Orientador: Tiago Santana Balbuena / Banca: José Roberto Aparecido dos Santos Pinto / Banca: Alessandro de Mello Varani / Resumo: As mudanças climáticas globais podem alterar significativamente o metabolismo das células vegetais. Um cenário com alta concentração de CO2 atmosférico pode ser benéfico para plantas do tipo C3 devido ao estímulo à fixação de carbono. No entanto, esse aumento esperado na taxa de assimilação de carbono também pode aumentar a atividade e a expressão das enzimas envolvidas na cadeia de transporte de elétrons, resultando em maior acúmulo de espécies reativas de oxigênio. Nesse trabalho, foi estudada a resposta do sistema antioxidante em cloroplastos de Eucalyptus urophylla cultivados sob altas concentrações de CO2. As plantas de E. urophylla expostas a alta concentração de CO2 (980 ppm) mostraram um aumento no fechamento estomático e pequena, mas significativa, indução do estresse oxidativo em relação as plantas cultivadas em concentração atmosférica de CO2. Entretanto, essas respostas não foram observadas quando as plantas foram cultivadas em concentração de CO2 igual a 680 ppm, cujo tratamento induziu abertura estomática. Através de uma abordagem de proteômica de descoberta, foram identificadas e detectadas 19 proteoformas antioxidantes cloroplastidiais e 2 proteoformas diferencialmente reguladas. Dentre essas, destacam-se uma proteoforma de ascorbato peroxidase e uma de superóxido dismutase, as quais estão possivelmente envolvidas na neutralização de espécies reativas de oxigênio após cultivo em atmosfera enriquecida com CO2, e que podem ser utilizadas como marcadores bioquími... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Global climate change can significantly alter plant cell metabolism. A higher atmospheric CO2 scenario may be beneficial for C3 plants through the stimulation of carbon fixation. However, this predicted increase in the rate of carbon assimilation may also increase the activity and expression of enzymes involved in the electron transport chain, resulting in higher accumulation of reactive oxygen species. Here, we studied the responses of the chloroplast antioxidant system of Eucalyptus urophylla plants cultivated under high-CO2 conditions. E. urophylla plants exposed to a high concentration (980 ppm) of CO2 showed an increase in stomatal closure and a small, but significant, induction of oxidative stress in relation to plants grown at atmospheric CO2 concentration. However, these responses were not observed at a CO2 concentration equal to 680 ppm, which induced stomatal aperture. With the discovery proteomics approach used herein, we identified 19 chloroplast antioxidant proteoforms and pinpointed 2 differentially regulated antioxidants proteoforms. We highlight an isoform of ascorbate peroxidase and one of superoxide dismutase, which are possibly involved in the neutralization of reactive oxygen species upon cultivation in a high CO2 atmosphere and could be used as biochemical markers of abiotic stress or as targets in genetic engineering programs. / Mestre

Acidentes com animais venenosos constituem um problema de saúde pública negligenciado em todo o mundo. Estimativas indicam que, considerando-se apenas acidentes com serpentes venenosas, ocorram mundialmente cerca de 2,5 milhões de casos, causando 85.000 óbitos anuais. O desenvolvimento do quadro patológico dos envenenamentos é o resultado conjunto de potentes atividades biológicas exercidas, principalmente, por proteínas e peptídeos que compõem os venenos animais. A proteômica aplicada à caracterização de componentes de venenos animais, denominada venômica, é uma metodologia essencial na identificação não apenas dos componentes tóxicos, mas também valiosa na investigação molecular dos mecanismos patológicos dos envenenamentos. Através de metodologias proteômicas, descrevemos a caracterização protéica dos venenos animais das serpentes Bothrops jararaca e Bothrops lanceolatus e da lagarta Lonomia obliqua. Ainda, avaliamos através da proteômica de tecido experimentalmente envenenado as ações tóxicas de um componente isolado do veneno de Bothrops jararaca. Através de análise comparativa e semi-quantitativa da composição protéica dos venenos de B. jararaca e B. lanceolatus, descrevemos uma diferença qualitativa na distribuição dos componentes tóxicos. Enfatizando o grupo protéico majoritário, metaloproteases (SVMP), descrevemos diferentes abundâncias relativas entre os subtipos destas enzimas. Esta diferença explicaria as repercussões clínicas opostas durante o envenenamento humano, sendo um veneno hemorrágico e o outro prótrombótico. Componentes tóxicos capazes de gerar um quadro hemorrágico também foram avaliados através da análise proteômica das secreções tóxicas de L. obliqua. O estudo comparativo entre hemolinfa e extrato de espículas demonstrou que, diferentemente dos venenos botrópicos, as secreções tóxicas são compostas majoritariamente de inibidores de proteases, predominantemente serpinas. Além disso, descrevemos pela primeira vez a presença de novos componentes potencialmente tóxicos, como metaloproteases. Por fim, a proteômica de tecidos foi aplicada à investigação dos efeitos locais da injeção da metaloprotease do veneno de B. jararaca, jararagina. O efeito direto da ação da metaloprotease foi observado através da identificação de proteínas presentes em maior ou menor abundância, denotando infiltração ou degradação, respectivamente. Hemorragia, edema e estresse oxidativo foram evidenciados por pronunciado aumento em proteínas envolvidas nesses processos, mas, acima de tudo, identificamos degradação de proteínas relacionadas à manutenção da integridade da matriz extracelular e estabilização de coágulos, sugerindo novos mecanismos relacionados à atividade tóxica a serem investigados. De uma maneira geral, o presente trabalho descreve componentes tóxicos de venenos animais causadores de síndromes hemorrágicas e gera novas hipóteses em relação a mecanismos moleculares envolvidos no desenvolvimento da patofisiologia dos envenenamentos. / Accidents with venomous animals are a neglected health issue worldwide. Global estimates points to the occurrence of 2,500,000 envenomation cases, causing 85,000 deaths per year. The pathological envenomation condition is a result of strong biological activities caused mainly by the action of venom's proteins and peptides components. Proteomics applied to the characterization of animal venom active principles, so called venomics, is an essential tool to the identification of toxic molecules as well as to help understanding the molecular mechanisms underlying pathological envenomation conditions. Through a proteomic methodology, here we describe the characterization of venoms from the snakes Bothrops jararaca and Bothrops lanceolatus and the caterpillar Lonomia obliqua. Moreover, from a tissue proteomic perspective we were able to evaluate the toxic effects of a B. jararaca venom component upon experimentally envenomed skin. Using a comparative semi-quantitative proteomic analysis, we described a qualitative difference in toxic components distribution between B. jararaca and B. lanceolatus venoms. Focusing on snake venom metaloproteases (SVMPs) distribution, we observed different relative abundance of these enzymes subgroups. Those differences could explain the opposite clinical envenomation characteristics, since one venom is hemorrhagic and the other induces a prothrombotic profile. Pro-hemorrhagic venom toxins were also characterized through the proteome of L. obliqua venomous secretions. Hemolymph and bristle extract were analyzed showing that, different from bothropic venoms, the toxic secretions composition are mainly protease inhibitors, especially serpins. Moreover, we were able to demonstrate for the first time the presence of new putative toxins, such as metalloproteases. Finally, we applied tissue proteomics to the investigation of local snakebite pathology by jararhagin, a metalloprotease from B. jararaca venom. The metalloprotease direct effect was observed through the increase or decrease in protein identification, indicating infiltration or degradation respectively. Hemorrhage, edema and oxidative stress were characterized by enhance in correlated proteins but, most of all, we identified degradation in proteins important to extracellular matrix integrity and clot stabilization, indicating novel mechanism of toxicity to be further evaluated. In a general perspective, the present work describes toxic components from venomous animals that cause hemorrhagic syndromes and generates new testable hypothesis of the mechanisms of action involved in the development of envenomation pathophysiology.

Mycoplasma hyopneumoniae é um importante patógeno suíno, sendo o agente da pneumonia enzoótica suína. Recentemente, o genoma de três cepas (J, 7448 e 232) de M. hyopneumoniae foi seqüenciado. Inicialmente, realizamos uma análise proteômica baseada em eletroforese bidimensional (2DE), estudos imunológicos e espectrometria de massas para a cepa patogênica 7448 de M. hyopneumoniae. Foram produzidos mapas proteômicos em duas faixas de pH (3-10 e 4-7). Um total de 31 produtos gênicos foram experimentalmente verificados. Em uma análise imunológica foi possível identificar pelo menos cinco proteínas antigênicas de M. hyopneumoniae. Seguindo este primeiro estudo prospectivo da cepa 7448, foi realizada uma análise proteômica comparativa de três cepas de M. hyopneumoniae, uma não-patogênica (J) e duas cepas patogênicas (7448 e 7422). Na comparação por 2DE foi possível identificar diferenças no nível de expressão entre as cepas em pelo menos 67 spots protéicos. Para uma análise mais ampla dos perfis protéicos das três cepas foi utilizada uma estratégia baseada em LC-MS/MS. Nas três cepas, 231 proteínas foram identificadas, correspondendo a cerca de 35% da capacidade codificadora do genoma de M. hyopneumoniae. A classificação funcional das proteínas identificadas sugere diferenças fisiológicas entres as cepas não-patogênicas e patogênicas. A aplicação de uma proteômica quantitativa label-free (o exponentially modified protein abundance index) demonstrou diferenças significativas nos níveis de expressão de pelo menos 64 proteínas. Por fim, uma análise imunológica baseada em 2DE utilizando um anticorpo monoclonal contra a repetição R1 da proteína P97, foi capaz de identificar um padrão de clivagem proteolítica diferencial entre as três cepas de M. hyopneumoniae. / Mycoplasma hyopneumoniae is an important pathogen for pigs, being the causative agent of enzootic pneumonia. Recently, the genome sequences of three strains, J, 7448 and 232 have been reported. Here, we describe the results of a proteomic analysis, based on two-dimensional gel electrophoresis of soluble protein extracts, immunoblot and mass spectrometry from the M. hyopneumoniae pathogenic strain 7448. A preliminary M. hyopneumoniae proteome map in two pH ranges (3 - 10 and 4 - 7) was produced. A total of 31 different coding DNA sequences were experimentally verified. Moreover, at least five highly antigenic proteins of M. hyopneumoniae were identified by immunoblots. Following the previous report of a proteomic survey of the pathogenic 7448 strain, we performed comparative protein profiling of three M. hyopneumoniae strains, namely the non-pathogenic J strain and the pathogenic strains 7448 and 7422. In 2DE comparisons, we were able to identify differences in expression levels between strains for 67 proteins. For more comprehensive protein profiling, an LC-MS/MS strategy was used. Overall, 231 different proteins were identified, corresponding to 35% of the M. hyopneumoniae genome coding capacity. The functional classification of identified proteins was suggestive of physiological differences between the non-pathogenic and the pathogenic strains. Also, application of the exponentially modified protein abundance index demonstrated significant differences in the expression levels of proteins detected in more than one strain, confirming over-expression in one or two of the strains for 64 proteins. 2DE immunoblot analyses allowed the identification of differential proteolytic cleavage patterns of the P97 adhesin in the three strains.

ROMERO, José Camilo Torres. Análise proteômica do plasma de pacientes portadores de síndrome mielodisplásica do tipo areb e arsa utilizando lectinas vegetais. 2016. 104 f. Tese (Doutorado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Anderson Silva Pereira (anderson.pereiraaa@gmail.com) on 2017-05-03T20:55:53Z No. of bitstreams: 1 2016_tese_jctromero.pdf: 2418639 bytes, checksum: f9af8288a0c70314148c067bb2ed7ae5 (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-05-18T23:10:09Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_tese_jctromero.pdf: 2418639 bytes, checksum: f9af8288a0c70314148c067bb2ed7ae5 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-18T23:10:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_tese_jctromero.pdf: 2418639 bytes, checksum: f9af8288a0c70314148c067bb2ed7ae5 (MD5) Previous issue date: 2016 / The myelodysplastic syndromes (Myelodysplastic Syndrome MDS) are diseases that occur when blood-producing cells are damaged bone marrow. This causes damage to one or moretypes of blood cells because its production is defective. MDS is considered a type of cancer and often end up being melodie acute leukemia (AML). The most common types of these syndromes are refractory anemia with ringed sideroblasts (ARSA) and anemia refractory with Excess Blasts (AREB). This study aimed to carry out the proteomic analysis of spinal cord serum of pediatric patients with any of the syndromes for the identification of proteins that are potential candidates for biological markers for evaluation, study and diagnosis of disease. The samples from ten patients with ARSA, tem with AREB and Ten healthy persons (control) were compared. These were subjected to immunodepletion, affinity chromatography with lectin galactose-linker selected by the anomeric recognition profile using chromatography in crosslinked hemicelulases, the selected lectins were subsequently immobilized in Sepharose 4B, the serum bone marrow samples were digested for subsequent analysis by mass spectrometry. The softwareExpressionE, based on protein expression levels, calculated the ratio between the selected groups, so 7 proteins have been identified as possible candidates for the biomarker syndromes. The overexpression of Vitronectin (VTN), fibrinogen (FGA), Pregnancy zone protein (PZP), Kininogen (KNG1) Immunoglobulin lambda chain (IGL), complement factor C4b (CB4) and Hemopexin (HPX) compared with the group control, seems to be an indicator of syndromes and were selected to form a panel of potential candidates for prognostic biomarkers. The only recognition by the frutalin to Clusterin (CLU) and Vitronectin in ARSA and Fibrinogen to AREB, do lectin a very useful tool to differentiate syndromes in proteomics studios. / As Síndromes Mielodisplásicas (SMD) são doenças que ocorrem quando as células produtoras de sangue são danificadas na medula óssea e esses danos podem afetar um ou mais tipos de células sanguíneas. Os tipos mais comuns de SMD são a Anemia Refratariacom Sideroblastos em Anel (ARSA) e Anemia Refratariacom Excesso de Blastos (AREB). Este trabalho teve como objetivo realizar a análise proteômica do plasmamedular de pacientes com SMD tipo ARSA e AREB, visando àidentificação de proteínas que sejam potenciais candidatas a marcadores biológicos para avaliação, estudo e diagnóstico dessas doenças. Amostras de plasmade dez pacientes com ARSA, dez com AREB e dez indivíduos saudáveis (Controle) foram selecionadas para análise proteômica. Estas foram submetidas à imunodepleção, cromatografia de afinidade com lectina α-D-galactose-ligante de sementes de Artocarpus incisa imobilizada em SepharoseTM 4B, concentradas e digeridas para posterior análise por espectrometria de massas. O programa ExpressionE, baseado nos níveis de expressão das proteínas, calculou a razão entre os grupos selecionados. Foram identificadas 7 proteínas potenciais candidatas a biomarcadores, tais como a Vitronectina (VTN), Fibrinogênio (FGA), Pregnancy zone protein (PZP), Cininogênio (KNG1), Cadeia de Imunoglobulina Lambda (IGLL1), Factor do complemento Cb4 (Cb4) e Hemopexina (HPX), por estarem super expressas no grupo de pacientes com SMD, em ambos os tipos, ao se comparar com o grupo controle (indivíduos sadios). Estas foram selecionadas para formar um painel de proteínas candidatas biomarcadoresde diagnóstico da SMD. O reconhecimento único por parte da frutalina para Clusterina (CLU) e Vitronectina em ARSA e Fibrinogenio para AREB, torna essa lectina, uma ferramenta muito útil para diferenciar as SMD em estudos proteômicos.

SILVA, Mariana Baraldi. Estudo sobre a reprodução de ovinos da raça somalis brasileira: histomorfometria epididimária, expressão gênica e proteica no aparelho reprodutor. 2013. 119 f. Dissertação (Mestrado em Zootecnia)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2013. / Submitted by Anderson Silva Pereira (anderson.pereiraaa@gmail.com) on 2017-05-04T22:45:42Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_mbsilva.pdf: 2980292 bytes, checksum: 55e03275ef98d0da21a2f964709deb05 (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-05-18T23:30:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_mbsilva.pdf: 2980292 bytes, checksum: 55e03275ef98d0da21a2f964709deb05 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-18T23:30:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_mbsilva.pdf: 2980292 bytes, checksum: 55e03275ef98d0da21a2f964709deb05 (MD5) Previous issue date: 2013 / The Somalis Brasileira breed is one of the most rustic sheep of the Northeast, being very adapted to the semi-arid and extensive breeding systems, based on native pasture. Therefore, this breed, as well as the others described, represent unique and extremely important genotypes to guarantee the variability of herds in production systems, formation of new breeds or crosses with exotic animals. Despite the aptitude and differentiated adaptability of the Brazilian Somalis sheep, few works are found in the literature on these animals. Therefore, the present study was conducted with the purpose of evaluating aspects of the epididymis, gene expression and proteomics of tissues of the reproductive apparatus of sheep of this breed. Animals with 150 days of age were slaughtered (according to norms of the Ministry of Agriculture) and organs collected for analysis of RNA extraction in testis, epididymis, vesicular and bulb-urethral glands, and epididymal histomorphometry. Expression of the genes was assessed by RT-PCR, using the GAPDH gene as a reference. Protein was also extracted from epididymal tissue samples for identification by mass spectrometry (ESI-Q-ToF). Data thus obtained were analyzed with the protein annotation application (STRAP) and the potential interactions of specific proteins, with the application STRING 9.05. The expression of clusterin was detected in all tissues analyzed, but the head (Ep2) and body (Ep5) regions of the epididymis presented the highest expressions (p <0.05). The expression of mRNA for osteopontin was localized in all tissues tested, but the expression in the seminal vesicles was higher than in the other organs (p <0.05). Levels of mRNA for osteopontin did not differ in the regions of the epididymis, testis and bulb-urethral glands (p> 0.05). Expression of prostaglandin D-synthetase (PGDS) mRNA was detected in the testes and all segments of the epididymis, with no differences between them (p> 0.05). However, it was not possible to detect expression levels of this gene in the accessory sex glands. The results obtained in the histological analysis of the 8 epididymal segments in Brazilian Somali sheep showed the presence of several cell types in the epithelium, such as main, apical, basal and halo cells. The main, basal and halo cells were observed in all segments of the epididymis and apical cells were not observed in the tail of the epididymis. The volumetric proportion of the regions showed a higher percentage of epithelium in the proximal head, distal head and body (Ep6), and the lower count was shown in the body (Ep5). The connective tissue count was higher in the same segment (Ep5) and without significant differences along the epididymal segments in general. The lamina propria count showed few alterations in the regions of the epididymis and the lumen without spermatozoa was visibly larger in the proximal head, whereas in the region of the head and body of the epididymis there was a large percentage of lumen with spermatozoa. / A raça Somalis Brasileira é uma das mais rústicas dentre os ovinos deslanados do Nordeste, sendo bastante adaptada ao semiárido e sistemas de criação extensivos, com base em pastagem nativa. Portanto, esta raça, assim como as demais deslanadas, representam genótipos únicos e de suma importância para a garantia da variabilidade dos rebanhos dos sistemas de produção, formação de novas raças ou cruzamentos com animais exóticos. Apesar das aptidões e diferenciada capacidade de adaptação dos carneiros Somalis Brasileira, poucos são os trabalhos encontrados na literatura sobre estes animais. Portanto, o presente estudo foi conduzido com a finalidade de avaliar aspectos do epidídimo, expressão gênica e proteômica de tecidos do aparelho reprodutivo de carneiros desta raça. Animais com 150 dias de idade foram abatidos (conforme normas do Ministério da Agricultura) e órgãos coletados para análise de extração de RNA, em testículo, epidídimo, glândulas vesiculares e bulbo-uretrais, e histomorfometria epididmária. A expressão dos genes foi avaliada através de RT-PCR, utilizando-se o gen da GAPDH como referência. Procedeu-se também à extração de proteínas das amostras de tecido epididimário para identificação através de espectrometria de massa (ESI-Q-ToF). Dados assim obtidos foram analisados com o aplicativo para anotações de proteínas (STRAP) e as potenciais interações de específicas proteínas, com o aplicativo STRING 9.05. A expressão de clusterina foi detectada em todos os tecidos analisados, mas a região da cabeça (Ep2) e corpo (Ep5) do epidídimo apresentaram as maiores expressões (p < 0,05). A expressão de mRNA para osteopontina foi localizada em todos os tecidos testados porém, a expressão nas vesículas seminais foi maior do que nos demais órgãos (p < 0,05). Níveis de mRNA para osteopontina não diferiram nas regiões do epidídimo, testículo e glândulas bulbo-uretrais (p > 0,05). A expressão de mRNA para a prostaglandina D-sintetase (PGDS) foi detectada nos testículos e todos os segmentos do epidídimo, não apresentando diferenças entre eles (p > 0,05). No entanto, não foi possível detectar níveis de expressão deste gen nas glândulas sexuais acessórias.

MATOS, M.N.C. Efeito da sazonalidade no perfil de proteínas de espermatozóides de caprinos da raça Moxotó. 2012. 73 f. Dissertação (MESTRADO EM BIOTECNOLOGIA) - Campus de Sobral, Universidade Federal do Ceará, Sobral, 2012. / Submitted by Djeanne Costa (djeannecosta@gmail.com) on 2017-09-01T12:24:59Z No. of bitstreams: 1 2012_dis_mncmatos.pdf: 1852275 bytes, checksum: 92d388e34188c10beb7b23a3216898b0 (MD5) / Approved for entry into archive by Djeanne Costa (djeannecosta@gmail.com) on 2017-09-27T15:12:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_dis_mncmatos.pdf: 1852275 bytes, checksum: 92d388e34188c10beb7b23a3216898b0 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-27T15:12:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_dis_mncmatos.pdf: 1852275 bytes, checksum: 92d388e34188c10beb7b23a3216898b0 (MD5) Previous issue date: 2012 / Proteomic studies of sperm cells may be contribute in the biological reproduction potential by mapping biomarkers of fertility. The present study aims to evaluate the effect of seasonality in the protein profile of sperm Moxotó breed goats, in order to identify markers of fertility. We used six animals in reproductive age (24-36 months) for the collection of semen in artificial vagina, which was carried out weekly during the dry and rainy seasons. After collection, semen was submitted to evaluation of sperm parameters (motility, vigor, concentration and testis volume). The profile of sperm proteins was obtained using the two-dimensional electrophoresis technique . Analysis of seminal parameters showed no significant differences between periods. We detected 330 and 246 spots for 2D gels representing the rainy and dry seasons. The distribution of spots through isoelectric point in the two study periods are concentrated in the pH range 5-6, both in the dry season (PS) and in the rainy season (PC) this region contains about 50% of the total protein . Regarding the molecular weight of 20-40 kDa proteins showed greater frequency over the years. It was observed the presence of 56 spots similar and constant expression in six animals. The qualitative and quantitative differences were observed between the season, highlighting the 349 spot that was present only in the PC, while the 566 and 1115 spots were differentially expressed in the dry season. Individual differences have been identified yet and it seems is correlated with sperm parameters evaluated. In general there was greater expression of proteins in the PS. In conclusion, the results show the influence of seasonality on the expression of some proteins, which may be strong candidates for biomarkers of fertility and may be related to some characteristics such as sperm maturation, capacitation, acrosome reaction and interaction between the gametes. / Estudos proteômicos da célula espermática podem contribuir para a utilização do potencial biológico reprodutivo através do mapeamento de biomarcadores de fertilidade. O presente trabalho tem o objetivo de avaliar o efeito da sazonalidade no perfil proteico de espermatozóides da raça caprina Moxotó, visando à identificação de marcadores de fertilidade. Foram utilizados seis reprodutores em idade reprodutiva (24 a 36 meses) para a coleta de sêmen em vaginal artificial, a qual foi realizada semanalmente durante os períodos seco e chuvoso. Após a coleta, o sêmen foi submetido à avaliação dos parâmetros espermáticos (motilidade, vigor, concentração e volume espermático). O perfil das proteínas espermáticas foi obtido através da técnica de eletroforese bidimensional (2D). A análise dos parâmetros seminais não apresentou diferenças significativas entre os períodos. Foram detectados 330 e 246 spots em géis 2D para os períodos chuvoso e seco, respectivamente. A distribuição dos spots pelo ponto isoelétrico nos dois períodos estudados, encontram-se majoritariamente concentrados na faixa de pH de 5 a 6, tanto no período seco (PS) quanto no período chuvoso (PC) essa região contem cerca 50% do total de proteínas. Em relação a massa molecular as proteínas de 20-40 kDa apresentaram maior frequência ao longo do ano. Observou-se a presença de 56 spots similares e com expressão constante nos seis animais. As diferenças qualitativas e quantitativas foram observadas entre os períodos, destacando-se o spot 349 que esteve presente apenas no PC, enquanto que os spots 566 e 1115 foram diferencialmente expressos no PS. Foram identificadas ainda diferenças individuais e estas parecem está correlacionadas com os parâmetros espermáticos avaliados. De uma forma geral observou-se maior expressão de proteínas no PC. Em conclusão, os resultados apontam influência da sazonalidade na expressão de algumas proteínas, as quais podem ser fortes candidatas a biomarcadores de fertilidade e podem estar relacionadas a várias características do espermatozóide como maturação, capacitação, reação acrossômica e interação entre os gametas.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Florianópolis, 2014. / Made available in DSpace on 2014-08-06T18:10:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 326781.pdf: 1818742 bytes, checksum: c9fcf683a62e94042b732ee609e236e5 (MD5) Previous issue date: 2014 / As rizobactérias promotoras de crescimento vegetal (RPCV) são um grupo de micro-organismos benéficos às plantas devido à sua capacidade de estimular o crescimento vegetal através de vários processos. Uma das mais importantes e estudadas RPCV é a Azospirillum brasilense, uma diazotrófica associada com importantes culturas tais como milho e trigo, a qual possui ampla distribuição geográfica e tem sido usada como organismo modelo para investigar a promoção do crescimento vegetal associativo. Vários mecanismos estão envolvidos na promoção do crescimento vegetal por A. brasilense, entre eles: capacidade de fixação biológica de nitrogênio e à produção de fitormônios, os quais levam à formação de raízes laterais e, consequentemente, à melhor adsorção de água e minerais e, à maior tolerância a estresses, promovendo efeitos positivos sobre os mecanismos de defesa. Neste trabalho foram avaliados parâmetros de crescimento de duas variedades de milho Dekalb 240 (DKB240) e Pioneer 30F53 (P30F53), crescimento bacteriano nas raízes e perfil de proteínas em uma variedade (P30F53) quando as plântulas foram crescidas in vitro. Realizou-se a detecção e quantificação por PCR em tempo real de A. brasilense em plântulas de duas variedades de milho. Os iniciadores foram desenhados e sua especificidade foi verificada usando DNA de 12 diferentes espécies de bactérias. Os resultados dos experimentos de qPCR apresentaram valores dentro da variação aceitável para qPCR, eficiência média de 95% e coeficiente de correlação de 0,98, indicando que o gene nifA é adequado para a análise quantitativa do genoma alvo bacteriano. O número de cópias de DNA bacteriano por grama de massa fresca de raiz aumentou de 3,3 x 106 (1 DAI) para 5,3 x 109 (10 DAI) quando raízes inoculadas de milho da variedade DKB240 foram analisadas e, da mesma maneira, variando de 6 x 106 (1 DAI) para 6,8 x 109 (10 DAI) na variedade P30F53 quando cultivadas in vitro. Os iniciadores desenvolvidos visando nifA serão úteis para monitorar Azospirillum brasilense FP2 em culturas no sistema solo-planta. Comparando-se plântulas da variedade P30F53, controle e inoculadas com A. brasilense FP2, foram encontradas diferenças significativas 7 dias após a inoculação (DAI) em 7 dos 8 parâmetros avaliados (massa fresca e tamanho da folha, massa fresca e tamanho da raiz principal, número de raízes laterais, massa fresca e número de raízes adventícias e massa fresca total das raízes). A observação de raízes através da microscopia eletrônica de varredura (MEV) mostrou que A. brasilense FP2 se liga à superfície radicular, tanto na região do ápice quanto do terço médio, e podem ser encontradas como células simples ou agregadas. A análise do perfil de proteínas, obtido através da técnica de eletroforese bidimensional (2DE), revelou 46 spots diferencialmente acumulados em raízes de milho da variedade Pioneer 30F53 inoculadas com A. brasilense FP2. Os spots foram analisados por espectrometria de massa e três proteínas apresentaram homologia com proteínas hipotéticas de milho e arroz.<br> / Abstract : The plant growth promoting bacteria (PGPB) are a group of microbes beneficial to plants due to its ability to stimulate plant growth by various processes. One of the most important and studied PGPB Azospirillum brasilense is a diazotrophic associated with major crops such as corn and wheat, which widely spread and has been used as a model organism to investigate the associative plant growth promotion. Several mechanisms are involved in the promotion of plant growth by A. brasilense, including: the ability of biological nitrogen fixation and production of phytohormones, which leads to the formation of lateral roots and thus the better absorption of water and minerals, greater tolerance to stress, have positive effects on the mechanisms of defense. In this work, the growth parameters of two varieties of corn Dekalb 240 (DKB240) and Pioneer 30F53 (P30F53), bacterial growth in roots and protein profile in a variety (P30F53) when seedlings were grown in vitro were evaluated. We carried out the detection and quantification by real time PCR A. brasilense seedlings in the two varieties of corn. Primers were designed and their specificity was verified using DNA from 12 different bacterial species. qPCR efficiency and correlation coefficient presented values within the acceptable range for qPCR, average efficiency of 95% and a correlation coefficient of 0.98, indicating that the nifA gene is suitable for the quantitative analysis of target bacterial genome. Bacterial DNA copy number per gram of fresh root increased from 3.3 x 106 (one DAI) to 5.3 x 109 (ten DAI) when inoculated maize roots of DKB 240 variety were analyzed and, in the same way, it ranged from 6 x 106 (one DAI) to 6.8 x 109 (ten DAI) in P30F53 variety when cultured in vitro. The primers developed targeting nifA gene will be useful for monitoring Azospirillum brasilense growth in crops. Comparing control seedlings (variety Pioneer 30F53) inoculated with A. brasilense FP2, significant differences were observed 7 days after inoculation (DAI) in 7 out to 8 evaluated parameters (fresh weight and leaf size, fresh weight and size of the main root, lateral root number, fresh weight and number of adventitious roots and total fresh weight of roots). The observation of roots by scanning electron microscopy (SEM) showed that A. brasilense FP2 binds to the root surface, both in the region of the apex and the middle third, and may be found as single cells or aggregated. Analysis of the protein profile obtained using the technique of two-dimensional electrophoresis (2DE) revealed 46 proteins differentially accumulated in roots of maize (variety Pioneer 30F53) inoculated with A. brasilense FP2. The spots were analyzed by mass spectrometry and three proteins presented homology with hypothetic proteins from corn and rice.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2014. / Made available in DSpace on 2015-02-05T20:13:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 328690.pdf: 5322895 bytes, checksum: c75d85937a50f1f8681ed05a0e4a837d (MD5) Previous issue date: 2014 / O Trypanosoma rangeli é um parasito hemoflagelado amplamente distribuído nas Américas onde ocorre em simpatria com o Trypanosoma cruzi, o agente etiológico da doença de Chagas. Apesar da ampla distribuição geográfica e da diversidade de hospedeiros invertebrados e mamíferos, incluindo seres humanos, as informações a respeito do ciclo biológico do T. rangeli nestes hospedeiros são ainda controversas. Ainda que o genoma do T. rangeli esteja em fase de publicação, são raras as abordagens proteômicas no estudo dos sistemas biológicos, permitindo o estudo de proteínas isoladas a partir da análise do proteoma total. Desta forma, a demanda por estudos de proteômica objetivando abordar o complexo e desconhecido ciclo de vida deste parasita nos levou a avaliar neste estudo o perfil de proteínas de T. rangeli durante o processo de diferenciação celular in vitro e selecionar algumas proteínas de interesse para uma análise molecular inicial. Extratos de proteínas solúveis foram obtidos durante o processo de diferenciação celular in vitro de formas epimastigotas a tripomastigotas. Três estratégias proteômicas foram utilizadas e um total de 1.455 proteínas não redundantes de T. rangeli foram identificadas, das quais quatro foram exclusivamente identificadas por eletroforese 2DE, 724 por eletroforese 1DE e 41 através uma abordagem sem o uso de gel. Entre essas proteínas, foram selecionadas 13 para dar continuidade ao estudo e, destas, quatro apresentaram regulação na expressão durante o período de diferenciação celular e podem se tornar marcadores importantes que irão auxiliar a entender a biologia de T. rangeli e os mecanismos moleculares durante o processo de diferenciação.<br> / Abstract : Trypanosoma rangeli is a hemoflagelate parasite occurring in sympatry with Trypanosoma cruzi, agent of Chagas disease, in a wide area in Central and South America. Despite this sympatric distribution and the diversity of invertebrate and mammalian hosts, including humans, information about the biological cycle of T. rangeli on these hosts is still scarce and controversial. The T. rangeli genome has been sequenced and is about to be published by our group but little proteomic data is so far available to address the complex and unknown life cycle this parasite. Thus, the aim of this study was to evaluate the protein profile of T. rangeli during the in vitro cellular differentiation and select some proteins of interest for an initial molecular analysis. Soluble protein extracts were obtained from parasites during the in vitro differentiation process of epimastigotes forms to trypomastigotes. Three proteomic approaches were used and a total of 1,455 non-redundant T. rangeli proteins were identified. Among these, four were identified exclusively by 2DE electrophoresis, 724 by 1DE gel based and 41 proteins via a gelfree approach. Several proteins revealing variation on their expression profiles were selected to continue this study, among which, four showed regulation of expression during cell differentiation and may become important stage-specific proteins that could help to understand T. rangeli biology and the molecular mechanisms during the differentiation process.

Made available in DSpace on 2016-03-10T13:16:19Z (GMT). No. of bitstreams: 2 aline_gomes_ioc_dout_2014.pdf: 10648737 bytes, checksum: 93332a2b40290f53d7df0cb86ea92716 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-01-13 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Strigomonas culicis, um tripanossomatídeo monoxênico, apresenta uma relação mutualística com uma bactéria em seu citoplasma. Esta pode ser removida por tratamento com antibiótico, sendo o cinetoplastídeo mantido em laboratório sob a forma de cepa apossimbiótica. Comparações entre as duas cepas fazem parte de uma estratégia interessante para o estudo da relação mantida pelos dois organismos. A ciência dirigida por descoberta, da qual a tecnologia proteômica faz parte, gera um volume de dados abrangente que pode posteriormente ser utilizado para retroalimentar projetos de ciência dirigida por hipótese. Desta forma, o estudo comparativo das duas cepas através da geração dos perfis bidimensionais, em distintas etapas do desenvolvimento celular, possibilitou a identificação de um número abrangente de proteínas diferencialmente abundantes entre as cepas, e entre as etapas do crescimento celular de cada cepa. As diferenças entre as cepas estão relacionadas tanto a alterações quantitativas quanto a proteínas exclusivas de cada condição analisada. Para a cepa selvagem uma maior modulação foi observada entre o meio e o fim de fase logarítmica, enquanto para a cepa apossimbiótica a modulação maior ocorre entre o início de fase log e a fase estacionária. Comparações entre as cepas indicam menores diferenças no início de fase logarítmica, sendo a maior porcentagem de spots diferenciais representada por aqueles que apresentam abundância diferencial estatisticamente significante Após as identificações proteicas três processos foram detalhados: expressão de peptidases, síntese de heme e interação parasito-hospedeiro. Uma calpaína foi identificada sendo modulada não apenas entre as etapas de crescimento celular, como também entre cepas. Neste sistema sua função poderia estar relacionada ao remodelamento do citoesqueleto. A enzima coproporfirinogênio oxidase foi identificada em ambas as cepas, com abundância superior em cepa selvagem, assim como a subunidade IV do complexo citocromo c oxidase, ambos com maior abundância em início de fase log, um indicativo de diferenças de requerimento de heme e/ou hemeproteínas, bem como de metabolismo energético diferenciado, pelo menos em etapas de início de crescimento, entre as cepas. Proteínas relacionadas ao flagelo também foram identificadas, e poderiam contribuir para a sustentação de um panorama multifatorial que proporcionaria uma maior capacidade de interação da cepa selvagem com seus hospedeiros. O grande volume de dados gerados será ainda utilizado para a identificação de redes metabólicas influenciadas pelo simbionte permitindo, futuramente, um entendimento amplo da relação simbiontetripanossomatídeo / Strigomonas culicis, a monoxenic trypanosomatid, shares a mutualistic relationship with a cytoplasmic bacterium. This bacterium can be removed by antibiotic treatment, and the kinetoplastid can be maintained in laboratory as an aposymbiotic strain. Comparisons between the strains are part of an interesting strategy to study the relationship maintained by both organisms. Discovery-driven science, which encompasses the proteomic technology, generates an in-depth data volume, which can be used to feedback hypothesis-driven projects. Therefore, the comparative study of the distinct strains through two-dimensional gel profiles, at different stages of development, enabled the identification of a large number of proteins differentially abundant between strains and among the cell growth stages for each one. The differences between the strains are related to both quantitative alterations and exclusive proteins of each analyzed condition. For the wild strain, major modulation was observed between the mid- and late log phases, while for the aposymbiotic strain, the major modulation occurred between early log and stationary phases. Comparisons between the strains indicate minor differences at the early log phase, being the major percentage of differential spots represented by those that present statistically significant differential abundance. After protein identification three processes were detailed: peptidases expression, heme synthesis and parasite-host interaction. A calpain was identified being modulated not only between the stages of cellular growth, but also between strains. This protein could be related to cytoskeleton remodeling. Coproporphyrinogen oxidase enzyme and subunit IV of the cytochrome c oxidase were identified in both strains, with overabundance in the wild strain. Both proteins presented higher abundance at the early log phase, which suggests differences in heme and/or heme proteins requirement, as well as a differential energetic metabolism between the strains, at least for the early stages of the growth. Flagellar-related proteins were also identified, which supports the idea of a multifactorial process that contributes to understand the better interaction capacity of the wild strain with its host. The vast amount of data obtained will be further utilized for the identification of metabolic networks influenced by the symbiont, hopefully allowing a broad understanding of the symbiotic-trypanosomatid relationship.

Made available in DSpace on 2016-04-07T13:23:13Z (GMT). No. of bitstreams: 2 leonardo_matilde_ioc_dout_2013.pdf: 10262111 bytes, checksum: 343b14b4b2a15acbb6b250c4067d32ff (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Os mosquitos Aedes albopictus (Skuse, 1894) e Aedes aegypti (Linnaeus, 1762) apresentam significativa importância epidemiológica dentro da família Culicidae por serem os principais vetores da febre amarela e dos quatro sorotipos do vírus da dengue. As peptidases ou proteases são enzimas que clivam ligações peptídicas. No sistema digestivo de invertebrados as peptidases, especificamente aquelas da classe das serino-peptidases, são abundantes e participam de vários processos fisiológicos, desempenhando um papel principal na hidrólise de proteínas destinadas à nutrição. Estas enzimas podem apresentar características espécie-específicas e essas diferenças são respostas adaptativas a diferentes estilos de vida, ambientes e habilidade de sobrevivência entre as espécies. Neste trabalho descreve-se a caracterização das atividades proteolíticas detectadas em extratos totais das formas pré-imaginais de A. aegypti e A. albopictus por enzimografia em uma dimensão. A estabilidade da expressão de peptidases nessas espécies foi avaliada pela comparação do perfil proteolítico de formas larvais obtidas de ovos de insetos recém coletados no ambiente com ovos de insetos mantidos em colônia por longo período. Foram também comparados os perfis proteolíticos das pupas com seus respectivos imagos, bem como a estabilidade térmica das peptidases detectadas. Observaram-se complexos perfis de serino-peptidases do tipo tripsina em ambas as espécies vetoras Contudo esses perfis apresentam diferenças espécie-específicas e também diferenças entre os distintos estágios evolutivos dentro de uma mesma espécie. Também, neste trabalho, descreve-se a caracterização das atividades proteolíticas detectadas no intestino médio de fêmeas de A. albopictus alimentadas com açúcar bem como o primeiro mapa proteô mico e a identificação de peptidases por eletroforese bi-dimensional e espectrometria de massas neste órgão. São discutidas aqui as estratégias usadas para analisar as peptidases expressas nesse tecido. As proteínas expressas no intestino médio de A. albopictus foram identificadas por similaridade com as sequencias de genoma de A. aegypti e distintas ferramentas bioinformáticas foram usadas para obter informação funcional de muitas dessas sequencias que estão pobremente anotadas. Foram identificadas 59 proteínas entre v Resumo as quais três serino-peptidases, e dessas, duas do tipo tripsina e uma quimiotripsina. Os resultados obtidos nos permitiram atribuir de maneira confiável um local de expressão para os genes de tripsina, tripsina alfa e quimotripsina. Em outras palavras, podemos afirmar que os genes acima mencionados se expressam no intestino médio de fêmeas adultas de A. albopictus alimentadas com açúcar. Este achado representa um pequeno, mas importante passo, para a atribuição funcional, ao nível de proteína, de genes codificantes para serino-peptidases do tipo tripsina e quimiotripsina no gênero Aedes / The mosquitoes Aedes albopictus (Skuse, 1894) and Aedes aegypti (Linnaeus, 1762) have significant epidemiological importance within the family Culicidae because they are the main vectors of the yellow fever virus and the four serotypes of Dengue virus. Peptidases or proteases are enzymes that hydrolyze peptide bonds. In the digestive system of invertebrates, the peptidases, specifically those from the class of serine peptidases, are abundant and participate in various physiological processes, playing a major role in the hydrolysis of proteins destined to nutrition. These enzymes may have species-specific characteristics, and such differences reflect adaptive responses to different lifestyles and environments. In this work we describe the characterization, using zymography, of the proteolytic activities detected in total extracts of larval forms of A. aegypti and A. albopictus. The stability of expression of peptidases in these species was evaluated by comparing the proteolytic profile of larval forms obtained from eggs of newly collected insects to that from eggs of insect kept in colony for a long period. We also compared the proteolytic profiles of pupae as well as the thermal stability of the peptidases detected. Complex profiles of trypsin-like serine peptidases were observed in both species. However, these profiles differ between species and also differences between the different evolutionary stages were detected within the same species. Also, in this work, we describe the characterization of the proteolytic activities detected in the midgut of A. albopictus females fed on sugar as well as the first proteome map and proteomic identification of peptidases in this organ, using two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry. The strategies used to analyze the proteases expressed in this tissue are discussed here. The proteins expressed in the midgut of A. albopictus were identified by similarity with the genome sequences of A. aegypti and various bioinformatic tools were used to obtain functional information for many of these sequences that are poorly annotated. We identified 59 proteins including three serine peptidases, and among these, two types of trypsin-like and one chymotrypsin. The results obtained here allowed us to reliably assign a localization for the expression of trypsin, trypsin-alpha and chymotrypsin genes. In other words, we can say that the above mentioned genes are expressed in the midgut of adult females of A. albopictus fed with sugar. This finding represents a small but important step for the functional assignment, at the protein level, of the genes coding for trypsin-like and chymotrypsin serine peptidases of the Aedes genus.