Halle, Universiẗat, Diss., 1999.

Frankfurt (Main), Universiẗat, Diss., 2001.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-05-03T10:38:37Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 5867083 bytes, checksum: 916fdcf3e282fa36b460ff1928933f7c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-03T10:38:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 5867083 bytes, checksum: 916fdcf3e282fa36b460ff1928933f7c (MD5) Previous issue date: 2005-04-15 / O gene Sw-5, membro de uma família multigênica com membros dispersos nos cromossomos 9 e 12 do tomateiro, é o principal gene de resistência a tospovírus utilizado nos programas de melhoramento de tomateiro para a indústria e para mesa. O acesso LA 371 de Lycopersicon peruvianum possui resistência de amplo espectro a tospovírus e estudos de introgressão e análise genética da resistência demonstraram que a resistência desse acesso é determinada por um gene dominante localizado no loco Sw-5 ou em um loco proximamente ligado. Estudos prévios haviam levantado a hipótese de que oligonucleotídeos que anelam nas regiões correspondentes ao início da ORF codificada por Sw-5 e na região 5’ deste gene poderiam amplificar seqüências do loco Sw-5 e de um loco proximamente ligado. Esta hipótese foi confirmada neste trabalho. Utilizando esses oligonucleotídeos foram amplificados e clonados dois genes homólogos ao Sw-5, denominados de homólogo 1 e homólogo 2, a partir de DNA extraído de uma planta resistente a tospovírus denominada EP-1 derivada do acesso LA 371. As proteínas putativas codificadas por esses homólogos apresentam 92,94 % de similaridade diferindo em 82 aminoácidos. A proteína 2 é mais similar à proteína codificada pelo gene Sw-5 (99,28%) sugerindo que o homólogo 2 é responsável pela resistência a tospovírus encontrada em LA 371. Essas seqüências foram transferidas para o vetor binário pBI121 e experimentos de transformação encontram-se em andamento visando à comprovação da função desses homólogos na resistência de LA 371 a tospovírus. / The gene Sw-5, member of a multigenic family with members dispersed in tomato chromosomes 9 and 12, is the most used tospovirus resistance gene in tomato breeding programs. The Lycopersicon peruvianum accession LA 371 has a broad-spectrum toposvirus resistance. Genetic analysis has demonstrated that a dominant gene located in the Sw-5 locus or in a closely linked locus is responsible for tospovirus resistance of this accession. Prior studies suggested that oligonucleotides with complementary sequences corresponding to the terminal regions of the Sw-5 ORF would be able to amplify sequences from the Sw-5 locus and from one closely linked locus. This hypothesis was confirmed in this work. DNA extracted from a tospovirus resistant plant called EP-1, derived from the accession LA 371, was used as template for PCR amplification. The PCR product was cloned and restriction analysis revealed that two Sw-5 homologous sequences, called homologous 1 and homologous 2, had been cloned. The putative protein codified by these homologous display 92.94% of similarity for each other, differing in 82 amino acids. The protein coded by homologous 2 is more similar to Sw-5 protein (99.28%) suggesting that this homologous is responsible for the LA 371 tospovirus resistance. These sequences were transferred to the binary vector pBI121 and transformation experiments are in progress aiming to test this hypothesis. / Dissertação importada do Alexandria

Universiẗat, Diss.--Halle-Wittenberg, 1997. / Zsfassung in engl. Sprache.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-05-10T17:38:43Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 609213 bytes, checksum: 2d38b204162050215b755964519aea1f (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-10T17:38:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 609213 bytes, checksum: 2d38b204162050215b755964519aea1f (MD5) Previous issue date: 2002-01-31 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Plantas dos acessos de Lycopersicon peruvianum (LA 444/1-19, LA 371-20, PI 126444-3, PI 126928-2, PI 126944-6 e PI 126944-12) e de L. chilense (LA 130-5 e LA 2753-11) que possuem resistência de amplo espectro a tospovírus foram utilizadas no cruzamento com a cultivar Moneymaker (L. esculentum) para produção de híbridos interespecíficos, visando a introgressão dessa resistência no tomateiro cultivado. Para superar as barreiras interespecíficas verificadas nestes cruzamentos utilizou-se o cultivo in vitro de sementes imaturas em meio de cultura Murashige & Skoog (MS). Obtiveram-se cinco híbridos do cruzamento L. esculentum x LA 130-5, quatro do cruzamento L. esculentum x LA 2753-11, quatro do cruzamento L. esculentum x LA 371-20, cinco do cruzamento L. esculentum x LA 444/1-19, um do cruzamento L. esculentum x PI 126944-6 e um do cruzamento L. esculentum x PI 126944-12. Não se obteve nenhuma planta dos cruzamentos entre L. esculentum e os acessos PI 126444 e PI 126928, mesmo utilizando-se o cultivo in vitro de semente imatura. Todos os híbridos foram auto-incompatíveis e apresentaram características morfológicas intermediárias aos seus progenitores. A natureza híbrida das plantas F 1 foi confirmada utilizando-se um marcador molecular CAPS. Alguns dos híbridos foram propagados mediante o processo de estaquia e inoculados para avaliação da resistência com isolados de tospovírus, pertencentes às espécies Tomato spotted wilt virus - TSWV, Groundnut ringspot virus GRSV e Tomato chlorotic spot virus - TCSV. Os híbridos foram submetidos a duas inoculações via extrato foliar tamponado, realizadas num intervalo de sete dias. Apenas os híbridos do cruzamento L. esculentum x LA 371-20 e L. esculentum x PI 126944-6 foram resistentes aos três isolados utilizados. Os demais híbridos foram resistentes aos isolados das espécies GRSV e TCSV, mas suscetíveis ao isolado da espécie TSWV. Os híbridos foram retrocruzados com a cultivar Moneymaker para obtenção de populações de retrocruzamento (RC). Populações RC 1 para os híbridos L. esculentum x LA 130-5, L. esculentum x LA 2753-11, L. esculentum x LA 371-20 e L. esculentum x LA 444/1-19 foram obtidas utilizando-se também o cultivo in vitro de sementes imaturas, obtendo- se um total de 99 plantas RC 1 . Estas plantas foram autofecundadas e novamente retrocruzadas com a cultivar Moneymaker, gerando populações RC 1 F 2 e RC 2 , respectivamente. O estudo da herança da resistência em uma população RC 1 F 2 derivada de L. peruvianum LA 371-20 indicou que a resistência originária dessa fonte é condicionada por um gene dominante, sendo efetiva contra três espécies de tospovírus (TSWV, TCSV e GRSV). A análise genética dessa progênie com um marcador molecular CAPS ligado ao gene Sw-5 demonstrou que o gene de resistência derivado do acesso LA 371-20 é um alelo do loco Sw-5 ou um gene proximamente ligado. / Accessions of Lycopersicon peruvianum (LA 444/1-19, LA 371-20, PI 126444-3, PI 126928-2, PI 126944-6, PI 126944-12) and L. chilense (LA 130-5, LA 2753-11) that possess wide spectrum tospovirus resistance were used in crosses with the cultivar Moneymaker (L. esculentum) for production of interspecific hybrids, seeking the introgression of this resistance into cultivated varieties. The interspecific barriers in these crossings were overcome by cultivating immature seeds in Murashige & Skoog medium. Hybrids were obtained from crosses ́Moneymaker ́x LA 130-5; ́Moneymaker ́x LA 2753-11; ́Moneymaker ́x LA 371-20; ́Moneymaker ́ x LA 444/1-19; ́Moneymaker ́ x PI 126944-6 and ́Moneymaker ́ x PI 126944-12. Seeds derived from crosses between ́Moneymaker ́and accessions PI 126444 and PI 126928 did not germinated or produced abnormal seedlings. All hybrids were self-incompatible and displayed morphological characteristics intermediate to their progenitors. The hybrid nature of the F 1 plants was also confirmed by molecular marker analysis. Cuttings from some of the hybrids were inoculated with virus isolates, belonging to the species Tomato spotted wilt virus - TSWV, Groundnut ringspot virus - GRSV and Tomato chlorotic spot virus - TCSV. Only the cuttings from ́Moneymaker ́x LA 371-20 and ́Moneymaker ́x PI 126944-6 hybrids were resistant to all isolates. The others hybrids were resistant to GRSV and TCSV, but susceptible to the TSWV isolate. The hybrids were backcrossed to ́Moneymaker ́ for production of backcross populations (RC). RC 1 populations were obtained for ́Moneymaker ́ x LA 130-5, ́Moneymaker ́x LA 2753-11, ́Moneymaker ́ x LA 371-20 and ́Moneymaker ́ x LA 444/1-19. The RC 1 plants were selfed and again backcrossed to ́Moneymaker ́ to obtain RC 1 F 2 and RC 2 populations, respectively. Inheritance studies of the resistance in a population RC 1 F 2 derived from LA 371-20, showed that the resistance of this accession is conditioned by a dominant gene effective against three tospovirus species (TSWV, TCSV and GRSV). Genetic analysis of this progeny with a molecular CAPS marker linked to Sw-5, demonstrated that the gene derived from LA 371-20 is allelic to Sw-5 or a tightly linked gene. / Dissertação importada do Alexandria

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-04-27T13:57:34Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2630530 bytes, checksum: 112de5671b9d3e521f0446f6d6d7237e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-27T13:57:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2630530 bytes, checksum: 112de5671b9d3e521f0446f6d6d7237e (MD5) Previous issue date: 2004-03-31 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Alguns aspectos da interação entre o gene de resistência Sw-5 e os tospovírus, foram analisados neste trabalho. A capacidade de Sw-5 conferir resistência em Nicotiana benthamiana foi avaliada em plantas transformadas com uma construção na qual a ORF e a região 3' do gene estavam sob controle do promotor 35S. As plantas transformadas foram resistentes à infecção por tospovírus. A comparação do espectro da resistência destas plantas com o observado para outras solanáceas , indica que as vias de sinalização e as respostas de defesa ativadas por Sw-5 estão conservadas nesta família, e que o polimorfismo genético nos componentes das vias de transdução de sinais pode resultar em diferentes níveis de resistência. A fim de identificar o gene de avirulência dos tospovírus, os genes N, NSm e NSs , foram expressos isoladamente ou em combinações, por meio do vetor viral PVX, em plantas com Sw-5. A expressão destes genes não foi capaz de desencadear a resposta de hipersensibilidade e tampouco interferiu na infecção da planta por PVX. Portanto, outro componente dos tospovírus deve ser responsável pelo desencadeamento da reação de resistência. Independentemente da presença do gene Sw-5, a expressão do gene NSs por meio do PVX , agravou os sintomas provocados por este vírus em algumas solanáceas, o que pode ter relação com a capacidade desta proteína de suprimir silenciamento gênico. Em plantas com Sw-5, a co-expressão da região 5' deste gene por meio do vetor PVX , favoreceu a infecção sistêmica por tospovírus. Uma vez que o efeito foi observado tanto para expressão senso quanto anti-senso, a redução dos níveis de mRNA de Sw-5 provocada por silenciamento gênico , poderia ser a causa desta interferência na resistência, embora a análise de Northern blot não tenha demonstrado tal redução. Uma seqüência homóloga a Sw-5 contendo uma ORF sem deleções ou interrupções prematuras foi clonada a partir do acesso LA371-20 de Lycopersicon peruvianum. Análises moleculares demonstraram que esta seqüência é originada do loco Sw-5 ou de região próxima a este e que segrega com a resistência a tospovírus. A capacidade deste e de outros três homólogos oriundos de distintos acessos de tomateiro de conferir resistência a tospovírus, foi avaliada em plantas transgênicas de tomateiro e tabaco. As plantas transformadas foram suscetíveis ao vírus. A não-funcionalidade destes homólogos pode ser devido à estrutura das construções utilizadas na transformação. Alternativamente, outros homólogos presentes nestes acessos de tomateiro podem ser os responsáveis pela resistência. / In this work some aspects of the tospovirus - Sw-5 interaction was analyzed. The capacity of the Sw-5 to confer resistance in Nicotiana benthamiana was evaluated in transgenic plants transformed with Sw-5 ORF containing its own 3 ́ UTR region under 35S promoter control. Transgenic plants were resistant to tospovirus infection. Comparisons of the resistance spectrum with other members of the Solanaceae suggest that the signal transduction pathways and resistance responses triggered by Sw-5 are conservated in solanaceae and that the genetic polymorphism in the signal transduction components may result in different resistance levels. The N, NSm and NSs genes isolated or in combination were expressed by PVX vector in plants harboring Sw-5 in order to detect the tospovirus avirulence gene. These genes were not able to trigger the hypersensitive response and to affect PVX infection in Sw-5 plants, which suggest that another tospovirus component is the elicitor of the resistance response. Independently of the Sw-5 gene, PVX clones harboring NSs gene induced more severe symptoms in some solanaceae plants. Gene silencing may be the cause of this symptoms. In transgenic plants harboring Sw-5 gene, the co-expression of the 5 ́ region of this gene by PVX favored tospovirus infection. As this effect was observed both for 5 ́ sense and anti- sense constructions it is possible that it has been caused by reduction on mRNA levels by gene silencing, although Northern blot analysis did not agree with this hypothesis. An Sw-5 homolog was cloned from LA371-20 accession. This homolog is localized in or near of Sw-5 locus and segregated with tospovirus resistance. The capacity of this and other three homologs originated from others accessions to confer tospovirus resistance was evaluated in tobacco and tomato transgenic plants. All the transformants were susceptible to the virus. Other homologs presents in the different accessions evaluated may be responsible for the resistance, although problems in the structure of the constructions can not be discarded. / Tese importada do Alexandria