fluorescence Protein (GFP) at their N-terminus, to enable easy visualization by confocal microscopy in leaf tissue. Whereas the full-length Sw-5b protein, the individual domains CC, NB-ARC, and LRR and the combined CC-NB-ARC version showed a nucleocytoplasmic distribution, NB-ARC-LRR localized only in the cytoplasm, suggesting that CC signalizes nuclear import. The subdomains NB-ARC and LRR were also investigated for a possible direct interaction with NSM using Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC). While for LRR interaction with NSM was not observed, the NB-ARC domain seemed to directly bind to NSM. The specificities for NSM recognition have been discussed in Chapter 7 taking into consideration evolutionary aspects of tomatoes and tospoviruses. A model for Sw-5b activation is postulated throughout the text based on the dissection of this protein in HR-triggering and subcellular localization assays and on its putative direct interaction with NSM.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, 2016. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2016-04-07T12:59:49Z No. of bitstreams: 1 2016_TadeuAraujoSouza.pdf: 1810896 bytes, checksum: 875d57d95829fcdd5ba22d41167265c1 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-04-07T16:48:40Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_TadeuAraujoSouza.pdf: 1810896 bytes, checksum: 875d57d95829fcdd5ba22d41167265c1 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-07T16:48:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_TadeuAraujoSouza.pdf: 1810896 bytes, checksum: 875d57d95829fcdd5ba22d41167265c1 (MD5) / O tomateiro (Solanum lycopersicum) é um das hortaliças mais cultivadas em todo o mundo, inclusive no Brasil, principalmente pelas suas características nutricionais e pela sua importância sócio econômica. Essa cultura pode ser alvo de uma grande diversidade de pragas, incluindo alguns grupos de vírus. Entre os principais encontram-se as espécies dos gêneros Begomovirus, Tospovirus e Crinivirus. Os crinivírus são vírus emergentes, com duas espécies conhecidas em tomateiro Tomato chlorosis virus (ToCV) e Tomato infectious chlorosis virus (TICV) e que foram identificadas em meados da década de 90, nos Estados Unidos. No Brasil, até o momento, apenas ToCV foi relatado infectando o tomateiro. Geneticamente, o ToCV é composto por duas moléculas de RNA fita simples, encapsidadas em partículas virais longas e flexuosas. A transmissão é feita por três espécies de moscas-brancas: Bemisia tabaci, Trialeurodes vaporariorum e T. abutiloneus. Em tomateiro, o principal sintoma caracteriza-se por manchas cloróticas que desenvolvem uma clorose internerval intensa, visualizada principalmente nas folhas baixeiras. O primeiro relato de ToCV no Brasil ocorreu em 2008 e, desde então, este vírus tem sido encontrado nas principais regiões produtoras de tomate do país, porém ainda é pouco estudado. Devido a essa demanda de pesquisa, o objetivo desse trabalho foi determinar a gama de hospedeiros do ToCV no Brasil. Foram avaliadas 50 espécies dentre elas, plantas cultivadas e não cultivadas, inoculadas com ToCV pelo inseto vetor (B. tabaci biótipo B). Do total de plantas avaliadas, nove espécies foram suscetíveis ao isolado testado de ToCV, indicando a potencial capacidade dessas plantas de atuarem como hospedeiras alternativas de ToCV em campo. Concluiu-se então que é necessária maior preocupação com as plantas Amaranthus hibridus, Solanum americanum, Nicandra physaloides e Physalis angulata, pois além de suscetíveis a ToCV, são plantas altamente infestantes em lavouras de tomate e potenciais hospedeiras alternativas do vírus na ausência ou na presença da cultura. Na ausência de tomateiro nas áreas de produção, o virus pode permanecer nas hospedeiras alternativas e, na presença de tomateiro, tais hospedeiras são potencias fontes de inóculo de ToCV. O sinergismo entre ToCV e o tospovírus Tomato spotted wilt virus (TSWV) foi recentemente relatado na Espanha. Nessa interação, há aparentemente um favorecimento da infecção de TSWV em plantas resistentes (com gene Sw-5), quando previamente infectadas por ToCV. Por se tratar de um relato preocupante, parte desse trabalho foi então desenvolvido para avaliar esse sinergismo entre ToCV e tospovírus em tomateiro. Foram selecionadas as cultivares resistentes a tospovírus, Predador e Viradoro, e a cultivar suscetível Dominador, utilizada como controle nos ensaios. As cultivares de tomateiro resistentes foram previamente infectadas por ToCV pelo inseto vetor e, posteriormente, inoculadas com os tospovírus Tomato chlorotic spot virus (TCSV) e Groundnut ringspot virus (GRSV). Após a inoculação, as plantas resistentes não foram infectadas pelos tospovírus, avaliadas visualmente e por teste sorológico (Dot-Elisa). Adicionalmente, foi utilizado outro modelo biológico com Nicotiana benthamina não transgênica e transgênica, transformada constitutivamente com o gene Sw-5. As plantas transgênicas resistentes previamente infectadas por ToCV e posteriomente inoculadas com os tospovírus apresentaram sintoma de lesão local, indicando resistência e ausência de infecção sistêmica. A infecção prévia de ToCV não alterou a expressão do gene Sw-5, responsável por conferir resistência a tospovírus em plantas de tomate e N. benthamiana. Estudos para identificar hospedeiras alternativas de ToCV e compreender o comportamento dos vírus em casos de infecção mista constituem ações indispensáveis para o sucesso de qualquer estratégia de controle. ________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The tomato (Solanum lycopersicum) is one of the most cultivated vegetables around the world, including Brazil, mainly by their nutritional characteristics and socio-economic importance. This crop is affected by a large variety of pests and pathogens, including some viruses. The major species are found within the genus Begomovirus, Tospovirus and Crinivirus. The criniviruses are emerging viruses, with two known species in tomato Tomato chlorosis virus (ToCV) and Tomato infectious chlorosis virus (TICV). They were identified in the mid 90s, in the United States. In Brazil, only ToCV was reported in tomatoes. Genetically, ToCV consists of two single-stranded RNA molecules, encapsidated in long and flexuous viral particles. They are transmitted by three whitefly species: Bemisia tabaci, Trialeurodes vaporariorum and T. abutiloneus. In tomato, the main symptoms are characterized by chlorotic spots, which evolve to strong internerval chlorosis, mainly visualized in the lower leaves. The first report of ToCV in Brazil was made in 2006 and since then the virus has been found in the main producing regions of tomato of the country. However, it has been poorly studied. Due to this demand, the aim of this study was to determine the host range of ToCV in Brazil. A total of 50 species of cultivated and non-cultivated plants was tested in inoculation with ToCV by the insect vector (B. tabaci biotype B). Nine species were shown to be susceptible to ToCV infection, indicating the potential ability of these plants to act as alternative hosts of ToCV in the field. Therefore, it was concluded that the growers are concerned with the following plants: Amaranthus hibridus, Solanum americanum, Nicandra physaloides and Physalis angulata. They were all susceptible to ToCV, and are frequently found in tomato crops. They are potential virus alternative hosts in the absence of tomato plants, and when tomatoes are present, they can act as inoculum source of ToCV to these plants. The possible synergism between ToCV and the tospovirus Tomato spotted wilt virus (TSWV) was recently reported. In this interaction, apparently a ToCV infection foster TSWV infection in TSWV-resistant plants (contatining the Sw-5 gene). The interaction between two or more viruses can result in unexpected pathological consequences and because of this possible impact in the Brazilian tomato production, we evaluated this synergism between ToCV and tospovirus in tomatoes in the Brazilian conditions. The tospovirus-resistant cultivars Predador and Viradoro were selected, and the susceptible cultivar Dominador was used as control in the assays. Resistant tomato cultivars were previously infected with ToCV by the insect-vector and then inoculated with tospoviruses Tomato chlorotic spot virus (TCSV) and Groundnut ringspot virus (GRSV). After inoculation, the resistant plants were not infected, confirmed by visual inspection and a sorologic test (Dot-Elisa). In addition, a similas test was performed using transgenic and non-transgenic Nicotiana benthamiana plants, which are constitutively transformed with the gene Sw-5. The resistant transgenic plants previously infected with ToCV and subsequently inoculated with TCSV and GRSV showed local lesion symptoms, indicating resistance and absence of systemic infection. The prior infection of the resistant plants with ToCV did not alter the expression of the Sw-5 gene. It is believed that this absence of resistance breakdown is possibly associated with the tomato variety and the viral species that were used. The identification of alternative hosts of ToCV and undertanding the interaction of the viruses in cases of mixed infection are essential information to enable the success of any virus control strategy.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-05-03T10:38:37Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 5867083 bytes, checksum: 916fdcf3e282fa36b460ff1928933f7c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-03T10:38:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 5867083 bytes, checksum: 916fdcf3e282fa36b460ff1928933f7c (MD5) Previous issue date: 2005-04-15 / O gene Sw-5, membro de uma família multigênica com membros dispersos nos cromossomos 9 e 12 do tomateiro, é o principal gene de resistência a tospovírus utilizado nos programas de melhoramento de tomateiro para a indústria e para mesa. O acesso LA 371 de Lycopersicon peruvianum possui resistência de amplo espectro a tospovírus e estudos de introgressão e análise genética da resistência demonstraram que a resistência desse acesso é determinada por um gene dominante localizado no loco Sw-5 ou em um loco proximamente ligado. Estudos prévios haviam levantado a hipótese de que oligonucleotídeos que anelam nas regiões correspondentes ao início da ORF codificada por Sw-5 e na região 5’ deste gene poderiam amplificar seqüências do loco Sw-5 e de um loco proximamente ligado. Esta hipótese foi confirmada neste trabalho. Utilizando esses oligonucleotídeos foram amplificados e clonados dois genes homólogos ao Sw-5, denominados de homólogo 1 e homólogo 2, a partir de DNA extraído de uma planta resistente a tospovírus denominada EP-1 derivada do acesso LA 371. As proteínas putativas codificadas por esses homólogos apresentam 92,94 % de similaridade diferindo em 82 aminoácidos. A proteína 2 é mais similar à proteína codificada pelo gene Sw-5 (99,28%) sugerindo que o homólogo 2 é responsável pela resistência a tospovírus encontrada em LA 371. Essas seqüências foram transferidas para o vetor binário pBI121 e experimentos de transformação encontram-se em andamento visando à comprovação da função desses homólogos na resistência de LA 371 a tospovírus. / The gene Sw-5, member of a multigenic family with members dispersed in tomato chromosomes 9 and 12, is the most used tospovirus resistance gene in tomato breeding programs. The Lycopersicon peruvianum accession LA 371 has a broad-spectrum toposvirus resistance. Genetic analysis has demonstrated that a dominant gene located in the Sw-5 locus or in a closely linked locus is responsible for tospovirus resistance of this accession. Prior studies suggested that oligonucleotides with complementary sequences corresponding to the terminal regions of the Sw-5 ORF would be able to amplify sequences from the Sw-5 locus and from one closely linked locus. This hypothesis was confirmed in this work. DNA extracted from a tospovirus resistant plant called EP-1, derived from the accession LA 371, was used as template for PCR amplification. The PCR product was cloned and restriction analysis revealed that two Sw-5 homologous sequences, called homologous 1 and homologous 2, had been cloned. The putative protein codified by these homologous display 92.94% of similarity for each other, differing in 82 amino acids. The protein coded by homologous 2 is more similar to Sw-5 protein (99.28%) suggesting that this homologous is responsible for the LA 371 tospovirus resistance. These sequences were transferred to the binary vector pBI121 and transformation experiments are in progress aiming to test this hypothesis. / Dissertação importada do Alexandria

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2016. / Submitted by Marianna Gomes (mariannasouza@bce.unb.br) on 2016-12-08T16:35:33Z No. of bitstreams: 1 2016_AndréGustavoMachadoBertran.pdf: 53030977 bytes, checksum: 8b87d46e5db736462cd27c947d0fa8ec (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-01-31T17:09:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_AndréGustavoMachadoBertran.pdf: 53030977 bytes, checksum: 8b87d46e5db736462cd27c947d0fa8ec (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-31T17:09:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_AndréGustavoMachadoBertran.pdf: 53030977 bytes, checksum: 8b87d46e5db736462cd27c947d0fa8ec (MD5) / As espécies do gênero Tospovirus são importantes patógenos vegetais efontes de prejuízo à produção agrícola mundial. Os tospovírus são membros da famíliaBunyaviridae de vírus de (-)ssRNA com genoma tri-segmentado denominado L, M e S RNAs. Arelação entre o vetor e o vírus é do tipo circulativa-propagativa e sabe-se que a presença deRNAs Defectivos-Interferentes (DI-RNAs) pode interferir negativamente na habilidade de umisolado viral ser transmitido pelo inseto vetor. Nesta tese de doutorado, os capítulos 1 e 2apresentam a descoberta, a caracterização molecular e estrutural, o estudo da dinâmica deacumulação e efeitos biológicos de um novo tipo de RNA defectivo viral: RNAs Diméricos-Imperfeitos (ID-RNAs). OS ID-RNAs são moléculas de RNA viral resultantes de duplicações dosegmento S RNA apresentando deleções, ou na região 3’UTR do primeiro monômero, ou naregião 5’UTR do segundo monômero, mas nunca nas duas regiões UTR simultaneamente. OsID-RNAs foram encontrados até o momento em Polygonum ringspot virus (PolRSV) e TSWVinfectando a planta modelo Nicotiana benthamiana. O acúmulo de ID-RNAs é modificado pelatemperatura de incubação das plantas: a baixas temperaturas (18˚C) há inibição, enquanto aaltas temperaturas (30˚C) há incremento. Interessantemente, os ID-RNAs caracterizados para oisolado p105 de TSWV parecem ter influenciado negativamente o acúmulo das proteínas viraisNSm e N. O capítulo 3 apresenta o resultado de diversas estratégias para o desenvolvimento deum sistema de genética reversa para tospovírus em modelos vegetais in vivo e in vitro e modelosanimais in vitro (células de hamster e mosquito). Dentre as abordagens testadas, a expressãoheteróloga das proteínas N e L de TSWV em células de hamster foi capaz de reconhecer,replicar e transcrever em mRNA o gene-repórter mGFP4 presente em uma construção sintéticade mini-genoma tipo-DI-RNA. Curiosamente, a transfecção do mini-genoma apenas na presençada expressão heteróloga da proteína L também levou a atividade do gene-repórter. Demonstrouseainda que a adição a esse sistema de um plasmídeo dirigindo a transcrição do S RNA deTSWV foi capaz de retardar a expressão do gene-repórter. Adicionalmente, descobriu-se que atransfecção do segmento M de TSWV em orientação viral complementar foi capaz de aumentara atividade detectada para o gene-repórter hRLuc em um sistema de genética reversa paraBunyamwera virus. Foram também realizados ensaios de resgate de infecção de TSWV emcélulas de hamster e mosquito nos quais verificou-se a expressão da proteína NSs para umtratamento composto por um conjunto mínimo de plasmídeos dirigindo a transcrição dos trêssegmentos genômicos virais, sem a expressão heteróloga das proteínas N e L (hamster) e aocorrência de efeitos citopáticos caracterizados por mudanças morfológicas e formação desincícios celulares (mosquito). Os resultados qualitativos apresentados no capítulo 3 constituema primeira demonstração científica em toda a literatura científica de um sistema de genéticareversa funcional para TSWV baseado em atividade de mini-replicon. / The tospoviruses are important plant pathogens that causeconsiderable damage to many crops worldwide. The Tospovirus genus is part of the Bunyaviridaefamily of negative ssRNA viruses with tripartite genomes (L, M and S RNAs). Tospoviruses havea circulative-propagative interaction with their insect vectors. It is known that the presence ofDefective-Interfering RNAs (DI-RNAs) in an inoculum can alter the transmissibility of an isolateand interfere with symptom development attenuating it. This doctorate thesis adds to the list ofknown defective viral RNAs for tospoviruses the Imperfect-Dimer RNAs (ID-RNAs), which aredescribed in length in chapter one and chapter two regarding their molecular characterization,structural properties, the dynamics of their accumulation and their biological effects. ID-RNAs aredimer forms of the S RNA that carry in their junction sites a deletion at either the 3'UTR of the firstmonomer or the 5'UTR of the second monomer and are generated specifically in the infection ofthe plant host Nicotiana benthamiana. ID-RNAs were detected so far for Polygonum ringspotvirus (PolRSV) and TSWV. ID-RNA accumulation is modulated by temperature: low incubationtemperatures (18˚C) inhibit ID-RNA accumulation, whereas high incubation temperatures (30˚C)enhance it. The accumulation of ID-RNAs for TSWV isolate p105 had a negative effect over theprotein expression of the NSm and N viral proteins. Lastly, chapter 3 presents the results ofdiverse approaches that were tested for the development of a reverse genetics system fortospoviruses using in vivo and in vitro plant models and in vitro animal models (hamster andmosquito cell lines). In one of the approaches, the heterologous expression of the N and Lproteins of TSWV was carried out in hamster cells and was able to recognize, replicate andtranscribe the mRNA of the mGFP4 reporter-gene contained in a synthetic DI-RNA-like minigenome.Interestingly, the expression of only the L protein in association to the transfection of themini-genome also led to the reporter-gene activity. It was also shown that the transfection of aplasmid that drives the cytosolic transcription of the genomic S RNA in concert with theheterologous expression of the N and L proteins and the transfection of the reporter-carryingmini-genome had a delaying effect on the reporter-gene expression. Moreover, it is shown thatthe transfection of a plasmid driving the transcription of the M RNA from TSWV in viralcomplementary sense in the context of a Bunyamwera virus mini-replicon system promoted anenhancement of the activity of the reporter-gene hRLuc. Infectivity rescue assays were alsoperformed in both hamster and mosquito cells. Protein NSs expression was faintly detected forthe former in a treatment composed only of transcription plasmids for the L, M and S RNAs invirus complementary sense, without heterologous expression of the L and N proteins. For thelatter, cytopathological effects characterized by alteration of cell morphology and syncytiaformation were observed. Taken together, the qualitative results presented in chapter 3 constitutethe first efficient scientific demonstration of a reverse genetics system for tospovirus andrepresent an important hallmark of research for the genus Tospovirus.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-07-10T20:45:08Z No. of bitstreams: 1 2017_MariaGeaneFontes.pdf: 4573833 bytes, checksum: ab50d2e6f2ab5d5e3f1d2ee9a669ced0 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-07-27T20:33:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_MariaGeaneFontes.pdf: 4573833 bytes, checksum: ab50d2e6f2ab5d5e3f1d2ee9a669ced0 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-27T20:33:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_MariaGeaneFontes.pdf: 4573833 bytes, checksum: ab50d2e6f2ab5d5e3f1d2ee9a669ced0 (MD5) Previous issue date: 2017-07-27 / O tomateiro (Solanum lycopersicum L.) é uma das hortaliças mais importantes no Brasil e no mundo. A doença comumente conhecida como ‘vira cabeça’ (causada por espécies de Tospovirus) é uma das mais importantes afetando o tomateiro a nível mundial. Dessa forma, o presente estudo teve como objetivo estudar a interação tomateiro-tospovírus através da análise transcritômica na interação compatível Solanum lycopersicum–Groundnut ringspot virus (GRSV), da avaliação da resistência a tospovírus na cv. ‘Rey de Los tempranos’ (=‘PI 203230’) e da caracaterização de novas espécies hospedeiras de GRSV. No CAPÍTULO II foi realizado um estudo do transcritoma na interação compatível entre a cultivar de tomate ‘Santa Clara’ e GRSV com a finalidade de identificar genes inibidos ou induzidos após inoculação do vírus. Amostras foliares de plantas da cv. ‘Santa Clara’ (mecanicamente inoculadas com um isolado de GRSV e mock-inoculadas) foram coletadas a 0, 3, 5, 7 e 10 dias após a inoculação. Um ‘pool’ equimolar entre os períodos 3-5 (3-5DAI) e 7-10 (7-10DAI) foi estabelecido após a extração do RNA, análise da concentração e da qualidade. Um total de 12 bibliotecas de cDNA foram sequenciadas gerando um total de 396 milhões reads que foram mapeados no genoma de referência do tomateiro. Cerca de 9.206 genes foram diferencialmente expressos na interação S. lycopersicum ‘Santa Clara’ – GRSV. Dentre esses genes 5.562, 5.283 e 3.924 foram identificados como diferencialmente expressos nos períodos 0DAI, 3-5DAI e 7-10DAI, respectivamente. O espectro de eficiência da resistência identificada na cultivar de tomate ‘Rey de Los Tempranos’ foi investigada em bioensaios envolvendo a inoculação mecânica com uma coleção de isolados de Tospovirus (CAPÍTULO III). Plantas da linhagem resistente ‘LAM 147’ (portadora do gene Sw-5) também foram avaliadas e a cv. ‘Santa Clara’ (isolinha suscetível de ‘LAM 147’) foi utilizada como controle suscetível. Os resultados indicaram que a resistência do acesso ‘Rey de Los Tempranos’ se caracteriza como sendo do tipo espécie-específica (funciona somente contra isolados de TSWV) e isolado-específica (alguns isolados de TSWV são capazes de ‘quebrar’ a resistência). Plantas híbridas (F1) resultante de cruzamentos realizados entre ‘Rey de Los Tempranos’ e cv. ‘Santa Clara’ (inoculadas com o isolado TSWV #523) não exibiram sintomas, indicando que esta seria uma resistência conferida por fator(es) dominante(s). No CAPÍTULO IV, amostras foliares com sintomas similares aos induzidos por espécies de Tospovirus (clorose, necrose foliar intensa, mosqueado, anéis concêntricos e deformação foliar) foram coletadas em campos de soja [Glycine max (L.) Merrill], ervilha (Pisum sativum L.), jiló (Solanum aethiopicum L. var. gilo Raddi), almeirão (Cichorium intybus L.) e jurubeba vermelha (S. stramonifolium Jacq.) em Brasília–DF, Brasil. Para a identificação do agente causal dessas doenças foram realizados testes sorológicos, moleculares e bioensaios examinando o círculo de plantas hospedeiras. Resultados dos testes moleculares e sorológicos (ELISA) mostraram que as plantas sintomáticas foram positivas apenas para a espécie GRSV. Todos os isolados foram capazes de induzir sintomas característicos de tospoviroses nos ensaios de círculos de hospedeiras. Desta forma, o presente trabalho também relata pela primeira vez cinco novas espécies como hospedeiras naturais de GRSV em condições brasileiras. / The tomato (Solanum lycopersicum L.) is one of the most important vegetables in Brazil and around the world. The disease universally known as ‘spotted wilt’ is caused by species of Tospovirus and it is one of the most important problems affecting tomato crops worldwide. The main objectives of the present work were to study the tomato–tospovirus interaction via transcriptional analysis of a compatible interaction Solanum lycopersicum–Groundnut ringspot virus (GRSV), to evaluate the spectrum of resistance to tospovirus in the cultivar ‘Rey de Los Tempranos’ (=‘PI 203230’ ) and to characterize new GRSV hosts. A transcriptome study on the compatible interaction between the tomato cultivar ‘Santa Clara’ and GRSV (CHAPTER II) was conducted in order to identify genes inhibited and/or induced after virus infection in ‘Santa Clara’ (a highly susceptible tomato accession). Leaf samples of ‘Santa Clara’ plants mechanically inoculated with one GRSV isolate as well as mockinoculated plants were collected at 0, 3, 5, 7 and 10 days after inoculation (DAI). Equimolar pools of the periods 3-5 (3-5DAI) and 7-10 (7-10DAI) were established after RNA extraction and concentration and quality assessement. Twelve cDNA libraries were sequenced and a total of 396.2 millions reads were mapped into the tomato reference genome. About 9,206 genes were differentially expressed in the interaction S. lycopersicum ‘Santa Clara’–GRSV. Among these genes, 5,283; 5,562 and 3,924 genes were identified as differential expressed in the periods 0DAI, 3-7-5DAI, and 10DAI, respectively. The resistance spectrum of the cultivar ‘Rey de Los Tempranos’ was investigated in bioassays involving mechanical inoculation with 22 tospovirus isolates (CHAPTER III). Plants of the resistant inbred line ‘LAM 147’ (carrying the Sw-5 gene in homozygous condition) were also evaluated and the susceptible cultivar ‘Santa Clara’ (the near isogenic line of ‘LAM 147’) was used as susceptible control. The results indicated that the resistance of ‘Rey de Los Tempranos’ might be characterized as being species-specific (i.e. effective only against TSWV isolates) and isolated-specific (i.e. a subgroup of TSWV isolates was able to overcome the resistance). Hybrid plants (F1) derived from the crosses between ‘Rey de Los Tempranos’ and ‘Santa Clara’ (inoculated with the TSWV #523 isolate) did not exhibit symptoms, indicating that the resistance could be conferred by dominant factor(s). In CHAPTER IV, foliar samples displaying symptoms similar to those induced by Tospovirus species (chlorosis, necrosis, leaf mottling, concentric rings and leaf deformation) were collected in production fields of soybean [Glycine max (L.) Merrill], field pea (Pisum sativum L.), chicory (Cichorium intybus L.), scarlet eggplant (Solanum aethiopicum L. var. gilo Raddi), and red jurubeba (S. stramonifolium Jacq.) in Brasília-DF, Brazil. Serological tests, molecular assays, and host range studies were carried out in order to identify the causal agents of these diseases. Serological tests (ELISA) showed that symptomatic plants were positive only for GRSV. PCR analyses of the soybean, field pea, scarlet eggplant, chicory, and red jurubeba were conducted using primers specific for the nucleocapsid protein (N). The sequence analyses of the tospovirus-derived amplicons displayed high identity with GRSV isolates. All isolates were able to induce characteristic symptoms of tospoviroses in all plant species employed in the host range studies. Thus, the present work also reports for the first time five new plant species as natural hosts of GRSV under Brazilian conditions.

Submitted by Cleber Casali (clebercasali@ufv.br) on 2017-06-28T17:17:51Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 598650 bytes, checksum: 028a6d83725fd48a983ea2b8264aaa29 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-28T17:17:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 598650 bytes, checksum: 028a6d83725fd48a983ea2b8264aaa29 (MD5) Previous issue date: 2001-01-23 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O presente trabalho objetivou: 1) avaliar a resistência de acessos de Lycopersicon spp. a tospovírus; 2) estudar a herança da resistência em algumas dessas fontes e 3) clonar e caracterizar molecularmente alelos do loco Sw-5 provenientes de Lycopersicon spp. Plantas de 12 acessos de tomateiro, pertencentes às espécies L. peruvianum, L. chilense e L. hirsutum foram inoculadas com cinco isolados de tospovírus, pertencentes às espécies TSWV, TCSV, CSNV e GRSV. A reação das plantas foi avaliada periodicamente por 30 dias. Ao final desse período, as plantas assintomáticas foram confirmadas como resistentes, mediante DAS-ELISA. A resistência na maioria dos materiais foi de amplo espectro (efetiva contra todos isolados), porém em alguns casos a resistência foi do tipo isolado-es pecífica. Os materiais mais promissores foram os acessos PI 126928, LA 444/1, LA 371 e PI 126944 de L. peruvianum e LA 130 e LA 2753 de L. chilense. Esses materiais constituem fontes de resistência alternativas para o manejo das tospoviroses do tomateiro. O estudo de herança da resistência em L. hirsutum PI 134417 indicou que a resistência nessa fonte é condicionada por dois genes independentes, um dominante e um recessivo. Num teste de alelismo, o gene dominante segregou independentemente do gene Sw-5, indicando que são genes distintos. Em L. peruvianum PI 126928, a resistência segregou como uma característica condicionada por dois ou mais genes dominantes não ligados. Na terceira etapa do trabalho, comparou-se o nível de conservação de alelos do loco Sw-5 em Lycopersicon spp. Os alelos foram obtidos mediante PCR de longo alcance, utilizando-se o sistema ELONGASE TM (Gibco-BRL) para amplificação. Nas reações de amplificação foram utilizadas três combinações de oligonucleotídeos desenhados com base na seqüência do gene Sw-5. Como molde foi utilizado DNA extraído de plantas cuja reação a tospovírus já era conhecida. Foram obtidos 16 alelos do loco Sw-5, provenientes de quatro espécies do gênero Lycopersicon. Após uma pré-caracterização mediante clivagem com enzimas de restrição, 10 clones foram selecionados para seqüenciamento. A análise de seqüência dos alelos revelou identidade de nucleotídeos superior a 91% para a ORF completa. Quando a comparação foi realizada para os diferentes domínios que compõem o gene Sw-5, observou-se que as maiores divergências residem nas extremidades 5’ e 3’ do gene. A comparação entre as proteínas codificadas pelo alelo Sw-5 1 (confere resistência) e seu alelo sw-5 2 (confere suscetibilidade) revelou 53 substituições ao nível de aminoácidos. Destas substituições, 14 são não-sinônimas e se concentram na extremidade amino e nas LRR, indicando o provável envolvimento dessas regiões na especificidade da resistência. A análise funcional dos alelos do loco Sw-5 e a construção de quimeras entre os alelos Sw-5 e sw-5 2 estão em andamento e auxiliarão a estabelecer as bases moleculares da resistência do tomateiro a tospovírus. / Lycopersicon peruvianum, L. chilense and L. hirsutum germplasm was inoculated with five isolates from the tospovirus species Tomato spotted wilt virus , Tomato chlorotic spot virus , Chrysanthemum stem necrosis virus, and Groundnut ringspot virus. Several introductions showed resistance to all isolates. However, in some cases, resistance isolate-specific was also observed. PI 126928, LA 444/1, LA 371 and PI 126944 of L. peruvianum and LA 130 and LA 2753 of L. chilense were the most resistant materials. Inheritance studies showed that two independent genes, one dominant and one recessive, control the PI 134417 resistance. Allelism tests revealed that this dominant gene is not an allele of the Sw-5 locus. The resistance derived from PI 126928 segregated as a trait controlled by two or more non-linked dominant genes. Sixteen alleles of the Sw-5 locus were PCR-amplified from four Lycopersicon species, cloned and sequenced. The alleles possess more than 91% of identity at nucleotide level; the largest divergence was observed in the 5 ́and 3 ́ extremities. Sequence comparisons between the resistance allele Sw-5 1 and the susceptible allele Sw-5 2, revealed 53 amino acid substitutions; fourteen substitutions are non-synonymous and located at the amino and carboxi terminus of the protein. The functional analysis of the other alleles and the construction of chimeras between Sw-5 1 and Sw-5 2 will allow to identify the protein region involved in the resistance specificity.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2018. / Submitted by Fabiana Santos (fabianacamargo@bce.unb.br) on 2018-09-04T20:45:35Z No. of bitstreams: 1 2018_RayaneNunesLima.pdf: 6996950 bytes, checksum: 2e6db0e375cb5a8815dab21b4f9cf1c0 (MD5) / Approved for entry into archive by Fabiana Santos (fabianacamargo@bce.unb.br) on 2018-09-11T18:44:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2018_RayaneNunesLima.pdf: 6996950 bytes, checksum: 2e6db0e375cb5a8815dab21b4f9cf1c0 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-11T18:44:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2018_RayaneNunesLima.pdf: 6996950 bytes, checksum: 2e6db0e375cb5a8815dab21b4f9cf1c0 (MD5) Previous issue date: 2018-09-04 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPQ). / O rápido progresso na compreensão dos mecanismos de enovelamento de proteínas e os avanços no campo da bioinformática forneceram ferramentas confiáveis para predizer as estruturas tridimensionais de proteínas de vírus de plantas. Por meio de Modelagem Estrutural por Homologia, foi possível obter um modelo tridimensional para a proteína do nucleocapsídeo (NP) e a proteína não estrutural do segmento S (NSs) de GRSV (Groundnut ringspot orthotospovirus) e para a NP de ZLCV (Zucchini lethal chlorosis orthotospovirus). Verificou-se que os monômeros GRSV NP e ZLCV NP são organizadas em um domínio globular (33-223 aa) contendo uma cavidade carregada positivamente para interação com RNA e com as duas cadeias terminais, formando um braço N-terminal (1-32 aa) e um braço C-terminal (224-258 aa). Além disso, a análise da estrutura tridimensional da proteína NSs de GRSV sugeriu uma possível atividade enzimática de fosfatase, para o metabolismo de nucleotídeos assim como um possível domínio de interação com a proteína Argonauta 1. A proteína NSs foi expressa de forma nativa e purificada para futuros ensaios de cristalização. Assim, as estruturas das NP e NSs podem lançar luz sobre os mecanismos de formação de RNP e silenciamento gênico e podem permitir a identificação de resíduos essenciais de aminoácidos como possíveis alvos para estratégias de controle das doenças causadas pelos orthotospovírus. Por fim, por meio da técnica de duplo híbrido em levedura, foi encontrada uma possível interação entre a proteína AtCSN5a e as proteínas NP e NSs de GRSV, e a relevância dessas interações para o sistema planta-vírus ainda serão investigadas. / The rapid progress in the understanding of protein folding mechanisms and the advances in the bioinformatics field have provided reliable tools for modeling and predict three-dimensional structures of plant virus proteins. Using Homology modeling technique, it was possible to obtain three-dimensional models for both NP and NSs of GRSV (Groundnut ringspot orthotospovirus) and for ZLCV NP (Zucchini lethal chlorosis orthotospovirus). GRSV NP and ZLCV NP monomers have been organized into a globular domain (33-223 aa) containing a positively charged cavity for RNA interactions, and two terminal chains forming an N-terminal arm (1-32 aa) and a C-terminal arm (224-258 aa). In addition, a three-dimensional structure of the GRSV NSs protein revealed a possible phosphatase enzymatic activity for nucleotide metabolism and a possible interaction domain with an Argonaute 1. Moreover, the NSS protein was natively expressed and purified for future crystallization assay. Thus, the proposed models can shed light on the mechanisms of RNP formation and gene silencing and may allow the identification of essential amino acid residues as possible targets for the orthotospovirus control strategy. Finally, using yeast two-hybrid technique, a possible interaction between the AtCSN5a protein and the NP and NSS of GRSV was found; however, the relevance of these interactions for the plant-virus system remains to be investigated.