Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2006. / Submitted by Natália Cristina Ramos dos Santos (nataliaguilera3@hotmail.com) on 2009-10-31T15:56:28Z No. of bitstreams: 1 2006_Daniele Scandiucci de Freitas.pdf: 1694002 bytes, checksum: 03cb9b1c64473673bc10bc56a5f75888 (MD5) / Approved for entry into archive by Gomes Neide(nagomes2005@gmail.com) on 2010-10-27T14:45:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_Daniele Scandiucci de Freitas.pdf: 1694002 bytes, checksum: 03cb9b1c64473673bc10bc56a5f75888 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-10-27T14:45:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006_Daniele Scandiucci de Freitas.pdf: 1694002 bytes, checksum: 03cb9b1c64473673bc10bc56a5f75888 (MD5) Previous issue date: 2006 / As plantas normalmente são hospedeiras de mais de um patógeno. O maracujazeiro, por exemplo, é infectado por diversos vírus, bactérias e fungos, que limitam consideravelmente a sua produção. Devido a isso, o uso dos sistemas de controle de doenças que confiram amplo espectro de resistência é cada vez mais necessário. Trabalhos recentes demonstraram que plantas de fumo ou tomate expressando genes anti-apoptóticos são resistentes a estresses abióticos e a vários patógenos necrotróficos, isto é, patógenos que matam a célula da planta hospedeira como parte do seu processo de infecção. Neste trabalho, os genes p35 e iap-3 de baculovirus foram separadamente introduzidos no genoma de plantas de maracujá usando biobalística. Os genes estrangeiros estavam sob o comando transcricional dos promotores 35S ou UBQ3. As plantas transgênicas foram regeneradas e selecionadas pela presença do transgene usando a técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR) e/ou Southern blot. Somente plantas p35+ foram selecionadas pela análise por PCR e/ou Sothern-blot. Onze plantas regeneradas mostraram a presença do gene p35. Análises transcricionais de plantas regeneradas mostraram a presença de transcritos específicos para o gene p35 em 9 delas. As plantas regeneradas, contendo o gene p35, foram inoculadas com o vírus Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV), a bactéria Xanthomonas axonopodis pv passiflorae, e o herbicida glufosinato (Syngenta). Nenhuma das plantas mostrou resistência ao CABMV. Plantas regeneradas (p35+) continham menos da metade do número de lesões detectadas nas plantas não-transgênicas, quando inoculadas com X. axonopodis pv. passiflorae e algumas plantas p35+ mostraram tolerância aumentada ao herbicida glufosinato, quando comparadas às plantas não-trangênicas. Além disso, no presente trabalho, é demonstrado que um promotor de baculovírus (promotor IE-1) é ativo em células vegetais e que, promotores usados em biotecnologia de plantas (UBQ e 35S) são também, ativos em células de inseto quando analisados em ensaios transientes de expressão onde o gene repórter luciferase (rluc) de Renilla reniformis estava sob o comando transcricional de cada promotor. _____________________________________________________________________________ ABSTRACT / Plants are usually hosts for more than one pathogen. The passion flower, for example, can be infected by a many virus, bactéria and fungi, which limit fruit yield considerably. Due to this, the use of diseases control systems that allow a wide range of disease resistance is needed. Recent work have shown that tobacco or tomato plants containing anti-apoptotic genes were more resistant to abiotic stresses and several necrotrophic pathogens, which are pathogens that kill the plant host cell as part of their infection process. In this work, the p35 and iap-3 genes from baculoviruses were separetely introduced into the genome of passion fruit plants by biobalistics. The foreign genes were under the transcriptional control of the 35S or UBQ3 promoters. The transgenic plants were regenerated and screened for the presence of the transgene by PCR and/or Southern blot. Only p35+ plants were confirmed by PCR and/or Sothern-blot analysis. Eleven regenerated plants showed the presence of the p35 gene. Transcriptional analysis of regenerated plants showed the presence of specific p35 transcripts in 9 of them. Regenerated plants containing the p35 gene were inoculated with the cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV), the bacterium Xanthomonas axonopodis pv passiflorae, and the herbicide, glufosinate, (Syngenta). None of the plants showed resistance to CABMV. Regenerated plants (p35+) showed less than half of local lesions showed by non-transgenic plants when inoculated with X. axonopodis and some p35+ plants showed increased tolerance to the glufosinate herbicide when compared to non-transgenic plants. Furthermore, we have shown that a baculovirus promoter (IE-1 promoter) is active in plant cells and promoters used in plant biotechnology (UBQ and 35S) are also active in insect cells by transient expression assays using the luciferase gene (rluc) from Renilla reniformis under the transcriptional control of each promoter.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, 2011. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-08-04T11:06:53Z No. of bitstreams: 1 2011_GlendaMoraisRochaBrana.pdf: 1031699 bytes, checksum: b286d3dd77daf3a32101a01af7660a3c (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-08-04T11:07:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_GlendaMoraisRochaBrana.pdf: 1031699 bytes, checksum: b286d3dd77daf3a32101a01af7660a3c (MD5) / Made available in DSpace on 2011-08-04T11:07:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_GlendaMoraisRochaBrana.pdf: 1031699 bytes, checksum: b286d3dd77daf3a32101a01af7660a3c (MD5) / No contexto moderno de constantes inovações tecnológicas, surge a preocupação de como o homem se relaciona com o ambiente no qual se insere. Na seara do meio ambiente genético, as descobertas trouxeram à tona a modificação genética de plantas sob os mais variados argumentos. Diversas são as posições, ora a favor, ora contra a liberação de organismos geneticamente modificados (GM) no ambiente. Contudo, o problema vai bem além de se posicionar a favor ou contra tais organismos. Há de se considerar a legislação, a ética, a biossegurança, enfim, o meio ambiente nas considerações relativas aos GM. Assim, o objetivo deste estudo foi investigar se as aprovações comerciais de GM estariam associadas ao perfil acadêmico/científico e à afiliação dos membros que compõem o Organismo Regulador. A metodologia utilizada baseou-se na pesquisa bibliográfica, por meio do levantamento de dados de fontes documentais, como livros, textos filosóficos, artigos científicos e análise e avaliação dos documentos oficiais do Organismo Regulador Brasileiro. Este último incluiu atas e extratos prévios das aprovações comerciais de 2006 a 2009 disponíveis no site da Comissão Técnica Nacional de Biossegurança (CTNBio), na tentativa de verificar quais aportes éticos estavam presentes nas votações dos membros do Organismo Regulador Brasileiro. Além disso, pesquisou-se em bases de dados, como o do Conselho Nacional de Desenvolvimento científico e Tecnológico (CNPq). Usou-se para tal a Lei nº 11.105 de 24 de março de 2005 e a Constituição Federal de 1988 como marcos normativos, que estabeleceram juridicamente a gestão da biossegurança e o papel da CTNBio no cenário pátrio. Foram analisadas as aprovações comerciais do milho-Bt, do algodão-Bt e da soja geneticamente tolerante ao herbicida glifosato. Os resultados mostraram que a afiliação não influenciou a decisão sobre a aprovação de plantas geneticamente modificadas; porém observou-se uma tendência maior de votações pela aprovação pelos membros com maior especialidade técnica sobre o tema, ou seja, as decisões foram baseadas em critérios técnicos, prevalecendo sobre outros tipos de questionamentos. A contribuição da bioética no tratamento das provações comerciais referendou o discurso ético de Hans Jonas. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The introduction of genetically modified plants into the environment has been marked by different positions, either in favor or against their release. However, the problem goes well beyond such contradictory positions; it is necessary to take into account the legislation, ethics, biosafety and the environment in the considerations related to the release of genetically modified organisms (GMOs). In this context, the objective of this study was to investigate whether commercial approvals of GMOs are associated with the academic/scientific profile and affiliation of the members of the regulatory agency (CTNBio). The methodology was based on a search through the data collected from documentary sources such as books, philosophical texts, scientific articles, as well as analysis and evaluation of official documents from the Brazilian regulatory agency. The latter included meeting minutes and previous extracts from the commercial approvals from 2006 to 2009 available on the CTNBio website, in an attempt to determine which ethical concerns affected voting by members of this Brazilian regulatory agency. We also found the curriculum vitae of CTNBio members on the website of the Plataforma Lattes database of the National Council for Scientific and Technological Development (CNPq, http://lattes.cnpq.br), which states their area of expertise. Law No. 11.105/2005 and the Constitution of 1988 were used as a legal framework, which established the legal management of biosecurity and the role of CTNBio in the national arena. We analyzed the commercial approval of Bt-maize, Bt-cotton and soybeans that are genetically tolerant to the herbicide glyphosate. Results showed that the affiliation of expert members did not appear to influence their decision to release GM plants, but that experts voted heavily in favor of release; that is, decisions were based on technical criteria, prevailing over any other type of questioning.

Orientador : Adilson Leite / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-28T02:27:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Parizotto_EneidaAbreu_D.pdf: 4976173 bytes, checksum: 7a2e225e15981e640002d110203d7495 (MD5) Previous issue date: 2001 / Doutorado

Toxinas Cry provenientes de Bacillus thuringiensis, também denominadas de δ- endotoxinas, possuem ampla atividade inseticida e são específicas para insetos de diferentes ordens, não sendo nocivas a mamíferos, aves, anfíbios ou répteis. Devido a esta característica, seus genes vêm sendo utilizados no desenvolvimento de plantas transgênicas, visando o controle de insetos-praga de culturas de importância econômica. Dentre estas, destaca-se o algodoeiro que tem como principais pragas o bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) e a lagarta-do-cartucho (Spodoptera frugiperda), ambas causadoras de grandes prejuízos econômicos. Assim, este trabalho objetivou: caracterizar uma estirpe de Bt (S811) tóxica contra S. frugiperda e A. grandis, identificar e clonar os genes codificadores de toxinas Cry potenciais para o controle dessas pragas, expressar os genes em sistema heterólogo Escherichia coli e testar a toxicidade das toxinas contra as pragas em questão. Os resultados obtidos nas análises da estirpe por microscopia eletrônica revelaram a presença de cristais esféricos e bipiramidais, enquanto que a análise de SDS-PAGE detectou proteínas de massa molecular com cerca de 140 kDa e 80 kDa. Posteriormente, uma caracterização gênica, utilizando oligonucleotídeos específicos para genes cry, identificou três genes, cry1Ab, cry1Ia e cry8, sendo estes dois últimos de maior interesse. O gene cry8, que foi isolado pela técnica TAIL-PCR, codifica uma proteína com 58% de identidade de aminoácidos com outras toxinas Cry8, enquanto que o gene cry1Ia12 (isolado com oligonucleotídeos específicos) codifica uma proteína que possui 99% de identidade com as outras proteínas do tipo Cry1Ia descritas na literatura. As porções tóxicas dos genes foram clonadas e expressadas em E. coli produzindo as proteínas recombinantes Cry8 e Cry1Ia12 de aproximadamente 70 kDa (cada uma). As proteínas recombinantes causaram mortalidade de 50% para larvas de A. grandis com 230 μg/ml e 160 μg/ml de Cry1Ia12 e Cry8, respectivamente, enquanto que para larvas de S. frugiperda, apenas Cry1Ia12 foi tóxica causando mortalidade de 50% com 5 μg/ml. Todos estes estudos contribuirão para o desenvolvimento de plantas transgênicas de algodão, bem como para a geração de novas moléculas com maior toxicidade e especificidade utilizando a evolução molecular in vitro (DNA shuffling) destes genes. / Cry toxins or δ-endotoxins, produced by Bacillus thuringiensis, show broad activity against several orders of insects. In addition, they are harmless to mammals, birds, amphibian, and reptiles. Because of these characteristics, several genes have been used in the development of transgenic plants to control pests in important crops. Among them, the cotton crop is very important in Brazil and it has the cotton boll weevil, Anthonomus grandis, and the fall armyworm, Spodoptera frugiperda, as the major pests in this crop, which cause several economic damages. The objective of this work was: to characterize a Bt strain (S811), which is toxic towards S. frugiperda and A. grandis, to identify and clone the coding genes of the Cry toxins with potential to control these pests, to express the genes in Escherichia coli heterologous system, and to test the toxicity of the recombinant proteins towards the reported pests. Electronic microscopic analysis revealed the presence of bipyramidal and spherical crystals and SDS-PAGE analysis showed proteins with 140 kDa and 80 kDa of molecular weight mass. Further gene characterization, using specific primer sets to detect cry genes, identified three genes, cry1Ab, cry1Ia e cry8, although the cry1Ia e cry8 were the genes of major interest. The cry8 gene was isolated through TAIL-PCR techniques and encodes a protein 58% identical to other Cry8 toxins, while the protein deduced from cry1Ia12 gene showed 99% identity with other Cry1Ia toxins previously described. The cry1A12 and cry8 gene toxic fragments were cloned and expressed in E. coli, and the 70 kDa recombinant proteins of were tested against A. grandis and S. frugiperda. Cry1Ia12 toxin caused 50% mortality at 230 μg/ml and 5 μg/ml towards both A. grandis and S. frugiperda, respectively. Cry8 toxin caused 50% mortality only against A. grandis at 160 μg/ml. In addition to the transgenic cotton development program, these results will permit the generation of new molecules with higher toxicity and specificity for these pests through in vitro molecular evolution (DNA shuffling) of these genes.

Toxinas Cry provenientes de Bacillus thuringiensis, também denominadas de δ- endotoxinas, possuem ampla atividade inseticida e são específicas para insetos de diferentes ordens, não sendo nocivas a mamíferos, aves, anfíbios ou répteis. Devido a esta característica, seus genes vêm sendo utilizados no desenvolvimento de plantas transgênicas, visando o controle de insetos-praga de culturas de importância econômica. Dentre estas, destaca-se o algodoeiro que tem como principais pragas o bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) e a lagarta-do-cartucho (Spodoptera frugiperda), ambas causadoras de grandes prejuízos econômicos. Assim, este trabalho objetivou: caracterizar uma estirpe de Bt (S811) tóxica contra S. frugiperda e A. grandis, identificar e clonar os genes codificadores de toxinas Cry potenciais para o controle dessas pragas, expressar os genes em sistema heterólogo Escherichia coli e testar a toxicidade das toxinas contra as pragas em questão. Os resultados obtidos nas análises da estirpe por microscopia eletrônica revelaram a presença de cristais esféricos e bipiramidais, enquanto que a análise de SDS-PAGE detectou proteínas de massa molecular com cerca de 140 kDa e 80 kDa. Posteriormente, uma caracterização gênica, utilizando oligonucleotídeos específicos para genes cry, identificou três genes, cry1Ab, cry1Ia e cry8, sendo estes dois últimos de maior interesse. O gene cry8, que foi isolado pela técnica TAIL-PCR, codifica uma proteína com 58% de identidade de aminoácidos com outras toxinas Cry8, enquanto que o gene cry1Ia12 (isolado com oligonucleotídeos específicos) codifica uma proteína que possui 99% de identidade com as outras proteínas do tipo Cry1Ia descritas na literatura. As porções tóxicas dos genes foram clonadas e expressadas em E. coli produzindo as proteínas recombinantes Cry8 e Cry1Ia12 de aproximadamente 70 kDa (cada uma). As proteínas recombinantes causaram mortalidade de 50% para larvas de A. grandis com 230 μg/ml e 160 μg/ml de Cry1Ia12 e Cry8, respectivamente, enquanto que para larvas de S. frugiperda, apenas Cry1Ia12 foi tóxica causando mortalidade de 50% com 5 μg/ml. Todos estes estudos contribuirão para o desenvolvimento de plantas transgênicas de algodão, bem como para a geração de novas moléculas com maior toxicidade e especificidade utilizando a evolução molecular in vitro (DNA shuffling) destes genes. / Cry toxins or δ-endotoxins, produced by Bacillus thuringiensis, show broad activity against several orders of insects. In addition, they are harmless to mammals, birds, amphibian, and reptiles. Because of these characteristics, several genes have been used in the development of transgenic plants to control pests in important crops. Among them, the cotton crop is very important in Brazil and it has the cotton boll weevil, Anthonomus grandis, and the fall armyworm, Spodoptera frugiperda, as the major pests in this crop, which cause several economic damages. The objective of this work was: to characterize a Bt strain (S811), which is toxic towards S. frugiperda and A. grandis, to identify and clone the coding genes of the Cry toxins with potential to control these pests, to express the genes in Escherichia coli heterologous system, and to test the toxicity of the recombinant proteins towards the reported pests. Electronic microscopic analysis revealed the presence of bipyramidal and spherical crystals and SDS-PAGE analysis showed proteins with 140 kDa and 80 kDa of molecular weight mass. Further gene characterization, using specific primer sets to detect cry genes, identified three genes, cry1Ab, cry1Ia e cry8, although the cry1Ia e cry8 were the genes of major interest. The cry8 gene was isolated through TAIL-PCR techniques and encodes a protein 58% identical to other Cry8 toxins, while the protein deduced from cry1Ia12 gene showed 99% identity with other Cry1Ia toxins previously described. The cry1A12 and cry8 gene toxic fragments were cloned and expressed in E. coli, and the 70 kDa recombinant proteins of were tested against A. grandis and S. frugiperda. Cry1Ia12 toxin caused 50% mortality at 230 μg/ml and 5 μg/ml towards both A. grandis and S. frugiperda, respectively. Cry8 toxin caused 50% mortality only against A. grandis at 160 μg/ml. In addition to the transgenic cotton development program, these results will permit the generation of new molecules with higher toxicity and specificity for these pests through in vitro molecular evolution (DNA shuffling) of these genes.

Bacillus thuringiensis é uma bactéria gram-positiva que produz cristais protéicos durante a fase de esporulação. Os cristais, são formados por proteínas Cry e apresentam atividade tóxica específica a determinadas classes de insetospraga, sendo o seu uso bastante difundido na agricultura. O presente trabalho teve como objetivo gerar uma biblioteca de variantes, do gene cry8Ha1, isolado da estirpe S811 de B. thuringiensis e selecionar variantes com atividade melhorada para pragas do algodoeiro. A biblioteca foi construída por meio da técnica de DNA shuffling e selecionada contra os insetos-praga Anthonomus grandis e Spodoptera frugiperda pela técnica de Phage display. As variantes foram selecionadas pela afinidade aos receptores presentes nas membranas dos intestinos do bicudo-do-algodoeiro (A.grandis) e da lagarta-do-cartucho (S. frugiperda), principais pragas do algodoeiro. Após expressão em fago, proteínas variantes foram testadas em bioensaios contra larvas dos insetos-alvo (A. grandis e S. frugiperda) e seqüenciadas. Os resultados de atividade, mostraram variantes mais efetivas para as duas pragas-alvo, quando comparado com a proteína original Cry8Ha1. O mutante Cry/BI-25 (ativo contra A. grandis) foi selecionado, por diferir estatisticamente do controle, e subclonado no vetor de expressão em bactéria. A proteína foi purificada e utilizada em bioensaio contra larvas de A. grandis. Os resultados indicaram um aumento de atividade entomotóxica de 333% da proteína mutante (Cry/BI-25) quando comparada com a proteína original (Cry8Ha1). A nova molécula, Cry/BI-25, está sendo utilizada em programas de melhoramento de plantas de algodão visando a obtenção de plantas resistentes à praga-alvo. / Bacillus thuringiensis is a gram-positive bacterium that produces protein crystals during its sporulation phase. These crystals are formed by Cry proteins that show specific toxicity to some insect-pest classes, which makes their use very common in agriculture. This work aimed at obtaining a library of cry8Ha1 gene variants, isolated from B. thuringiensis S811 and the selection of gene variants, whose products would have an improved insecticidal activity against cotton insect-pests. The library was constructed using DNA shuffling and selected against the insectpests Anthonomus grandis and Spodoptera frugiperda using Phage display. The variants were selected by affinity to Brush Border Membrane Vesicles (BBMVs) of A. grandis and S. frugiperda midguts. After phage expression, variant proteins were tested in bioassays against the target insects and their genes sequenced. The mutant Cry/BI-25 showed higher insecticidal activity against A. grandis and was subcloned to a bacterium expression vector. The purified expressed protein Cry/BI-25 is 333% more active when compared with protein original (Cry8Ha1). Gene variants selected against S. frugiperda are still under analysis. The new improved protein Cry/BI-25 will be used in cotton plant transformation experiments, with the purpose of developing insect-pest resistant GM cotton plants.

Toxinas Cry provenientes de Bacillus thuringiensis, também denominadas de δ- endotoxinas, possuem ampla atividade inseticida e são específicas para insetos de diferentes ordens, não sendo nocivas a mamíferos, aves, anfíbios ou répteis. Devido a esta característica, seus genes vêm sendo utilizados no desenvolvimento de plantas transgênicas, visando o controle de insetos-praga de culturas de importância econômica. Dentre estas, destaca-se o algodoeiro que tem como principais pragas o bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) e a lagarta-do-cartucho (Spodoptera frugiperda), ambas causadoras de grandes prejuízos econômicos. Assim, este trabalho objetivou: caracterizar uma estirpe de Bt (S811) tóxica contra S. frugiperda e A. grandis, identificar e clonar os genes codificadores de toxinas Cry potenciais para o controle dessas pragas, expressar os genes em sistema heterólogo Escherichia coli e testar a toxicidade das toxinas contra as pragas em questão. Os resultados obtidos nas análises da estirpe por microscopia eletrônica revelaram a presença de cristais esféricos e bipiramidais, enquanto que a análise de SDS-PAGE detectou proteínas de massa molecular com cerca de 140 kDa e 80 kDa. Posteriormente, uma caracterização gênica, utilizando oligonucleotídeos específicos para genes cry, identificou três genes, cry1Ab, cry1Ia e cry8, sendo estes dois últimos de maior interesse. O gene cry8, que foi isolado pela técnica TAIL-PCR, codifica uma proteína com 58% de identidade de aminoácidos com outras toxinas Cry8, enquanto que o gene cry1Ia12 (isolado com oligonucleotídeos específicos) codifica uma proteína que possui 99% de identidade com as outras proteínas do tipo Cry1Ia descritas na literatura. As porções tóxicas dos genes foram clonadas e expressadas em E. coli produzindo as proteínas recombinantes Cry8 e Cry1Ia12 de aproximadamente 70 kDa (cada uma). As proteínas recombinantes causaram mortalidade de 50% para larvas de A. grandis com 230 μg/ml e 160 μg/ml de Cry1Ia12 e Cry8, respectivamente, enquanto que para larvas de S. frugiperda, apenas Cry1Ia12 foi tóxica causando mortalidade de 50% com 5 μg/ml. Todos estes estudos contribuirão para o desenvolvimento de plantas transgênicas de algodão, bem como para a geração de novas moléculas com maior toxicidade e especificidade utilizando a evolução molecular in vitro (DNA shuffling) destes genes. / Cry toxins or δ-endotoxins, produced by Bacillus thuringiensis, show broad activity against several orders of insects. In addition, they are harmless to mammals, birds, amphibian, and reptiles. Because of these characteristics, several genes have been used in the development of transgenic plants to control pests in important crops. Among them, the cotton crop is very important in Brazil and it has the cotton boll weevil, Anthonomus grandis, and the fall armyworm, Spodoptera frugiperda, as the major pests in this crop, which cause several economic damages. The objective of this work was: to characterize a Bt strain (S811), which is toxic towards S. frugiperda and A. grandis, to identify and clone the coding genes of the Cry toxins with potential to control these pests, to express the genes in Escherichia coli heterologous system, and to test the toxicity of the recombinant proteins towards the reported pests. Electronic microscopic analysis revealed the presence of bipyramidal and spherical crystals and SDS-PAGE analysis showed proteins with 140 kDa and 80 kDa of molecular weight mass. Further gene characterization, using specific primer sets to detect cry genes, identified three genes, cry1Ab, cry1Ia e cry8, although the cry1Ia e cry8 were the genes of major interest. The cry8 gene was isolated through TAIL-PCR techniques and encodes a protein 58% identical to other Cry8 toxins, while the protein deduced from cry1Ia12 gene showed 99% identity with other Cry1Ia toxins previously described. The cry1A12 and cry8 gene toxic fragments were cloned and expressed in E. coli, and the 70 kDa recombinant proteins of were tested against A. grandis and S. frugiperda. Cry1Ia12 toxin caused 50% mortality at 230 μg/ml and 5 μg/ml towards both A. grandis and S. frugiperda, respectively. Cry8 toxin caused 50% mortality only against A. grandis at 160 μg/ml. In addition to the transgenic cotton development program, these results will permit the generation of new molecules with higher toxicity and specificity for these pests through in vitro molecular evolution (DNA shuffling) of these genes.

Bacillus thuringiensis é uma bactéria gram-positiva que produz cristais protéicos durante a fase de esporulação. Os cristais, são formados por proteínas Cry e apresentam atividade tóxica específica a determinadas classes de insetospraga, sendo o seu uso bastante difundido na agricultura. O presente trabalho teve como objetivo gerar uma biblioteca de variantes, do gene cry8Ha1, isolado da estirpe S811 de B. thuringiensis e selecionar variantes com atividade melhorada para pragas do algodoeiro. A biblioteca foi construída por meio da técnica de DNA shuffling e selecionada contra os insetos-praga Anthonomus grandis e Spodoptera frugiperda pela técnica de Phage display. As variantes foram selecionadas pela afinidade aos receptores presentes nas membranas dos intestinos do bicudo-do-algodoeiro (A.grandis) e da lagarta-do-cartucho (S. frugiperda), principais pragas do algodoeiro. Após expressão em fago, proteínas variantes foram testadas em bioensaios contra larvas dos insetos-alvo (A. grandis e S. frugiperda) e seqüenciadas. Os resultados de atividade, mostraram variantes mais efetivas para as duas pragas-alvo, quando comparado com a proteína original Cry8Ha1. O mutante Cry/BI-25 (ativo contra A. grandis) foi selecionado, por diferir estatisticamente do controle, e subclonado no vetor de expressão em bactéria. A proteína foi purificada e utilizada em bioensaio contra larvas de A. grandis. Os resultados indicaram um aumento de atividade entomotóxica de 333% da proteína mutante (Cry/BI-25) quando comparada com a proteína original (Cry8Ha1). A nova molécula, Cry/BI-25, está sendo utilizada em programas de melhoramento de plantas de algodão visando a obtenção de plantas resistentes à praga-alvo. / Bacillus thuringiensis is a gram-positive bacterium that produces protein crystals during its sporulation phase. These crystals are formed by Cry proteins that show specific toxicity to some insect-pest classes, which makes their use very common in agriculture. This work aimed at obtaining a library of cry8Ha1 gene variants, isolated from B. thuringiensis S811 and the selection of gene variants, whose products would have an improved insecticidal activity against cotton insect-pests. The library was constructed using DNA shuffling and selected against the insectpests Anthonomus grandis and Spodoptera frugiperda using Phage display. The variants were selected by affinity to Brush Border Membrane Vesicles (BBMVs) of A. grandis and S. frugiperda midguts. After phage expression, variant proteins were tested in bioassays against the target insects and their genes sequenced. The mutant Cry/BI-25 showed higher insecticidal activity against A. grandis and was subcloned to a bacterium expression vector. The purified expressed protein Cry/BI-25 is 333% more active when compared with protein original (Cry8Ha1). Gene variants selected against S. frugiperda are still under analysis. The new improved protein Cry/BI-25 will be used in cotton plant transformation experiments, with the purpose of developing insect-pest resistant GM cotton plants.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Programa de Pós-graduação em Agronegócios, 2010. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-05-07T00:49:43Z No. of bitstreams: 1 2010_KellianeConsolacaoFuscaldi.pdf: 2816688 bytes, checksum: 880a78a675bec2c2677f5b43cbc3c9b3 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-05-07T00:52:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_KellianeConsolacaoFuscaldi.pdf: 2816688 bytes, checksum: 880a78a675bec2c2677f5b43cbc3c9b3 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-05-07T00:52:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_KellianeConsolacaoFuscaldi.pdf: 2816688 bytes, checksum: 880a78a675bec2c2677f5b43cbc3c9b3 (MD5) / O debate atual acerca do sistema de produção transgênico na agricultura, bem como seus impactos sobre a saúde humana e a preservação do meio ambiente, evidencia o baixo grau de consenso entre estudiosos e pesquisadores. Não obstante, a área destinada a este sistema de produção aumenta a cada ano. No que se refere especificamente à cultura da soja, o surgimento da variedade transgênica ocasionou uma externalidade negativa aos produtores convencionais, uma vez que o reconhecimento e a certificação da soja como um produto livre de transgênico passou a implicar custos elevados para que se possa fazer a segregação ao longo das etapas do processo produtivo. Mesmo havendo possibilidade de contaminação e prejuízos para os produtores não-transgênicos, normas de coexistência para estes produtos são praticamente inexistentes. Diante disso, o presente estudo teve como objetivo investigar os parâmetros legais que deveriam constar no marco jurídico brasileiro para regulamentar a matéria. Instituições mal definidas ou incompletas podem comprometer o desempenho da cadeia produtiva da soja, importante segmento produtivo brasileiro, o que torna estudos como este necessários para apoiar sua competitividade e sustentabilidade. A pesquisa, de cunho exploratório-descritivo, está baseada em análises preliminares sobre aspectos da legislação vigente no Brasil e na União Européia relacionados aos organismos geneticamente modificados. Desse modo, informações complementares foram coletadas junto aos principais segmentos do Sistema Agroindustrial da Soja (setor de sementes, produção rural e ambiente institucional). Para tanto foram utilizados roteiros de entrevista semi-estruturados, compostos por questões abertas e dicotômicas, com vistas ao levantamento das percepções dos atores representantes desses segmentos. A análise dos conteúdos verbalizados pelos participantes foi feita por meio do software Alceste (Analyse de Lexémes Coocurrent dans lês Ennoncés Simple d’un Texte - Análise Lexical Contextual de um Conjunto de Segmentos de Texto), e posteriormente, via análise manual de conteúdo, foi possível validar o exame eletrônico. Algumas categorias de análise emergiram a partir da verbalização dos participantes e os resultados foram organizados e interpretados à luz dos quadros referenciais da Visão Sistêmica do Agronegócio e da teoria da Nova Economia Institucional, indicando a necessidade de regulamentação de parâmetros específicos para se garantir a coexistência da soja transgênica e convencional. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The current debate about transgenic production in agriculture as well as its impacts on human health and environment protection shows the low level of consensus between studiers and researchers. However, the area intended for that production system increases each year. Specifically on soybean crop, the transgenic variety caused a negative externality for conventional farmers since recognition and certification as transgenic-free implied on high costs so that segregation is made along the steps of the production process. Even though there is possibility of contamination and losses for non-transgenic farmers, regulations of coexistence for those products practically do not exist. Considering that, this study aims to investigate the legal parameters that should be in Brazilian legislation to regulate the matter. Poorly defined or incomplete institutions may jeopardize the performance of the soybean chain, an important productive sector in Brazil, thus making studies like this necessary in order to support its competitiveness and sustainability. The exploratory-descriptive research is based on preliminary analysis about aspects of legislation in force in Brazil and the European Union regarding genetically modified organisms. Therefore, complementary information was collected from the main Soybean Agro-Industrial System segments (seeds, rural production and institutional environment). Semi-structured interview scripts comprised of open and dichotomic questions were used aiming to raise perceptions from the actors that represent those segments. The analysis of the content verbalized by participants was made by software Alceste (Analyse de Lexémes Coocurrent dans lês Ennoncés Simple d’un Texte – Lexical Contextual Analysis of a Group of Text Segments) and afterwards, by manual analysis of the content, it was possible to validate the electronic examination. Some categories of analysis emerged from the participants‘ speech and results were organized and interpreted under the referential framework of Agribusiness Systemic View and the theory of New Institutional Economics, indicating the need for regulating specific parameters in order to assure the coexistence of both transgenic and conventional soybean.

Bacillus thuringiensis é uma bactéria gram-positiva que produz cristais protéicos durante a fase de esporulação. Os cristais, são formados por proteínas Cry e apresentam atividade tóxica específica a determinadas classes de insetospraga, sendo o seu uso bastante difundido na agricultura. O presente trabalho teve como objetivo gerar uma biblioteca de variantes, do gene cry8Ha1, isolado da estirpe S811 de B. thuringiensis e selecionar variantes com atividade melhorada para pragas do algodoeiro. A biblioteca foi construída por meio da técnica de DNA shuffling e selecionada contra os insetos-praga Anthonomus grandis e Spodoptera frugiperda pela técnica de Phage display. As variantes foram selecionadas pela afinidade aos receptores presentes nas membranas dos intestinos do bicudo-do-algodoeiro (A.grandis) e da lagarta-do-cartucho (S. frugiperda), principais pragas do algodoeiro. Após expressão em fago, proteínas variantes foram testadas em bioensaios contra larvas dos insetos-alvo (A. grandis e S. frugiperda) e seqüenciadas. Os resultados de atividade, mostraram variantes mais efetivas para as duas pragas-alvo, quando comparado com a proteína original Cry8Ha1. O mutante Cry/BI-25 (ativo contra A. grandis) foi selecionado, por diferir estatisticamente do controle, e subclonado no vetor de expressão em bactéria. A proteína foi purificada e utilizada em bioensaio contra larvas de A. grandis. Os resultados indicaram um aumento de atividade entomotóxica de 333% da proteína mutante (Cry/BI-25) quando comparada com a proteína original (Cry8Ha1). A nova molécula, Cry/BI-25, está sendo utilizada em programas de melhoramento de plantas de algodão visando a obtenção de plantas resistentes à praga-alvo. / Bacillus thuringiensis is a gram-positive bacterium that produces protein crystals during its sporulation phase. These crystals are formed by Cry proteins that show specific toxicity to some insect-pest classes, which makes their use very common in agriculture. This work aimed at obtaining a library of cry8Ha1 gene variants, isolated from B. thuringiensis S811 and the selection of gene variants, whose products would have an improved insecticidal activity against cotton insect-pests. The library was constructed using DNA shuffling and selected against the insectpests Anthonomus grandis and Spodoptera frugiperda using Phage display. The variants were selected by affinity to Brush Border Membrane Vesicles (BBMVs) of A. grandis and S. frugiperda midguts. After phage expression, variant proteins were tested in bioassays against the target insects and their genes sequenced. The mutant Cry/BI-25 showed higher insecticidal activity against A. grandis and was subcloned to a bacterium expression vector. The purified expressed protein Cry/BI-25 is 333% more active when compared with protein original (Cry8Ha1). Gene variants selected against S. frugiperda are still under analysis. The new improved protein Cry/BI-25 will be used in cotton plant transformation experiments, with the purpose of developing insect-pest resistant GM cotton plants.