Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Exatas, Departamento de Ciência da Computação, 2014. / Submitted by Larissa Stefane Vieira Rodrigues (larissarodrigues@bce.unb.br) on 2014-12-02T16:33:58Z No. of bitstreams: 1 2014_WaldeyrMendesCordeiroDaSilva.pdf: 7282235 bytes, checksum: 1cac8233b834aef263b3415e216ce1b1 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2014-12-02T17:40:26Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_WaldeyrMendesCordeiroDaSilva.pdf: 7282235 bytes, checksum: 1cac8233b834aef263b3415e216ce1b1 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-12-02T17:40:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_WaldeyrMendesCordeiroDaSilva.pdf: 7282235 bytes, checksum: 1cac8233b834aef263b3415e216ce1b1 (MD5) / Os fungos produzem uma variedade de metabólitos com aplicações na indústria e na medicina, ao mesmo tempo que podem ser patógenos humanos. O Paracoccidioides lutzii é um fungo dimórfico causador da paracoccidioidomicose (PCM), uma micose sistêmica autóctone da América Latina, onde cerca de 10 milhões de pessoas estão infectadas, inclusive no Brasil, o qual contribui com cerca de 80% dos casos, afetando principalmente indivíduos em áreas rurais. Neste trabalho, foi criado um método para identificar e organizar vias de metabolismo em fungos, com ênfase no metabolismo secundário. Para validar o método, foi realizado um estudo de caso para o fungo P. lutzii, cujos resultados obtidos identificaram 2.087 reações enzimáticas, 1.437 enzimas, 1.464 compostos e 335 vias metabólicas. As vias de metabolismo secundário representaram cerca de 4,5% do total de vias identificadas no P. lutzii. O método criado pode ser aplicado à reconstrução in silico de redes metabólicas de outros fungos. ________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Fungi produce various metabolites with applications in industry and medicine, furthermore, can be human pathogens. Paracoccidioides lutzii is a dimorphic fungus that causes paracoccidioidomycosis (PCM), a systemic mycosis in Latin America affecting approximately 10 million people, including Brazil, which contributes about 80% of cases, usually affecting individuals in rural areas. In this work, we create a method to identify and organize metabolic pathways in fungi, with emphasis on secondary metabolism. To validate this method, a case study was performed for the fungus P. lutzii. The results identified 2,087 enzymatic reactions, 1,437 enzymes, 1,464 compounds and 335 metabolic pathways. The secondary metabolism pathways represented around 4.5% of pathways identified in the P. lutzii. The method created can be applied to the in silico reconstruction of metabolic networks of other fungi.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2015. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2015-04-06T16:31:05Z No. of bitstreams: 1 2015_LauraMariaBarbosaGonçalves.pdf: 3250806 bytes, checksum: 090e9b400e068bd5c145dc1ddc1e6f71 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2015-04-29T18:09:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_LauraMariaBarbosaGonçalves.pdf: 3250806 bytes, checksum: 090e9b400e068bd5c145dc1ddc1e6f71 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-29T18:09:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_LauraMariaBarbosaGonçalves.pdf: 3250806 bytes, checksum: 090e9b400e068bd5c145dc1ddc1e6f71 (MD5) / Paracoccidioides spp. é um fungo termodimórfico, agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM). Durante o processo de infecção Paracoccidioides spp. encontra ambientes com diferentes disponibilidades de micronutrientes essenciais como cobre, por exemplo. A obtenção de micronutrientes no hospedeiro é mecanismo crucial de estratégia adaptativa deste patógeno. Neste sentido, a identificação de proteínas relacionadas com captação/homeostase de metais traços, durante a infecção é importante para se obter um melhor entendimento dos mecanismos que compõem a resposta adaptativa do fungo. No presente estudo a técnica de eletroforese bidimensional (2-DE) e Nano-ESI-UPLC-MSE foi utilizada como ferramenta proteômica a fim de investigar o perfil de expressão de proteínas da forma de levedura de P. lutzii após 24 e 48h de privação de cobre. Foram identificadas 68 proteínas/isoformas por eletroforese 2-DE, sendo 42 com expressão aumentada e 26 com expressão diminuída em condições de depleção de cobre. Através do Nano-ESI-UPLC-MSE um total de 366 proteínas foram identificadas, sendo 232 induzidas e 134 reprimidas. As proteínas de P. lutzii que se apresentaram diferencialmente reguladas estão envolvidas em processos celulares que incluem metabolismo, energia, síntese de proteínas, defesa e virulência. As proteínas envolvidas no metabolismo de aminoácidos e que apresentaram expressão aumentada, são aquelas relacionadas à degradação de aminoácidos. Estas proteínas provavelmente foram induzidas para proporcionar precursores ao ciclo do ácido tricarboxílico (TCA). O aumento da expressão de enzimas da via glicolítica também foi observado. Isto provavelmente ocorreu como forma de gerar ATP e intermediários metabólicos necessários para a manutenção do fungo sob condições de privação de cobre. Os dados gerados evidenciaram ainda uma indução em enzimas da via glicolítica, ciclo do TCA, via das pentoses fosfato, ciclo do metilcitrato e metabolismo dos lipídeos. Em condições de privação de cobre o metabolismo aeróbio é favorecido, o que provavelmente justifica o aumento da expressão de enzimas destas vias. Em conclusão, os dados do presente estudo indicam que a remodelação metabólica observada em condições de privação de cobre possivelmente é um mecanismo de sobrevivência do patógeno no ambiente hostil do hospedeiro. / Paracoccidioides spp. is a termodimorphic fungus, etiological agent of paracoccidioidomycosis (PCM). During the infection process, Paracoccidioides spp. faces environments with different availability of essential micronutrients such as copper, for example. The micronutrients obtainment in the host is a crucial mechanism of adaptive strategy for this host. Hence, the identification of proteins related to uptake/homeostasis of trace metals during infection is important for a better understanding of the mechanisms that makeup the fungus adaptive response. In the present study, the bidimensional electrophoresis (2-DE) and Nano-ESI-UPLC-MSE were used as proteomic tools in order to investigate the protein expression profile of P. lutzii in yeast form after 24 and 48h of copper deprivation. 68 proteins/isoforms were identified by 2-D analysis, which 42 were upregulated and 26 down regulated in copper depletion conditions. Through Nano-ESI-UPLC-MSE technique, 366 proteins were identified, 232 of them were induced and 134 repressed. P. lutzii proteins differentially regulated are involved in cellular processes including metabolism, energy, protein synthesis, defense and virulence. Proteins involved in the amino acid metabolism and showed an increased expression are related to amino acid degradation. These proteins were probably induced to provide precursors for tricarboxylic acid cycle (TAC). The increased expression of glycolytic pathway enzymes was observed. This probably happened as a way to generate ATP and metabolic intermediaries necessary for up keeping the fungus under copper deprivation conditions. The generated data pointed the induction of glycolytic pathway, tricarboxylic acid pathway, pentose phosphate pathway, methyl citrate pathway and lipid metabolism enzymes. The copper deprivation conditions favors the aerobic metabolism, which probably explains the increased expression of enzymes from the cited pathways. In conclusion, the presenting data indicate that the metabolic remodeling observed under copper deprivation conditions is possibly a survival mechanism of the pathogen under the host hostile environment.

A paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose granulomatosa sistêmica, que tem como agentes etiológicos fungos dimórficos do gênero Paracoccidioides. A produção de melanina por vários fungos interfere no mecanismo da patogênese, como ocorre na paracoccidioidomicose. O presente projeto visou avaliar a produção de melanina pelos isolados de P. lutzii, e seus efeitos in vitro, avaliando o processo de fagocitose. Os resultados obtidos durante este trabalho mostraram que os isolados de P. lutzii (Pb01, Pb66, ED01, Pb1578 e Pb8334) melanizam de formas diferenciadas entre eles e quando comparados com isolados de P. brasiliensis (Pb60855, Pb18 e Pbcão). Ensaios de fagocitose, com os isolados Pb18, Pb60855 e Pb01, mostraram que a melanina reduziu a porcentagem de fagocitose das leveduras não tratadas de Pb18 e Pb60855, e o contrário aconteceu com Pb01. As análises dos perfis proteicos e enzimáticos dos isolados Pb18, Pb60855 e Pb01, permitiram determinar que o isolado Pb01 produz uma menor quantidade de proteínas que Pb18 e Pb60855 nas condições ensaiadas. / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a granulomatous systemic mycosis, whose etiological agents are dimorphic fungi of the genus Paracoccidioides. Melanin production by various fungi interferes in the mechanism of pathogenesis, as in paracoccidioidomycosis. Thus, this project aimed to evaluate the production of melanin by isolates of P. lutzii and its in vitro effects by assessing the process of phagocytosis. The results obtained during this work showed that the isolates of P. lutzii (Pb01, Pb66, ED01, Pb1578 and Pb8334) produce melanin in different ways between them and also when compared with isolates of P. brasiliensis (Pb60855, Pb18 and Pbcão). Phagocytosis assays, with Pb18, Pb60855 and Pb01, showed that melanin reduced the percentage of phagocytosis of untreated yeast of Pb60855 and Pb18 and the opposite happened with Pb01. The analysis of the protein and enzymatic profiles, of the isolates Pb18, Pb60855 and Pb01, enabled to determine that the isolated Pb01 produces a smaller amount of proteins compared with Pb18 and Pb60855 in the tested conditions.

A paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose granulomatosa sistêmica, que tem como agentes etiológicos fungos dimórficos do gênero Paracoccidioides. A produção de melanina por vários fungos interfere no mecanismo da patogênese, como ocorre na paracoccidioidomicose. O presente projeto visou avaliar a produção de melanina pelos isolados de P. lutzii, e seus efeitos in vitro, avaliando o processo de fagocitose. Os resultados obtidos durante este trabalho mostraram que os isolados de P. lutzii (Pb01, Pb66, ED01, Pb1578 e Pb8334) melanizam de formas diferenciadas entre eles e quando comparados com isolados de P. brasiliensis (Pb60855, Pb18 e Pbcão). Ensaios de fagocitose, com os isolados Pb18, Pb60855 e Pb01, mostraram que a melanina reduziu a porcentagem de fagocitose das leveduras não tratadas de Pb18 e Pb60855, e o contrário aconteceu com Pb01. As análises dos perfis proteicos e enzimáticos dos isolados Pb18, Pb60855 e Pb01, permitiram determinar que o isolado Pb01 produz uma menor quantidade de proteínas que Pb18 e Pb60855 nas condições ensaiadas. / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a granulomatous systemic mycosis, whose etiological agents are dimorphic fungi of the genus Paracoccidioides. Melanin production by various fungi interferes in the mechanism of pathogenesis, as in paracoccidioidomycosis. Thus, this project aimed to evaluate the production of melanin by isolates of P. lutzii and its in vitro effects by assessing the process of phagocytosis. The results obtained during this work showed that the isolates of P. lutzii (Pb01, Pb66, ED01, Pb1578 and Pb8334) produce melanin in different ways between them and also when compared with isolates of P. brasiliensis (Pb60855, Pb18 and Pbcão). Phagocytosis assays, with Pb18, Pb60855 and Pb01, showed that melanin reduced the percentage of phagocytosis of untreated yeast of Pb60855 and Pb18 and the opposite happened with Pb01. The analysis of the protein and enzymatic profiles, of the isolates Pb18, Pb60855 and Pb01, enabled to determine that the isolated Pb01 produces a smaller amount of proteins compared with Pb18 and Pb60855 in the tested conditions.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2015. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2015-11-03T14:18:27Z No. of bitstreams: 1 2015_PatriciaAlvesSilva.pdf: 1963450 bytes, checksum: 252f173b1b9d8c60126eea7dac7dc38c (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2015-12-30T11:53:23Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_PatriciaAlvesSilva.pdf: 1963450 bytes, checksum: 252f173b1b9d8c60126eea7dac7dc38c (MD5) / Made available in DSpace on 2015-12-30T11:53:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_PatriciaAlvesSilva.pdf: 1963450 bytes, checksum: 252f173b1b9d8c60126eea7dac7dc38c (MD5) / O crescente número de casos de infecções fúngicas sistêmicas tem sido motivo de grande preocupação em âmbito mundial. As opções terapêuticas disponíveis atualmente são limitadas, dividida em quatro grupos: os Polienos (anfotericina B), Fluoropirimidinas (flucitosina), Azólicos (cetoconazol, fluconazol, itraconazol, posaconazol e voriconazol) e Equinocandinas (caspofungina, micafungina e anidulafungina. Além disso, vem sendo observado há algum tempo o surgimento de resistência aos agentes antifúngicos como Anfotericina B e derivados azólicos, surgindo à necessidade do desenvolvimento de novos antifúngicos. Atualmente, a pesquisa e o desenvolvimento de drogas consomem muito tempo e apresentam altos riscos. O planejamento baseado na estrutura e no mecanismo de ação tem se mostrado uma estratégia eficiente e menos dispendiosa para desenvolvimento de novos fármacos. Neste contexto, em resultados preliminares obtidos pelo grupo, por meio de análise in silico, foram identificados quatro possíveis genes-alvos, que estão presentes em sete fungos patogênicos humanos relevantes e ausentes no genoma humano. Entre estes genes-alvo está o kre2 ou Mnt1, que codifica uma proteína de aproximadamente 49 kDa, a α - 1,2 manosiltransferase. Esta é uma proteína importante para viabilidade celular e virulência do patógeno no interior do hospedeiro. Além da seleção dos dez genes candidatos, nosso grupo identificou por métodos in silico de modelagem molecular e screening virtual, 17 compostos de baixa massa molecular (small molecules) que potencialmente têm capacidade de inibir a enzima α - 1,2- manosiltransferase (KRE2) de P. lutzii. Das 17 moléculas selecionadas, uma se destacou nos testes de susceptibilidade contra fungos de importância médica e foi denominada de molécula 3. Com testes de inibição in vitro promissores surgiu-se a necessidade de avaliar se de fato esta molécula é capaz de inibir especificamente o alvo molecular KRE2 de P. lutzii. Os resultados alcançados neste trabalho apontam para o sucesso na obtenção desta proteína no sistema de expressão heteróloga em Pichia pastoris. Uma vez que este sistema realiza glicosilação de proteínas, possibilita o dobramento correto da enzima alvo, e fornece as condições necessárias para continuidade dos experimentos. Quantidades razoáveis da proteína foram produzidas heterologamente, o que possibilitou a realização dos ensaios para determinação dos parâmetros cinéticos e testes de inibição enzimática usando a molécula 3 contra o alvo KRE2 de P. lutzii. Utilizando substrato marcado com [14C] nas reações, foi determinado o Km aparente de KRE2 de P. lutzii que atingiu 3,7 pM, demonstrando alta afinidade da enzima pelo substrato em relação aos dados descritos na literatura. De forma semelhante, os testes de inibição enzimática utilizaram o isótopo radioativo e a molécula 3 foi usada contra as enzimas KRE2 de P. lutzii e MNT1 de Cândida albicans. Os resultados obtidos para KRE2 de P. lutzii demonstram que na presença da molécula inibidora, foi observada uma redução da atividade enzimática de até 60%. No entanto, a redução da atividade enzimática de MNT1 de Cândida albicans ficou em 20%. Faz-se necessário destacar que a molécula 3 apresenta problemas de solubilidade e que novos ensaios de susceptibilidade contra espécies de Cândida spp. utilizando Pluronic F-127 associados a molécula 3 foram realizados pelo nosso grupo e os resultados foram promissores. Desta forma, o melhoramento da solubilidade da molécula 3 representa um avanço nos testes de inibição in vitro, o que aumenta a expectativa de um MIC90 melhor para os outros fungos de importância médica. Os resultados apresentados neste trabalho representam um avanço na validação da molécula 3 como inibidor de KRE2 de P. lutzii, o que poderá contribuir com dados relevantes para o desenvolvimento de novas drogas para o tratamento de micoses de relevância mundial. / The occurrence of growth of systemic infections has been the cause of great concern worldwide. The therapeutic options currently available are limited, and are divided into four groups, Polyenes (amphotericin B), fluoropyrimidines (flucitosine), Azoles (ketoconazole, fluconazole, itraconazole, posaconazole and voriconazole) and Echinocandins (caspofungin, micafungin and anidulafungin. Furthermore, this is observed of resistance to antifungal agents such as amphotericin B and azoles, leading to the need of development of new antifungal agents. Currently, the research and drug development, consume much time and it have high risks. The planning based on structure and mechanism of action has proven to be an efficient and less expensive strategy for development of new drugs. In this context, in preliminar results obtained by the group using in silico analysis identified four possible target genes which are present in seven relevant human pathogenic fungi and absent in the human genome. Among these target genes Kre2 or Mnt1 is responsible to encode a protein of approximately 49 kDa, the α - 1,2 mannosyltransferase. This is an important protein for cell viability and virulence of the pathogen within the host. Besides the selection of ten candidate genes, our group identified using in silico methods of molecular modeling and virtual screening 17 compounds of low molecular weight (small molecules) that potentially have the ability to inhibit the enzyme α - 1,2 mannosyltransferase (KRE2) of P. lutzii. Of the 17 molecules selected, one highlighted out in susceptibility tests against fungi of medical importance and was called molecule 3. With in vitro inhibition tests promising, the need to evaluate if in fact this molecule is able to specifically inhibit the molecular target KRE2 of P. lutzii emerged. The results obtained in this study point to the success in getting this protein in heterologous expression system in Pichia pastoris. Once this system performs glycosylation of proteins, it allows the correct folding of the target enzyme, favoring the necessary conditions to continue the experiments. Reasonable amounts of protein were produced heterologously, allowing the tests to determine the kinetic parameters and enzyme inhibition tests using the molecule 3 against the target KRE2 P. lutzii. Using labeled substrate [14C] in the reactions, apparent Km of KRE2 of P. lutzii was determined, which reached 3.7 pM, demonstrating the high affinity of the enzyme for the substrate in comparison to data in the literature. Similarly, the enzymatic inhibition tests used the radioactive isotope and the molecule 3 was used against enzymes KRE2 of P. lutzii and MNT1 of Candida albicans. The results obtained for KRE2 of P. lutzii demonstrated that in the presence of the inhibitor molecule, was observed a reduction in the enzymatic activity by 60%. However, reduction of the enzymatic activity of MNT1 of Candida albicans was 20%. It is necessary to point out that the molecule 3 shows solubility issues, additional susceptibility testing against species of Candida spp. using Pluronic F-127 linked to molecule3 were carried out by our group with promising results. Thus, the improvement of the solubility of the molecule 3 represented an advance in vitro inhibition tests, which increases the expectation of better MIC90 for other fungi of medical importance. The results presented in this work represents an advancement in the validation of the molecule 3 as an inhibitor of KRE2 of P. lutzii, which may contribute to important data for the development of new drugs for the treatment of fungal infections of global relevance.

Submitted by Rui Rafael Durlacher (rui.durlacher@saolucas.edu.br) on 2018-04-13T20:38:11Z No. of bitstreams: 1 Tese-RUI RAFAEL DURLACHER - DINTER.pdf: 926965 bytes, checksum: 79fa32ffa8165d98f1c245255bbd4716 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Rimoli de Oliveira null (anapaula@foa.unesp.br) on 2018-04-16T11:58:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 durlacker_rr_dr_araca_int.pdf: 926965 bytes, checksum: 79fa32ffa8165d98f1c245255bbd4716 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-16T11:58:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 durlacker_rr_dr_araca_int.pdf: 926965 bytes, checksum: 79fa32ffa8165d98f1c245255bbd4716 (MD5) Previous issue date: 2017-10-17 / Introdução: a paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica endêmica cuja incidência vem aumentando de forma significativa na região norte do Brasil. Duas espécies, Paracoccidioides brasiliensis e Paracoccidioides lutzii podem causar a doença. A última aparenta ter maior importância em Rondônia, estado com as maiores taxas de incidência e mortalidade por PCM do Brasil. Objetivo: descrever as características clínicas, epidemiológicas e laboratoriais de pacientes portadores de PCM e estabelecer correlação com lesões orais. Material e Métodos: estudo retrospectivo de pacientes atendidos no Centro de Referência em Medicina Tropical de Rondônia durante o período de janeiro de 2013 a dezembro de 2016. Resultados: foram diagnosticados 107 pacientes com média de idade de 53,8 anos, sendo 100 homens e 07 mulheres. Observou-se que 77% mantinham contato ou relataram experiência anterior com lavoura. A maioria (98,1%) apresentou a forma crônica da doença. O diagnóstico foi confirmado em 74,7%, e baseado em achados clínicos e/ou epidemiológicos no restante. O diagnóstico sorológico não esteve disponível no período. O tempo médio entre o início dos sintomas e a realização do diagnóstico foi de 7,3 meses. Os principais locais acometidos foram os pulmões (95,3%), seguidos da cavidade oral (55,1%) e dos gânglios (28%). Na cavidade oral, a faringe/laringe predominou (33%), seguida da mucosa jugal (17,8%) e palato mole (13,1%). Houve 58,3% de associação com tabagismo. O medicamento mais utilizado para o tratamento foi o Itraconazol, fornecido pelo governo. Conclusão: não houve diferença entre os grupos com ou sem comprometimento da cavidade oral. A presença de lesões orais em mais da metade dos casos, com diagnóstico mais acessível, sugere que se pode diminuir o tempo entre o início dos sintomas e o início do tratamento, e contribuir para uma menor proporção de sequelas. Sugere-se ainda que o P. lutzii pode manifestar doença com características clínicas, epidemiológicas e laboratoriais semelhantes ao P. brasiliensis, exceto pela menor proporção de formas agudas de PCM. Mas novos estudos são necessários. / Background: Paracoccidioidomycosis (PCM) is an endemic systemic mycosis whose incidence has been increasing significantly in the northern region of Brazil. Two species, Paracoccidioides brasiliensis and Paracoccidioides lutzii can cause the disease. The latter appears to be more important in Rondônia, the state with the highest incidence and mortality rates by PCM in Brazil. O bjective : T o describe the clinical, epidemiological and laboratory characteristics of PCM patients and to establish correlation with oral lesions . Material and Methods: a retrospective study of patients attended at the Reference Center in Tropical Medicine of Rondônia during the period from January 2013 to December 2016. Results: A total of 107 patients were diagnosed, with mean age of 53.8 years, 100 men and 7 women. It was observed that 77% maintained contact or reported previous experience with rural areas . The majority (98.1%) presented the chronic form of the disease. The diagnosis was confirmed by the finding of the fungus in clinical specimen s in 74.7%, and based on clinical and/or epidemiological findings in the rest. The serological diagnosis was not available in the period. The mean time between onset of symptoms and the diagnosis was 7.3 months. The main sites were the lungs (95.3%), follo wed by the oral cavity (55.1%) and the ganglia (28%). In the oral cavity, the pharynx/larynx predominated (33%), followed by jugal mucosa (17.8%) and soft palate (13.1%). There was an 58,3 % association with smoking . The most commonly used drug was Itr acona zole in 93.5% of patients. Conclu sion: There was no difference between groups with or without oral cavity involvement. The presence of oral lesions in more than half of the cases, with a more accessible diagnosis, suggests that the time between onset of sy mptoms and the beginning of treatment can be shortened and contribute to a lower proportion of sequelae. It is also suggested that P. lutzii can manifest disease with clinical, epidemiological and laboratory characteristics similar to P. brasiliensis , exce pt for the smaller proportion of acute forms of PCM. But new studies are needed.

Orientador: Rinaldo Poncio Mendes / Resumo: A paracoccidioidomicose (PCM) é uma doença sistêmica causada por fungos termodimórficos do complexo Paracoccidioides brasiliensis - P. brasiliensis e P. lutzii. Pacientes com PCM revelam comprometimento imune celular específico. Apesar do tratamento efetivo, os fungos quiescentes podem levar à recaída, geralmente tardia, cujo diagnóstico sorológico tem se mostrado pouco sensível. A sensibilidade do teste de imunodifusão é de cerca de 90% em pacientes com PCM não tratados, mas de apenas 45% em casos de recaída. Além disso, o soro de pacientes com PCM causada por P. lutzii, freqüente na região Centro-Oeste do Brasil, não reage com o antígeno clássico obtido do Pb B-339. No seguimento dos pacientes, continua a busca de um critério que dê maior segurança à decisão de se suspender o tratamento. Esses achados mostraram a necessidade de métodos alternativos de diagnóstico e seguimento, como os utilizados em proteômica, que constituiram o presente estudo. Assim, proteínas expressas no soro de pacientes com PCM em atividade - não tratada (causada por P. brasiliensis e por P. lutzii), com recaída da doença (causada por P. brasiliensis) e de controles saudáveis foram identificadas usando-se abordagem proteômica, realizada em quatro etapas - quantificação de proteínas, digestão de proteínas em solução, sequenciamento de peptídeos por espectrometria de massa e análise de dados para identificação de proteínas. Foram identificadas 29 proteínas plasmáticas à admissão, cuja comparação entre o... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Submitted by TATIANE FERNANDA SYLVESTRE null (thaty_sylvestre@hotmail.com) on 2018-03-09T14:15:45Z No. of bitstreams: 1 Doutorado versão final correções.pdf: 1948063 bytes, checksum: 67732e30851ac4f403a6e63c147faa2f (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Pizzani null (luciana@btu.unesp.br) on 2018-03-09T17:35:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 sylvestre_tf_dr_bot.pdf: 3415633 bytes, checksum: af28727bb056bb44e01fe82328f62eec (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-09T17:35:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 sylvestre_tf_dr_bot.pdf: 3415633 bytes, checksum: af28727bb056bb44e01fe82328f62eec (MD5) Previous issue date: 2018-02-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A paracoccidioidomicose (PCM) é uma doença sistêmica causada por fungos termodimórficos do complexo Paracoccidioides brasiliensis - P. brasiliensis e P. lutzii. Pacientes com PCM revelam comprometimento imune celular específico. Apesar do tratamento efetivo, os fungos quiescentes podem levar à recaída, geralmente tardia, cujo diagnóstico sorológico tem se mostrado pouco sensível. A sensibilidade do teste de imunodifusão é de cerca de 90% em pacientes com PCM não tratados, mas de apenas 45% em casos de recaída. Além disso, o soro de pacientes com PCM causada por P. lutzii, freqüente na região Centro-Oeste do Brasil, não reage com o antígeno clássico obtido do Pb B-339. No seguimento dos pacientes, continua a busca de um critério que dê maior segurança à decisão de se suspender o tratamento. Esses achados mostraram a necessidade de métodos alternativos de diagnóstico e seguimento, como os utilizados em proteômica, que constituiram o presente estudo. Assim, proteínas expressas no soro de pacientes com PCM em atividade - não tratada (causada por P. brasiliensis e por P. lutzii), com recaída da doença (causada por P. brasiliensis) e de controles saudáveis foram identificadas usando-se abordagem proteômica, realizada em quatro etapas - quantificação de proteínas, digestão de proteínas em solução, sequenciamento de peptídeos por espectrometria de massa e análise de dados para identificação de proteínas. Foram identificadas 29 proteínas plasmáticas à admissão, cuja comparação entre os grupos de pacientes sugeriu que a presença da immunoglobulin (Ig) alpha-2 chain C region e a ausência de Ig heavy chain V-III TIL indicariam infecção por P. lutzii e que a ausência da proteína complement factor B poderia ser um preditor de recaída. Na análise evolutiva das proteínas identificadas em pacientes com PCM por P. brasiliensis em tratamento, comparando-se aqueles que apresentaram com os que não revelaram recaída, 29 proteínas foram identificadas. As interações observadas entre as proteínas, usando transferrin e haptoglobin como a principal proteína de ligação, foram fortes com todas as demais. O acompanhamento desses pacientes sugere que a presença de cerulosplamin pode ser um marcador de recaída e que a de transferrin e a apolipoprotein A-II podem contribuir para a avaliação da cura e suspensão do tratamento, evitando que esta decisão seja muito precoce. A avaliação das proteínas selecionadas, identificadas por metodologia proteômica, deve ser realizada em um número maior de pacientes, para validar esses achados. / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic disease caused by thermodymorphic fungi of the Paracoccidioides brasiliensis complex - P. brasiliensis and P. lutzii. Patients with PCM reveal specific cellular immune impairment. Despite the effective treatment, quiescent fungi can lead to relapse, usually late, whose serological diagnosis has presented low sensitivity. The double agar gel immunodiffusion test shows a 90% sensitivity in untreated PCM patients, but it is much lower (45%) in cases of relapse. In addition, serum from patients with PCM caused by P. lutzii, frequent in the Midwest region of Brazil, do not react with the classical antigen obtained from Pb B-339. In the follow-up of the patients, persists the search of a criterium that gives a higher safety for treatment discontinuation. These findings showed the need for alternative methods for diagnosis and follow-up, such as those based on proteomics, which constituted the present study. Thus, serum expressed proteins from patients with active - untreated PCM (caused by P. brasiliensis and by P. lutzii), from relapsed PCM patients (caused by P. brasiliensis) and from healthy controls were identified using a proteomic approach, performed in four steps - protein quantification, protein digestion in solution, peptide sequencing by mass spectrometry and data analysis for protein identification. A total of 29 plasma proteins were identified at admission (before introduction of the treatment), and the comparison regarding groups suggested that the presence of the immunoglobulin (Ig) alpha-2 chain C region and the absence of heavy chain Ig V-III TIL are indicative of infection by P. lutzii and that the absence of the complement factor B protein may be a predictor of relapse. The evaluation of the proteins during the treatment follow-up of the PCM patients infected by P. brasiliensis, separated regarding the presence of relapse, identified 29 proteins. The interactions observed between the proteins, using transferrin and haptoglobin as the main binding protein, were strong with all the others. Patients’ follow-up suggests that cerulosplamin may be a marker of relapse and that transferrin and apolipoprotein A-II may contribute to the evaluation of cure and discontinuation of treatment, avoiding that this decision is too early. The study of the selected proteins in a higher number of patients should be carried out in order to validate these findings.

Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2018-06-29T18:20:13Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Luiz Paulo Araújo dos Santos - 2015.pdf: 1282200 bytes, checksum: ceda1b43513d7bf6756357d40f977117 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2018-07-03T15:03:29Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Luiz Paulo Araújo dos Santos - 2015.pdf: 1282200 bytes, checksum: ceda1b43513d7bf6756357d40f977117 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-03T15:03:29Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Luiz Paulo Araújo dos Santos - 2015.pdf: 1282200 bytes, checksum: ceda1b43513d7bf6756357d40f977117 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2015-01-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Pathogens can find different carbon sources in host niches generating propionyl-CoA, among them propionate. This compound is toxic to the organism if accumulated within the cell, and can be generated in the host tissue by the metabolism of amino acids isoleucine, valine and methionine, or by the metabolism of odd-chain fatty acids. Therefore, during infection, the propionyl-CoA metabolism to nontoxic nutrient and usable energetically is of great relevance. Nonetheless, there are no studies about the propionyl-CoA metabolization pathway in fungi of the genus Paracoccidioides, causer of paracoccidioidomycosis, a systemic mycosis of high incidence in Latin America. Thus, to characterize of which metabolic pathway this fungus utilizes to propionyl-CoA metabolization, it was made a search the genes coding to enzymes of methylcitrate cycle in genome of Paracoccidioides spp. and were identified genes coding to the three exclusive enzymes of this cycle, which are methylcitrate synthase, methylcitrate dehydrogenase and methylcitrate lyase. After analysis of growth and viability, which demonstrated that Paracoccidioides lutzii utilizes propionate as carbon source, it was made gene expression analysis of enzymes of methylcitrate cycle and was observed that are regulated in response to propionate. Additionally, the enzymatic activity of the MCS showed that this enzyme is active inside of fungal cells and also when is secreted, as well as its dual capacity of to act with a citrate synthase and metylcitrate synthase. Finally, the proteomic profile of P. lutzii in propionate showed enzymes induction of methylcitrate cycle, glyoxylate cycle, amino acid metabolism and gluconeogenesis, and the repression of glycolytic pathway, fermentation and fatty acid synthesis, which demonstrated of metabolic rearrangement to supply the cellular energetic demand, metabolizing propionate. In this sense, to understand the mechanism of propionyl-CoA metabolism in P. lutzii provides data for visualization of metabolic adaptation that this fungus makes use in different colonization of niches. / Micro-organismos patogênicos podem encontrar em nichos do hospedeiro diferentes fontes de carbono geradoras de propionil-CoA, dentre elas, o propionato. Este composto é tóxico para a célula se acumulado no seu interior, e pode ser gerado nos tecidos do hospedeiro pelo metabolismo dos aminoácidos isoleucina, valina e metionina, ou pelo metabolismo de ácidos graxos de cadeia ímpar. Portanto, durante a infecção, o metabolismo de propionil-CoA a um nutriente não tóxico e aproveitável energeticamente se faz de grande relevância. Contudo, não há estudos sobre a via de metabolização de propionil-CoA em fungo do gênero Paracoccidioides, causador da paracoccidioidomicose, uma micose sistêmica de alta incidência na América Latina. Sendo assim, para caracterização de qual via metabólica este organismo utiliza para metabolização de propionil-CoA, foi feita uma busca dos genes codificantes para enzimas do ciclo do metilcitrato no genoma de Paracoccidioides spp. e foram identificados genes codificantes para as três enzimas exclusivas desse ciclo, as quais são metilcitrato sintase, metilcitrato desidrogenase e metilcitrato liase. Após análise de crescimento e viabilidade, a qual demonstrou que Paracoccidioides lutzii utiliza propionato como fonte de carbono, foi feita a análise de expressão gênica das enzimas do ciclo do metilcitrato e observou-se que são reguladas em resposta ao propionato. Adicionalmente, a atividade enzimática da MCS demonstrou que essa enzima é ativa no interior da célula fúngica ou mesmo quando é secretada. Além disso, foi demostrada sua capacidade de atuar também como uma citrato sintase. Por fim, o perfil proteômico de P. lutzii em propionato mostrou a indução do ciclo do metilcitrato, ciclo do glioxilato, metabolismo de aminoácidos e gliconeogênese, e a repressão de vias como glicólise, fermentação e síntese de ácidos graxos, os quais demonstram o rearranjo metabólico para suprir a demanda energética celular metabolizando propionato. Neste sentido, entender os mecanismos pelo qual P. lutzii lança mão para metabolizar propionil-CoA permite a compreensão dos mecanismos de adaptação metabólica que esse fungo lança mão em diferentes nichos de colonização.

Submitted by Marlene Santos (marlene.bc.ufg@gmail.com) on 2018-07-17T17:09:33Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Sheila Janaína Sestari - 2017.pdf: 2781342 bytes, checksum: 55b64ac559e09fb7b078b0906ccd9791 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2018-07-18T11:28:17Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Sheila Janaína Sestari - 2017.pdf: 2781342 bytes, checksum: 55b64ac559e09fb7b078b0906ccd9791 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-18T11:28:17Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Sheila Janaína Sestari - 2017.pdf: 2781342 bytes, checksum: 55b64ac559e09fb7b078b0906ccd9791 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-03-10 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Paracoccidioides lutzii alternates between filamentous and yeast growth when exposed to temperatures of 36ºC. Morphological transition is an essential event for establishment of paracoccidioidomycosis (PCM), one of the most frequent systemic mycoses in Latin America. Paracoccidioides brasiliensis and other dimorphic fungi, cAMP-dependent protein kinase (PKA) is essential in the dimorphic process. However, molecular events responsible for mycelial-yeast differentiation in P. lutzii remain unknown. The aim of this work was to characterize in silico the PKA subunits of P. lutzii, and to evaluate the role of this enzyme during the morphological transition of this fungus. During the in silico approach, we used computational tools for identity, domains, cell localization prediction, and similarity between P. lutzii and human sequences analysis. The importance of this enzyme was investigated through the use of specific inhibitor, H89. The behavior of cells in the presence of the drug was observed and the PKA activity measured by specific kit. Our in silico results reveal a single regulatory subunit, PbPKA-R located primarily in the nucleus, and two catalytic subunits, PbPKA-C1 and PbPKA-C2, with localization in the cytoplasm and nucleus respectively, all highly conserved. The PbPKA-R subunits were identified with two copies of the CNMP domain in the C-terminal, while the catalytic with a single copy of two domains: protein kinase and AGC kinase. The alignment of the PKA catalytic subunits of humans and Paracoccidioides shows a large divergence between them, making PKA an interesting target for antifungal. The results show that PKA activity is phase regulated, being about five times higher in yeast than in mycelium. We also show that H89 blocks the mycelium to yeast differentiation when PKA activity decreases. However, when the drug is removal from the culture medium, the fungus resumes the differentiation to the yeast phase. Our results show that PKA activity affects the phase transition in P. lutzii. / Paracoccidioides lutzii alterna entre crescimento filamentoso e leveduriforme quando exposto a temperaturas de 36ºC. A transição morfológica é um evento essencial para estabelecimento da paracoccidioidomicose (PCM), uma das micoses sistêmicas mais frequentes na América Latina. Em Paracoccidioides brasiliensis e outros fungos dimórficos, a proteína quinase dependente de AMPc (PKA) é essencial no processo dimórfico. No entanto, os eventos moleculares responsáveis pela diferenciação micélio-levedura em P. lutzii permanecem desconhecidos. O objetivo deste trabalho foi caracterizar in silico as subunidades da PKA de P. lutzii, e avaliar o papel dessa enzima durante a transição morfológica desse fungo. Durante a abordagem in silico, utilizamos ferramentas computacionais para análise de identidade, domínios, predição da localização celular e similaridade entre as sequências de P. lutzii e humanos. Para investigar a importância dessa enzima, utilizamos um inibidor específico, H89, observando o comportamento das células quando induzidas à transição morfológica e posteriormente mensuramos sua atividade através de kit específico. Nossos resultados in silico revelam uma única subunidade regulatória, PbPKA-R localizada principalmente no núcleo, e duas subunidades catalíticas, PbPKA-C1 e PbPKA-C2, com localização no citoplasma e núcleo respectivamente, todas altamente conservadas. Na região Cterminal, as subunidades PbPKA-R foram identificadas com duas cópias do domínio CNMP, já as catalíticas com uma única cópia de dois domínios: proteína quinase e AGC quinase. O alinhamento das subunidades catalíticas da PKA de humanos e Paracoccidioides aponta uma grande divergência entre elas, o que torna a PKA um alvo interessante para antifúngicos. Os resultados do ensaio de atividade da PKA mostram que a atividade é regulada ao longo da transição de fases, sendo cerca de cinco vezes maior em levedura do que em micélio. Os dados também evidenciam que H89 bloqueia a diferenciação de micélio para levedura e que este bloqueio acontece concomitantemente à diminuição da atividade da PKA. No entanto, quando a droga é retirada do meio de cultura, o fungo retoma a diferenciação para fase leveduriforme. Os resultados revelam que a atividade da PKA afeta a transição de fases em P. lutzii.