A soja é uma das espécies cultivadas de maior importância econômica para o Brasil, atualmente o segundo maior produtor mundial deste grão. Contudo, doenças causadas por fungos são um dos principais problemas enfrentados pelos produtores de soja, o que leva a grandes perdas. Uma das alternativas para superar este problema é a utilização de cultivares com resistência genética. Com este objetivo, foram realizados quatro experimentos independentes de transformação genética de soja, em que o gene chit1, que codifica uma quitinase, enzima capaz de degradar paredes fúngicas, foi transferido para culturas embriogênicas, através da metodologia de biobalística. O gene marcador hpt, que confere resistência ao antibiótico higromicina, também foi utilizado. Em três dos experimentos realizados, uma nova metodologia foi testada, em que sequências desnecessárias, presentes nos vetores de transformação, não são colocadas na planta, e sim apenas os cassetes gênicos, contendo regiões regulatórias e codificadoras. No 1° Experimento realizado, foram obtidas plantas transgênicas transformadas com plasmídeos, mas estas não produziram sementes. No 2° Experimento, foi obtida uma linhagem transgênica, oriunda da transformação com plasmídeos. Foi confirmada a presença e a expressão do gene de quitinase em uma planta T0. Esta planta gerou uma progênie de 16 plântulas. Destas, 10 foram analisadas por PCR e foi confirmada a transmissão do transgene marcador para seis plantas T1. Análises moleculares complementares são necessárias para a determinação do padrão de herança dos transgenes. Como resultado do 3º Experimento realizado, foram obtidos 3.298 embriões histodiferenciados da cultivar Bragg (2.804 oriundos da transformação com plasmídeos e 494 da transformação com cassetes) e 2.286 para a cultivar IAS (759 com plasmídeos e 1.527 com cassetes). Do 4º Experimento realizado, foram obtidos 1.339 embriões histodiferenciados da cultivar Bragg (1.312 oriundos da transformação com plasmídeos e 27 da transformação com cassetes) e 1.035 para a cultivar IAS5 (851 com plasmídeos e 184 com cassetes). Mesmo considerando a possibilidade de alguns dos embriões obtidos serem escapes à seleção, a resistência ao antibiótico é um forte indício de transformação estável. Já foram obtidos embriões germinados oriundos da transformação com cassetes, resultantes dos 3° e 4° Experimentos. Com a condição transgênica comprovada, será realizada uma comparação dos padrões de integração gerados por transformação com plasmídeos e cassetes gênicos. / Soybean is one of the most important crops in Brazil, which is nowadays the second world largest producer. However, injuries caused by fungus are one of the main problems faced by the producers, causing great losses. One of the possibilities to deal with this problem is the utilization of cultivars with genetic resistance. With this goal, four independent soybean transformation experiments were performed. A chitinase gene, chit1, which can break fungal cell walls, was transferred to soybean embryogenic cultures, through the use of biolistic. The selection marker gene hpt, which confers hygromycin resistance, was also transferred to the embryos. In three of the performed experiments, a new methodology was tested, where unnecessary sequences, that are part of the transformation vectors, were not introduced into the plant, but only the gene cassettes, which contain regulatory and coding sequences. In the first experiment, transgenic plants were obtained, but they left no progeny. In the second experiment, one transgenic line was obtained from the plasmid transformation. The presence and expression of the chitinase gene in one T0 plant was confirmed. 16 T1 plantlets were obtained. 10 were analyzed by PCR, and the transmission of the marker gene to six T1 plants was confirmed. Further molecular analyses are necessary in order to determine the inheritance pattern of the transgenes. As a result of the 3rd Experiment, 3.298 histodifferentiated embryos of the cultivar Bragg were obtained (2.804 from the plasmid transformation and 494 from the gene cassettes transformation) and 2.286 of the cultivar IAS (759 from the plasmid transformation and 1.527 from the gene cassettes transformation). From the 4th Experiment, 1.339 histodifferentiated embryos were obtained for cultivar Bragg (1.312 from the plasmid transformation and 27 from the cassettes) and 1.035 for IAS (851 from the plasmid transformation and 184 from the cassettes). Even considering the possibility that some of the embryos obtained may have escaped selection, the hygromycin resistance is a great indication of stable transformation. Plants transformed, resulting from the 3rd and 4th experiments, were already obtained with the minimal cassettes. Once their transgenic nature is proved, the patterns of integration of plasmid transformed plants and cassette transformed plants will be compared.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-26T06:38:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 289228.pdf: 1486347 bytes, checksum: acd470fda9f45a55c31dbe6aeb4337c9 (MD5) / Estudos de biossegurança que comparam OGMs e não-OGMs geralmente compreendem características agronômicas/fenotípicas, composição nutricional e bromatologia. No entanto, técnicas que analisam um perfil molecular do OGM (molecular profiling techniques) podem facilitar uma análise comparativa mais completa e holística. Essa abordagem envolve diversas tecnologias, entre as quais destaca-se a proteômica. Desta forma, focando os eventuais riscos inerentes à transformação genética de plantas, nosso trabalho buscou caracterizar possíveis efeitos pleiotrópicos em híbridos comerciais de milho transgênico Bt (Evento MON810) comercializados e cultivados em Santa Catarina, Brasil. Para tanto, utilizou-se a técnica de eletroforese bidimensional para análise comparativa e diferencial de perfis protéicos de folhas de milhos transgênicos em comparação a sua versão não-transgênica (isogenica). Também, objetivou-se detectar a proteína CRY1Ab expressa nos mesmos híbridos. Mais além, buscou-se avaliar algumas técnicas e metodologias para tal estudo, incluindo a utilização de protéina CRY1Ab bacterial. Foram coletadas folhas de plantas em estagio de florescimento em três localidades diferentes, Canoinhas, Chapecó e Campos Novos. O delineamente experimental utilizado foi o de blocos completamente casualizados. Nossos resultados indicam que a proteína CRY1Ab detectada também sofre clivagem enzimática, gerando uma molécula de peso molecular de aproximadamente 70kDa, o que pode corresponder a parte da ?- endotoxina. Entretanto, quando realizada extração baseada em tampão fenol saturado (pH ±8,0) e precipitação com acetato de amônio em metanol, a proteína CRY1Ab detectada apresenta cerca de 100kDa. Esta proteina detectada pode não estar na sua forma não clivada, ou ainda, pode ser uma isoforma. Caso seja confirmado, tal resultado permitiria o seqüenciamento total da proteína expressa, ou o seqüenciamento de isoformas presentes em plantas geneticamente modificadas. Os resultados das análises dos géis bidimensionais de proteínas CRY1Ab bacterial (expressas em E. coli) apresentaram seis spots com mesmo peso molecular (aproximadamente 70kDa) porém com diferentes pI, variando de aproximadamente 5,6 a 6,0. A presença de BSA na amostra não explica os seis spots, uma vez que existem indicações que BSA exista em três isoformas. Desta forma, análises posteriores para o seqüenciamento destes spots devem ser realizadas a fim de esclarecer a origem destes spots. Uma possibilidade está relacionada a interações proteína-proteína durante a expressão e purificação da mesma. Tal resultado é importante, pois serve como indicação de que estes possíveis processos também ocorram com proteínas CRY1Ab expressas em plantas. Os experimentos de Chapecó e Campos Novos obtiveram menor coeficiente de variação médio (entre 20 e 23%) para os spots detectados, o que traz maior consistência para análise proteômica comparativa e diferencial. O experimento de canoinhas obteve maior coeficiente de variação médio (aprox. 60%) e a hipótese levantada diz respeito à possível degradação das amostras durante as coletas e conseqüente má resolução dos géis bidimensionais. Em relação aos spots diferenciais, observou-se um grande número de spots detectados. O experimento de Campos Novos obteve 96 spots diferenciais; seguido de Chapecó com 69 e Canoinhas com 41. O tipo de diferença que obteve maior número de spots foi aquele cujo spot é exclusivo ao tratamento não-Bt (118 spots). Observou-se que o software utilizado pode não ser eficiente quando os géis apresentam distorções geométricas pontuais e globais. As proteínas diferencialmente expressas podem estar relacionadas com diversas funções e interações com diversos processos metabólicos importantes para a planta. No entanto, apenas após o seqüenciamento das mesmas é que se podem estimar os possíveis efeitos adversos oriundos desta tecnologia moderna. De qualquer forma, a abordagem utilizada em nosso trabalho, incluindo a metodologia para amostragem, desenho experimental e procedimento de análise de imagens, foi eficiente em detectar efeitos pleiotrópicos oriundos da engenharia genética de plantas cultivadas em larga escala.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-05-15T17:33:53Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1122210 bytes, checksum: f3b8ea6c8b07bc43a33d58c50576af76 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-15T17:33:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1122210 bytes, checksum: f3b8ea6c8b07bc43a33d58c50576af76 (MD5) Previous issue date: 2014-11-28 / A contaminação do solo e da água com metais pesados é um crescente problema ambiental em todo o mundo. Dentre os metais pesados está o cádmio (Cd), que é altamente tóxico para humanos, animais e plantas. A toxicidade desse metal causa estresse oxidativo nas plantas, afetando de maneira negativa seu crescimento e metabolismo, desencadeando alterações bioquímicas, fisiológicas e moleculares que limitam a produtividade das culturas. A expressão de alguns genes confere às plantas maior capacidade de enfrentar os estresses, aumentando sua tolerância a condições adversas do ambiente. Trabalhos desenvolvidos com plantas transgênicas mostraram que a expressão ectópica dos genes BiP e ALDH7 confere tolerância aos estresses hídrico e salino nas plantas. Estas observações levaram à hipótese de que as vantagens adquiridas com a expressão ectópica de BiP e ALDH7 nas plantas poderiam também ser efetivas contra toxicidade por metais pesados. Os objetivos deste trabalho foram estudar a toxicidade de Cd em plantas de soja e de tabaco, avaliando seu efeito no crescimento da planta e caracterizando os sintomas de toxidez; e avaliar se plantas transgênicas de soja superexpressando BiP e plantas transgênicas de tabaco expressando ALDH7 apresentam tolerância ao estresse causado por excesso de Cd. As linhagens de soja transformadas utilizadas neste trabalho foram 35S:BIP-2 e 35S:BIP-4, e para o tratamento controle, foram utilizadas linhagens não-transformadas (“wild type”) (WT). As plantas de soja foram cultivadas durante oito dias em solução nutritiva contendo Cd nas doses 0; 0,5; 1,5; 3,0 mg L -1 . As linhagens de tabaco transformadas utilizadas foram TP55-S3 (senso) e TP55anti-4 (anti-senso), e para o tratamento controle, foram utilizadas linhagens não-transformadas (“wild type”). As plantas de tabaco foram cultivadas durante quatro dias em solução nutritiva contendo Cd nas doses 0; 5,5 e 22,5 mg L -1 . A produção de matéria seca nas plantas das três linhagens de soja estudadas diminuiu com o incremento das doses de Cd na solução nutritiva, no entanto, a linhagem WT apresentou sensibilidade ao Cd significativamente maior do que as linhagens transgênicas, em termos de redução relativa de matéria seca. O teor e o conteúdo de Cd aumentaram tanto na raiz como na parte aérea das plantas das três linhagens de soja, entretanto, as linhagens transgênicas apresentaram maior capacidade de absorver o Cd e transportá-lo para a parte aérea, em comparação com a linhagem WT. Com o incremento das doses de Cd na solução nutritiva, a retenção de Cd aumentou no sistema radicular da soja, nas três linhagens. Os sintomas de toxidez de Cd se caracterizaram pelo aparecimento de manchas avermelhadas nos caules, pecíolos e nervuras das folhas, folhas cloróticas, encarquilhadas, murchas e secas, liberação de exsudados avermelhados nos caules e redução do crescimento. Nas plantas expostas à maior dose de Cd, esses sintomas foram mais brandos nas linhagens transgênicas, superexpressando BiP em comparação às plantas controle. Isso sugere a possibilidade dessas plantas apresentarem mecanismo de tolerância ao Cd. Nas três linhagens de tabaco estudadas, a produção de matéria seca das plantas diminuiu com o incremento das doses de Cd na solução nutritiva, no entanto, a linhagem anti-senso apresentou sensibilidade ao Cd significativamente maior do que as linhagens senso e WT, em termos de redução relativa de matéria seca. O incremento nas doses de Cd na solução nutritiva resultou em aumento do teor de Cd tanto nas raízes como na parte aérea das plantas das três linhagens, apresentando pequena variação entre estas. Houve maior absorção de Cd pelas plantas senso e WT, sendo que essa diminuiu com o aumento das doses de Cd na solução nutritiva. A linhagem anti-senso apresentou menor absorção de Cd devido à maior intensidade de danos no sistema radicular, em consequência da sua maior sensibilidade à toxidez do Cd. Houve maior acúmulo de Cd na parte aérea do que na raiz das três linhagens. As plantas apresentaram danos severos no sistema radicular, murcha acentuada, manchas avermelhadas nas nervuras das folhas, encarquilhamento das folhas novas, clorose internerval e redução do crescimento, sendo esses sintomas mais severos nas plantas anti-senso. Não se observou nenhuma vantagem adquirida com a expressão da proteína ALDH7A nas plantas de tabaco. Entretanto, os resultados sugerem que a expressão do ALDH7A em tabaco pode ser importante para ativar mecanismos de resposta ao estresse oxidativo causado pelo Cd nas plantas uma vez que, mesmo não tendo sido observada tolerância diferencial das plantas senso em relação às plantas WT, a supressão da expressão desse gene nas plantas anti-senso levou a maiores danos causados pelo Cd. / The contamination of the soil and water with heavy metals is one of the biggest problem in the environment in the world. Cadmium (Cd) is a heavy metal highly toxic to humans, animals and plants. Cd toxicity causes oxidative stress in plants, which affects the growing and metabolism in a negative way. Moreover, in Cd contaminated areas, it promotes biochemical and physiological changes, which are associated with lower productivity in the crops around the world. It is known that some genes are able to help the plants to cope with different kind of stresses, in such a way that there is an increase in the plant tolerance to adverse environmental conditions. Transgenic plants, which overexpress BiP and ALDH7 genes, have shown tolerance to hydric and salinity stresses. This kind of occurrence has led to the hypotheses that those genes could confer tolerance to heavy metal toxicity. In this work, the focus was the study of the effects of Cd toxicity in soybean and tobacco in plants expressing BiP and ALDH7, respectively. It was evaluated the plant growth under Cd exposure, it was characterized the symptoms of Cd toxicity in those plants and evaluated if the transgenic lines are more tolerant to Cd stress. In the soybean experimental work, it was used two different transgenic lines of BiP (35S-BiP2 and 35S-BiP4) and a non-transgenic line (wild type) (WT) as a control. Soybean plants were grown in hydroponic conditions in Cd enriched nutrient solutions during eight days, to evaluate the effect of different Cd concentrations 0; 0,5; 1,5; 3,0 mg L -1 in transgenic and non-transgenic plant growth. Dry matter weight decreased in all soybean lines as a result of increased Cd concentration in the nutrient solution. However, the WT line showed higher relative reduction of dry weight compared to the soybean transgenic lines, which suggests a higher sensibility of the WT to Cd toxicity. Cadmium concentrations and contents increased in roots and shoots of soybean as the Cd in nutrient solution was increased and, although the transgenic lines had higher efficiency to transport Cd to the leaves, Cd retention was higher in roots than shoots, for the three lines. Cadmium toxicity symptoms in soybean were characterized by red spots on the stem and petioles, redness in leaf nervures, chlorosis, wrinkled leaves, release of red exudates in the stem and decrease in growth. In plants grown exposed to the highest Cd concentration, these symptoms were less apparent in the transgenic lines plants as compared to the control plants. The results found for the soybean BiP overexpressing lines indicate the possibility that those plants have a mechanism that helps the plant to cope with Cd toxicity and make them more tolerant than the WT plants. The experiment with tobacco was performed with plants that express the ALDH7 in sense orientation (TP55-S3) and antisense orientation (TP55anti- 4) and non-transgenic plants (wild type) as control. The tobacco plants were grown in nutrient solutions that received Cd at the concentrations 0; 5.5 e 22.5 mg L -1 , by four days. The three tobacco lines showed a decrease in dry weight production when Cd concentration was raised in nutrient solution. The line TP55anti-4 presented a higher sensibility to Cd compared to WT and TP55-S3 lines, when the data of relative decrease in dry matter yield were compared. Cadmium concentrations in roots and shoots increased as a result of the raise in the Cd concentrations in the nutrient solutions, for the three lines, with low variation among them. Cadmium absorption was higher in WT and TP55-S3 plants and decreased when the solution Cd concentration was raised. The lower Cd absorption in TP55anti-4 was due to more severe damage that occurred in its root system, which is related to the higher sensibility of those plants to Cd toxicity. Cadmium accumulation was higher in shoots than in roots for the three tobacco lines. It was observed severe damage in the root system, along with loss of cell turgor, red spots in the leaves nervures, wrinkled leaves, chlorophyll loss and decrease in growth. All these symptoms were more severe in the TP55anti-4 line. Even though no acquired advantage had been observed in the tobacco plants expressing ALDH7A as compared to the WT plants, the results indicate that the expression of the ALDH7A in tobacco may be important to activate a tolerance mechanism to cope the oxidative stress caused by Cd. This is based on the observation that although no differential tolerance had been observed for the sense plants as compared to the WT plants, the suppression of this gene in the TP55anti-4 plants has led to more severe damage caused by Cd toxicity in those plants.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-04-19T17:22:46Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1750733 bytes, checksum: ccb91d96b8d7ad75acae4c3a5be30057 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-19T17:22:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1750733 bytes, checksum: ccb91d96b8d7ad75acae4c3a5be30057 (MD5) Previous issue date: 2013-03-08 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Esta tese foi desenvolvida em dois capítulos. No primeiro estudou-se os componentes crítico e os fatores chave de perdas no milho Bt e não-Bt em duas localidades (Localidade 1 e 2). A Localidade 1 apresentava solos com baixa fertilidade e alta saturação de alumínio, a Localidade 2 apresentava solos com alta fertilidade e baixa saturação de alumínio. No segundo capítulo estudou-se a distribuição espacial de das injúrias de Helicoverpa zea (Boddie) (Lepidoptera: Noctuidae), Spodoptera frugiperda (J. E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae) e Euxesta spp. (Diptera: Otitidae) e de adultos de Sitophilus spp. (Coleoptera: Curculionidae) e Cathartus quadricollis (Guerin-Meneville) (Coleoptera: Silvanidae) em lavouras de milho Bt e não-Bt. Para determinação do componente crítico e dos fatores chave de perda monitorou-se a mortalidade de plantas e as perdas de espigas e de grãos. Para o estudo da distribuição espacial foram coletadas de 280 a 405 amostras por lavoura. Cada ponto amostral era constituído por cinco espigas de milho. As distâncias entre os pontos amostrais foram de oito metros. As espigas foram levadas para laboratório, onde foi realizada a avaliação das injúrias da H. zea, S. frugiperda e da Euxesta spp. e a contagem do número de adultos de Sitophilus spp. e C. quadricollis. As perdas de grãos foi o componente crítico de perdas dos milhos cultivados nas duas localidades ao longo dois anos de cultivo. O fator chave de perdas para os milhos cultivados, na Localidade 1, no primeiro cultivo foi grãos defeituosos e no segundo ano foi H. zea. O fator chave de perdas para os milhos cultivados, na Localidade 2, foram às perdas causadas pela Euxesta spp. no primeiro ano e grãos defeituosos no segundo ano. Houve ajustamento de semivariogramas isotrópicos no milho Bt e no não-Bt para as injurias de H. zea, S. frugiperda e da Euxesta spp. e do número de adultos de Sitophilus spp. e de C. quadricollis. Houve tendência de movimentação dos insetos ao longo e entre as linhas de cultivo dos milhos dos dois anos de amostragem. / This thesis has been developed in two chapters. At first we studied the critical components and key factors of loss on Bt and non-Bt in two locations, one with low fertility soils and high aluminum saturation (Location 1) and another location had soils with high fertility and low aluminum saturation (Location 2). In the second chapter we studied the spatial distribution of injuries Helicoverpa zea (Boddie) (Lepidoptera: Noctuidae), Spodoptera frugiperda (JE Smith) (Lepidoptera: Noctuidae) and Euxesta spp. (Diptera: Otitidae) and adults of Sitophilus spp. (Coleoptera: Curculionidae) and Cathartus quadricollis (Guerin- Meneville) (Coleoptera: Silvanidae) in corn fields Bt and non-Bt. To determine the critical component and loss of the key factors were monitored plant mortality and loss of corn ear and grains. To study the spatial distribution were collected 280-405 samples per crop. Each sampling point consisted of five corn cobs. The distances between the sampling points were eight meters. The cob corns were taken to the laboratory, where it was performed evaluating the injuries of H. zea, S. frugiperda and Euxesta spp. and counting the number of adults of Sitophilus spp. and C. quadricollis. The grain loss was the critical component of losses to corn grown in two locations along two years of cultivation. The key factor in losses for corn grown, in Location 1, was corn defective grain and the second year was H. zea. The key factor in losses for corn grown, in Location 2, was caused by Euxesta spp. in the first year and defective grains in the second year. There was adjustment isotropic semivariograms in Bt and non-Bt for injuries H. zea, S. frugiperda and Euxesta spp. and the number of adults of Sitophilus spp. and C. quadricollis. There was a tendency of moving insects along and between corn rows during the two years of sampling.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-06-14T09:46:30Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 930284 bytes, checksum: c53f457fa4116be5bc4e687ad459a112 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-14T09:46:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 930284 bytes, checksum: c53f457fa4116be5bc4e687ad459a112 (MD5) Previous issue date: 2002-04-16 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O vírus do endurecimento dos frutos do maracujazeiro (PWV) é membro da família Potyviridae, gênero Potyvirus. No Brasil a doença está presente relatada nos principais Estados produtores. Plantas de maracujá-amarelo (Passiflora edulis f. flavicarpa Degener) transformadas com uma construção não traduzível correspondente a 2/3 da região 3 do gene nib e 1/3 da região 5 do gene cp de PWV-isolado Minas Gerais (PWV-MG) foram propagadas por estaquia e desafiadas por inoculação mecânica via extrato foliar tamponado com os isolados PWV-MG e PWV-isolado Pernambuco (PWV-PE). O transformante (T10) foi resistente ao PWV-MG, mas suscetível ao PWV-PE. A ausência de vírus nestes transformantes foi confirmada por ELISA indireta. As demais plantas transgênicas desenvolveram sintomas evidentes quando inoculadas com ambos os isolados. Análises de expressão gênica por hibridização demonstraram que na linhagem T10 não ocorreu acúmulo de mRNA transgênico antes da inoculação. Após a inoculação, apenas em plantas inoculadas com o isolado PWV-PE foi detectado RNA viral. Estes resultados comprovam que o transformante T10 é resistente ao isolado PWV-MG, que o mecanismo de resistência envolvido é o silenciamento gênico pós- transcricional e que este mecanismo já está ativado nas plantas transgênicas antes da inoculação com o vírus. A linhagem T10 será propagada vegetativamente a testada para resistência ao PWV em condições naturais. / The passionfruit woodiness virus (PWV) is a member of the family Potyviridae, gender Potyvirus. In Brazil the disease is present in the principal States producers. Passionfruit yellow plants (Passiflora edulis f. flavicarpa Degener) were transformed with a non translatable construction corresponding to 2/3 of the area 3 ' of the gene nib and 1/3 of the 5 ' of the gene PWV-isolated cp Minas Gerais (PWV-MG). Trangenic plants were cloned by stem cuttings and challenged by sap inoculation with isolated PWV-MG and PWV-isolated Pernambuco (PWV-PE). The transgenic plant (T10) was resistant to PWV-MG, but susceptible to the PWV-PE. The virus absence in these plant was confirmed by ELISA indirect. The other transgenic plants developed evident symptoms when inoculated with both isolated ones. Northern blot analyses demonstrated that in the transgenic plant T10 did not accumulate transgenic mRNA before the inoculation. After the inoculation, viral RNA was detected just in plants inoculated with the isolated PWV-PE. These results proved that the transgenic plant T10 was resistant to isolated PWV-MG, that the resistance mechanism involved it was post-transcriptionaly gene silencing and that this mechanism was already activated in the transgenic plants before virus inoculation. The transgenic plant T10 will be vegetatively propagated and tested for resistance to PWV under natural conditions. / Não foi encontrado o currículo lattes do autor.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2015-09-22T04:11:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 334500.pdf: 2215960 bytes, checksum: 94a2277129c588f5b8fc62a1b6ff8e8a (MD5) Previous issue date: 2015 / O milho é a cultura mais amplamente distribuída em todo o mundo e possui um papel chave na segurança alimentar. Muitas pesquisas estão direcionadas ao milho transgênico, pois é amplamente cultivado e ainda gera dúvidas entre os cientistas. Os impactos ambientais das plantas transgênicas têm sido avaliados sobre os organismos não alvo da tecnologia, sobretudo os microrganismos endofíticos, uma vez que estão envolvidos em mecanismos de defesa e adaptação utilizados pelas plantas. Assim, nesse estudo buscou-se avaliar o efeito da inserção de transgenes e do fluxo gênico de transgenes sobre a estrutura de comunidades de microrganismos endofíticos uma variedade crioula de milho. Para isso, foram estudados três híbridos isogênicos, dos quais um deles era não geneticamente modificado (NGM), o segundo continha a transgenia Herculex, evento TC1507 (Hx) e o terceiro, a transgenia Herculex combinada com Roundup Ready, evento NK603 (Hxrr). A variedade crioula de milho utilizada foi a ?Rosado? (RS) conservada on farm por agricultores familiares do Extremo Oeste de Santa Catarina, Brasil. Através de polinizações manuais controladas foram inseridos os pólens dos híbridos em plantas de milho crioulo, durante duas gerações, a fim de simular a ocorrência de fluxo gênico reincidente, e assim gerar as populações de milho crioulo contendo 25, 50 e 75% da composição genética de cada híbrido, separadamente. Inicialmente avaliou-se bactérias e fungos endofíticos das folhas de plantas de milho, comparando apenas os quatro genótipos iniciais (RS, NGM, Hx e Hxrr), em quatro estádios do desenvolvimento das plantas, dois vegetativos (V3 e V4) e dois reprodutivos (R1 e R2). Para isso, em um ensaio a campo foram coletadas as folhas de três plantas de cada genótipo, em cada estádio, totalizando 48 amostras. Dessas amostras foram extraídos DNAs e feitas PCRs para amplificação do rDNA 16S de bactérias e da ssu rDNA de fungos, os quais foram avaliados por DGGE. Após as análises de cluster e ANOSIM, concluiu-se que as bactérias endofíticas variam apenas de acordo com o estádio fenológico, enquanto que os fungos endofíticos sofreram alterações devido ao genótipo das plantas. Com relação a estrutura da comunidade de fungos, RS diferiu dos demais genótipos avaliados, nos quatro estádios. Nos estádios vegetativos (V3 e V4), os fungos foram diferentes entre os híbridos com e sem transgenia. No estádio reprodutivo (R1) ainda foi possível diferenciar a comunidade de fungos entre os dois transgenes, porém o NGM foi semelhante ao Hx. Após isso, implantou-se o experimento a campo, com três repetições em blocos casualizados, a fim de comparar os quatro genótipos (RS, NGM, Hx e Hxrr) e mais nove populações de milho crioulo geradas, contendo 25, 50 ou 75% do genoma de cada híbrido. Coletou-se 10 plantas de cada tratamento, no estádio reprodutivo (R1) previamente selecionado, totalizando 390 amostras, das quais foi extraído DNA e amplificada a região ssu rDNA de fungos endofíticos para análise por DGGE. Após análises de cluster e ANOSIM, concluiu-se que os fungos endofíticos da variedade RS diferiram dos demais tratamentos, assim como observado no ensaio anterior. As populações com introgressão do transgene Hxrr foram as que mais sofreram alterações. Os efeitos não intencionais dos transgenes nas plantas ainda são desconhecidos, por outro lado o presente trabalho permite inferir que os transgenes afetam a diversidade estrutural de fungos endofíticos do milho e que os efeitos diretos sobre as plantas ainda devem ser estudados.<br> / Abstract : Maize is the most widely crop distributed around the world and it has a key role in food safety. Many researches are performed with transgenic maize because it is widely cultivated and still generates doubts among scientists. The environmental impacts of the transgenic plants have been evaluated on non-target organisms of the biotechnology, especially the endophytic microorganisms, since they are involved in defense mechanisms and adaptation used by plants. Thus, this study aimed at assessing the effect of the insertion of transgenes into the plant and gene flow on the structure of endophytic microbial communities of a corn landrace. Thus, we used three isogenic hybrids, of which one was the isogenic form not genetically modified form (NGM), the second contained the transgenic Herculex, TC1507 event (Hx), and the third, the transgenic Herculex combined with Roundup Ready, NK603 event (Hxrr). The corn landrace was "Rosado" (RS) conserved on farm by small-scale farmers in Western Santa Catarina, Brazil. The pollen of hybrids were used to pollinate RS for two generations through controlled pollinations in order to simulate the occurrence of recurrent gene flow and generate populations contain 25, 50 and 75% of the genetic background of each hybrid. Initially, endophytic fungi and bacteria from leaves of plants were evaluated, based on the four genitors genotypes (RS, NGM, Hx and Hxrr) in four stages of plant development, two vegetative (V3 and V4) and two reproductive (R1 and R2). Thus, in a field trial was collected leaves from three plants for each genotype and each stage, totaling 48 samples. DNAs were extracted from these samples, following of PCR amplifications with 16S rDNA of bacteria and ssu rDNA of fungi, which were evaluated by DGGE. After cluster analysis and ANOSIM, it may be concluded that endophytic bacteria vary according to the phenological stage, while the endophytic fungi change due to the genotype of plants. Regarding the structure of fungal community, RS differed from the other genotypes in the four stages. In the vegetative stages (V3 and V4), the fungi were different among the hybrids with and without genetic modification. In the reproductive stage (R1), the fungal community was different for the two transgenic hybrids (Hx and Hxrr), but NGM was similar to Hx. After that, the field experiment was implanted with three replications in a randomized block design, in order to compare the four genotypes (RS, NGM, Hx and Hxrr) and nine populations containing 25, 50 or 75% of the genome each hybrid separately. Leaves of 10 plants of each treatment were collected in the reproductive stage (R1) previously selected, totaling 390 samples. DNAs were extracted from these samples and the rDNA ssu region of endophytic fungi was amplified the rDNA ssu region for analysis through DGGE. After cluster analysis and ANOSIM, it may be concluded that endophytic fungi of RS differed from other treatments, such as previous test. Populations with introgression of Hxrr transgene suffered more changes. The unintended effects of transgenes in plants is still unknown; on the order hand, we can infer from this work that the transgenes affect the structural diversity of endophytic fungi of corn and the direct effects on plants still need to be studied.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2017-05-30T04:03:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 345795.pdf: 2243347 bytes, checksum: 2c97a0d74648175423566a78cecddb09 (MD5) Previous issue date: 2015 / Em ambientes naturais e agrícolas, as plantas geneticamente modificadas e seus transgenes estabelecem contato com espécies não alvo que desempenham importantes funções ecológicas. Os estudos revelam que a eficiência de plantas geneticamente modificadas para controlar pragas é bem conhecida; no entanto, seus efeitos letais e/ou sub-letais sobre insetos não-alvo, permanecem em discussão. O conhecimento sobre o impacto das plantas transgênicas em insetos não alvo, como as abelhas, a campo ainda é escasso. Neste contexto buscou-se avaliar o efeito do pólen de plantas de milho geneticamente modificado sobre o desenvolvimento das áreas de cria, caracteres morfológicos e comportamento higiênico de abelhas africanizadas em condições de campo; e determinar a ocorrência de proteínas transgênicas no mel produzido em Santa Catarina, através do uso de tiras imunocromatográficas de detecção de proteínas transgênicas. Os resultados mostraram que o pólen transgênico dos cultivares de milho que expressam as proteínas Cry1A.105 Cry2Ab2 e Cry1A.105 Cry2Ab2 CP4-EPSPS causaram aumento na área de desenvolvimento de crias aberta e redução na área de desenvolvimento de crias operculada; redução no peso de pupas e diminuição gradativa da taxa de comportamento higiênico. Em relação ao teste de detecção imunocromatográfica através de tiras em mel, este mostrou-se eficiente para detecção da presença das proteínas transgênicas, e do total de amostras de mel analisadas, seis amostras responderam positivamente para todos os transgenes avaliados: Cry 1Ab, Cry 1F e RR; comprovando que as abelhas forrageiam em plantas transgênicas.<br> / Abstract : In natural and agricultural environments, genetically modified plants and their transgenes establish contact with non-target species that perform important ecological functions. Studies show that the efficiency of genetically modified plants to control pests is well known; however, its lethal and / or sub-lethal effects on non-target insects remain under discussion. Knowledge about the impact of transgenic plants on nontarget insects, such as bees, on the field is still scarce. The objective of this study was to evaluate the effect of pollen from genetically modified corn plants on the development of breeding areas, morphological characters and hygienic behavior of africanized bees under field conditions; and to determine the occurrence of transgenic proteins in the honey produced in Santa Catarina, through the use of immunochromatographic strips of detection of transgenic proteins. The results showed that transgenic pollen from maize cultivars expressing the Cry1A.105 Cry2Ab2 and Cry1A.105 Cry2Ab2 CP4-EPSPS proteins caused an increase in the area of open hatchlings development and reduction in the area of hatchlings development; reduction in pupal weight and gradual decrease in the rate of hygienic behavior. In relation to the immunochromatographic detection test by means of honeycomb strips, it was efficient to detect the presence of the transgenic proteins, and of the total honey samples analyzed, six samples responded positively to all the evaluated transgenes: Cry 1Ab, Cry 1F And RR; oroving that bees forage in transgenic plants.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2017-01-17T03:14:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 343443.pdf: 16757930 bytes, checksum: d1d29d7a1434b129fc00027e7599fded (MD5) Previous issue date: 2016 / A área plantada com culturas transgênicas cresceu rapidamente desde a primeira liberação comercial em 1996, sendo Brasil o segundo país com maior área plantada com este tipo de lavouras. Nas plantas transgênicas, há expressão constitutiva das proteínas recombinantes, que são liberadas no ambiente da rizosfera, através dos exsudatos da raiz, ou através da decomposição dos resíduos de colheita. Dessa forma, os microrganismos da rizosfera, como os fungos micorrízicos arbusculares, entram em contato com aquelas proteínas. A presente pesquisa avaliou os efeitos da transgenia sobre o desenvolvimento da simbiose e sobre a diversidade dos FMA em cinco genótipos de milho: um um crioulo, dois híbridos convencionais (DKB 240 e Fórmula) e dois transgênicos (DKB 240 VT-Pro e Fórmula TL). Para avaliar o desenvolvimento da simbiose, realizaram-se dois ensaios independentes, o primeiro durante os meses de maio a julho de 2013 e o segundo durante os meses de fevereiro a abril de 2015. As plantas de milho foram inoculadas com Rhizophagus clarus (Rc) e Gigaspora margarita (Gm) e comparadas com plantas sem inoculação. Foram avaliadas a porcentagem de colonização, número de esporos, teor e acúmulo de fósforo e biomassa vegetal, 30 e 60 dias após a inoculação. Não houve efeitos consistentes da transgenia sobre nenhuma das variáveis estudadas, porém a espécie de FMA e o genótipo de milho influenciaram o desenvolvimento da simbiose. O genótipo Fórmula (isolinha e transgênico), apresentou resposta negativa à inoculação, com um decréscimo médio de 29% na biomassa e 30% no teor de P das plantas inoculadas com Rc. Por outro lado, o milho crioulo apresentou resposta positiva, com aumento médio de 17% e 14% nas mesmas variáveis. O genótipo DKB apresentou efeitos negativos, positivos e neutros. Posteriormente, em experimento realizado a campo, avaliamos a diversidade de FMA associada a rizosfera de plantas de milho crioulo, o híbrido convencional DKB 240 e o transgênico DKB 240 VT-Pro. O desenho foi de blocos inteiramente casualizados, com seis repetições. As coletas foram realizadas antes da instalação do experimento (linha base para comparação), e em três estágios fenológicos da cultura, vegetativo (V3), durante a formação das flores (R1) e durante a formação dos grãos (R3). As avaliações foram realizadas mediante identificação morfológica dos esporos e pela amplificação parcial do gene 28S rDNA, com posterior separação dos amplicons mediante electroforese em gel com gradiente denaturante (DGGE), a partir de amostras de solo e de raiz. A análise dos dados foi realizada utilizando o índice de similaridade de Sørensen e a análise de variância multivariada não paramétrica (PERMANOVA). Foram identificadas 20 espécies de FMA com os gêneros Acaulospora, Glomus e Dentiscutata, apresentando o maior número de espécies. Não houve diferenças na composição da comunidade de FMA entre os genótipos testados, assim como também não foram detectadas diferenças causadas pela transgenia. Por outro lado, as comunidades de FMA estiveram influenciadas pelo estágio fenológico do milho, sendo que, tanto nas comunidades do solo, como nas da raiz, houve maior similaridade entre os estágios adjacentes e as diferenças aumentaram com o passar do tempo. O maior índice de similaridade (47% e 43% respectivamente) foi observado entre o estágio V3 e R1.<br> / Abstract : Surface with genetically modified (GM) crop's has grown rapidly since their first commercial release in 1996, and Brazil has the second largest area with those plants. The constitutive expression of recombinant proteins in GM plants leads to their release into the rhizosphere environment through root exudates, or by residue decomposition. Thus, rhizosphere microorganisms, such as arbuscular mycorrhizal fungi (AMF), come in contact with those proteins. This study evaluated the development of symbiosis and AMF diversity in five maize genotypes: one landrace, two conventional hybrids (DKB 240 and Formula) and two GM hybrids (DKB 240 VTPro and Formula TL ). Symbiosis response was evaluated in two separate experiments: one from May to July 2013 and other, from February to April 2015. Plants were inoculated with Rhizophagus clarus (Rc) and Gigaspora margarita (Gm) and compared to plants without inoculation. We evaluated the percentage of colonization, spore number, phosphorous accumulation and plant biomass 30 and 60 days after inoculation. There were no consistent effects of GM crops on any of the variables analized, but AMF species and maize genotype, affected the symbiosis development. Formula genotype (isoline and GM), had a negative response to inoculation, with an average decrease of 29% in biomass, and 30% in P content in plants inoculated with Rc. On the other hand, the maize landrace showed a positive response, with an average increase of 17% and 14% in the same variables. DKB genotype showed negative, positive and neutral effects. Afterwards, an experiment was carried out in field conditions to assess AMF community composition associated with rhizosphere of landrace, conventional hybrid (DKB 240) and GM maize plants (DKB 240 VTpro). The experimental design was a completely randomized block design with six replications. Samples were collected before the experiment installation (baseline for comparison), and in three phenological stages, vegetative (V3) during flower formation (R1), and during grain formation (R3). The evaluations performed in soil and root samples were spore morphological identification and partial amplification of the 28S rDNA gene, with subsequent separation of amplicons by denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). Data analysis was performed using the Sørensen similarity index and nonparametric multivariate-ANOVA (PERMANOVA). We identified 20 AMF species, and Acaulospora, Glomus and Dentiscutata were the genera with the highest number of species. There were no differences in AMF community composition among genotypes, meotjer dofferemces sie tp GM. However, AMF communities were influenced by phenological stage. Band patterns were different in all stages in both soil and root communities, differences were smaller between adjacent stages and were increasing over time. The greater similarity (47% and 43% respectively) was found between stages V3 and R1.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:03Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-10-07Bitstream added on 2014-06-13T19:12:49Z : No. of bitstreams: 1 costa_cs_me_botib.pdf: 556138 bytes, checksum: f3943b845a387e5013dc6b9cb14d81da (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A identificação de promotores com expressão tecido-específica é uma alternativa viável para substituição dos promotores com expressão ubíqua geralmente utilizados em transgenia. Nesse contexto, o presente trabalho teve como objetivos caracterizar funcionalmente o promotor de um gene de eucalipto que codifica um transportador de potássio com expressão específica em raiz bem como isolar e caracterizar a região promotora de um gene de eucalipto selecionado como apresentando expressão específica em folha. Plantas transgênicas de tabaco (Nicotiana tabacum SR1) contendo um cassete de expressão composto pelo promotor de raiz fusionado ao gene repórter GUS (que codifica a β-glucoronidase) foram usadas em ensaios histoquímicos e histológicos para investigar a especificidade da expressão determinada pelo promotor em estudo. Os resultados evidenciaram que o promotor investigado dirige a expressão do gene repórter em tecido vascular de folhas e raízes. A expressão em feixes vasculares de folhas e raízes foi confirmada em cortes histológicos. Visando avaliar a resposta deste promotor a baixas concentrações de potássio, duas linhagens da geração T2 foram submetidas à deficiência de potássio, e a expressão relativa do gene repórter GUS foi determinada por PCR em tempo real. Nas linhagens submetidas a estresse de potássio observou-se um aumento da expressão relativa do gene repórter GUS em função da privação do elemento. Em paralelo, um gene selecionado in silico como apresentando expressão em folha de eucalipto teve seu perfil de expressão validado por RT-PCR. A construção de um cassete de expressão contendo o referido promotor fusionado ao gene repórter GUS foi empreendida visando futuras validações funcionais / The identification of tissue-specific promoters is of great value to substitute the ubiquitous promoters generally used in transgenic production. In this context, the present study aimed to functionally characterize the promoter of a Eucalyptus grandis gene encoding a potassium transporter showing root specific expression, and to isolate and functionally characterize the promoter region of an E. grandis gene selected as showing specific expression in leaf. Transgenic tobacco plants (Nicotiniana tabacum SR1) harboring a promoter:GUS fusion were used to investigate the expression specificity of the selected root promoter. The results showed that the investigated promoter drives a reporter gene expression in vascular tissues of leaves and roots. The expression in vascular bundles of leaves and roots was confirmed in histological crosssections. To evaluate the promoter responsiveness to low potassium concentrations, two transgenic lines (T2) were submitted to potassium starvation and the relative expression of the GUS reporter gene was determined by real time PCR. An increase in the relative expression of GUS in response to potassium starvation was observed. In parallel, the expression pattern of a gene showing leaf specific expression in Eucalyptus grandis was validated by RT-PCR. The construction of an expression cassette containing this promoter fused to the GUS reporter gene was performed aiming future functional characterization

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:47Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-09-23Bitstream added on 2014-06-13T20:55:21Z : No. of bitstreams: 1 000755469.pdf: 613954 bytes, checksum: 3e086e30c591b47aa10a97dc16e50048 (MD5) / O milho (Zea mays L.), uma das gramíneas de maior importância econômica do mundo, é cultivado em países de clima tropical, subtropical e de clima temperado. No Brasil a produção de milho tem-se caracterizado pela divisão em duas épocas de semeadura, a semeadura de verão, ou primeira safra, e mais recentemente, temos a produção obtida na safrinha, ou segunda safra. O estresse hídrico é a maior fonte de instabilidade do rendimento de grãos de milho, em áreas de milho, e as estimativas de perdas na produção de milho, causadas pelo déficit hídrico, estão entre 14% e 28% do total produzido, estudos envolvendo o milho nesse segmento podem trazer melhorias no rendimento da cultura em diversas regiões. O objetivo do trabalho foi avaliar os efeitos fisiológicos, biométricos e produtivos do estresse hídrico no híbrido de milho 2B587 e seu isogênico 2B587 Hx. O experimento foi conduzido em ambiente protegido do Departamento de Solos e Recursos Ambientais - Faculdade de Ciências Agronômicas da UNESP, campus de Botucatu, SP. Localizado entre os paralelos 22º30’ a 23º05’ de latitude sul e os meridianos 48º15’ a 48º52' de longitude Oeste de Greenwich, e altitude média de 830 metros. O delineamento experimental utilizado foi em blocos casualizados, com 5 repetições, em esquema fatorial 2 X 4, sendo o primeiro fator o híbrido de milho convencional e o híbrido de milho transgênico (Hx), e o segundo fator representa os quatro diferentes estresse hídrico, correspondentes a irrigar quando a tensão de água no solo atingir 16.6, 22.4, 31.1, 45.2 Kpa. Conclui-se que o fator água é de extrema importância para a desenvolvimento do milho, sendo... / The corn (Zea mays L.), is one of the most economically important grasses of the world, is grown in tropical, subtropical and temperate countries. In Brazil, corn production has been characterized according to two different seasons of sowing: summer plantation, or first crop-rotation, and “safrinha” or second crop, most recently implemented in the system of cultivation of maize. Drought stress is a major source of instability in the yield of maize, and estimates of losses in maize production caused by water deficit are between 14 % and 28 % of total production. Studies developed in different regions in the country can help to improve crop yield. The aim of this study was to evaluate the physiological, biometric and productive effects of water stress in both maize hybrid variety and its isogenic 2B587 2B587 Hx. The experiment was conducted in a greenhouse of the Department of Soil and Environmental Resources - College of Agricultural Sciences of UNESP, Botucatu, SP. The experimental design was randomized blocks with five replications in a factorial 2 X 4. The first factor was the conventional hybrid corn and hybrid transgenic maize (Hx), and the second factor represented the four different water stress conditions, corresponding to irrigate when the soil water tension reached 16.6 , 22.4 , 31.1 and 45.2 kPa . It can be concluded that the water factor is of utmost importance for the development of corn. The increase of water stress condition in the plant caused a large decrease in productivity. It shows that it is inevitable the proper crop management and monitoring, in order to focus on the efficient use of water resources and to be able to explore the maximum potential of maize productivity