Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-08-17T20:14:00Z No. of bitstreams: 1 2016_YannaReisPraça.pdf: 8951084 bytes, checksum: 723a2e6a0e521ef29a7ba1303584bf80 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-09-20T18:44:27Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_YannaReisPraça.pdf: 8951084 bytes, checksum: 723a2e6a0e521ef29a7ba1303584bf80 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-20T18:44:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_YannaReisPraça.pdf: 8951084 bytes, checksum: 723a2e6a0e521ef29a7ba1303584bf80 (MD5) / Os triatomíneos são artrópodes hematófagos durante todo o seu ciclo de vida e para garantir o sucesso de seu repasto, desenvolveram estratégias adaptativas que contrapõem o sistema hemostático e imune do hospedeiro, injetando moléculas farmacologicamente ativas durante esse processo. Por possuirem diversas moléculas com interesse farmacológico, a saliva desses artrópodes hematófagos passou a ser alvo de pesquisas. Para ampliar o conhecimento sobre essas moléculas, esse trabalho teve como objetivos: 1) investigar a expressão protéica na saliva de Triatoma dimidiata em diferentes tempos após a alimentação sanguínea, por meio da análise proteômica comparativa por LC-MS/MS, eletroforese bidimensional e análises in silico, e 2) caracterizar in silico a sequência aminoacídica do antígeno 5 salivar de Rhodnius neglectus (RNAV), além da expressão dessa molécula em Escherichia coli. A análise proteômica comparativa da saliva de T. dimidiata levou à identificação de 362 proteínas, das quais 65 eram específicas da amostra de cinco dias após a alimentação sanguínea (dpa) e 79 específicas da amostra de 10 dpa, além de contribuir para validar dados do transcritoma dessa espécie disponível na literatura. A análise in silico do RNAV sugere que a molécula é secretada pela via clássica, que modificações pós-traducionais como fosforilação e glicosilação devem ocorrer na proteína, e que existem aproximadamente 25 resíduos de aminoácidos que podem estar presentes em epítopos lineares para células B. Não foi possível obter o RNAV recombinante. O conhecimento das proteínas salivares do T. dimidiata e sua comparação com as de outras espécies de artrópodes hematófagos pode ser útil para entender processos biológicos fundamentais como sobrevivência, adaptação e as interações desses vetores com seus hospedeiros e com os agentes infecciosos que eles são capazes de transmitir. _________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Triatomine are bloodsucking arthropods throughout their life cycle and to ensure the success of their meal, they have developed adaptive strategies that counteract the hemostatic and immune system of the host, injecting pharmacologically active molecules during this process. By owning several molecules with pharmacological interest, bloodsucking arthropods saliva has become the subject of various research. To enhance our knowledge about these molecules, this study aimed 1) to investigate the protein expression in Triatoma dimidiata saliva at different times after the blood feeding through comparative proteomic analysis using LC-MS/MS, 2-DE electrophoresis and bioinformatics, and 2) to characterize in silico the salivary antigen 5 of Rhodnius neglectus (RNAV), beyond its expressin in Escherichia coli. The comparative proteomic analysis of T. dimidiata saliva revealed 362 proteins, 65 specific of the sample collected 5 days after feeding and 79 specific of the sample collected 10 days after feeding, and aided to validate available data from T. dimidiata transcriptome. RNAV in silico analysis revealed this protein may be secreted by the classical pathway, phosphorilation and glycosilation sites, and the existence of 25 amino acid residues that may be present in linear epitopes to B cells. Our attempt failed to produce recombinant RNAV. Knowing T. dimidiata salivary proteins and comparison with those from other species of hematophagous arthropods may help to understand fundamental biological processes such as survival, adaptation, vector-host and vector-pathogens interactions.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2016. / Este trabalho foi elaborado em conjunto com a Université Pierre et Marie Curie. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2017-02-07T16:06:48Z No. of bitstreams: 1 2016_CarlosHenriqueSaraivaGarcia_Parcial.pdf: 4658600 bytes, checksum: a608388f9b6fa01da088371cfde06c09 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-02-27T20:54:27Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_CarlosHenriqueSaraivaGarcia_Parcial.pdf: 4658600 bytes, checksum: a608388f9b6fa01da088371cfde06c09 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-27T20:54:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_CarlosHenriqueSaraivaGarcia_Parcial.pdf: 4658600 bytes, checksum: a608388f9b6fa01da088371cfde06c09 (MD5) / Na história da medicina, a malária é uma das doenças parasitárias mais graves e distribuídas que afetam seres humanos. A doença é causada por parasitas do gênero Plasmodium. A malária de roedores é utilizada comumente como modelo por permitir a combinação de experimentos in vivo e in vitro, além de estudos por genética reversa. Embora a gametogênese dos estágios sexuais de Plasmodium seja um passo essencial da transmissão da malária, dados moleculares sobre a reorganização nuclear, montagem do flagelo e sua regulação na gametogênese estão incompletas. A ATPase cinesina-8 de P. berghei é uma proteína motora sugerida como um importante componente para a gametogênese macho. Os gametócitos com o gene kin8 interrompido (Δkin8) são semelhantes morfologicamente aos tipos selvagens (WT), enquanto que na gametogênese existe disfunção que tornam as células Δkin8 incompetentes para gametogênese completa e incapazes de exflagelar. Nos esforços para melhorar o conhecimento sobre a exflagelação de gametas, fizemos experimentos quantitativos de proteômica e fosfoproteômica com gametócitos WT e Δkin8. A amostra enriquecida de gametócitos do sangue murinho no tempo T0 foi induzida a exflagelação por ácido xanturênico e colhida no tempo T7 e T15 min. A quantificação relativa entre amostras foi realizada com uso de peptídeos marcados por iTRAQ na triplicata biológica independente e analisados por nanoLC/MS-MS Orbitrap Elite Mass Spectrometer após enriquecimento TiO2. Os dados foram processados através do softwares Patternlab for Proteomics e Blast2GO. Em parasitas WT, 443 proteínas e 206 fosfoproteínas foram identificados a partir de 2.617 peptídeos. Em parasitas Δkin8, 530 proteínas e 218 fosfoproteínas proteínas foram identificadas a partir de 3.198 peptídeos. A produção de gametas é regulada por fosforilações nas duas condições celulares. Entre os processos biológicos da Ontologia de Genes, aqueles relacionados a tradução de RNA, e biossíntese de DNA e proteínas foram as que mais se destacaram e mais regulados na gametogênese. Foi observado também que a glicólise e a resposta ao estresse ambiental foram mais notável principalmente no início da diferenciação celular. Para Δkin8, a desorganização de microtúbulos dos axonemas e fusos mitóticos é causa provável da supressão de proteínas motoras (cinesina -8, -13 e dineína) como também pela superexpressão de proteínas de organização do braço interno e braço radial. Observamos importante diminuição de unidades de nucleossomos e aumento de proteínas envolvidas com a desorganização da divisão nuclear. Quando comparado com o WT, no mutante houve maior expressão de proteínas envolvidas no complexo proteassoma dependente de ubiquitina e menor quantidade de algumas proteínas interferentes no metabolismo energético e egresso. A análise do Δkin8 traz novas informações sobre a exflagelação e mal funcionamento do microgameta mutante. Em conclusão, a gametogênese exige manifestamente a expressão de proteínas e sua regulação por fosforilações para a produção de energia na diferenciação dos gametas. A Cinesina 8 é essencial para a gametogênese masculina normal como também para a montagem de axonemas em P. berghei, e seu estudo fornece informações quanto a organização celular e biologia de Plasmodium. / Malaria is one of the most serious and widespread parasitic diseases that affected humans in medicine history. The disease is caused by parasites from Plasmodium genus. Rodent malaria parasites are commonly used as model since it permits the combination of in vivo and in vitro experiments and reverse genetic studies. Although Plasmodium sexual stages gametogenesis is an essential step to ensure the malaria transmission, molecular data on nuclear reorganization and intracytoplasmic flagellum assembly proteins and their regulating in gametogenesis is still missing. The P. berghei motor ATPase kinesin 8 is proposed as important component for male gametogenesis. Kin8-disrupted gametocytes (Δkin8) were morphologically similar to wild-type (WT) parasites, while male gametogenesis is not functional and able to exflagellate. In efforts to improve the knowledge on gamete exflagellation, we did quantitative proteomic and phosphoproteomic experiments with WT and Δkin8 gametocytes. Gametocytes-enriched sample from mice blood at time T0 were xanthurenic acid-induced to exflagellate and harvested at time T7 and T15 min. The relative quantitative comparisons overtime were performed through iTRAQ labelled peptides from independent biological triplicate sample analysed by nanoLC/MS-MS Orbitrap Elite Mass Spectrometer after TiO2 enrichment. Data was processed through Patternlab for Proteomics software and Blast2GO. In the WT parasites, 443 proteins and 206 phosphoproteins were identified from 2,617 peptides. In Δkin8 parasites, 530 proteins and 218 phosphoproteins were identified from 3,198 peptides. Gamete formation is highly regulated by phosphorylation in both cell conditions. Among GO biological processes, those related to RNA translation, DNA and protein biosynthesis were most prominent and strongly regulated throughout the gametogenesis, and phosphorylated proteins are mainly RNA, ATP or protein binding proteins. We observed that glycolysis and environmental stress response are predominant, mainly at the beginning of the differentiation. For Δkin8 parasites, axoneme and mitotic spindle microtubules disorganization is likely to be caused by motor proteins down-regulation (kinesin-8, -13, and dynein) as well as by up-regulated proteins from inner arm and radial spoke organization. We noticed important down-expression of nucleosome units, up-expression of proteins involved in the replication that could be related to the nuclear division disorganisation. A higher expression of proteins involved in the ubiquitin-dependant proteasome complex and stress response and folding, and lower expression of some proteins that interferes in energy metabolism and egress in the mutant compared to the WT. The Δkin8 proteomic approach brings new clues on the exflagellation and the mutant microgamete impairment observed. In conclusion, gametogenesis clearly requires a high protein expression and phosphorylation modulation to produce energy for gamete differentiation. Kinesin 8 is essential for male gametogenesis and normal axoneme assembly in P. berghei, providing new insights into Plasmodium flagellar organization and biology. / Dans l'histoire de la médecine, le paludisme est l'une des maladies parasitaires les plus graves et répandues. Elle est causée par des parasites du genre Plasmodium. Les parasites du paludisme de rongeurs sont couramment utilisés comme modèles pour étudier le paludisme humain permettant des études de génétique inverse in vivo. Bien que la gamétogenèse des stades sexués de Plasmodium soit une étape essentielle pour la transmission du paludisme, les données moléculaires sur la réorganisation nucléaire, l'assemblage du flagelle et de leurs régulations pendant la gamétogenèse, sont toujours incomplètes. La kinésine-8 de P. berghei est une protéine motrice qui jouerait un rôle important lors de la formation des gamètes mâles. Les gamétocytes avec le gène kin8 interrompu (Δkin8) sont morphologiquement semblables au type sauvage (WT) mais la gametogenèse mâle n’est pas fonctionnelle et les cellules mutantes sont incapables de produire des gamètes mâles. Afin d’avoir une meilleure connaissance des mécanismes moléculaires mis en oeuvre au cours de la gamétogenese, nous avons entrepris des études protéomiques et phosphoprotéomiques comparatives et quantitatives chez le parasite de type sauvage et chez le mutant Δkin8. Les gamétocytes enrichis à partir du sang de souris infectées ont été récoltés au temps 0, 7 et 15 min après induction de la gamétogenese par l'acide xanthurénique. Des comparaisons quantitatives relatives ont été effectuées par nanoLC/MS-MS du type Orbitrap Elite à partir des peptides et phosphopeptides préalablement enrichis par TiO2, marqués par iTRAQ, et de triplicats biologiques. Les données ont été traitées par les logiciels Patternlab for Proteomics et Blast2GO. Chez WT, 443 protéines et 206 phosphoprotéines ont été identifiées à partir de 2.617 peptides. Chez Δkin8, 530 protéines et 218 phosphoprotéines ont été identifiées à partir de 3.198 peptides. La formation de gamètes est fortement régulée par phosphorylation dans les deux conditions cellulaires. Parmi les processus biologiques (GO term), ceux liés à la traduction de l’ARN, la biosynthèse de l’ADN et de protéines sont les plus marquants et les plus régulés. La glycolyse et la réponse aux stress environnementaux sont également prédominantes, surtout au début de la différenciation des gamètes. Chez Δkin8, une forte sous-expression des protéines motrices kinésine-13 et dynéine, et une surexpression de protéines de l'organisation des bras intérieur et radiaire des axonèmes sont observées. La modulation de l’expression de ces protéines participe certainement, en plus de l’absence de la kinésine-8, au phénotype observé chez Δkin8: l’absence d’assemblage des axonèmes des gamètes mâles. Nous avons constaté également une sous-expression significative d’unités des nucléosomes et la surexpression de protéines impliquées dans la réplication. Ceci pourrait être relié à la perturbation de la division nucléaire observée chez Δkin8. Par rapport au WT, Δkin8 montre une expression élevée de protéines du complexe de protéasome dépendant de l’ubiquitine et de protéines impliquées dans la réponse au stress et le repliement des protéines, ainsi qu’une faible expression de certaines protéines qui interviennent dans le métabolisme énergétique et la sortie de l’hématie. Ces approches de protéomique et phosphoprotéomique comparatives permettent pour la première fois d’identifier les évènements moléculaires, leur dynamique et leur modulation, mis en jeux lors de la gamétogenèse de P. berghei.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2015. / Submitted by Guimaraes Jacqueline (jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2015-11-11T14:31:12Z No. of bitstreams: 1 2015_JessicaKeleArrudaMacedo.pdf: 7042853 bytes, checksum: 2fd7157750744a04a33aedad26b23527 (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2016-01-25T13:53:53Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_JessicaKeleArrudaMacedo.pdf: 7042853 bytes, checksum: 2fd7157750744a04a33aedad26b23527 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-01-25T13:53:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_JessicaKeleArrudaMacedo.pdf: 7042853 bytes, checksum: 2fd7157750744a04a33aedad26b23527 (MD5) / Introdução: A emergência contra a resistência de células tumorais às drogas quimioterápicas disponíveis no mercado faz com que o desenvolvimento de novos agentes seja de grande importância. As toxinas isoladas de venenos animais, incluindo serpentes, têm disso sujeitos de numerosos estudos devido ao seu potencial biotecnológico e aplicações médicas. Objetivos: Foram investigados os efeitos provocados pelo tratamento de diversas linhagens celulares com a peçonha bruta de B. marmoratus, bem como os efeitos de uma PLA2 cataliticamente inativa isolada (BmPLA2) sobre células HeLa. Métodos: A abordagem experimental para análise da peçonha bruta incluiu principalmente detecção da viabilidade celular e caracterização do tipo de morte celular por citometria de fluxo. Para análise das alterações transcriptômicas provocadas pelo tratamento com BmPLA2 por 2 h, 12 h ou 24 h RNA extraído foi analisado por microarranjo utilizando Affymetrix GeneChip® Human Gene 2.0 ST. As alterações proteômicas também foram analisadas por meio da descomplexação do lisado protéico utilizando SDS-PAGE, seguida por analise por LC / MS / MS.Resultados: A análise dos resultados permitiu a verificação de morte celular apoptótica causada pela peçonha bruta com IC50 de 5 µg/mL para HeLa, 2,5 µg/mL para B16F10 e 2,2 µg/mL para NIH/3T3. Por outro lado, o IC50 determinado para BmPLA2 foi de 8,7 µM. Os dados de transcriptômica e proteômica juntos, demonstraram as mudanças típicas associadas à apoptose bem como associadas a outras vias importantes como MAPK, adesão focal e autofagia, produzindo insights sobre os mecanismos que levam à morte celular. Conclusões: BmPLA2 induz morte de células tumorais via apoptose, mas pode por outro lado ativar mecanismos relacionados à resistência e sobrevida, sendo portanto necessário a confirmação dessas vias, bem como uma análise mais detalhada e a longo prazo para determinação efetiva do seu efeito. ____________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Introduction: The emergence against tumor cell resistance to chemotherapy drugs available in the market makes the development of new agents of great importance. The toxins isolated from animals including snake venoms have been subject of numerous studies due to their potential on biotechnological and medical applications. Objectives: The effects caused by treatment of different cell lines with crude venom of B. marmoratus, as well as the effect of a catalytically inactive PLA2 isolated (BmPLA2) were investigated on HeLa cells. Methods: The experimental approach for analysis of crude venom included mainly detection of cell viability and characterization of cell death by flow cytometry. For analysis of transcriptomic changes caused by treatment with BmPLA2 for 2 h, 12 h and 24 h, extracted RNA was analyzed by microarray using Affymetrix GeneChip® Human Gene 2.0 ST. The proteomic alterations were also analyzed by decomplexation of protein lysate using SDS-PAGE followed by analysis by LC / MS / MS. Results: The results allowed the verification of apoptotic cell death caused by crude venom with IC50 of 5µg / ml to HeLa, 2.5 µg / ml for B16F10 and 2.2 µg / ml for NIH / 3T3. On the other hand, the IC50 for BmPLA2 was 8.7 µM. The transcriptomic and proteomic data together, showed typical changes associated with apoptosis and associated with other pathways such as MAPK, focal adhesion and autophagy, yielding insights into the mechanisms that lead to cell death. Conclusions: BmPLA2 induces tumor cell death via apoptosis but can on the other hand, elicit mechanisms related to the resilience and survival. It is still necessary to confirm these pathways, as well as perform some additional detailed analysis and long-term effective to determine their effect.

Submitted by Amanda Ribeiro dos Santos null (amandashalar@hotmail.com) on 2018-04-09T20:47:32Z No. of bitstreams: 1 2018-04-09_Dissertação_AmandaRibeiro-VersãoFinal.pdf: 5828961 bytes, checksum: d332ff1b02f6b315b3c46c6eb3e0fe4c (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Pizzani null (luciana@btu.unesp.br) on 2018-04-10T18:58:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 santos_ar_me_bot.pdf: 5828961 bytes, checksum: d332ff1b02f6b315b3c46c6eb3e0fe4c (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-10T18:58:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 santos_ar_me_bot.pdf: 5828961 bytes, checksum: d332ff1b02f6b315b3c46c6eb3e0fe4c (MD5) Previous issue date: 2018-02-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica causada por fungos do gênero Paracoccidioides; suas principais formas clinicas são aguda/subaguda, crônica (FC) e residual. A maioria dos pacientes com a FC da doença, mesmo após tratamento eficaz, apresenta sequelas, principalmente fibrose pulmonar (FP) e enfisema. Os problemas sociais, econômicos e psicológicos desencadeados pela FP são subestimados. Apesar da fibrogênese na PCM ser reconhecida como um processo precoce, seus mecanismos não são totalmente conhecidos. No presente estudo, determinamos o perfil proteômico sérico de pacientes com PCM-FC com diferentes desfechos de FP. Vinte e nove pacientes com PCM pulmonar foram acompanhados periodicamente e as amostras de soro sanguíneo foram coletadas em quatro momentos: antes do tratamento (M0), cura clínica (M1), cura sorológica (M2) e cura aparente (M3). O grupo controle foi constituído por amostras de quinze indivíduos fumantes, pareados com idade e sexo dos pacientes avaliados. Ao final do tratamento (M3), os pacientes foram submetidos à avaliação de tomografia computadorizada e dois grupos de pacientes foram formados com base nos resultados de PF: PF menor (n = 17) e PF maior (n = 12). As proteínas de elevada abundância no soro foram removidas e, em seguida, submetidas à análise proteômica shotgun através do sistema nanoACQUITY UPLC-Xevo QTof MS. A identificação e quantificação das proteínas foram realizadas usando o software PLGS Expression E. Análise de enriquecimento e análise de rede de interação proteína-proteína (PPI) foram realizadas usando o software String. Antes do tratamento, os pacientes com PF menor, em comparação aos controles, apresentavam 91 proteínas diferencialmente expressas (60 sub-reguladas 31 superreguladas). Soro de pacientes com maior PF apresentaram 70 proteínas diferencialmente expressas (66 sub-reguladas 4 reguladas). A maioria dessas proteínas estavam envolvidas na regulação do processo celular e resposta inflamatória. Nas condições ensaiadas, o estudo permitiu identificar as proteínas APOH, A2M, GC e SERPINA1 como alvos envolvidos nos mecanismos moleculares da fibrogênse pulmonar na paracoccidioidomicose. Foi observado, ainda, que o momento de cura clínica apresentou maior atividade pró-fibrótica durante o seguimento dos pacientes. Além disso, foram identificadas 20 proteínas candidatas a biomarcadores no prognóstico da fibrose pulmonar, conforme segue: família das hemoglobulinas (HBB, HBD, HBG2, HBE1, HBG1, HBA1), ENO3, A2M, APOH, GC, IGHG-1, -2 e 3, IGLC1, -2 e -3, HP, SERPINA1, LRG1 e PZP. Nossos achados fornecem novos alvos para estudos futuros envolvendo a FP na PCM, assim como biomarcadores séricos em potencial. / Paracoccidioidomycosis (PCM) is systemic mycosis caused by fungi of the genus Paracoccidioides; its main clinical forms are acute / subacute, chronic (CF) and residual. Most FC-PCM patients, even after effective treatment, present sequelae, mainly pulmonary fibrosis (PF) and emphysema. The social, economic and psychological problems triggered by PF are underestimated. Although fibrogenesis in PCM is recognized as an early process, its mechanisms are not fully known. In the present study, we aimed to determine the serum proteomic profile of patients with FC-PCM with different (PF) outcomes. Twenty-nine patients with pulmonary PCM patients were followed up periodically, and blood serum samples were collected in four moments: before treatment (M0), clinical cure (M1), serological cure (M2), and apparent cure (M3). For control group (n=15), serum samples of sex and age-matched smokers were also collected. At the end of treatment (M3), the patients were submitted to CT Scan evaluation and two groups of patients were formed based on PF outcomes: minor PF (n=17) and major PF (n=12). High-abundance proteins were removed from serum and submitted to shotgun proteomic assay using a nanoACQUITY UPLC-Xevo QTof MS system. The identification and quantification of proteins were performed using PLGS Expression E software. Enrichment analysis and protein-protein interaction (PPI) network analysis were performed using String software. Before treatment, patients with minor PF, in comparison to controls, showed 91 differentially expressed proteins (60 down-regulated and 31 up-regulated). Serum of patients with major PF exhibited 70 differentially expressed proteins (66 down-regulated and 4 up-regulated). Most of these proteins are involved in the regulation of cellular process and inflammatory response. The results allowed the identification of APOH, A2M, GC and SERPINA1 as targets involved in the molecular mechanisms of pulmonary fibrogenesis in paracoccidioidomycosis. It was also observed that the clinical cure presented greater pro-fibrotic activity during the follow-up of the patients. In addition, 20 candidate biomarkers were identified in the prognosis of pulmonary fibrosis, as follows: hemoglobin family (HBB, HBD, HBG2, HBE1, HBG1, HBA1), ENO3, A2M, APOH, GC, IGHG-1, -2 and 3, IGLC1, -2 and -3, HP, SERPINA1, LRG1 and PZP. Our findings provide new targets for further studies involving mechanisms of PF in PCM, as well as for promising potential biomarkers. / CNPq 470221/2014-3

Orientador: Ana Marisa Fusco Almeida / Banca: Maria Aparecida de Resende Stoianoff / Banca: Juliana Campos Junqueira / Resumo: Histoplasma capsulatum variedade capsulatum é um fungo dimórfico causador da Histoplasmose, uma doença fúngica sistêmica que constitui um importante problema de saúde mundial. A infecção ocorre através da inalação de propágulos infectantes provenientes do meio ambiente. A capacidade de formação de biofilme por esse fungo foi caracterizada recentemente, porém ainda pouco se sabe sobre os mecanismos envolvidos na sua formação. Neste caso, estudos com abordagens proteômicas seriam de fundamental importância para o entendimento da diferença entre a forma planctônica e o biofilme. Os antifúngicos usados na terapia convencional contra biofilmes não são eficientes, além disso, doses elevadas para perfusão destes fármacos nesta forma seriam tóxicas para os pacientes. O presente trabalho teve como objetivo verificar a atividade anti-Histoplasma de 92 compostos derivados de chalcona e do ácido protocatecuico; caracterizar o biofilme do isolado clínico H. capsulatum 317 e pesquisar compostos anti-biofilme buscando um provável mecanismo de ação através da análise proteômica diferencial entre o biofilme tratado e não tratado. Os testes de susceptibilidade foram realizados conforme o documento M27-A3, proposto pelo CLSI (2008). Os biofilmes foram formados em caldo BHI suplementado e a atividade metabólica foi determinada através do ensaio de redução do XTT. Para a caracterização da formação do biofilme e da ação do composto, utilizou-se a microscopia eletrônica de varredura (MEV) e microscopia confocal, enquanto que a massa do biofilme e a matriz extracelular foram quantificadas pelo cristal violeta e safranina. E como etapa final foi realizada a análise do perfil proteico dos biofilmes com e sem tratamento. Os melhores valores de concentração inibitória mínima (CIM) foram obtidos por seis derivados de chalconas (T50, C3, E2A, F2A, T18A e T46A) e... / Abstract: Histoplasma capsulatum var. capsulatum is a dimorphic fungi that causes Histoplasmosis, a systemical fungal disease that is a major health problem worldwide. Infection occurs by inhalation of infective propagules from the environment. The biofilm formation by this fungi was characterized recently, however little is known about the mechanisms involved in their formation. In this case, studies with proteomic approaches would be of fundamental importance for understanding the difference between the planktonic and biofilm forms. The antifungal agents used in conventional therapy are not effective against biofilms, in addition, high doses of these drugs can be toxic to patients. This study aimed to verify the anti-Histoplasma activity of 93 compounds derived from chalcones and protocatechuic acid; characterize the biofilm formation by the clinical isolate H. capsulatum 317 and discover new anti-biofilm compounds searching for a mechanism of action by differential proteomics analysis, comparing the treated and untreated biofilms. Susceptibility tests were performed according to the document M27- A3, proposed by the CLSI (2008). The biofilms were formed in BHI broth supplemented and metabolic activity was determined by the XTT reduction assay. For the characterization of biofilm formation and action of the compound, was used the scanning electron microscopy (SEM) and confocal microscopy, while the mass of the biofilm and the extracellular matrix were quantified by crystal violet and safranin. Lastly was performed the analysis of the protein profile of biofilms with and without treatment. The best minimum inhibitory concentration values (MIC) were obtained for six derivatives of chalcones (T50, C3, E2A, F2A, T18A and T46A) and nonyl protocatechuate (MIC = 3.9 mg/L). The clinical isolate H. capsulatum EH317 was able to form biofilms in vitro after 96 hours. After 96 hours, the biofilm ... / Mestre

Orientador: Luis Henrique Souza Guimarães / Co-orientador: José Roberto Ernandes / Banca: Arthur Henrique Cavalcante de Oliveira / Banca: Sílvia Isabel Palma Ferreira / Resumo: Com a crescente demanda nacional e internacional de bioetanol combustível a indústria alcooleira carece de mais estudos que possam beneficiar a produtividade sem que haja aumento exacerbado de investimentos. Para tanto, faz-se necessário conhecimento bioquímico e fisiológico dos microrganismos, bem como otimização do meio de cultivo e das condições fermentativas. A análise proteômica, proposta neste trabalho, é uma ferramenta chave na elucidação das alterações sofridas pelo microrganismo quando exposto a adversidades como, por exemplo, dificuldade de aeração, baixa manutenção do pH e variações de teor de sacarose no mosto e no melaço de acordo com cada safra, casos recorrentes nos processos fermentativos industriais. Sendo assim, foi objetivo deste trabalho investigar as alterações bioquímicas sofridas por Saccharomyces cerevisiae linhagem CAT-1 cultivada em 30% (very high gravity fermentation) e 14% (high gravity fermentation) de concentração de sacarose. As análises foram realizadas por eletroforese bidimensional, seguida por espectrometria de massa (MALDI-TOF/TOF). Os resultados demonstram a presença de 22 spots protéicos diferenciais entre as duas condições no que diz respeito às análises quantitativas, qualitativas e estatísticas, dentre os quais quatro foram seqüenciados e correspondem às proteínas GRX1p, Rtc3p, ENO2p e ADH1p. Adicionalmente, a atividade invertásica foi analisada para a compreensão da repressão catabólica, sendo que a atividade enzimática atingiu seu pico de produção no tempo de 10h em cultivos contendo 30% de sacarose (13,68 ± 2,26U.ml-1). As análises de rendimento etanólico e viabilidade celular demonstram que cultivos contendo 30% de sacarose apresentam resultados vantajosos frente aos cultivos contendo 14% de sacarose, uma vez que proporcionaram um rendimento alcoólico de 15,99% e 99,2% de células viáveis ao final de cada... / Abstract: Bacause of the national and international increasing demand for fuel ethanol, the alcohol industry needs more studies to benefit productivity without exacerbated increased investment. Therefore, it is necessary biochemical and physiological knowledge of the microorganisms and optimization of the medium and fermentation conditions. The proteomic analysis proposed in this work is a key tool in the elucidation of the changes suffered by the microorganism when exposed to adversity as, for example, aeration difficulty, low pH maintenance and sugar content of the mash and variations in molasses according to the harvest, recurrent situations in industrial fermentation processes. So, the aim of this study was to investigate the biochemical changes suffered by Saccharomyces cerevisiae CAT-1 grown by 30% (very high gravity fermentation) and 14% (high gravity fermentation) sucrose concentration. The analysis were performed by two-dimensional electrophoresis followed by mass spectrometry (MALDI-TOF/TOF). The results showed the presence of 22 differential protein spots between the two conditions with regard to quantitative analysis, qualitative and statistics analysis. Four of these spots were sequenced and correspond to GRX1p, Rtc3p, ENO2p and ADH1p. Additionally, the invertase activity was analyzed for understanding the catabolite repression and the enzyme activity reached its peak in 10 h in cultures containing 30% sucrose (13.68 ± 2,26U.ml-1). The ethanol yield and cell viability analysis showed that cultures containing 30% sucrose show advantageous results when compared to cultures containing 14% sucrose, once these cultures provided an ethanol yield of 15.99% and 99.2% viable cells at the end of each fermentation, very close to the theoretical values expected for an industrial process. Biomass and reducing sugars were also quantified. / Mestre

Orientador: Cleslei Fernando Zanelli / Coorientador: Sandro Roberto Valentini / Banca: Maria Célia Bertolini / Banca: Nilson Ivo Tonin Zanchin / Banca: Beatriz Amaral de Castilho / Banca: Gustavo Henrique Goldman / Resumo: O fator de início de tradução 5A (eIF5A) é altamente conservado em arqueas e em eucariotos e sofre uma modificação pós-traducional única e essencial chamada hipusinação. Este fator já foi relacionado com início de tradução, transporte nucleocitoplasmático, decaimento de mRNA e proliferação celular. Resultados recentes colocam essa proteína novamente no cenário da síntese proteica, mais especificamente na etapa de elongação da tradução. Estudos que relacionam eIF5A com proliferação celular e transição G1/S do ciclo celular e via secretória sugerem seu envolvimento com tradução específica de proteínas que atuam na progressão do ciclo celular. No intuito de avaliar a hipótese da participação de eIF5A na tradução de um subgrupo específico de mRNAs, envolvidos na via secretória e proliferação celular, este trabalho estudou inicialmente, o envolvimento de eIF5A na translocação de proteínas para o RE. Os resultados revelam que eIF5A não atua na via pós-traducional, mas sugere que desempenhe um papel na translocação pela via co-traducional. A análise proteômica realizada com um mutante de Dys1, que apresenta redução de eIF5A ativa, revelou diversas proteínas diferencialmente presentes, as quais participam dos processos de biogênese de ribossomo e regulação da tradução, ciclo celular, organização de membrana e via secretória. A proteína Asc1 foi selecionada para análises adicionais por ser uma proteína amplamente envolvida no controle traducional, por diversos mecanismos. Foram realizados ensaios de interação genética entre Asc1, Dys1 e eIF5A, e os resultados obtidos sugerem que essas proteínas participam, conjuntamente, da regulação do processo de tradução por afetar a tradução de grupos de... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The translation initiation factor 5A (eIF5A) is highly conserved in archaea and eukaryotes and undergoes an unique and essential posttranslational modification named hypusination. This factor has been associated with translation initiation, nucleocytoplasmic transport, mRNA decay and cell proliferation. Recent results place this protein back in the protein synthesis scenario, acting specifically at the elongation step of translation. Studies that correlate eIF5A with cell proliferation, cell cycle and the secretory pathway suggest its involvement in the translation of specific mRNAs that act on cell cycle progression. In order to evaluate this hypothesis, this study has investigated the involvement of eIF5A in protein translocation into the ER. The results have shown that eIF5A does not act in the post-translational pathway, but suggest that it plays a role in protein translocation via the co-translational pathway. The proteomic analysis performed with a mutant of Dys1, which shows a reduction of active eIF5A, revealed many proteins differentially present, that participate in the process of ribosome biogenesis and regulation of translation, cell cycle, organization of membrane and secretory pathway. The protein Asc1 was chosen for futher analysis due to its involvemet in several mechanisms at translational control. We performed genetic interaction assays with Asc1, Dys1 and eIF5A, and the results suggest that these proteins coordinately... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Fasciola hepatica é o parasito causador da fasciolose, doença transmitida através dos alimentos, que afeta a produção pecuária e a saúde humana. Embora a doença seja tratada com anti-helmínticos, as possibilidades de reinfecção e o desenvolvimento de resistência ao triclabendazol exigem novas estratégias de controle. Os produtos de excreção/secreção liberados pelo parasito durante a infecção auxiliam a sobrevivência do parasito, protegendo-o das respostas do hospedeiro, permitindo sua sobrevivência durante um longo período no hospedeiro vertebrado e a finalização do ciclo larval no hospedeiro intermediário. Este trabalho teve como objetivo gerar uma análise proteômica dos estágios intra-mamífero, adulto e NEJ (juvenil recentemente desencistado), de F. hepatica. Até o momento, os dados gerados representam o maior número de proteínas identificadas para este parasito. A classificação funcional revelou a presença de proteínas envolvidas em diferentes processos biológicos, muitos dos quais representam achados originais para este organismo. Além disso, os padrões de infecção dos parasitos são frequentemente ligados ao comportamento do hospedeiro intermediário, o qual pode desempenhar um papel na distribuição e acumulação dos parasitos. Os dois proteomas analisados neste trabalho possuem diferenças em abundância de proteínas individuais e entre as categorias funcionais. Estas diferenças podem ser causadas pelas características do ciclo biológico do parasito em cada hospedeiro (duração do ciclo de vida, quantidade de cercárias geradas, durabilidade das metacercárias, competição com outros parasitos), aspectos biológicos (como idade ou espécie) ou variações ambientais (temperatura, umidade, estação). A compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes à interação com os hospedeiros intermediário e definitivo pode fornecer dados que auxiliem a busca de novos alvos no diagnóstico e controle da fasciolose. / Fasciola hepatica is the agent of fasciolosis, a foodborne zoonosis that affects livestock production and human health. Although flukicidal drugs are available, re-infection and expanding resistance to triclabendazole demand new control strategies. Parasite compounds released during infection, known as excretory/secretory products, mediate parasite survival within the host. ESP are thought to protect parasites from host responses, allowing them to survive for a long period in the vertebrate host and complete their larval cycle in the intermediate host. This work provides in-depth proteomic analysis of F. hepatica intra-mammalian stages, adult and NEJ (newly existed juvenile), and represents the largest number of proteins identified to date for this parasite. Functional classification revealed the presence of proteins involved in different biological processes, many of which represent original findings for this organism and are can be vital for parasite survival within the host. In addition, infection patterns of parasites are often tied to host behavior, and intermediate host behavior can play a role in shaping the distribution and accumulation of parasites. The two proteomes analyzed here have differences in protein abundance, categories and individual proteins. The differences found here could be due to differences in the biological cycle of the parasite in the host (as duration of the life cycle, amount of cercariae generated, durability of metacercariae, competition with other parasites), biological aspects (as age or species) or environmental variabilities (as temperature, humidity, season). Understanding the molecular mechanisms underlying the complex interaction with the intermediate and definitive host could provide relevant clues, aiding the search for novel targets in diagnosis and control of fasciolosis.

Acidentes com animais venenosos constituem um problema de saúde pública negligenciado em todo o mundo. Estimativas indicam que, considerando-se apenas acidentes com serpentes venenosas, ocorram mundialmente cerca de 2,5 milhões de casos, causando 85.000 óbitos anuais. O desenvolvimento do quadro patológico dos envenenamentos é o resultado conjunto de potentes atividades biológicas exercidas, principalmente, por proteínas e peptídeos que compõem os venenos animais. A proteômica aplicada à caracterização de componentes de venenos animais, denominada venômica, é uma metodologia essencial na identificação não apenas dos componentes tóxicos, mas também valiosa na investigação molecular dos mecanismos patológicos dos envenenamentos. Através de metodologias proteômicas, descrevemos a caracterização protéica dos venenos animais das serpentes Bothrops jararaca e Bothrops lanceolatus e da lagarta Lonomia obliqua. Ainda, avaliamos através da proteômica de tecido experimentalmente envenenado as ações tóxicas de um componente isolado do veneno de Bothrops jararaca. Através de análise comparativa e semi-quantitativa da composição protéica dos venenos de B. jararaca e B. lanceolatus, descrevemos uma diferença qualitativa na distribuição dos componentes tóxicos. Enfatizando o grupo protéico majoritário, metaloproteases (SVMP), descrevemos diferentes abundâncias relativas entre os subtipos destas enzimas. Esta diferença explicaria as repercussões clínicas opostas durante o envenenamento humano, sendo um veneno hemorrágico e o outro prótrombótico. Componentes tóxicos capazes de gerar um quadro hemorrágico também foram avaliados através da análise proteômica das secreções tóxicas de L. obliqua. O estudo comparativo entre hemolinfa e extrato de espículas demonstrou que, diferentemente dos venenos botrópicos, as secreções tóxicas são compostas majoritariamente de inibidores de proteases, predominantemente serpinas. Além disso, descrevemos pela primeira vez a presença de novos componentes potencialmente tóxicos, como metaloproteases. Por fim, a proteômica de tecidos foi aplicada à investigação dos efeitos locais da injeção da metaloprotease do veneno de B. jararaca, jararagina. O efeito direto da ação da metaloprotease foi observado através da identificação de proteínas presentes em maior ou menor abundância, denotando infiltração ou degradação, respectivamente. Hemorragia, edema e estresse oxidativo foram evidenciados por pronunciado aumento em proteínas envolvidas nesses processos, mas, acima de tudo, identificamos degradação de proteínas relacionadas à manutenção da integridade da matriz extracelular e estabilização de coágulos, sugerindo novos mecanismos relacionados à atividade tóxica a serem investigados. De uma maneira geral, o presente trabalho descreve componentes tóxicos de venenos animais causadores de síndromes hemorrágicas e gera novas hipóteses em relação a mecanismos moleculares envolvidos no desenvolvimento da patofisiologia dos envenenamentos. / Accidents with venomous animals are a neglected health issue worldwide. Global estimates points to the occurrence of 2,500,000 envenomation cases, causing 85,000 deaths per year. The pathological envenomation condition is a result of strong biological activities caused mainly by the action of venom's proteins and peptides components. Proteomics applied to the characterization of animal venom active principles, so called venomics, is an essential tool to the identification of toxic molecules as well as to help understanding the molecular mechanisms underlying pathological envenomation conditions. Through a proteomic methodology, here we describe the characterization of venoms from the snakes Bothrops jararaca and Bothrops lanceolatus and the caterpillar Lonomia obliqua. Moreover, from a tissue proteomic perspective we were able to evaluate the toxic effects of a B. jararaca venom component upon experimentally envenomed skin. Using a comparative semi-quantitative proteomic analysis, we described a qualitative difference in toxic components distribution between B. jararaca and B. lanceolatus venoms. Focusing on snake venom metaloproteases (SVMPs) distribution, we observed different relative abundance of these enzymes subgroups. Those differences could explain the opposite clinical envenomation characteristics, since one venom is hemorrhagic and the other induces a prothrombotic profile. Pro-hemorrhagic venom toxins were also characterized through the proteome of L. obliqua venomous secretions. Hemolymph and bristle extract were analyzed showing that, different from bothropic venoms, the toxic secretions composition are mainly protease inhibitors, especially serpins. Moreover, we were able to demonstrate for the first time the presence of new putative toxins, such as metalloproteases. Finally, we applied tissue proteomics to the investigation of local snakebite pathology by jararhagin, a metalloprotease from B. jararaca venom. The metalloprotease direct effect was observed through the increase or decrease in protein identification, indicating infiltration or degradation respectively. Hemorrhage, edema and oxidative stress were characterized by enhance in correlated proteins but, most of all, we identified degradation in proteins important to extracellular matrix integrity and clot stabilization, indicating novel mechanism of toxicity to be further evaluated. In a general perspective, the present work describes toxic components from venomous animals that cause hemorrhagic syndromes and generates new testable hypothesis of the mechanisms of action involved in the development of envenomation pathophysiology.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2015. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2015-04-06T16:31:05Z No. of bitstreams: 1 2015_LauraMariaBarbosaGonçalves.pdf: 3250806 bytes, checksum: 090e9b400e068bd5c145dc1ddc1e6f71 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2015-04-29T18:09:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_LauraMariaBarbosaGonçalves.pdf: 3250806 bytes, checksum: 090e9b400e068bd5c145dc1ddc1e6f71 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-29T18:09:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_LauraMariaBarbosaGonçalves.pdf: 3250806 bytes, checksum: 090e9b400e068bd5c145dc1ddc1e6f71 (MD5) / Paracoccidioides spp. é um fungo termodimórfico, agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM). Durante o processo de infecção Paracoccidioides spp. encontra ambientes com diferentes disponibilidades de micronutrientes essenciais como cobre, por exemplo. A obtenção de micronutrientes no hospedeiro é mecanismo crucial de estratégia adaptativa deste patógeno. Neste sentido, a identificação de proteínas relacionadas com captação/homeostase de metais traços, durante a infecção é importante para se obter um melhor entendimento dos mecanismos que compõem a resposta adaptativa do fungo. No presente estudo a técnica de eletroforese bidimensional (2-DE) e Nano-ESI-UPLC-MSE foi utilizada como ferramenta proteômica a fim de investigar o perfil de expressão de proteínas da forma de levedura de P. lutzii após 24 e 48h de privação de cobre. Foram identificadas 68 proteínas/isoformas por eletroforese 2-DE, sendo 42 com expressão aumentada e 26 com expressão diminuída em condições de depleção de cobre. Através do Nano-ESI-UPLC-MSE um total de 366 proteínas foram identificadas, sendo 232 induzidas e 134 reprimidas. As proteínas de P. lutzii que se apresentaram diferencialmente reguladas estão envolvidas em processos celulares que incluem metabolismo, energia, síntese de proteínas, defesa e virulência. As proteínas envolvidas no metabolismo de aminoácidos e que apresentaram expressão aumentada, são aquelas relacionadas à degradação de aminoácidos. Estas proteínas provavelmente foram induzidas para proporcionar precursores ao ciclo do ácido tricarboxílico (TCA). O aumento da expressão de enzimas da via glicolítica também foi observado. Isto provavelmente ocorreu como forma de gerar ATP e intermediários metabólicos necessários para a manutenção do fungo sob condições de privação de cobre. Os dados gerados evidenciaram ainda uma indução em enzimas da via glicolítica, ciclo do TCA, via das pentoses fosfato, ciclo do metilcitrato e metabolismo dos lipídeos. Em condições de privação de cobre o metabolismo aeróbio é favorecido, o que provavelmente justifica o aumento da expressão de enzimas destas vias. Em conclusão, os dados do presente estudo indicam que a remodelação metabólica observada em condições de privação de cobre possivelmente é um mecanismo de sobrevivência do patógeno no ambiente hostil do hospedeiro. / Paracoccidioides spp. is a termodimorphic fungus, etiological agent of paracoccidioidomycosis (PCM). During the infection process, Paracoccidioides spp. faces environments with different availability of essential micronutrients such as copper, for example. The micronutrients obtainment in the host is a crucial mechanism of adaptive strategy for this host. Hence, the identification of proteins related to uptake/homeostasis of trace metals during infection is important for a better understanding of the mechanisms that makeup the fungus adaptive response. In the present study, the bidimensional electrophoresis (2-DE) and Nano-ESI-UPLC-MSE were used as proteomic tools in order to investigate the protein expression profile of P. lutzii in yeast form after 24 and 48h of copper deprivation. 68 proteins/isoforms were identified by 2-D analysis, which 42 were upregulated and 26 down regulated in copper depletion conditions. Through Nano-ESI-UPLC-MSE technique, 366 proteins were identified, 232 of them were induced and 134 repressed. P. lutzii proteins differentially regulated are involved in cellular processes including metabolism, energy, protein synthesis, defense and virulence. Proteins involved in the amino acid metabolism and showed an increased expression are related to amino acid degradation. These proteins were probably induced to provide precursors for tricarboxylic acid cycle (TAC). The increased expression of glycolytic pathway enzymes was observed. This probably happened as a way to generate ATP and metabolic intermediaries necessary for up keeping the fungus under copper deprivation conditions. The generated data pointed the induction of glycolytic pathway, tricarboxylic acid pathway, pentose phosphate pathway, methyl citrate pathway and lipid metabolism enzymes. The copper deprivation conditions favors the aerobic metabolism, which probably explains the increased expression of enzymes from the cited pathways. In conclusion, the presenting data indicate that the metabolic remodeling observed under copper deprivation conditions is possibly a survival mechanism of the pathogen under the host hostile environment.