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Tipagem molecular e evolução do gênero Paracoccidioides

Teixeira, Marcus de Melo 17 March 2008 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2008. / Submitted by Rosane Cossich Furtado (rosanecossich@gmail.com) on 2010-05-11T14:09:01Z No. of bitstreams: 1 2008_MarcusMeloTeixeira.pdf: 3636528 bytes, checksum: 945b7e82264df2556c02eec37ab595f9 (MD5) / Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2010-05-12T04:45:36Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_MarcusMeloTeixeira.pdf: 3636528 bytes, checksum: 945b7e82264df2556c02eec37ab595f9 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-05-12T04:45:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_MarcusMeloTeixeira.pdf: 3636528 bytes, checksum: 945b7e82264df2556c02eec37ab595f9 (MD5) Previous issue date: 2008-03-17 / A PCM é uma micose sistêmica que ocorre em vários países da América Latina, principalmente Brasil, Venezuela e Colômbia e, afeta principalmente indivíduos da população rural. Estudos de variabilidade genética de isolados do Paracoccidioides brasiliensis, utilizando diferentes tipos de marcadores moleculares, já mostraram uma alta variabilidade genética deste patógeno. O isolado Pb01, em especial, diverge das 3 espécies filogenéticas identificadas previamente (S1, PS2, PS3) e sua classificação taxonômica dentro do gênero Paracoccidioides ainda permanece não definida. Neste trabalho, foram identificados mais 16 isolados que apresentaram um genótipo semelhante ao Pb01, por análise de um marcador molecular presente no íntron1 do gene hsp70, os quais foram denominados “Pb01-like”. Utilizando a metodologia do reconhecimento de espécies filogenéticas pela concordância genealógica (GCPSR), este trabalho teve como objetivo investigar a existência de um grupo sistematicamente significante que abrigasse estes isolados do tipo “Pb01-like”, em uma amostragem total de 88 isolados. Para análise filogenética foram utilizados os métodos de máxima parcimônia e análise de Bayes de 13 loci polimórficos, tanto individuais ou concatenados, o que permitiu agrupar estes isolados “Pb01-like” em um grupo filogenético separado das 3 espécies filogenéticas S1, PS2 e PS3. Foi detectado um alto número de polimorfismos fixados entre os dois grupos geneticamente isolados, o que sugere um bloqueio do fluxo gênico entre eles. O evento de especiação do grupo filogenético “Pb01-like” é simpátrico uma vez que compartilha algumas regiões geográficas das outras 3 espécies filogenéticas. Os dois grupos, “Pb01-like” e S1,PS2,PS3, são altamente divergentes e o tempo médio estimado de isolamento genético entre eles foi de 19 milhões de anos atrás. A análise de recombinação possibilitou detectar que o evento de recombinação ocorre dentro das duas populações de forma separada, o que é compatível com o isolamento reprodutivo. De acordo com o critério do método de reconhecimento de espécies filogenéticas pela concordância genealógica (GCPSR) o grupo “Pb01-like” pode ser considerado uma nova espécie filogenética, diferente das três espécies filogenéticas previamente mencionadas (Matute et al., 2006), uma vez que o clado correspondente aos isolados “Pb01-like” aparece fortemente sustentado nas genealogias geradas a partir dos dados de polimorfismo de 13 loci analisados, tanto simples como concatenados, com valores de probabilidade posterior (1.0) e “bootstrap” (100%) altamente significantes. Análise sobre características morfológicas, possibilidade de cruzamento genético, características fenotípicas e da doença (PCM), utilizando isolados representativos dos 2 grupos, se encontram em andamento. Se forem confirmadas as características exclusivas e específicas para cada grupo aqui identificado, em conjunto com os dados de filogenia molecular, isto sustentaria fortemente a descrição formal de uma nova espécie para o gênero Paracoccidioides. e devido a grande relevância deste patógeno na área médica na América Latina seria importante nomear o clado “Pb01-like”. Uma nova nomenclatura pode facilitar a comunicação entre médicos patologistas e pesquisadores da área. Para a espécie filogenética correspondente aos isolados “Pb01-like” sugere-se a descrição formal de uma nova espécie: Paracoccidioides lutzii, em tributo ao médico micologista Adolpho Lutz, que foi o pioneiro a descrever o fungo patogênico humano P. brasiliensis há exatamente 100 anos atrás (1908). _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Paracoccidioidomycosis is a systemic illness with an area of occurrence covering most of Latin America, with highest prevalence in Brazil, Venezuela and Colombia, and that affects mainly individuals living in the countryside. Studies on difference isolates of the causative agent, Paracoccidoides brasiliensis, have revealed a great degree of genetic variability in this pathogen. The Pb01 isolate, in particular, differs from the three previously described phylogenetic species (S1, PS2 and PS3; Matute et al., 2006) and its taxonomic classification in the genus Paracoccidioides remains undefined. In the present work, sixteen isolates genotypically similar to Pb01 have been identified by analysis of a molecular marker from the first intron of the hsp70 gene; these isolates have been dubbed ‘Pb01-like’. Using the method of recognition of phylogenetic species by genealogic concordance (GCPSR), this work aimed at looking into the existence of a systematically significant group of ‘Pb01-like’ isolates from a total of 88 samples. For phylogenetic analysis the methods of maximal likelihood and Bayesian analysis were applied to thirteen polymorphic regions, including individual and concatenated loci. This allowed the grouping of the ‘Pb01-like’ isolates in a phylogenetic group distinct from S1, PS2 and PS3. A high number of fixed polymorphisms was identified between the ‘Pb01-like’ cluster and that composed of the other three species, which suggests a blockage of all genetic flow between them. The speciation event that defined the new phylogenetic group is sympatric relative to S1 and PS2. The group that includes S1, PS2 and PS3 and the ‘Pb01-like’ cluster are highly divergent and have been genetically isolated for about 19 million years. Recombination analysis revealed that recombination events occur independently inside the two groups, which suggests reproductive isolation. In keeping with GCPSR, the ‘Pb01-like group’ can be considered a new phylogenetic species distinct from the other three, since the clade corresponding to ‘Pb01-like’ isolates is strongly supported by all pedigrees independently generated from polymorphism data of the thirteen loci, with values of posterior probability (1.0) and of bootstrap agreement (100%) highly significant. Further analysis of morphological, phenotypical and pathogenic profiles, and of the possibility of mating, is under way for isolates representative of all species. If exclusive and specific characteristics are identified for the ‘Pb01-like’ group, this would justify, in conjunction with molecular phylogeny data, the formal description of a new species for the genus Paracoccidioides, which would be accompanied by a renaming of the group, in the light of the medical relevance of this pathogen in Latin America. A new nomenclature would obviously ease information exchange among pathologists and researchers. We suggest formally to name the phylogenetic species encompassing the ‘Pb01-like’ clade as Paracoccidioides lutzii, as a tribute to medical mycologist Adolpho Lutz, who first described human pathogen P. brasiliensis exactly one hundred years ago.
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Efeito de Interleucina-6 sobre a atividade fungicida e produção de citocinas por monócitos humanos, infectados in vitro com cepa virulenta de paracoccidioides brasiliensis /

Siqueira, Keila Zaniboni. January 2004 (has links)
Orientador : Maria Terezinha Serrão Peraçoli / Resumo: O efeito interleucina-6 (IL-6) sobre a atividade fungicida e a produção de citocinas foi avaliado em cultura de monócitos humanos, infectados com cepa virulenta (Pb18) de Paracoccidioides brasiliensis. Monócitos de sangue periférico, obtidos de indivíduos saudáveis, foram pré-incubados por 24h na ausência ou presença de IL-6 recombinante humana e, a seguir, infectados com cepa virulenta Pb18 do fungo durante 4h e 18h na proporção de 50 monócitos para uma célula fúngica. A atividade fungicida de monócitos foi avaliada por plaqueamento das co-culturas em BHI-ágar e determinação da recuperação de fungos viáveis e, a produção de fator de necrose tumoral-alfa (TNF-a), IL-6 e IL-10 por monócitos foi determinada nos sobrenadantes das culturas por ensaio imunoenzimático (ELISA). Os resultados demonstraram que a pré-incubação de monócitos com IL-6 e desafio com Pb18 durante 4h induziu aumento significativo na recuperação fúngica em comparação às culturas controles não-estimuladas com esta citocina. Monócitos infectados com P. brasiliensis, na ausência de IL-6, produziram níveis de TNF-a, IL-6 e IL-10 significativamente maiores após 18h de co-cultivo em comparação aos experimentos de 4h de incubação. O tratamento de monócitos com IL-6 induziu um efeito inibitório na produção de TNF-a e IL-10 por essas células durante a infecção com P. brasiliensis, representado por 79,5% e 75,6% de redução nos níveis de TNF-a e IL-10, respectivamente, após 18h de cultivo. Por outro lado, efeito estimulatório da IL-6 sobre a produção autócrina dessa citocina foi observado nessas culturas e revelado por acréscimo de 84,8% em 4h e 59,4% em 18h de co-cultura. A redução nos níveis de TNF-a e estimulação na produção de IL-6 podem ser responsáveis pelo aumento significante no crescimento do fungo em monócitos humanos, induzido por tratamento prévio com IL-6... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The effect of interleukin-6 (IL-6) on fungicidal activity and cytokine production was evaluated in human monocytes cultures infected with virulent strain (Pb18) of Paracoccidioides brasiliensis. Peripheral blood monocytes obtained from healthy individuals were pre-incubated for 24h with or without human recombinant IL-6, and then challenged with Pb18 by co-culture during 4h and 18h in a ratio of 50:1 monocytes:fungi. Fungicidal activity of monocytes was assessed by viable fungi recovery from co-cultures plating in BHI-agar, and tumor necrosis factor-alpha (TNF-a), IL-6 and IL-10 production by monocytes were determined in culture supernatants by enzyme immunoassay (ELISA). The monocytes pre-incubation with IL-6, and further challenge with Pb18 during 4h led to significant higher fungi recovery when compared to non-treated cocultures. Monocytes infected with P. brasiliensis in the absence of IL-6, produced ? significantly higher levels of TNF-a, IL-6 and IL-10 after 18h of coculture in comparison to experiments of 4h-incubation with the fungus. The pretreatment of monocytes with IL-6 induced an inhibitory effect on TNF-a and IL- 10 production by these cells during 18h of fungus infection, respectively represented by 79.5% and 75.6% reduction in TNF-a and IL-10 levels. On the contrary an autocrine stimulatory effect on IL-6 production was detected in these cultures, revealed by an elevation of 84.8% at 4h and 59.4% at 18h in IL- 6 levels. The reduction in TNF-a levels and stimulation in IL-6 production might be responsible for the significant increase of fungus growth in human monocytes induced by previous treatment with IL-6. Together, the results suggest that IL-6 may exert a modulatory effect on monocyte-P.brasiliensis interaction by inhibiting TNF-a production and promoting the growth of a fungus virulent strain in these cells. / Mestre
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Análise de cDNA diferencialmente expressos durante o processo de infecção de Paracoccidioides brasiliensis a queratinócitos e pneumócitos

Silva, Roberta Peres da [UNESP] 01 June 2010 (has links) (PDF)
Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:19Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-06-01Bitstream added on 2014-06-13T19:14:39Z : No. of bitstreams: 1 silva_rp_me_arafcf.pdf: 536845 bytes, checksum: 3ba525b127840312a55b9b1b1e2c7d26 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A paracoccidioidomicose é micose sistêmica causada pelo fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis. As manifestações clínicas incluem desde formas localizadas até doença disseminada que pode evoluir para letalidade, dependendo provavelmente da relação entre a virulência do fungo, a resposta imunológica e a habilidade deste em interagir com as estruturas superficiais do hospedeiro e invadir células epiteliais e mononucleares. P. brasiliensis tem a capacidade de invadir células epiteliais de linhagens humanas e animais, pode circunscrever os sinais celulares via actina e tubulina para invadir células normalmente não fagocíticas, assim como a citoqueratina parece desempenhar um importante papel. Neste projeto foi estudado o comportamento de P. brasiliensis quanto ao perfil de infecção aos queratinócitos e as células epiteliais pulmonares. Por outro lado, identificou-se a expressão diferencial de RNAm e de proteínas quando o fungo foi posto em contato com os dois tipos celulares, no intuito de caracterizar genes diferencialmente expressos e proteínas durante a infecção de P. brasiliensis. Verificou-se que a porcentagem de fungos que interagiu com os dois tipos celulares foi bastante semelhante. No entanto, o mecanismo de interação pode ser diferente, uma vez que as proteínas encontradas ligadas fracamente à parede do fungo apresentaram diferenças significativas no perfil eletroforético. O fungo após o contato com as células NOK aparentemente induziu alterações expressivas nas células, aparecendo prolongamentos celulares, fruto da provável alteração do citoesqueleto em que actina pode estar envolvida, principalmente em cinco e oito horas de infecção. Por outro lado, a técnica de RDA foi extremamente útil, fornecendo-nos uma visão global da situação da célula nas horas iniciais de contato... / Paracoccidioidomycosis is a systemic mycosis caused by the dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis. Clinical manifestations range from localized forms to disseminated disease that can progress to lethality, probably depending on the relationship among the virulence of the fungus, the immune response, the ability to interact with the surface structures and invade epithelial cells and mononuclear cells of the host. In order to study the steps involved from the initial contact of P. brasiliensis until the events of adhesion and invasion culminating in its entry into the cell. Using this model, it was demonstrated that not only P. brasiliensis has the ability to invade human and animal epithelial cells, as correlated for the first time, the degree of virulence with the adhesion ability of the isolates. Among the components of the cytoskeleton, P. brasiliensis probably using the actin and tubulin to invade cells, and cytokeratin seems to play an important role. In this study, we evaluated the behavior of P. brasiliensis and the profile of infection to keratinocytes and lung epithelial cells. Furthermore, we identified the differential expression of mRNA and protein when the fungus was placed in contact with the two cell types in order to characterize differentially expressed genes and proteins during P. brasiliensis infection. The percentage of fungi that interacted with the two cell types was very similar. However, the mechanism of interaction may be different, since the expressed proteins showed significant differences in electrophoretic profile. We analyzed two cDNA populations of P. brasiliensis, one obtained from contact between P. brasiliensis and pneumocytes, and other PB and keratinocytes. Our analysis identified transcripts related to 28 proteins involved in different biological processes. Transcripts were found with multiple functions... (Complete abstract click electronic access below)
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Efeito de Interleucina-6 sobre a atividade fungicida e produção de citocinas por monócitos humanos, infectados in vitro com cepa virulenta de paracoccidioides brasiliensis

Siqueira, Keila Zaniboni [UNESP] January 2004 (has links) (PDF)
Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:57Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2004Bitstream added on 2014-06-13T18:32:16Z : No. of bitstreams: 1 siqueira_kz_me_botfm.pdf: 206406 bytes, checksum: 537429d637477b520782ea075ff9330d (MD5) / O efeito interleucina-6 (IL-6) sobre a atividade fungicida e a produção de citocinas foi avaliado em cultura de monócitos humanos, infectados com cepa virulenta (Pb18) de Paracoccidioides brasiliensis. Monócitos de sangue periférico, obtidos de indivíduos saudáveis, foram pré-incubados por 24h na ausência ou presença de IL-6 recombinante humana e, a seguir, infectados com cepa virulenta Pb18 do fungo durante 4h e 18h na proporção de 50 monócitos para uma célula fúngica. A atividade fungicida de monócitos foi avaliada por plaqueamento das co-culturas em BHI-ágar e determinação da recuperação de fungos viáveis e, a produção de fator de necrose tumoral-alfa (TNF-a), IL-6 e IL-10 por monócitos foi determinada nos sobrenadantes das culturas por ensaio imunoenzimático (ELISA). Os resultados demonstraram que a pré-incubação de monócitos com IL-6 e desafio com Pb18 durante 4h induziu aumento significativo na recuperação fúngica em comparação às culturas controles não-estimuladas com esta citocina. Monócitos infectados com P. brasiliensis, na ausência de IL-6, produziram níveis de TNF-a, IL-6 e IL-10 significativamente maiores após 18h de co-cultivo em comparação aos experimentos de 4h de incubação. O tratamento de monócitos com IL-6 induziu um efeito inibitório na produção de TNF-a e IL-10 por essas células durante a infecção com P. brasiliensis, representado por 79,5% e 75,6% de redução nos níveis de TNF-a e IL-10, respectivamente, após 18h de cultivo. Por outro lado, efeito estimulatório da IL-6 sobre a produção autócrina dessa citocina foi observado nessas culturas e revelado por acréscimo de 84,8% em 4h e 59,4% em 18h de co-cultura. A redução nos níveis de TNF-a e estimulação na produção de IL-6 podem ser responsáveis pelo aumento significante no crescimento do fungo em monócitos humanos, induzido por tratamento prévio com IL-6... / The effect of interleukin-6 (IL-6) on fungicidal activity and cytokine production was evaluated in human monocytes cultures infected with virulent strain (Pb18) of Paracoccidioides brasiliensis. Peripheral blood monocytes obtained from healthy individuals were pre-incubated for 24h with or without human recombinant IL-6, and then challenged with Pb18 by co-culture during 4h and 18h in a ratio of 50:1 monocytes:fungi. Fungicidal activity of monocytes was assessed by viable fungi recovery from co-cultures plating in BHI-agar, and tumor necrosis factor-alpha (TNF-a), IL-6 and IL-10 production by monocytes were determined in culture supernatants by enzyme immunoassay (ELISA). The monocytes pre-incubation with IL-6, and further challenge with Pb18 during 4h led to significant higher fungi recovery when compared to non-treated cocultures. Monocytes infected with P. brasiliensis in the absence of IL-6, produced ? significantly higher levels of TNF-a, IL-6 and IL-10 after 18h of coculture in comparison to experiments of 4h-incubation with the fungus. The pretreatment of monocytes with IL-6 induced an inhibitory effect on TNF-a and IL- 10 production by these cells during 18h of fungus infection, respectively represented by 79.5% and 75.6% reduction in TNF-a and IL-10 levels. On the contrary an autocrine stimulatory effect on IL-6 production was detected in these cultures, revealed by an elevation of 84.8% at 4h and 59.4% at 18h in IL- 6 levels. The reduction in TNF-a levels and stimulation in IL-6 production might be responsible for the significant increase of fungus growth in human monocytes induced by previous treatment with IL-6. Together, the results suggest that IL-6 may exert a modulatory effect on monocyte-P.brasiliensis interaction by inhibiting TNF-a production and promoting the growth of a fungus virulent strain in these cells.
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Interação com constituintes da matriz extracelular e o envolvimento do citoesqueleto na adesão e invasão de Paracoccidioides brasiliensis às células epiteliais /

Hanna, Samira Abdallah. January 2001 (has links)
Orientador: Maria José Soares Mendes Giannini / Resumo: A virulência microbiana é considerada uma propriedade complexa propiciando ao agente infeccioso condições para penetrar as barreiras protetoras do hospedeiro, sobreviver aos mecanismos de defesa, multiplicar-se e produzir a doença. A paracoccidioidomicose apresenta um amplo espectro de manifestações clínicas, onde o fungo, Paracoccidioides brasiliensis, pode atingir vários tecidos com ênfase ao pulmão. Os mecanismos de disseminação são baseados em evidências indiretas, porém observando-se os aspectos clínicos polimórficos pode-se sugerir que diferentes mecanismos de virulência estão envolvidos. A propriedade do patógeno de interagir com as estruturas superficiais do hospedeiro é essencial para sua virulência e poucas informações são disponíveis no que se refere aos prováveis mecanismos de interação de P.brasiliensis às células. Assim, foram avaliadas a interação de P.brasiliensis e células epiteliais das linhagens Vero e A549, dando ênfase a interação com componentes da matriz extracelular e o envolvimento do citoesqueleto durante a cinética de interação fungocélula. A cinética da interação mostrou que a adesão do fungo ocorreu a partir de 30 minutos de contato nas duas linhagens celulares levando a um acréscimo no número de leveduras aderidas nos tempos subseqüentes. A presença dos fungos no interior das células ocorreu a partir de duas horas de contato com as células Vero e uma hora com as células A549. A interação de P.brasiliensis com as células epiteliais e componentes da matriz extracelular (MEC) foi avaliada por imunoperoxidase in situ e imunofluorescência indireta. O padrão de reconhecimento nas células epiteliais frente aos soros antifibronectina, anti-laminina e anti-colágeno tipo I foi de maneira diferenciada nas células infectadas. A distribuição característica da marcação... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Microbial virulence is a set of mechanisms that enable the infectious agent to penetrate the host protection barriers and then survive against the defense mechanisms, multiply and cause disease. Paracoccidioidomycosis presents a variety of clinical manifestations, and the fungus Paracoccidioides brasiliensis can reach many tissues, most importantly the lungs. Understanding of the mechanisms of dissemination is based on indirect evidence, and the polymorphic aspects of disease suggest that several virulence mechanisms are involved. The ability of the pathogen to interact with the host superficial structures is essential to its virulence, but little is known about interactions between cells and P.brasiliensis. For this reason, interactions between P.brasiliensis and epithelial Vero and A549 cells were evaluated, with the emphasis on interactions with extracellular matrix and the induction of cytoskeletal alterations during the interaction process fungus-cells. The kinetics of interaction showed that adhesion occurred after 30 minutes of contact between the two cell lines and the yeast, and the number of adhesion points increased on the cells after that. The fungus were inside the Vero cells after two hours and inside A549 after one hour. The interaction between P.brasiliensis and epithelial cells and the components of the extracellular matrix (MEC) were evaluated through immunoperoxidase in situ and indirect immunofluorescence. The recognition patterns of the infected cells against anti-fibronectin, anti-laminin and anti-collagen type I sera were different from those of the uninfected cells. Characteristic distributions of bound anti-fibronectin and anti-laminin on the surface of yeast cells were detected, indicating the presence of specific binding sites for each one. Cytochalasin D, an inhibitor of actin polymerization and colchicine... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor
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Análise de cDNA diferencialmente expressos durante o processo de infecção de Paracoccidioides brasiliensis a queratinócitos e pneumócitos /

Silva, Roberta Peres da. January 2010 (has links)
Orientador: Maria José Soares Mendes Giannini / Banca: Henrique Leonel Lenzi / Banca: Eduardo Bagagli / Resumo: A paracoccidioidomicose é micose sistêmica causada pelo fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis. As manifestações clínicas incluem desde formas localizadas até doença disseminada que pode evoluir para letalidade, dependendo provavelmente da relação entre a virulência do fungo, a resposta imunológica e a habilidade deste em interagir com as estruturas superficiais do hospedeiro e invadir células epiteliais e mononucleares. P. brasiliensis tem a capacidade de invadir células epiteliais de linhagens humanas e animais, pode circunscrever os sinais celulares via actina e tubulina para invadir células normalmente não fagocíticas, assim como a citoqueratina parece desempenhar um importante papel. Neste projeto foi estudado o comportamento de P. brasiliensis quanto ao perfil de infecção aos queratinócitos e as células epiteliais pulmonares. Por outro lado, identificou-se a expressão diferencial de RNAm e de proteínas quando o fungo foi posto em contato com os dois tipos celulares, no intuito de caracterizar genes diferencialmente expressos e proteínas durante a infecção de P. brasiliensis. Verificou-se que a porcentagem de fungos que interagiu com os dois tipos celulares foi bastante semelhante. No entanto, o mecanismo de interação pode ser diferente, uma vez que as proteínas encontradas ligadas fracamente à parede do fungo apresentaram diferenças significativas no perfil eletroforético. O fungo após o contato com as células NOK aparentemente induziu alterações expressivas nas células, aparecendo prolongamentos celulares, fruto da provável alteração do citoesqueleto em que actina pode estar envolvida, principalmente em cinco e oito horas de infecção. Por outro lado, a técnica de RDA foi extremamente útil, fornecendo-nos uma visão global da situação da célula nas horas iniciais de contato... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Paracoccidioidomycosis is a systemic mycosis caused by the dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis. Clinical manifestations range from localized forms to disseminated disease that can progress to lethality, probably depending on the relationship among the virulence of the fungus, the immune response, the ability to interact with the surface structures and invade epithelial cells and mononuclear cells of the host. In order to study the steps involved from the initial contact of P. brasiliensis until the events of adhesion and invasion culminating in its entry into the cell. Using this model, it was demonstrated that not only P. brasiliensis has the ability to invade human and animal epithelial cells, as correlated for the first time, the degree of virulence with the adhesion ability of the isolates. Among the components of the cytoskeleton, P. brasiliensis probably using the actin and tubulin to invade cells, and cytokeratin seems to play an important role. In this study, we evaluated the behavior of P. brasiliensis and the profile of infection to keratinocytes and lung epithelial cells. Furthermore, we identified the differential expression of mRNA and protein when the fungus was placed in contact with the two cell types in order to characterize differentially expressed genes and proteins during P. brasiliensis infection. The percentage of fungi that interacted with the two cell types was very similar. However, the mechanism of interaction may be different, since the expressed proteins showed significant differences in electrophoretic profile. We analyzed two cDNA populations of P. brasiliensis, one obtained from contact between P. brasiliensis and pneumocytes, and other PB and keratinocytes. Our analysis identified transcripts related to 28 proteins involved in different biological processes. Transcripts were found with multiple functions... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre
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Interação com constituintes da matriz extracelular e o envolvimento do citoesqueleto na adesão e invasão de Paracoccidioides brasiliensis às células epiteliais

Hanna, Samira Abdallah [UNESP] January 2001 (has links) (PDF)
Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:57Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2001Bitstream added on 2014-06-13T18:41:14Z : No. of bitstreams: 1 hanna_sa_dr_botfm.pdf: 4239450 bytes, checksum: a2303b4b075a8f209a246b54d76deee8 (MD5) / A virulência microbiana é considerada uma propriedade complexa propiciando ao agente infeccioso condições para penetrar as barreiras protetoras do hospedeiro, sobreviver aos mecanismos de defesa, multiplicar-se e produzir a doença. A paracoccidioidomicose apresenta um amplo espectro de manifestações clínicas, onde o fungo, Paracoccidioides brasiliensis, pode atingir vários tecidos com ênfase ao pulmão. Os mecanismos de disseminação são baseados em evidências indiretas, porém observando-se os aspectos clínicos polimórficos pode-se sugerir que diferentes mecanismos de virulência estão envolvidos. A propriedade do patógeno de interagir com as estruturas superficiais do hospedeiro é essencial para sua virulência e poucas informações são disponíveis no que se refere aos prováveis mecanismos de interação de P.brasiliensis às células. Assim, foram avaliadas a interação de P.brasiliensis e células epiteliais das linhagens Vero e A549, dando ênfase a interação com componentes da matriz extracelular e o envolvimento do citoesqueleto durante a cinética de interação fungocélula. A cinética da interação mostrou que a adesão do fungo ocorreu a partir de 30 minutos de contato nas duas linhagens celulares levando a um acréscimo no número de leveduras aderidas nos tempos subseqüentes. A presença dos fungos no interior das células ocorreu a partir de duas horas de contato com as células Vero e uma hora com as células A549. A interação de P.brasiliensis com as células epiteliais e componentes da matriz extracelular (MEC) foi avaliada por imunoperoxidase in situ e imunofluorescência indireta. O padrão de reconhecimento nas células epiteliais frente aos soros antifibronectina, anti-laminina e anti-colágeno tipo I foi de maneira diferenciada nas células infectadas. A distribuição característica da marcação... / Microbial virulence is a set of mechanisms that enable the infectious agent to penetrate the host protection barriers and then survive against the defense mechanisms, multiply and cause disease. Paracoccidioidomycosis presents a variety of clinical manifestations, and the fungus Paracoccidioides brasiliensis can reach many tissues, most importantly the lungs. Understanding of the mechanisms of dissemination is based on indirect evidence, and the polymorphic aspects of disease suggest that several virulence mechanisms are involved. The ability of the pathogen to interact with the host superficial structures is essential to its virulence, but little is known about interactions between cells and P.brasiliensis. For this reason, interactions between P.brasiliensis and epithelial Vero and A549 cells were evaluated, with the emphasis on interactions with extracellular matrix and the induction of cytoskeletal alterations during the interaction process fungus-cells. The kinetics of interaction showed that adhesion occurred after 30 minutes of contact between the two cell lines and the yeast, and the number of adhesion points increased on the cells after that. The fungus were inside the Vero cells after two hours and inside A549 after one hour. The interaction between P.brasiliensis and epithelial cells and the components of the extracellular matrix (MEC) were evaluated through immunoperoxidase in situ and indirect immunofluorescence. The recognition patterns of the infected cells against anti-fibronectin, anti-laminin and anti-collagen type I sera were different from those of the uninfected cells. Characteristic distributions of bound anti-fibronectin and anti-laminin on the surface of yeast cells were detected, indicating the presence of specific binding sites for each one. Cytochalasin D, an inhibitor of actin polymerization and colchicine... (Complete abstract click electronic access below)
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Produção de prostaglandinas e leucotrienos por Paracoccidioides brasiliensis

Biondo, Guilherme Augusto [UNESP] 30 October 2008 (has links) (PDF)
Made available in DSpace on 2014-06-11T19:24:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-10-30Bitstream added on 2014-06-13T20:12:22Z : No. of bitstreams: 1 biondo_ga_me_botfm.pdf: 10870076 bytes, checksum: c768a26cf85de27fd0f5359da74435ca (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Paracoccidioides brasiliensis, é o agente da paracoccidioidomicose, a micose profunda endêmica na América Latina. Produção de eicosanóides, como prostaglandinas e leucotrienos, durante as infecções fúngicas tem mostrado desempenhar um papel crítico na sobrevivência e/ou crescimento fúngico, bem como na modulação da resposta imune do hospedeiro. As células hospedeiras são uma fonte desses mediadores, porém outra fonte em potencial pode ser o próprio fungo. O objetivo do nosso estudo foi avaliar se cepas do P. brasiliensis com diferentes graus de virulência (Pb18, Pb265, BT79, Pb192) produzem, prostaglandina E2 (PGE2) e leucotrieno B4 (LTB4). Além disso, verificamos se P. brasiliensis pode usar fontes exógenas de ácido araquidônico (AA), bem como as vias metabólicas dependentes das enzimas cicloxigenase (COX) e lipoxigenase (5-LO), para a produção de PGE2 e LTB4, respectivamente. Finalmente, uma possível associação entre esses eicosanóides e a viabilidade do fungo também foi avaliada. Demonstramos, usando ensaios de Elisa, que todas as cepas de P. brasiliensis, independente do seu grau de virulência, produzem altos níveis de PGE2 e LTB4 após 4h cultura que foram reduzidos após 8h. No entanto, em ambos os tempos da cultura, foram detectados níveis mais elevados de eicosanóides, quando as culturas foram complementadas com uma fonte exógena de AA. Diferentemente, o tratamento com indometacina, um inibidor da COX, ou MK886, um inibidor da 5-LO, induz a uma redução nos níveis de PGE2 e LTB4, respectivamente, bem como a viabilidade do fungo. Os dados fornecem evidências de que P. brasiliensis tem a capacidade de metabolizar, tanto AA endógeno como exógeno por vias dependentes da COX e 5-LO enzimas que participam da produção de PGE2 e LTB4, respectivamente, que são indispensáveis para a sua viabilidade. / Paracoccidioides brasiliensis, is the agent of paracoccidioidomycosis, the most prevalent deep mycosis in Latin America. Production of eicosanoids, such as prostaglandins and leukotrienes, during fungal infections is theorized to play a critical role on fungal survival and/or growth as well as on host immune response modulation. Host cells are one source of these mediators; however another potential source may be the fungal itself. The purpose of our study was to assess whether P. brasiliensis strains with different degree of virulence (Pb18, Pb265, PbBT79, Pb192) produce both, prostaglandin E2 (PGE2) and leukotriene B4 (LTB4). Moreover, we asked if P. brasiliensis can use exogenous sources of arachidonic acid (AA), as well as metabolic pathways dependent on cyclooxygenase ( COX) and lipooxygenase (5-LO ) enzymes, for PGE2 and LTB4 production , respectively. Finally, a possible association between these eicosanoides and fungus viability was assessed. We have demonstrated, using Elisa assays, that all P. brasiliensis strains, independently of their virulence degree, produce high PGE2 and LTB4 levels on 4h culture that were reduced after 8 h. However, in both culture times, higher eicosanoides levels were detected when culture medium was supplemented with exogenous AA. Differently, treatment with indomethacin, a COX inhibitor, or MK886, a 5-LO inhibitor, induces a reduction on PGE2 and LTB4 levels, respectively, as well as in fungus viability. The data provide evidence that P. brasiliensis has the capacity to metabolize either endogenous or exogenous AA by pathways dependent on COX and 5-LO enzymes for producing PGE2 and LTB4, respectively, that are critical for its viability.
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Estudo de diferentes isolados de Paracoccidioides brasiliensis quanto ao padrão de adesão e expressão de ligantes da matriz extracelular /

Silva, Julhiany de Fátima da. January 2008 (has links)
Orientador: Maria José Soares Mendes Giannini / Banca: Célia Maria de Almeida Soares / Banca: Gil Bernard / Resumo: Paracoccidioides brasiliensis é um fungo dimórfico causador da paracoccidioidomicose, doença de comprometimento orgânico múltiplo e de evolução prolongada. A virulência de P. brasiliensis pode ser atenuada ou perdida após subseqüentes ciclos de subcultivos durante longos períodos e restabelecida após inoculações em animais ou pela passagem em cultura de células. Um aspecto importante na interação entre P.brasiliensis e seu hospedeiro é a habilidade do fungo em aderir aos componentes da matriz extracelular. O entendimento e identificação destas moléculas revestem-se de importância na descoberta de tratamentos eficientes para as micoses sistêmicas. Assim, neste trabalho, foram estudados 13 diferentes isolados de P. brasiliensis quanto ao padrão de infecção à cultura de células epiteliais pulmonares (A549), genotipagem com os iniciadores OPJ4, M13 e GACA4 empregando as técnicas de RAPD e PCR fingerprinting, bem como a verificação de proteínas expressas diferencialmente, e sua capacidade de ligação a componentes da matriz extracelular (MEC). Os diferentes isolados de P. brasiliensis apresentaram maior capacidade de infecção após reisolamento de células epiteliais. As amostras mais aderentes foram Pb18, Pb2508 e Pb2367 e as menos aderentes foram Pb2669, Pb2508 e Pb2367. Quanto aos genótipos, perfis diferenciais foram observados e correlação com padrão de infecção e distribuição geográfica foi observada para alguns isolados com dois dos iniciadores (OPJ4 e M13). A análise protéica dos extratos "cell free" de P. brasiliensis, por eletroforese bidimensional também forneceu perfis diferenciais entre as amostras subcultivadas e reisoladas e 62 ligantes de colágeno tipo I, 18 de laminina e 23 de fibronectina de um total de 420 proteínas expressas foram observados...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abastract: Paracoccidioides brasiliensis is a dimorphic fungus, ethiologic agent of paracoccidioidomycosis, disease of multiple organic implications and prolonged evolution. P. brasiliensis virulence can be attenuated or lost after subsequent cycles of subcultive for during long periods and reestablished after by the passage in animals or in the epithelial cells culture. The success of colonization is a complex event, generally involving a ligand coded by the pathogen (adhesins) and a cell receptor. An important aspect in the interaction between P.brasiliensis and your host is the ability to adhere to matrix extracelular components (ECM). This fungal employs a series of strategies to colonize and to disseminate, including ligands. The understanding and identification of these molecules is very important in the discovery of efficient treatments for the systemic mycoses. The aim of this study was to investigate the P. brasiliensis infection pattern to the pulmonary epithelial cells (A549), the molecular typing by RAPD and PCR fingerprinting using, respectively, the primers OPJ4, M13 and GACA4, as well as the protein expressed and the ligand to ECM of the different strains. All P. brasiliensis isolates presented different capacity to adhere to epithelial cells. The most and less adherent isolates were respectively Pb18, Pb2508ar and Pb2367ar, and Pb2669ar, Pb113 e Pb2663ar. Regarding the genomic polymorphisms, differential RAPD's profiles and PCR fingerprinting were observed and a relative correlation with the infection pattern and geographical distribution could be observed. The profile of four P. brasiliensis "cell-free" extracts from subcultivated and reisolated strains was analysed by two-dimensional electrophoresis. Differentially expressed proteins were identified. Furthermore, a lot of ligands were observed to ECM components, 62 ligands to collagen type I, 23 to fibronectin...(Complete abstract, click electronic access below) / Mestre
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Análise do transcriptoma parcial do fungo Paracoccidioides brasiliensis recuperado após infecção de macrófagos peritoneais murinos

Silva, Luciano Procópio da January 2006 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2006. / Submitted by Raquel Viana (tempestade_b@hotmail.com) on 2009-11-12T16:32:11Z No. of bitstreams: 1 Dissert Luciano Procopio da Silva.pdf: 1768563 bytes, checksum: 6f7f3caa7029a384719b7ffd5c5d69a3 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2009-12-07T15:52:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissert Luciano Procopio da Silva.pdf: 1768563 bytes, checksum: 6f7f3caa7029a384719b7ffd5c5d69a3 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-12-07T15:52:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissert Luciano Procopio da Silva.pdf: 1768563 bytes, checksum: 6f7f3caa7029a384719b7ffd5c5d69a3 (MD5) Previous issue date: 2006 / O fungo patogênico e dimórfico Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da paracoccidioidomicose, a micose sistêmica de maior prevalência na América do Sul. O fungo ocorre na natureza na forma de micélio, na temperatura de 26ºC, e na forma de levedura, na temperatura de 37ºC in vitro, sendo esta a forma encontrada nos tecidos de hospedeiros. A transição dimórfica da forma miceliana para a de levedura parece ser essencial para a patogênese, como também observado para outros fungos patogênicos e dimórficos. O projeto "Genoma Funcional e Diferencial do Fungo P. brasiliensis", realizado sob coordenação de nosso laboratório, foi empreendido a partir do seqüenciamento de bibliotecas de cDNA das formas de micélio e levedura cultivadas in vitro. No contexto desse trabalho, foi construída uma biblioteca de cDNA a partir do RNA total de P. brasiliensis obtido após seis horas de co-cultivo com células de macrófagos peritoneais murinos, sem qualquer cultivo adicional do fungo in vitro. A análise do perfil transcricional desse fungo a partir dessa biblioteca de cDNA, denominada PbY-MF, visa melhor compreender o padrão de expressão de genes potencialmente importantes para a adaptação e sobrevivência de P. brasiliensis no modelo de infecção. Nesse sentido, esse trabalho iniciou a caracterização do transcriptoma de P. brasiliensis recuperado de macrófagos, pelo seqüenciamento de cDNAs da biblioteca PbY-MF. A partir da submissão das seqüências ao pipeline de análise, um total de 474 ESTs de qualidade (PHRED ³ 20 e tamanho ³ 100 nt), foram geradas e analisadas. Após agrupamento pelo CAP3, essas ESTs foram agrupadas em 16 contigs e 99 singlets. Análises de similaridades empregando os bancos de dados do projeto transcriptoma de P. brasiliensis, GeneBank nr e dbEST, utilizando as ferramentas Blastn e Blastx, foram realizadas. Os resultados dessa análise revelam que 355 ESTs, agrupadas em 4 contigs e 16 singlets, apresentaram similaridades com seqüências já descritas para o fungo P. brasiliensis, sendo a maioria relacionada com genes da maquinaria traducional mitocondrial. Cinco contigs e sete singlets, ainda não descritos em P. brasiliensis, apresentaram similaridades com seqüências de outros organismos, sendo que a maioria também mostrava similaridade com genes mitocondriais que codificam proteínas da cadeia de transporte de elétrons. Das 474 ESTs analisadas no contexto desse trabalho, seis contigs e 63 singlets não apresentaram similaridades com nenhuma seqüência descrita nos bancos de dados empregados nessa análise, correspondendo a genes novos potencialmente específicos de P. brasiliensis. Em adição, nesse trabalho também foi realizada a análise de quatro contigs que apresentam similaridades com o gene de isocitrato liase (icl), o qual codifica uma proteína chave do ciclo do glioxilato, que mostra-se ativado em diferentes modelos de células de mamíferos infectadas por patógenos intracelulares facultativos. Essas contigs foram identificadas no transcriptoma de P. brasiliensis cultivado in vitro. Nesse sentido, foram realizados o seqüenciamento adicional de clones de cDNAs relacionados a essas contigs, análises de similaridade dessas seqüências e experimentos de Southern blot. Os resultados sugerem que três contigs, apresentando similaridade com uma mesma seqüência de isocitrato liase do fungo Coccidioides immitis, representam provavelmente um mesmo transcrito de P. brasiliensis, enquanto a quarta contig apresenta maior similaridade com o gene metilisocitrato liase do fungo Emericella nidulans. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis is the causative agent of paracocidioidomycosis, the most prevalent systemic mycosis in Latin America. Dimorphic transition is triggered by a temperature shift from the environmental 26 ºC, in which the fungus is found as a free-living mycelium, to the 37 ºC of the human host, when it changes to the pathogenic yeast form. The dimorphic transition is believed to play an essential role in pathogenesis, as described for other dimorphic pathogenic fungi. The project "Functional and Differential Genomics of the P. brasiliensis fungus", coordinated by our laboratory, has performed the sequencing of cDNA libraries from in vitro grown yeast and mycelium cells, resulting in 19,718 expressed sequence tags (ESTs) from in vitro cultivated yeast (9,941 ESTs) and mycelium (9,777 ESTs). The CAP3 clusterization software has assembled these raw sequence data into 2,655 contigs and 3,367 singlets. In order to better understand the expression of genes potentially involved in P. brasiliensis adaptation and survival in an infection model, in this work we describe the construction of a cDNA library using as template mRNA extracted from a six-hour co-culture of P. brasiliensis yeast cells and murine peritoneal macrophages, named PbY-MΦ. The sequencing of the PbY-MΦ library generated 474 ESTs that suited inclusion criteria of PHRED ≥ 20 and size greater than 100 nucleotides, which were clustered into 16 contigs and 99 singlets. BLAST-analysis against the P. brasiliensis transcritpome project, nr and dbEST databases, grouped 355 ESTs into four contigs and 16 singlets similar to previously described P. brasiliensis sequences, most of them corresponding to components of the mitochondrial translation apparatus. Five contigs and seven singlets, which were not described in P. brasiliensis, were found to be similar to sequences described in other organisms, with most of them implicated in the mitochondrial electron transport chain. Six contigs and 63 singlets were unique in that they had no homology to known sequences. In addition, we have performed a better characterization of four contigs described in the in vitro transcriptome, which were similar to the isocitrate lyase gene (icl), an enzyme of the glyoxylate cycle. Sequencing, similarity analysis and southern blotting experiments of these contigs suggest that three of them correspond to the isocitrate lyase from Coccidioides immitis, while the fourth is related to a methyl-isocitrate lyase gene from Emericella nidulans.

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