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Caracterização das alterações proteômicas de Burkholderia sp. em resposta ao fenol / Characterization of proteomic changes of Burkholderia sp. in response to phenol

Soares, Maria Amélia Araújo January 2013 (has links)
SOARES, M.A.A. Caracterização das alterações proteômicas de Burkholderia sp. em resposta ao fenol. 2013. 100 f. Dissertação (MESTRADO EM BIOTECNOLOGIA) - Campus de Sobral, Universidade Federal do Ceará, Sobral, 2013. / Submitted by Djeanne Costa (djeannecosta@gmail.com) on 2017-09-01T12:01:15Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_maasoares.pdf: 2768119 bytes, checksum: c0677297cb45936115346dc705abe45e (MD5) / Approved for entry into archive by Djeanne Costa (djeannecosta@gmail.com) on 2017-09-27T15:04:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_maasoares.pdf: 2768119 bytes, checksum: c0677297cb45936115346dc705abe45e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-27T15:04:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_maasoares.pdf: 2768119 bytes, checksum: c0677297cb45936115346dc705abe45e (MD5) Previous issue date: 2013 / Bacteria of the genus Burkholderia have as one of its biotechnological applications the ability to biodegrade recalcitrant xenobiotic compounds. Thus, this study aimed to evaluate the ability of Burkholderia sp. SMF 07 tolerate and using phenol as the sole carbon source and performing proteomic analysis of this bacterium, in response to phenol, in order to identify differentially expressed proteins that are related to biodegradation of phenol, the stress response or metabolic pathways involving the production of energy for cells. The evaluation of the capacity of Burkholderia sp. SMF 07 using phenol as the sole carbon source was based on the construction of the curve of growth in mineral medium (BH). For extraction of total proteins was performed bacterial growth in culture medium TY (Triptone-Yeast Medium), supplemented or not with 1000 mg/L phenol, incubated at 28°C. The extraction of total proteins was done after the cultures reached the end of the log phase of bacterial growth (O.D between 0.8 and 1.0 and 0.6 and 0.8 for the control conditions and phenol, respectively). The proteins were quantified by the Bradford method (1976) and assessment of protein purity of the samples was performed by SDS-PAGE. The protein map for each tested condition was determined from two-dimensional electrophoresis (2-D). The adjustment of two-dimensional images of the gels, the detection of protein spots, and data evaluation to determine quantitative and qualitative changes of spots was made by the ImageMaster® software. The identification of proteins was performed using the ExPASy Proteomics Server, using the values of pI and MW of spot. Through the data obtained was observed differentially expressed proteins between the groups tested. Among the proteins that showed increased expression quantitative in the presence of phenol is highlight 4-hydroxy-2-oxovalerate aldolase, an enzyme involved in the degradation meta pathway phenol. Among those that showed decreased expression in the presence of phenol are highlights those involved in the biosynthesis of nucleotides and fatty acids, molecules important to the development and maintenance of microbial structure. Proteins which have inhibited its expression in the presence of phenol were mainly involved in the biosynthesis of amino acids, proteins, lipids, ubiquinone, purines and pyrimidines; beyond participate processing of tRNA, peptidoglycan synthesis, and in the stress response. In conclusion, the study showed that Burkholderia sp. SMF 07 not been able to utilize phenol as the sole carbon source but showed the ability to tolerate phenol when grown in nutrient medium at the concentrations tested. Through proteomic analysis was concluded that the pollutant alter the expression of proteins important for metabolism and maintenance of cellular structure. / Bactérias do gênero Burkholderia apresentam como uma das suas aplicações biotecnológicas a capacidade de biodegradar compostos xenobióticos recalcitrantes. Dessa forma, este trabalho teve como objetivo avaliar a capacidade da Burkholderia sp. SMF 07 tolerar e utilizar o fenol como única fonte de carbono e realizar a análise proteômica desta bactéria, em resposta ao fenol, com a finalidade de identificar proteínas diferencialmente expressas que estão relacionadas à biodegradação do fenol, à resposta ao estresse ou ainda, que participem das vias metabólicas de produção de energia para as células. A avaliação da capacidade da Burkholderia sp. SMF 07 utilizar o fenol como única fonte de carbono foi realizada a partir na construção da curva de crescimento em meio mineral (BH). A fim de realizar a extração das proteínas totais foi realizado o crescimento bacteriano em meio de cultivo TY (Triptone-Yeast Medium), suplementado ou não com 1000 mg/L de fenol, incubado a 28ºC. A extração das proteínas totais foi feita após as culturas atingirem o final da fase log do crescimento bacteriano (O.D entre 0,8 e 1,0 e 0,6 e 0,8, para as condições controle e fenol, respectivamente). As proteínas foram quantificadas pelo método de Bradford (1976) e a avaliação da pureza das amostras proteicas foi realizada por SDS-PAGE. O mapa protéico para cada condição testada foi determinado a partir da eletroforese bidimensional (2-D). O ajuste das imagens dos géis bidimensionais, a detecção de spots protéicos e a avaliação dos dados para determinação de variações quantitativas e qualitativas dos spots foi feito pelo programa ImageMaster®. A identificação das proteínas foi feita através do ExPASy Proteomics Server, utilizando os valores de pI e MW do spot. Através dos dados obtidos foi possível observar proteínas diferencialmente expressas entre os grupos testados. Entre as proteínas que apresentaram expressão quantitativa aumentada na presença do fenol destaca-se a 4-hidroxi-2-oxovalerato aldolase, uma enzima envolvida na via meta de degradação do fenol. Entre aquelas que apresentaram expressão reduzida na presença do fenol se destacam aquelas envolvidas na biossíntese de nucleotídeos e de ácidos graxos, moléculas importantes para o desenvolvimento e manutenção da estrutura microbiana. As proteínas que tiveram sua expressão inibida na presença do fenol estavam envolvidas principalmente na biossíntese de aminoácidos, proteínas, lipídeos, ubiquinona, purinas e pirimidinas; além de participarem do processamento do RNAt, síntese do peptideoglicano e na resposta ao estresse. Em conclusão, o estudo mostrou que a Burkholderia sp. SMF 07 não foi capaz de utilizar o fenol como única fonte de carbono, mas apresentou capacidade de tolerar o fenol quando cultivada em meio nutritivo nas concentrações testadas. Através da análise proteômica concluiu-se que o poluente alterou a expressão de proteínas importantes para o metabolismo e manutenção da estrutura celular.
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Análise proteômica, potencial de biodegradação e formação de biofilme de Burkholderia SMF090 sob tratamento com gasolina comercial / Proteomic analysis, Biodegradation potential and biofilm formation of Burkholderia SMF090 under treatment with commercial gasoline

Lima, Mariana da Silva de January 2013 (has links)
LIMA, M.S. Análise proteômica, potencial de biodegradação e formação de biofilme de Burkholderia SMF090 sob tratamento com gasolina comercial. 2013. 67 f. Dissertação (MESTRADO EM BIOTECNOLOGIA) - Campus de Sobral, Universidade Federal do Ceará, Sobral, 2013. / Submitted by Djeanne Costa (djeannecosta@gmail.com) on 2017-09-01T12:38:13Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_mdslima.pdf: 1741006 bytes, checksum: 359adb1f36cc306126973b67c1d5bae0 (MD5) / Approved for entry into archive by Djeanne Costa (djeannecosta@gmail.com) on 2017-09-27T15:18:16Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_mdslima.pdf: 1741006 bytes, checksum: 359adb1f36cc306126973b67c1d5bae0 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-27T15:18:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_mdslima.pdf: 1741006 bytes, checksum: 359adb1f36cc306126973b67c1d5bae0 (MD5) Previous issue date: 2013 / Os compostos pertencentes ao grupo caracterizado como BTEX (sigla para designar Benzeno Tolueno Etilbenzeno e Xileno) são largamente utilizados na indústria como matéria prima para diversos produtos como herbicidas tintas gasolina corantes borracha dentre outras substâncias que podem ser praticamente inertes ou potencialmente poluidoras A utilização da atividade microbiana como alternativa aos tratamentos convencionais de despoluição destas substâncias tem sido bastante estudada como forma de remoção destes compostos visto que é um processo viável e que muitas vezes deixa pouco ou nenhum resíduo secundário Este trabalho teve como objetivo analisar a capacidade de biodegradação por meio de curvas de crescimento do perfil proteômico e do potencial de formação de biofilme de Burkholderia SMF090 submetida ao crescimento em meio mínimo BH suplementado com gasolina comercial Curvas de crescimento foram feitas em meio BH suplementados com 2000 ppm do poluente A análise proteômica foi feita a partir de crescimentos em meio BH suplementados com 2000 ppm de gasolina comercial As proteínas bacterianas do referido crescimento foram extraídas a fim de realizar a eletroforese bidimensional Foram analisadas as proteínas diferencialmente expressas entre tratamento e controle (crescimento apenas em meio BH) análise da tendência de pI e massa molecular das proteínas obtidas e identificação das mesmas a partir do Expert Protein Analysis System (Expasy) As curvas de crescimento mostraram que à medida em que a bactéria é submetida ao poluente seu crescimento é mais rápido sugerindo uma adaptação ao poluente pela célula bacteriana As proteínas encontradas na análise proteômica são principalmente proteínas relacionadas à síntese protéica e ao metabolismo energético bacteriano Nos géis bidimensionais foram encontrados também proteínas pertencentes à via de degradação de compostos BTEX presentes na gasolina As análises prévias do potencial de formação de biofilme demonstraram alta capacidade da célula de formar esta estrutura inclusive não havendo diferenças na formação de biofilme em presença e ausência de gasolina comercial Os resultados sugerem que Burkholderia SMF 090 tem alto potencial de bidegradação dos compostos BTEX presentes na gasolina podendo futuramente ser estudada como possível alternativa biotecnológica para fins de biorremediação / Les composés appartenant au groupe caracterisé comme BTEX (Sigle pour designé Benzene, Toluene, Ethylbenzene, et xylène) sont largement utilisés dans l'industrie comme matière première pour divers produits, comme herbicides, peintures, colorants, caoutchouc, et dans d'autres substances qui peuvent etre pratiquement inertes ou potenciellement polluantes.L'utilisation de l'activité microbienne comme alternative aux traitements conventionnels de dépollution de ces substances, a été très etudié comme une forme d'enlèvement de ses composés, vu que c'est un procès viable et que très souvent ne laisse que peu, ou pas, de residu secondair.Ce travail a eu comme objectif d'analiser la capacité de biodegradation, par le biais de courbes de croissance, du profil proteomique et du potentiel de formation de biofilm Burkholderia SMF090, soumit à la croissance en milieu minimum BH complété avec de l'éssence commerciale.Des courbes de croissance ont été faites en milieu BH completé avec 2000 ppm d'éssence.L'analise proteomique a été faite a partir de croissances en milieu BH completé avec 2000 ppm d'éssence commerciale.Il a été realisé une extraction des proteines bacteriennes de la dite croissance, et electrophorèse bidimensionnellee.Ont été analisées les proteines différentiellement produites entre traitement et contrôle (Croissance seulement en milieu BH), analise de la tendance de pI et masse moleculaire des proteines obtenues, et identification de celle-ci a partir de la base de données Expasy. Les courbes de croissance montrent que, au fur et á mesure que la basterie est soumise au polluant, sa croissance est plus rapide, suggérant une adaptation au polluant par la cellule bactérienne.Les proteines rencontrées dans l'analise proteomique, sont principalment des proteines relationnées á la synthèse protéique, et au metabolisme énergetique bactérien.Dans les gels bidimensionnels, ont été rencontrés aussi des proteines appartenant á la voie de dégradation de composés BTEX, présents dans l'éssence. Les premières analises du potenciel de formation de biofilm, ont montré la haute capacité de la celule á former cette structure, y compris sans avoir de differences dans la formation du biofilm,entre en présence et absence d'éssence commerciale. Les résultats suggerent que Burkholderia SMF 090 a un haut potenciel de biodégradation des composés BTEX presents dans l'éssence, pouvant dans le futur être etudié comme possible alternative biotecnologique a des fins bioremédiation.
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Respostas bioquímicas e moleculares em Crassostrea brasiliana (Lamarck, 1819) e Danio rerio (Hamilton, 1822) expostos a hidrocarbonetos

Müller, Gabrielle do Amaral e Silva January 2017 (has links)
Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2017. / Made available in DSpace on 2018-01-09T03:24:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 349093.pdf: 3720270 bytes, checksum: 3800594c491e81d970ecd6dea19e24e4 (MD5) Previous issue date: 2017 / O consumo e transporte de petróleo está diretamente ligado à contaminação ambiental por hidrocarbonetos em diversas regiões do mundo. Uma vez no ambiente aquático, o petróleo e seus derivados podem produzir alterações variadas nos organismos expostos, tais como alterações biológicas de caráter molecular, celular, fisiológico ou ecológico, resultando em efeitos danosos às comunidades naturais, incluindo os organismos destinados ao consumo humano. Desta forma, a investigação dessas alterações é urgente como forma preventiva e de avaliação de ambientes aquáticos contaminados. Nesse sentido, o presente trabalho teve como principais objetivos avaliar os efeitos no perfil de proteínas em ostras após exposição à fração de óleo diesel acomodada em água, buscar genes normalizadores em ostras expostas às diferentes condições experimentais e avaliar os efeitos da contaminação do derivado foto-oxidado de petróleo 6-hidroxicriseno em peixes Danio rerio. Para atingir esses objetivos, primeiramente, ostras do mangue Crassostrea brasiliana foram expostas à fração de óleo diesel acomodada em água durante 24h e 72h com intuito de identificar biomarcadores moleculares. Entre as 11 proteínas expressas diferencialmente, podemos destacar sete: citocromo P450 6A (CYP6A), NADPH citocromo P450 redutase (envolvidas no metabolismo lipídico / xenobiótico), alfa e beta tubulina (envolvidas na formação de fagossomo mediados por retículo endoplasmático - RE), tiorredoxina e proteína ubiquitina ligase E3 (envolvidas no processamento e degradação de proteínas no RE). A avaliação de respostas em compartimentos subcelulares mostrou-se bastante sensível e viável para estudos ecotoxicológicos, além de auxiliar na compreensão dos mecanismos que envolvem o RE frente à exposição. Esses dados indicam um papel promissor da avaliação do RE em programas de biomonitoramento ambiental. Entretanto, como muito pouco é conhecido sobre a biologia molecular de C. brasiliana, surgiu a necessidade de utilizar genes normalizadores ideais para diferentes condições experimentais para adequada análise da transcrição gênica. Neste trabalho foram identificados diferentes conjuntos de genes adequados para a normalização de dados de PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR) em cada desenho experimental testado. O gene anquirina teve maior estabilidade de transcrição e foi considerado candidato promissor como gene normalizador em estudos posteriores. Por fim, com o intuito de aumentar as informações sobre os efeitos de compostos foto-oxidados do petróleo, avaliou-se a exposição de embriões de D. rerio ao 6-hidroxicriseno. Foram observadas respostas dos genes relacionados com transportadores iônicos (nck1 e kchna), associadas à bioacumulação e deformidades cardiácas nos animais nas fases de desenvolvimento embrionário de 74 hpf de exposição. / Abstract : The consumption and transportation of petroleum are directly linked to the contamination by hydrocarbons in many regions around the world. Once in the aquatic environment, petroleum and its derivatives can produce many alterations to exposed organisms such as biological, cellular, physiological or ecological biological alterations, resulting in harmful effects to natural communities including organisms destined for human consumption. Then, it is urgent the investigation of these impacts in an attempt to prevent and evaluate contaminated aquatic environments. In this context, the main goal of this work was to evaluate the effects of diesel oil water accommodated fraction on the proteomic profile in oysters, search for normalizing genes in oysters submitted to different experimental conditions, and evaluate the effects of photo-oxidized petroleum derivative 6-hydroxycrysene in D. rerio. In order to achieve these goals, firstly, the mangrove oyster C. brasiliana were exposed to diesel oil water accommodated fraction for 24h and 72h. Among the 11 differentially expressed proteins, we pointed out seven: cytochrome P450 6A (CYP6A), NADPH cytochrome P450 reductase (involved in lipid / xenobiotic metabolism), alpha and beta tubulin (involved in the formation of RE-mediated phagosome), tioredoxin containg-protein and ubiquitin ligase E3 protein (involved in the processing and degradation of proteins in RE). Subcellular compartments responses had shown to be sensitive and feasible for ecotoxicological studies, besides helping to understand the mechanisms that involve ER in relation to exposure. These data indicate a promising role for ER evaluation in environmental biomonitoring programs. However, few studies had focused on molecular biology of C. brasiliana, there is a necessity to use select normalizing genes ideal for different experimental conditions for adequate analysis of gene expression. In this work, different sets of genes suitable for the normalization of qRT-PCR data were identified in each experimental design tested. The ankyrin gene had greater transcriptional stability and was considered a promising candidate as a normalizing gene in later studies. Finally, in order to increase the information about the effects of photo-oxidized petroleum derivative compounds, the exposure by 6-hydroxychrisene in the embryonic development of D. rerio was evaluated. In summary, the responses of the genes related to the ionic transporters (nck1 and kchna), together with chemical aspects of bioaccumulation, have been shown to play an important role in the cardiac deformities generated during morphogenesis in the embryonic development stages in 74 hpf of exhibition.
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Identificação de proteínas associadas à carcinogênese induzida por Dibenzotiofeno e Dibenzotiofeno Sulfona em ratos Wistar.

Silva, Karina Taciana Santos January 2015 (has links)
Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto. / Submitted by Oliveira Flávia (flavia@sisbin.ufop.br) on 2015-05-27T20:10:51Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) TESE_IdentificaçãoProteínasAssociadas.pdf: 9965361 bytes, checksum: d5313388c3380d6c40007f75d982c4ac (MD5) / Approved for entry into archive by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2015-05-28T17:04:40Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) TESE_IdentificaçãoProteínasAssociadas.pdf: 9965361 bytes, checksum: d5313388c3380d6c40007f75d982c4ac (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-28T17:04:40Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) TESE_IdentificaçãoProteínasAssociadas.pdf: 9965361 bytes, checksum: d5313388c3380d6c40007f75d982c4ac (MD5) Previous issue date: 2015 / O alto conteúdo de compostos organossulfurados nos derivados de petróleo compromete sua qualidade; assim, sua remoção ou conversão a substâncias menos tóxicas são importantes etapas durante o processo de refino. Os limites de concentração para esses compostos estão sob rígido controle em diversos países com o objetivo de minimizar seu impacto negativo sobre a saúde animal e o ambiente. Dentre eles, o dibenzotiofeno (DBT) é um hidrocarboneto policíclico aromático que contém um átomo de enxofre em substituição em sua estrutura. Devido à importância dessas moléculas na oncogênese, e a escassez de investigações toxicológicas relacionadas ao DBT, este trabalho propôs realizar uma avaliação dos efeitos tóxicos e moleculares promovidos por um tratamento crônico de ratos Wistar com dose sub-letal (30 mg/kg) de DBT e seu derivado oxidado DBTO2 (dibenzotiofeno sulfona), ambos administrados durante 10 semanas. Em paralelo, seus efeitos tóxicos foram comparados com aqueles provocados pelo tratamento com o agente mutagênico clássico, 1,2-dimetilhidrazina (DMH), administrado na mesma dose durante o mesmo período. Na 14ª semana após a última dose, os animais foram sacrificados para uma avaliação inicial da contagem de células sanguíneas e das funções hepáticas e pancreáticas. Não foram observadas alterações nesses parâmetros. Entretanto, análises histopatológicas revelaram lesões de caráter pré-neoplásico nos intestinos dos animais tratados com DBT e DBTO2 que mostraram-se comparáveis em intensidade e alterações morfológicas com aquelas encontradas no cólon de animais tratados com DMH. Em concordância com esse achado, os marcadores tumorais CD44 e CEA (antígeno carcinoembrionário), utilizados em ensaios de imunohistoquímica demonstraram aumento de expressão de aproximadamente três vezes para os animais dos grupos Testes em relação aos animais dos grupos Controle. Análises proteômicas realizadas por eletroforese bidimensional (2D SDS-PAGE) demonstraram padrões de expressão proteica diferenciados entre os diferentes grupos. Além da análise proteômica, foi realizado ensaio de seleção de peptídeos ligantes de proteínas especificamente relacionados às alterações promovidas pelos indutores químicos utilizados, empregando a técnica de Phage Dislay. Tal metodologia permitiu a pré-seleção de seis peptídeos específicos e relacionados aos mecanismos de desenvolvimento/manutenção de câncer. A identificação das proteínas diferencialmente expressas observadas por 2D SDS-PAGE e, das proteínas alvo que interagem com peptídeos específicos relacionados às alterações promovidas por esses agentes químicos, auxilia no avanço do entendimento acerca dos mecanismos envolvidos no estabelecimento das lesões encontradas nos animais tratados com DBT e DBTO2. ____________________________________________________________________________________________________________________ / ABSTRACT: The high content of organosulfur compounds in petroleum derivatives compromises their quality and, therefore, their removal or conversion to less toxic substances are important steps during oil refining. The concentration limits of such compounds in fuels are under strict control worldwide with the aim to minimize their negative impact upon animal health and the environment. Among them, dibenzothiophene (DBT) is a polycyclic aromatic hydrocarbon containing a sulfur atom replacing a carbon in the main structure. Given the importance of such molecules during oncogenesis and the scarcity of toxicological investigations related to DBT, this work proposes an evaluation of the toxic effects promoted by a chronic treatment of Wistar rats with a sub-lethal dose (30 mg/kg) of DBT and its oxidized derivative DBTO2 (dibenzothiophene sulfone), both administered during 10 weeks. In parallel, their toxicological effects were compared to those inflicted by treatment with the classic mutagenic compound, 1,2-dimethylhydrazine (DMH), given at 30 mg/kg for the same period. At the 14th week after the last dose, the animals were sacrificed for the initial evaluation of blood cell counts and assessment of hepatic and pancreatic functions. We have observed no alterations in either blood cell parameters or indication of liver and spleen injuries. However, pre-neoplastic lesions in the small intestine of DBT and DBTO2 treated animals were comparable in intensity and morphology to those found in the colon of DMH-treated animals. In agreement with this finding two tumor markers CD44 and CEA (carcinoembrionic antigen), were detected by immunohistochemistry and demonstrate approximately three fold higher for treated animals when compared to control groups. Proteomic analyses by 2D electrophoresis (2D SDS-PAGE) reveal different expression patterns for Test groups when compared to Control groups. In addition to the proteomic analysis, we also performed a selection of test specifically protein binding peptides related to changes produced by chemical inducers used employing the Phage Display technique. This methodology allowed the pre-selection of six specific peptides related to the mechanisms of development/maintenance of cancer. The identification of differentially expressed proteins observed by 2D SDS-PAGE, and of proteins that interact with specific peptides related to alterations caused by such agents, assists in advancing understanding of mechanisms involved in the establishment of lesions found in animals treated DBT and DBTO2.
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Análise proteômica comparativa de Leishmania (Leishmania) infantum para identificação de proteínas diferencialmente expressas induzidas pelo modelo de desnutrição proteica murino.

Ostolin, Thalita Lopes Valentim January 2014 (has links)
Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto. / Submitted by Oliveira Flávia (flavia@sisbin.ufop.br) on 2015-10-14T21:05:26Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 20592 bytes, checksum: 0c9b9c579af4cbbcf785ca803bd18d4b (MD5) DISSERTAÇÃO_AnáliseProteômicaComparativa.pdf: 1930862 bytes, checksum: 8b9ca5313718b5e5a2d966f239ed40c1 (MD5) / Approved for entry into archive by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2015-10-29T18:49:47Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 20592 bytes, checksum: 0c9b9c579af4cbbcf785ca803bd18d4b (MD5) DISSERTAÇÃO_AnáliseProteômicaComparativa.pdf: 1930862 bytes, checksum: 8b9ca5313718b5e5a2d966f239ed40c1 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-29T18:49:47Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 20592 bytes, checksum: 0c9b9c579af4cbbcf785ca803bd18d4b (MD5) DISSERTAÇÃO_AnáliseProteômicaComparativa.pdf: 1930862 bytes, checksum: 8b9ca5313718b5e5a2d966f239ed40c1 (MD5) Previous issue date: 2014 / A leishmaniose é uma doença endêmica em vários países, com incidência anual de 2 milhões de casos. A forma visceral da doença é a mais severa e a falta de tratamento pode levar o indivíduo à morte. Está bem estabelecido que a desnutrição (DPC) constitui fator de risco para a progressão clínica da leishmaniose visceral (LV), porém, pouco se conhece sobre os mecanismos bioquímicos envolvidos tanto na biologia do parasito quanto na resposta do hospedeiro na ocorrência simultânea de DPC e LV. Assim, o presente trabalho teve como foco a análise do perfil proteômico de Leishmania (Leishmania) infantum após a passagem pelo modelo murino de desnutrição proteica. Camundongos do grupo teste receberam dieta contendo 3% de proteína, enquanto os do grupo controle receberam dieta normal, contendo 14%. Após 8 semanas do início da dieta, confirmou-se a desnutrição dos animais do grupo teste a partir dos parâmetros peso corporal e dosagem sérica de proteína total e albumina. Os camundongos de cada grupo foram infectados com promastigotas de L. infantum, na mesma dose, e, posteriormente, os parasitos foram recuperados do fígado e baço na 2a semana (fase aguda) e na 15a semana (fase crônica) pós-infecção. Após a 15ª semana de infecção crônica, parasitos recuperados de animais de ambos os grupos exibiram curva de crescimento diferencial in vitro, sugerindo maior atividade proliferativa de promastigotas isolados de camundongos desnutridos. O estado nutricional também influenciou significativamente no aumento da carga parasitária total do fígado em animais desnutridos. A técnica 2D-PAGE comparativa, para os extratos de L. infantum recuperados dos dois grupos, revelou perfis eletroforéticos similares com poucos spots únicos de cada extrato. No entanto, promastigotas recuperados de animais em fase crônica da LV e submetidos à desnutrição apresentaram aumento de expressão para proteínas envolvidas com biossíntese proteica. A resposta imune humoral dos animais, frente a antígenos solúveis do parasito, também foi avaliada pela técnica de Western blotting. Essa abordagem imunoproteômica revelou padrões de reatividade distintos para os soros de animais de ambos os grupos. De particular importância, o soro de camundongos desnutridos quando empregado na mesma diluição do soro de camundongos normonutridos, não reconhece proteínas da família das HSP’s e chaperoninas, as quais têm sido descritas como altamente imunogênicas em diversos estudos. Coletivamente, os resultados obtidos demonstraram que a DPC altera o perfil proteômico de L. infantum, compromete o estabelecimento de uma resposta humoral eficaz contra proteínas do parasito e está associada ao aumento de carga parasitária no hospedeiro vertebrado. ____________________________________________________________________________________________ / ABSTRACT: Leishmaniasis is an endemic disease in many countries with approximately 2 million cases reported annually. The visceral form of the disease is the most severe, and the lack of treatment can lead to death. It has been established that undernutrition constitutes a risk factor for the progression of visceral leishmaniasis (VL). However, little is known about the biochemical mechanisms involved in parasite´s biology as well as in the host response when undernutrition and VL occur simultaneously. In this context, the present investigation intended to evaluate the proteomic profile of Leishmania (Leishmania) infantum promastigotes after passage in mice previously maintained under protein restriction. Mice belonging to the test group received a diet containing 3% protein whilst those from the control were fed a 14% protein diet. After 8 weeks, protein undernutrition was confirmed for test-group animals by monitoring body weight and serum levels of total protein and albumin. Mice from both groups were then inoculated with L. infantum promastigotes, at the same dose, and parasites recovered from liver and spleen on the 2nd (acute phase) and 15th (chronic phase) weeks post-infection. Promastigotes from mice under chronic phase VL exhibited a differential growth curve in vitro, suggesting an increased proliferative activity for parasites isolated from animals of the test group. The nutritional status also significantly increased parasite burden in the liver of test-group animals. A comparative 2D-PAGE technique, using protein extracts of L. infantum promastigotes isolated from both groups, revealed similar electrophoretic profiles with few unique spots assigned to each extract. Nevertheless, promastigotes recovered from animals under chronic phase VL and submitted to protein restriction displayed increased expression of molecules involved with protein biosynthesis. The reactivity of whole serum IgG against parasite soluble antigens was also evaluated using the Western blotting technique. This immunoproteomic approach revealed distinct reactivity patterns associated with the sera of animals belonging to the two groups. Of particular importance, sera from test-group animals, when used in the same dilution as sera from control-group animals, did not recognize HSP´s and chaperones which have been described as highly immunogenic in various studies. Collectively, our results demonstrated that protein undernutrition alters the proteomic profile of L. infantum, compromises the establishment of an efficient humoral response against promastigote antigens and is associated to increased parasite burden in the vertebrate host.
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Proteômica abrangente de alta resolução na análise de neutrófilos humanos ativados pelo peptideo formyl Methyl Leucyl Phenylalanine (fMLP)

Fonseca, Micaella Pereira da 12 July 2017 (has links)
Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2017. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2017-08-22T14:42:46Z No. of bitstreams: 1 2017_MicaellaPereiradaFonseca.pdf: 4630281 bytes, checksum: 0e37678d479f619b59d863660a07a446 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-09-26T19:21:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_MicaellaPereiradaFonseca.pdf: 4630281 bytes, checksum: 0e37678d479f619b59d863660a07a446 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-26T19:21:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_MicaellaPereiradaFonseca.pdf: 4630281 bytes, checksum: 0e37678d479f619b59d863660a07a446 (MD5) Previous issue date: 2017-09-26 / Os neutrófilos são granulócitos polimorfonucleares que utilizam mecanismos intra e extracelulares para eliminar patógenos. A ativação de neutrófilos pela N-formil-Metionil-Leucyl-Phenylalanine (fMLP), uma molécula quimiotáctica liberada de bactérias Gram-positivas, disparadores de explosão respiratória, modificações morfológicas, degranulação e liberação de NETs. No entanto, a desregulamentação de neutrófilos está envolvida com várias patologias, em parte, devido à exacerbação da descarga de espécies reativas de oxigênio e enzimas citolíticas Embora haja um número considerável de estudos sobre condições, as questões sobre como essas desregulações permanecem sem resposta; Para os caminhos exatos que são percorridos por esses caminhos intracelulares ainda estão preenchidos com lacunas. Atualmente, a comunidade científica vem usando uma ferramenta de análise conhecida como espectrometria de massa (MS) para desempenhar melhor o papel dos neutrófilos na resposta imune; a realização de estudos relacionados aos neutrófilos de proteômica comparativa são ferramentas essenciais para a compreensão dos mecanismos intracelulares que regem a resposta inflamatória. Usando ferramentas proteômicas de alta resolução, o presente trabalho identificou 8362 proteínas no total, na ativação de neutrófilos por fmp de 100 nmL / L. Em conclusão este trabalho representa a eficiência dos métodos de análise proteômica proporcionaram a identificação de 8362 proteínas, sendo 301 proteínas reguladas diante do estímulo com fMLP. Pois, proteínas importantes para a resposta inflamatória dos neutrófilos foram identificadas, mostrando que a análise comparativa dos mapas proteômicos utilizando diferentes métodos de aquisição e extração proteicas atuaram de forma complementar na robustez da identificação mais abrangente de proteínas de neutrófilos, tanto quiescentes quanto ativados com fMLP. Ademais, E que existe uma forte conexão entre a família das pequenas GTPases com a maioria dos processo desencadeados pela ativação de vias por fMLP, como por exemplo as evidências de alterações estruturais em MEV. Com as análises conjugadas será possível sugerir pontos de modulação da resposta inflamatória promovidas por agentes ativadores relacionados a receptores ligados a proteína G. A identificação de regulações por subunidades do proteassoma 26S tendo extensa participação nas vias reguladas, o que pode ser um indicativo para um mecanismo de regulação por esse complexo. Outrossim, a proteômica se mostra uma ferramenta essencial para a análise de vias, pois proporciona a identificação de proteínas que estão em pequenas quantidades como citocinas liberadas pela ativação. No mais, os mecanismos de morte celular programada com divergência entre vias de ativação e bloqueio da apoptose, podendo acarretar desregulação pois os dados tentem a sugerir um fino balanço entre as vias de vida e morte. O presente trabalho apresenta um conjunto de proteínas com diversas funções relacionadas aos processos da resposta inflamatória, que incluem a atividade oxidativa, motilidade, metabolismo energético e sinalização intra e intercelular. Este estudo adiciona dados relacionados à ativação de neutrófilos por fMLP, também revelando proteínas que não foram previamente identificadas em neutrófilos, ampliando as possibilidades de modulação da resposta inflamatória. Nosso estudo também comtempla o maior número de proteínas nos neutrófilos ativados por fMLP, ampliando assim as possibilidades de sugerir uma modulação da resposta inflamatória em neutrófilos. / Neutrophils are polymorphonuclear granulocytes that use intra- and extracellular mechanisms to eliminate pathogens. Activation of neutrophils by N-formyl-Methionyl-Leucyl-Phenylalanine (fMLP), a chemotactic molecule released from gram-positive bacteria, triggers respiratory burst, morphological modifications, degranulation and NETs´ release. However, neutrophils´ deregulation are involved with several pathologies, in part, due to the exacerbated discharge of reactive oxygen species and cytolytic enzymes; in other words, prolonged lifespan of activated neutrophils and their migration to non-injured tissues may result in severe clinical conditions. Although there are a considerable number of studies on conditions, questions about how such deregulations still remain unanswered; For the exact pathways that are traversed by these intracellular pathways are still filled with gaps. Currently, the scientific community has been using an analysis tool known as mass spectrometry (MS) to better play the role of neutrophils in the immune response; studies related to comparative proteomics neutrophils are essential tools for understanding the intracellular mechanisms governing the inflammatory response. In conclusion, this work represents the efficiency of the methods of proteomic analysis, which allowed the identification of 8362 proteins, 301 of which were regulated proteins before the stimulation with fMLP. Because proteins important for the inflammatory response of neutrophils were identified, showing that the comparative analysis of proteomic maps using different methods of protein acquisition and extraction acted in a complementary way in the robustness of the more comprehensive identification of neutrophil proteins, both quiescent and activated with fMLP . In addition, there is a strong connection between the family of small GTPases with most of the processes triggered by the activation of fMLP pathways, such as the evidence of structural alterations in SEM. With the conjugated analyzes it will be possible to suggest modulation points of the inflammatory response promoted by activating agents related to G protein-linked receptors. The identification of 26S proteasome subunit regimens having extensive participation in the regulated pathways, which may be indicative of a mechanism of regulation by this complex. In addition, the mechanisms of programmed cell death with divergence between activation pathways and apoptosis blockade, may lead to deregulation as the data try to suggest a fine balance between the life and death pathways. The present work presents a set of proteins with diverse functions related to the processes of the inflammatory response, which include oxidative activity, motility, energetic metabolism and intra and intercellular signaling. This study adds data related to the activation of neutrophils by fMLP, also revealing proteins that were not previously identified in neutrophils, increasing the possibilities of modulation of the inflammatory response. Our study also contemplates the largest number of proteins in the neutrophils activated by fMLP, thus increasing the possibilities of suggesting a modulation of the inflammatory response in neutrophils.
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Análise proteômica revela que a saliva de Dipetalogaster maxima é rica em lipocalinas e possui apirase da família 5’ nucleotidase

Santiago, Paula Beatriz 04 March 2011 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2011. / Submitted by Matheus Denezine (matheusdenezine@yahoo.com.br) on 2011-06-20T14:02:41Z No. of bitstreams: 1 2011_PaulaBeatrizdeMedeirosSantiago.pdf: 11948167 bytes, checksum: 2c8b46d29088a72eb877776e2587dc84 (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2011-06-20T18:48:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_PaulaBeatrizdeMedeirosSantiago.pdf: 11948167 bytes, checksum: 2c8b46d29088a72eb877776e2587dc84 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-06-20T18:48:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_PaulaBeatrizdeMedeirosSantiago.pdf: 11948167 bytes, checksum: 2c8b46d29088a72eb877776e2587dc84 (MD5) / A pesquisa em doença de Chagas acumula bons resultados no que se refere à transmissão do Trypanosoma cruzi. Contudo, fatores devem ser considerados: a ocupação humana de áreas naturalmente habitadas por esses insetos e a presença constante do T. cruzi em populações animais aumentam o risco de novas transmissões ao homem. Esse cenário é similar ao encontrado na região sul da Baixa Califórnia, México, onde a invasão do ambiente do triatomíneo da espécie Dipetalogaster maxima pelo homem mostrou a versatilidade alimentar do vetor, que além do sangue de lagartos, passou a se alimentar do sangue humano. O fluxo sanguíneo deve ser constante para o sucesso do repasto e para contrapor a hemostasia do hospedeiro os triatomíneos hematófagos apresentam uma fonte complexa de proteínas em sua saliva, como vasodilatadores, anti-agregadores plaquetários e anti-coagulantes. O trabalho aqui realizado demonstrou que a saliva do triatomíneo D. maxima contém proteínas anti-hemostáticas já descritas na saliva de outros triatomíneos como Rhodnius prolixus, Triatoma infestans e Triatoma pallidipennis. A análise proteômica revelou as três maiores famílias de proteínas salivares encontradas em outros triatomíneos: lipocalina, antígeno-5 e apirase. A atividade apirásica salivar detectada em D. maxima apresenta características similares àquelas encontradas na saliva de T. infestans. Além disso, a análise molecular revelou que as apirases de ambos triatomíneos pertencem à família 5’nucleotidase e são enzimas oligoméricas. A pesquisa dos compostos salivares de hematófagos estimula o desenvolvimento de novos fármacos usados em desordens de origem circulatória. / The research on Chagas disease accumulates good results with regard to the control of Trypanosoma cruzi transmission. However, some factors should be considered: the human occupation of areas naturally inhabited by these insects and the constant presence of T. cruzi in animal population increasing the risk of new transmissions to humans. This scenario is similar to that found in southern Baja California, Mexico, where the invasion of the triatomine species Dipetalogaster maxima environment by man showed the versatility of the feeding vector, that besides the blood of lizards, started to feed on human blood. Blood flow must be constant for the success of the meal and to counteract host hemostasis, hematophagous triatomines emply a complex source of proteins and other molecules, present in their saliva, as vasodilators, anti-platelet aggregators and anti-coagulants. The work conducted here demonstrated that the salive of triatomine D. maxima comprises anti-hemostatic proteins that had been already described in the saliva of other triatomines such as Rhodnius prolixus, Triatoma infestans, and Triatoma pallidipennis. Proteome analysis showed the three major salivary families of proteins found in other triatomines: lipocalin, antigen-5 and apyrase. The detected salivary apyrase activity of D. maxima displays features of that found in the saliva of T. infestans. Furthermore, molecular analysis revealed that apyrases of both insects belong to the 5’ nucleotidase family and are oligomeric enzymes. The research on salivary compounds of hematophagous insects stimulates the development of new drugs to be used in disorders of circulatory origin.
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Caractetização proteica do fluido aspirado de mama de pacientes brasileiras com câncer de mama unilateral

Brunoro, Giselle Villa Flor January 2010 (has links)
Submitted by Tatiana Silva (tsilva@icict.fiocruz.br) on 2012-12-26T16:35:34Z No. of bitstreams: 1 giselle_v_f_brunoro_ioc_bcm_0003_2010.pdf: 21708458 bytes, checksum: 70db8700af3ee0df74e2440ef79ab8fc (MD5) / Made available in DSpace on 2012-12-26T16:35:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 giselle_v_f_brunoro_ioc_bcm_0003_2010.pdf: 21708458 bytes, checksum: 70db8700af3ee0df74e2440ef79ab8fc (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz.Instituto Oswaldo Cruz. Rio de janeiro, RJ, Brasil / O câncer de mama é a principal causa de morte por câncer em mulheres no mundo. De acordo com o Instituto Nacional do Câncer, 7.470 novos casos são estimados em 2010 apenas no Rio de Janeiro. A maioria dos casos de câncer de mama são originados nas células ductais mamárias. Elas secretam o fluido aspirado de mama (NAF), que contém proteínas intimamente associadas ao microambiente tumoral. O objetivo deste trabalho foi utilizar a abordagem proteômica como ferramenta para caracterizar e comparar o NAF das duas mamas de pacientes brasileiras com câncer da mama unilateral. A concentração média de proteínas das amostras controle, tumor benigno ou câncer de mama de 13 mulheres foi aproximadamente 115 ± 60 μg/μL. A atividade proteolítica do NAF foi visualizada por zimografia das amostras de duas pacientes. Observamos que o padrão de bandas gelatinolíticas diferiu substancialmente entre as pacientes, mas não entre as duas mamas do mesmo indivíduo. As enzimas proteolíticas se apresentaram sensíveis à inibição por agentes quelantes de metais (EDTA e orto-fenantrolina). As amostras de NAF também foram submetidas à 2D-PAGE em condições otimizadas (IPG 4-7 e aplicação de amostra por reidratação in gel) e poucos spotsproteicos muito abundantes foram detectados e identificados por espectrometria de massas MALDI-TOF/TOF como albumina, imunoglobulinas, zinco-α2-glicoproteína e proteína induzida por prolactina. Para enriquecer o NAF em suas proteínas menos abundantes, testamos estratégias de depleção usando a coluna de múltipla afinidade Hu-6 da Agilent ou proteína L agarose. Este passo de pré-fracionamento introduziu variabilidade adicional importante nas amostras e por este motivo não foi empregado em etapas posteriores do estudo. Catorze amostras de NAF das mamas pareadas de mulheres com câncer unilateral foram sistematicamente comparadas por 2D-DIGE. Foram observadas diferenças qualitativas substanciais entre as pacientes, prejudicando as comparações quantitativas entre as amostras. Dois grandes perfis proteicos distintos foram definidos por 2D-DIGE. O perfil A caracterizou-se pela presença de dois grupos de spotsácidos típicos (pI ≈ 4,5 e MM 29,5 e 18 kDa), ausentes no perfil B. A presença de glico- e fosfo-proteínas foi determinada em amostras de ambos os perfis após revelação dos géis 2D com ProQ- Emerald ou Diamond,respectivamente. As amostras dos dois perfis se mostraram muito mais ricas em glicoproteínas do que em fosfoproteínas. Este trabalho constituiu a primeira caracterização proteômica sistemática do NAF de pacientes brasileiras com câncer de mama unilateral. Nossos resultados mostraram uma variabilidade importante do conteúdo de proteínas nas amostras individuais de NAF, sugerindo a necessidade de uma estratificação mais uniforme daspacientes. Por fim, o emprego de tecnologias proteômicas mais sensíveis e acuradas deverá ser necessário para possibilitar a detecção e identificação de proteínas menos abundantes no NAF, que poderão constituir candidatos a biomarcadores do câncer de mama. / Breast cancer is the main cause of cancer deaths worldwide in women. According to the Instituto Nacional do Câncer, 7.470 new cases are estimated for 2010 in Rio de Janeiro. Most breast cancer cases originate from mammary ductal cells that secrete the nipple aspirate fluid (NAF), witch contains proteins associated with the breast cancer microenvironment. The aim of this study was to use the proteomic approach as a reliable tool to characterize NAF samples from brazilian patients with unilateralbreast cancer. The mean concentration of NAF proteins from healthy, benign or cancer breast samples from 13 women was approximately 115 ±60 μg/μL. The proteolytic activity of NAF samples from both breasts of two patients was visualized by SDS-PAGE zymography.The patterns of gelatinolytic bands differed substantially between patients but were very similar within the same patient. The proteolytic activity was sensible to inhibition by metal quelators (EDTA and orthophenantrolin). In this study, NAF samples weresubmitted to 2D-PAGE under optimized conditions (IPG 4-7 and sample in gel rehydratation) and a few very abundant protein spots were detected. They were identified by MALDI-TOF/TOF MS as albumin, immunoglobulins, zinc-α2-glycoprotein and prolactin-induced protein.To enrich NAF for less abundant proteins, we tested protein depletion using AgilentHu-6 column or Protein L Agarose. These pre-fractionation steps introduced important additional variability in the samples and were not further used. Fourteen NAF samples from tumorous and non-tumorous breasts of women with unilateral cancer were systematically compared by 2D-DIGE. Substantial qualitative individual differences were observed, impairing proper quantitative comparisons. Two main 2D-DIGE protein profiles were observed: profile A was characterized by two groups of acidic spots (pI ≈ 4,5 and MM 29,5 and 18kDa), not detected in profile B. The presence of glyco- and phosphoproteins was determined after staining NAF 2D gels with ProQ-Emerald or Diamond, respectively. The samples from both profiles were much richer in glycoproteins than phosphoproteins. This work was the first systematic proteomic characterization of NAF from brazilian patients with unilateral breast cancer. The results highlight important variability in the protein content of NAF samples, suggesting that a more uniform patient stratification and the use of more sensible and accurate proteomic technologies will be needed for the detection and identification of breast cancer biomarker candidates.
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Análise proteômica diferencial da interação incompatível entre o feijão-de-corda e o fitopatógeno Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc. / Differential incompatible interaction between bean-to-string and pathogen Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz proteomic analysis. & Sacc.

Moura, Hudson Fernando Nunes January 2013 (has links)
MOURA, H. F. N. Análise proteômica diferencial da interação incompatível entre o feijão-de-corda e o fitopatógeno Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc. 2013. 108 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2013. / Submitted by Daniel Eduardo Alencar da Silva (dealencar.silva@gmail.com) on 2015-01-05T21:31:59Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_hfnmoura.pdf: 3809000 bytes, checksum: 421954cdf8bcca7c2a89805297537b8f (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2016-03-29T17:21:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_hfnmoura.pdf: 3809000 bytes, checksum: 421954cdf8bcca7c2a89805297537b8f (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-29T17:21:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_hfnmoura.pdf: 3809000 bytes, checksum: 421954cdf8bcca7c2a89805297537b8f (MD5) Previous issue date: 2013 / Cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp.] belongs to the family Fabaceae and is widely used in food as a source of protein, carbohydrates, vitamins and minerals. Among the main features of cowpea, its high protein content and good tolerance to conditions of low water availability in soils, high temperatures and relative tolerance to salinity conditions typical of semi-arid regions of northeastern Brazil, are some of which can be cited. However, despite the considerable capacity of tolerance to different stress conditions, the productivity of cowpea is threatened by the action of various pathogens, among which stand out as major causes of fungal diseases of this crop, the example of Anthracnose as a result of infection by C. gloeosporioides, characterized by reddish-brown spots on the leaf veins that can be extended by all organs of the host plant. Fortunately, the cowpea has cultivars that have different characteristics of resistance against C. gloeosporioides, regarding the activation of plant defenses in incompatible interactions said, given that the pathogen is unable to resolve the infection. From this premise, it is worth mentioning that most of the mechanisms of plant resistance to pathogens is related to the differential gene expression of proteins that act as markers of defense in response to infection. Thus, this study proposes a differential proteomic analysis of the incompatible interaction (resistance) between plants of cowpea genotype BR3, and isolated LPVD-1, the fungus C. gloeosporioides in order to identify potential protein markers for the determinants of this resistance pathossystem. By using the approach 2D-PAGE in addition with mass spectrometry ESI-Q-TOF MS / MS, we have identified 118 differentially expressed proteins, whereas proteins overexpressed (102) and down-expressed (16), involved in various cellular processes, such as : energy metabolism, photosynthesis, protein and nucleic acids metabolism, stress response, cellular transport, redox homeostasis, signaling and defense, with emphasis on expression of PR-10 proteins (pathogenesis-related), remorina and ascorbate peroxidase that had significant alterations at all time points tested. These findings demonstrate the complexity of the mechanisms involved in plant resistance and assist in directing the programs of genetic improvement of this crop against fungal attack. Furthermore, it’s promoting the understanding of the biochemical and physiological interconnections arising from incompatible plant-fungus interaction. / O feijão-de-corda [Vigna unguiculata (L.) Walp.] pertence à família Fabaceae e é bastante utilizado na alimentação humana como fonte de proteínas, carboidratos, vitaminas e minerais. Dentre as principais características do feijão-de-corda, seu elevado conteúdo proteico e a boa tolerância às condições de baixa disponibilidade de água nos solos, altas temperaturas e relativa tolerância à salinidade, condições típicas das regiões semi-áridas do nordeste do Brasil, são algumas das que podem ser citadas. Entretanto, apesar da considerável capacidade de tolerância às diferentes condições de estresses, parte da produtividade do feijão-de-corda é ameaçada pela ação de diversos fitopatógenos, dentre os quais se destacam os fungos como maiores causadores de patologias desta cultura, a exemplo da Antracnose, resultado da infecção por C. gloeosporioides, caracterizada por manchas marrom-avermelhadas nas nervuras foliares que podem se prolongar por todos os órgãos da planta hospedeira. Felizmente, o feijão-de-corda possui cultivares que apresentam características diferenciadas de resistência, frente ao C. gloeosporioides, no que concerne à ativação das defesas da planta em interações ditas incompatíveis, haja vista que o patógeno não consegue deliberar a infecção. Partindo dessa premissa, é válido mencionar que grande parte dos mecanismos de resistência de plantas aos patógenos está relacionada com a expressão gênica diferencial de proteínas que funcionariam como marcadores de defesa em resposta à infecção. Nesse sentido, esse estudo propõe a análise proteômica diferencial da interação incompatível (resistência) entre plantas de feijão-de-corda, genótipo BR3, e o isolado LPVD-1, do fungo C. gloeosporioides a fim de identificar possíveis marcadores proteicos determinantes da resistência para esse patossistema. Por meio da utilização da abordagem Eletroforese Bidimensional em combinação com Espectrometria de Massas ESI-Q-TOF MS/MS, foram identificadas 118 proteínas diferencialmente expressas, considerando proteínas superexpressas (102) e subexpressas (16), envolvidas em diversos processos celulares, tais como: Metabolismo energético, fotossíntese, metabolismo de proteínas e ácidos nucleicos, resposta ao estresse, transporte celular, homeostase redox, sinalização e defesa, com destaque para expressão das proteínas PR-10 (relacionada à patogênese), Remorina e Ascorbato peroxidase que apresentaram alterações significativas em todos os tempos experimentais testados. Esses achados demonstram a complexidade dos mecanismos envolvidos durante a resistência vegetal e auxiliam no direcionamento dos programas de melhoramento genético dessa cultura frente ao ataque de fungos. Além de favorecerem o entendimento das interconexões bioquímicas e fisiológicas que decorrem da interação incompatível planta-fungo.
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Venômica e antivenômica de Bothrops erythromelas : estudo da variação intraespecífica / Venomics and antivenomics of the Bothrops erythromelas : study of intraspecific variation

Jorge, Roberta Jeane Bezerra January 2015 (has links)
JORGE, Roberta Jeane Bezerra. Venômica e antivenômica de Bothrops erythromelas : estudo da variação intraespecífica. 2015. 131 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2015. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2015-03-06T13:00:26Z No. of bitstreams: 1 2015_tese_rjbjorge.pdf: 8490082 bytes, checksum: d6ca5417614b4fb1e727b7db3ef1d01d (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2015-03-06T13:02:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_tese_rjbjorge.pdf: 8490082 bytes, checksum: d6ca5417614b4fb1e727b7db3ef1d01d (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-06T13:02:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_tese_rjbjorge.pdf: 8490082 bytes, checksum: d6ca5417614b4fb1e727b7db3ef1d01d (MD5) Previous issue date: 2015 / ABSTRACT Bothrops erythromelas snake is a species of medical importance responsible for snakebites, predominantly in the Northeast of B razil. This study aimed to conduct a comparative proteomic study of venoms pool of this species from five geographical regions of the Northeast: Ceará, Pernambuco, Juazeiro, Paraíba and Itaparica Island. In addition, we investigated the ability of Bothrops antivenom (SAB) of the Vital Brazil Institute and polyspecific serum (BCL) of Costa Rica to neutralize the venoms from these populations (antivenomics) and the ability to neutralize the in vivo haemorrhagic activity of venom. Two - dimensional electrophores is (2DE) showed similar patterns of protein distributed in the range of 14 - 95 kDa molecular mass and isoelectric points ranging from 4 to 8.5. Thirty to forty fractions were collected by Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography (RP - HPLC). Each chromatographic fraction collected manually were analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis - SDS (SDS - PAGE) and protein bands were excised and subjected to venomic analysis resulting in the identification of approximately 65 proteins and 8 species of peptides belonging to 12 protein families (Bradykinin - Potentiating Peptides (BPPs), Snake Venom Vascular Endothelial Growth Factor (svVEGF), Phospholipase A 2 , Serine Preotease, Metalloproteases class I and class III (PI and PIII - Symp), Disintegrins and Disintegrin - like and Rich in Cysteine domains, C - type Lectins, Nucleotidases (5' - nucleotidase; 5'NT and Phosphodiesterase; PDE), Secretory Proteins rich in Cysteine (CRISP) and snake venoms Phospholipase B. Through this work it was shown that the proteomes of venoms of B. erythromelas of different regions of Northeast are similar and seem to be quite kept according to their geographical distribution, although they contain peculiar differences such as the presence of CRISP detected only in the venoms of Pern ambuco and 5 'NT in the population of Juazeiro; and PDEs only in proteomes of populations of Ceará and Pernambuco and PLB in Ceará, Juazeiro and Itaparica Island. The antivenomics results showed that SAB pentavalent serum immunoreactivity is similar across the five populations and more efficient compared to the polyvalent BCL. However, it can be seen that especially low molecular weight fractions are not efficiently recognized by both antivenoms. Although differences were shown in their neutralization effic acy, both were effective in neutralizing antivenom hemorrhagic activity. Despite the B.erythromelas snake inhabit acomprehensivegeographical area , the five populations showed similar composition, displaying a highly conserved profile of representative venom protein classes. Therefore, this study assigned all proteins in the venom of B. erythromelas that have been characterized in the literature (BPP, PLA2 Asp49, PIII - Symp and svVEGF) and provided additional information to the presence of Serine Proteases and C - type Lectins and other minor or specific components (PDE, 5'NT, PLB, CRISP). / UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ FACULDADE DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA PÓS - GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA ROBERTA JEANE BEZERRA JORGE VENÔMICA E ANTIVENÔMICA DE Bothro p s eryth r omelas : ESTUDO DA VARIAÇÃO INTRAESPECÍ FICA . ORIEN TADORA: HELENA SERRA AZUL MONTEIRO CO - ORIENTADOR : JUAN JOSÉ CALVETE CHORNET Fortaleza 2015 ROBERTA JEANE BEZERRA JORGE VENÔMICA E ANTIVENÔMICA DE Bothro ps eryth r omelas : ESTUDO DA VARIAÇÃO INTRAESPECIFICA . Tese de Doutorado apresentada ao Cur so de Pós - G raduação em Farmacologia da Universidade Federal do Ce ará para obtenção do titulo de Doutor em Farm a cologia ORIENTADORA: HELENA SERRA AZUL MONTEIRO CO - ORIENTADOR : JUAN JOSÉ CALVETE CHORNET Fortaleza 2015 Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Federal do Ceará Biblioteca de Ciências da Saúde J71v Jorge, Roberta Jeane Bezerra. Venô mica e Antivenômica de Bothrops erythromelas : estudo da variação intraespecífi ca. / Roberta Jeane B ezerra Jorge. – 2015. 130 f.: il. color., enc.; 30 cm. Tese (doutorado) – Universidade Federal do Ceará, Faculdade de Medicina, Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Programa de Pós - Graduação em Farmacologia, Doutorado em Farmacologia, Fortaleza, 201 5. Área de Concentração: Farmacologia. Orientação: Profa. Dra. Helena Serra Azul Monteiro. Co - Orientação: Prof. Dr. Juan José Calvete Chornet. 1. Bothrops. 2. Proteômica. 3. Venenos de Serpente. I. Título. CDD 615.942 A os meus pais Nádja e Roberto e ao meu irmão Júnior. AGRADECIMENTOS A Deus, minha força maior e inexaurível . A os meus pais pelo que sou hoje. A todos meus familiares e amigos pelo companheirismo e presteza, seria impossível e a té passível de cometer algum esquecimento citar o nome de todos eles, mas cada um sabe o quanto sou grata e que podem sempre contar comigo . Aos que contribuíram diretamente para a realização deste trabalho: M inha orientadora P rofa Dra Helena Serra Azul M onteiro e ao meu co - orientador Prof . Dr. Juan José Calvete e a sua equipe do Laboratório de Ve nômica y Proteinómica Estructural do Instituto de Biomedicina de Valencia e aos grandes amigos que fiz no período de estágio de doutorado na Espanha . A todos os colaboradores deste trabalho no Brasil, Espanha e Costa Rica . A todos do Laboratório de Farmacologia Venenos e Toxina s (LAFAVET) , aos companheiros científicos, em especial aos amigos que fiz e a Pós - graduação em Farmacologia da Universidade Federal do Cea rá, os quais me proporcionaram crescimento profissional e pessoal. A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior ( CAPES ) pela concessão da bolsa de Doutorado Sanduiche e m Valencia - Espanha . Ao Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq) pelo apoio financeiro . “ Entrega teu caminho ao S enhor, confia nele , e ele o fará ” Salmo 37:5 RESUMO A serpente Bothrops erythromelas é uma espécie de importância médica responsável por acidentes ofídicos, com predominância no N ordeste do Brasil. O presente trabalho teve como objetivo realizar um estudo proteômico comparativo do pool de venenos desta espécie procedentes de cinco regiões geográficas do Nordeste: Ceará, Pernambuco, Juazeiro, Paraíba e Ilha de Itaparica. Além disso, foi investigada a capacidade do soro antibotrópico (SAB) do Instituto Vital Brazil e soro poliespecífico (BCL) da Costa Rica em neutralizar os venenos provenientes dessas populações através da antivenômica e a capacidade de neutralização frente à atividad e hemorrágica in vivo . A eletroforese bidimensional (2DE) mostrou padrões similares de proteínas distribuídas no intervalo de 14 - 95 kDa de massa molecular e pontos isoelétricos variando de 4 - 8,5. Trinta a quarenta frações foram recolhidas por meio de Cro matografia Líquida de Alta Eficiência em Fase Reversa (RP - HPLC). Cada fração cromatográfica coletada manualmente foi analisada por eletroforese em gel de poliacrilamida – SDS ( SDS - PAGE) e as bandas de proteínas foram excisadas e submetidas à análise venômi ca que resultaram na identificação de aproximadamente 65 proteínas e 8 espécies de peptídeos pertencentes a 12 famílias de proteínas de venenos de serpentes: (Peptídeos Potenciadores de Bradicinina (BPPs), Fator de Crescimento Endotelial Vascular de Veneno de Serpente (svVEGF), Fosfolipase A 2 , Serinoproteases, Metaloproteases da classe I e da classe III (PI e PIII – SVMP), Desintegrinas e Domínios tipo Desintegrina e rico em Cisteínas, Lectinas do tipo C, Nucleotidases (5' - nucleotidase; 5’NT e Fosfodiester ase; PDE), Proteínas Secretórias Ricas em Cisteína (CRISP) e Fosfolipase B). Através desse trabalho foi demonstrado que os proteomas dos venenos das B. erythromelas das diferentes regiões do Nordeste são similares e parecem ser bastante conservados de acor do com sua distribuição geográfica, embora contenham diferenças peculiares tais como, a presença de CRISP detectadas apenas nos venenos de Pernambuco e da 5’ NT na população de Juazeiro; assim como PDEs apenas nos proteomas das populações do Ceará e Pernam buco e da PLB no Ceará, Juazeiro e Ilha de Itaparica. Os resultados da antivenômica mostraram que a imunorreatividade do soro pentavalente SAB é similar frente às cinco populações e mais eficiente em relação ao polivalente BCL. No entanto, pode - se observar especialmente que as frações de baixo peso molecular não são reconhecidas pelos dois antivenenos de forma eficiente. Embora tenham mostrado diferenças na sua eficácia de neutralização, ambos os antivenenos foram eficazes na neutralização da atividade hemo rrágica in vivo . Apesar da serpente de B. erythromelas habitar uma abrangente área geográfica, as cinco populações estudadas apresentaram composição semelhante, exibindo um perfil altamente conservado das classes das proteínas representativas do veneno. Po rtanto, este estudo identificou as proteínas do veneno de B. erythromelas já caracterizadas na literatura (BPP, PLA 2 Asp49, PIII - SVMP e svVEGF) e forneceu informações adicionais para a presença de Serinoproteases e Lectinas do tipo C e de outros component es minoritários ou específicos (PDE, 5’NT, PLB, CRISP).

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