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Investigação das concentrações plasmáticas e pulmonares da Anfotericina B (AMB) estruturada em polímero biodegradável de Ácido Polilático-Poliglicólico (PLGA) revestido com Ácido Dimercaptossuccínico (DMSA)

Santos, Luciano da Ressurreição 09 April 2010 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, 2010. / Submitted by Shayane Marques Zica (marquacizh@uol.com.br) on 2011-06-13T18:11:49Z No. of bitstreams: 1 2010_LucianodaRessurreicaoSantos.pdf: 1435722 bytes, checksum: 5b20f61ccd78addf9a53d5a83dc2c0c8 (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2011-06-14T15:01:09Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_LucianodaRessurreicaoSantos.pdf: 1435722 bytes, checksum: 5b20f61ccd78addf9a53d5a83dc2c0c8 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-06-14T15:01:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_LucianodaRessurreicaoSantos.pdf: 1435722 bytes, checksum: 5b20f61ccd78addf9a53d5a83dc2c0c8 (MD5) / O presente trabalho avaliou a utilização e validou um método de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) para quantificar o antifúngico anfotericina B (AMB) em amostras de plasma e pulmão de camundongos. Este método foi utilizado para quantificar os níveis de AMB em amostras teciduais obtidas de animais tratados com um possível sistema deliberação sustentada de AMB, Nano-D-AMB (NanoAnf), baseado em misturas de polímeros de ácido polilático-co-glicólico (PLGA) e ácido dimercaptossuccínico(DMSA). O protocolo experimental incluiu a extração em fase sólida da AMB, seguido por uma análise por CLAE com detecção UV a 382 nm. Para a separação cromatográfica, utilizou-se uma coluna C18 defase reversa e uma fase móvel composta por acetonitrila:EDTA 10 mM (40:60, v/v) em pH4,65. Foi observada resposta linear no intervalo de concentração de 2,25-180 μg . mL-1, com limite de quantificação de 0,68 μg . mL-1. Os desvios padrões relativos dos ensaios intra-dia e inter-dia foram inferiores a 6% (n = 15). As taxas de recuperação das extrações variaram de acordo com os tecidos avaliados e com as concentrações utilizadas na fortificação dos mesmos (0,5-5 μg . mL-1), obtendo-se valores médios de 74,6% e 61,3% para plasma e pulmões, respectivamente. Os testes de concentração plasmática e pulmonar de AMB foram realizados em camundongos, divididos em 6 grupos de 5 animais, como segue: grupo I(tratado com Nano-D-AMB (NanoAnf), 6 mg . kg-1 i.p., eutanásia em 24 h); grupo II (tratado com Nano-D-AMB (NanoAnf), 6 mg . kg-1 i.p., eutanásia em 48 h); grupo III (tratado com Nano-D-AMB (NanoAnf), 6 mg . kg-1 i.p., eutanásia em 72 h); grupo IV (tratado com Anforicin B®, 6 mg . kg-1 i.p., eutanásia em 24 h); grupo V (tratado com Anforicin B®, 6 mg .kg-1 i.p., eutanásia em 48 h); grupo VI (tratado com Anforicin B®, 6 mg . kg-1 i.p., eutanásia em 72 h). As concentrações plasmáticas de AMB nos tempos 24 h, 48 h, e 72 h foram superiores nos grupos tratados com Nano-D-AMB (NanoAnf) (2,04 ± 0,51; 2,31 ± 0,57; 1,85± 0,46, respectivamente) em relação àqueles tratados com Anforicin B® (1,16 ± 0,19; 1,41 ±0,56; 1,32 ± 0,41, respectivamente) (p<0,05, Mann-Whitney test). Quanto aos níveis pulmonares, não foi verificada diferença significativa entre os tratamentos. Para ambas aspreparações, verificou-se um pico de concentração tecidual de AMB após 48 h de tratamento,apesar da diferença não apresentar significância estatística. Concluindo, o presente estudo avaliou um protocolo de CLAE exato e preciso para determinação de AMB no plasma e pulmões de camundongos. A preparação nano estruturada de AMB, Nano-D-AMB(NanoAnf), apresentou níveis plasmáticos superiores ao longo do tempo, o que pode sugerir um fenômeno de liberação sustentada do fármaco a partir das estruturas poliméricas de PLGA e DMSA. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The present work was aimed to validate a High Performance Liquid Chromatography(HPLC) method for measuring amphotericin B (AMB) concentrations in murine plasma andlung samples. This method was used to quantify the levels of AMB in tissue samples obtained from animals treated with a desoxycholate amphotericin sustained delivery system based on poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) and dimercaptosuccinic acid (DMSA)polymeric blends (Nano-D-AMB). The experimental protocol includes the solid-phase extraction of AMB followed by HPLC analysis with UV detection at 382 nm. Forchromatographic separation, we used a C18 reversed-phase column and a mobile phase composed by acetonitrile:EDTA 10 mM (40:60, v/v) at pH 4.65. A linear response was observed in the concentration range of 2.25-180 μg . mL-1, with a limit of quantification of0.68 μg . mL-1. The intra-day and inter-day relative standard deviations (R.S.D.) were lessthan 6% (n=15). The extraction recovery rates varied according to the tissue and the spiked concentrations used (0.5-5 μg . mL-1); the recovery rates were 74.6% and 61.3% for plasma and lungs, respectively. For testing the AMB levels in lungs and plasma of treated mice, the animals were randomly divided into six groups of 5 animals as follows: group I (treated withNano-D-AMB 6 mg . kg-1 i.p., euthanized at 24 h); group II (treated with Nano-D-AMB, 6mg . kg-1 i.p., euthanized at 48 h); group III (treated with Nano-D-AMB, 6 mg . kg-1 i.p.,euthanized at 72 h); group IV (treated with Anforicin B®, 6 mg . kg-1 i.p., euthanized at 24 h);group V (treated with Anforicin B®, 6 mg . kg-1 i.p., euthanized at 48 h); group VI (treatedwith Anforicin B®, 6 mg . kg-1 i.p., euthanized at 72 h). Nano-D-AMB provided higher AMBconcentrations in plasma at 24 h, 48 h, and 72 h (2.04 ± 0.51; 2.31 ± 0.57; 1.85 ± 0.46,respectively) than Anforicin B® (1.16 ± 0.19; 1.41 ± 0.56; 1.32 ± 0.41) (p<0.05, Mann-Whitney test). However, no significant differences were found in the pulmonary levels for allperiod of time tested. Although the level of AMB has showed a peak at 48 h after treatment,no significant differences were found along of the time intervals for both tested preparations.In conclusion, this study evaluated a HPLC protocol that provided an accurate and precise method to measure AMB concentrations in murine plasma and lung samples. Thenano structured preparation of AMB named Nano-D-AMB showed a marked increase inplasma concentration over the time, which could reflect a sustained drug releasing behaviorfrom the PLGA and DMSA polymeric blends.
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Fungos isolados de sirÃnios e cetÃceos no brasil: uma abordagem fenotÃpica, genotÃpica, diagnÃstica e de virulÃncia

Vitor Luz Carvalho 30 July 2015 (has links)
CoordenaÃÃo de AperfeÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O objetivo desse trabalho foi isolar fungos de sirÃnios e cetÃceos no Brasil, visando investigar aspectos fenotÃpicos, genotÃpicos, diagnÃsticos e de virulÃncia. Para tanto, foi coletadoâ com swabs estÃreisâ material da cavidade oralâ narina/espirÃculoâ abertura genital e/ou reto de 104 animais, incluindo 50 peixes-bois-da-AmazÃnia (Trichechus inunguis), 33 peixes-bois-marinho (T. manatus), 13 botos-vermelhos (Inia geoffrensis), trÃs cachalotes-anÃo (Kogia sima), dois golfinhos-cabeÃa-de-melÃo (Peponocephala electra)â um cachalote-pigmeu (K. breviceps)â um cachalote (Physeter macrocephalus) e uma baleia-jubarte (Megaptera novaeangliae). Dentre estes animais, um peixe-boi-da-AmazÃnia e oito peixes-boi-marinho apresentaram lesÃes suspeitas de micose cutÃnea, sendo realizados raspados de pele. Os swabs foram semeados em placas contendo Ãgar Sabouraud com cloranfenicolâ mantidas a 37ÂC por cinco dias, enquanto as escamas de pele foram semeadas em tubos contendo Ãgar Sabouraud com cloranfenicol a 25ÂC por dez dias. As leveduras isoladas foram identificadas atravÃs de provas bioquÃmicas, micromorfologia, sistema automatizado Vitek, PCR, RFLP e/ou sequenciamento, enquanto os fungos filamentosos foram identificados pela macro e micromorfologia. As cepas de Candida spp. (n=114) obtidas foram submetidas ao teste de microdiluiÃÃo em caldo para avaliaÃÃo do perfil de sensibilidade aos antifÃngicos itraconazolâ fluconazol e anfotericina B e aos testes de produÃÃo de fatores de virulÃncia (fosfolipases, proteases e biofilme). Leveduras da espÃcie C. albicans foram submetidas à tipagem molecular por MLST. Foram diagnosticados dois casos de micoses superficiais cutÃneas em sirÃnios, sendo uma levedurose mista por C. tropicalis e Trichosporon asahii e um caso de feohifomicose por Bipolaris hawaiiensis, bem como um surto de fusariose (Fusarium sp.). Foram isoladas 155 cepasâ sendo 112 de T. inunguis (40 Candida albicansâ 14 C. parapsilosis sensu strictoâ 3 C. metapsilosis, 4 C. orthopsilosis, 9 C. guilliermondiiâ 3 C. pelliculosaâ 2 C. tropicalisâ 2 C. glabrataâ 1 C. famataâ 1 C. kruseiâ 1 C. norvegensisâ 1 C. ciferriâ 22 Trichosporon sp.â 6 T.asahii, 2 Rhodotorula sp., 1 Cryptococcus laurentii), 29 de T. manatus (12 C. albicansâ 4 C. tropicalisâ4 C. famataâ 3 C. guilliermondiiâ 1 C. kruseiâ 1 Rhodotorula sp.â 2 R. mucilaginosa, 1 R. minuta, 1 Trichosporon sp.) e 14 de cetÃceos (6 C. tropicalis, 2 C. parapsilosis, 2 C. famata, 1 Candida sp., 3 Cryptococcus sp.). As concentraÃÃes inibitÃrias mÃnimas (CIMs) para anfotericina B variaram de 0â03 a 1Âg/mLâ nÃo sendo observadas cepas resistentes. As CIMs de itraconazol e fluconazol variaram de 0â03 a 16 Âg/ml e de 0â125 a 64 Âg/mlâ respectivamenteâ sendo constatada resistÃncia a pelo menos uma droga em 34â2% dos isolados, com destaque para C. albicans e C. tropicalis. Quanto aos fatores de virulÃncia testados, 50% produziram fosfolipases, com elevada frequÃncia em C. albicans; 50% produziram proteases, com maior prevalÃncia em C. albicans e C. tropicalis; e 35% produziram biofilme em escalas variÃveis, com maior prevalÃncia em C. tropicalis e C. orthopsilosis. A tipagem molecular foi realizada com 45 cepas de C. albicans, obtendo-se genÃtipos pertencentes a seis clados dentre os 18 existentes para a espÃcie, variando de acordo com o hospedeiro e localizaÃÃo geogrÃfica. Baseado no exposto, esse estudo representa uma contribuiÃÃo sistemÃtica e multidisciplinar acerca da micologia de mamÃferos aquÃticos.
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Biofilmes de Trichosporon asahii e Trichosporon inkin: aspectos morfofisiolÃgicos, sensibilidade a antifÃngicos e inibiÃÃo mediada por ritonavir / Trichosporon asahii and Trichosporon inkin biofilms: morphophysiological aspects, susceptibility to antifungals and inhibition mediated by ritonavir

Rosana Serpa 27 July 2016 (has links)
CoordenaÃÃo de AperfeÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Nos Ãltimos anos, diversos estudos tÃm considerado os fungos do gÃnero Trichosporon como patÃgenos oportunistas emergentes em pacientes imunocomprometidos. Embora a dinÃmica nÃo seja bem compreendida, sabe-se que eventos associados à formaÃÃo de biofilme nestes fungos tÃm papel importante no processo infeccioso. Desta forma, o presente estudo analisou aspectos morfofisiolÃgicos dos biofilmes produzidos por T. inkin, bem como o papel de um inibidor de proteases sobre as cÃlulas e biofilmes de T. asahii e T. inkin. Na primeira parte da pesquisa, foi investigada a formaÃÃo de biofilmes de T. inkin (n=7) nos meios RPMI, Caldo CLED e Caldo Sabouraud, em pH 5,5 e pH 7,0, com inÃculos iniciais de 1x104, 1x105 e 1x106 cÃlulas/mL, incubados a 28ÂC e 35ÂC, de forma estÃtica ou agitaÃÃo a 80 rpm, por 48h. Os biofilmes formados foram avaliados quanto à biomassa e atividade metabÃlica, contagem de cÃlulas viÃveis, quantificaÃÃo de Ãcidos nuclÃicos e atividade proteÃsica. Investigou-se ainda a sensibilidade dos biofilmes frente à anfotericina B, caspofungina, fluconazol, itraconazol e voriconazol. Para avaliaÃÃo da atividade inibitÃria do ritonavir sobre a estrutura e o funcionamento dos biofilmes de T. asahii e T. inkin, biofilmes foram formados na presenÃa de ritonavir e avaliados quanto à adesÃo celular, desenvolvimento estrutural e atividade proteÃsica. Adicionalmente, o ritonavir foi avaliado sobre biofilmes maduros, composiÃÃo de matriz e alteraÃÃes estruturais. CÃlulas planctÃnicas de T. asahii e T. inkin (n=2 cada) tambÃm foram investigadas quanto à sensibilidade ao ritonavir isolado e em combinaÃÃo com antifÃngicos. Por fim, cÃlulas planctÃnicas foram prÃ-expostas ao ritonavir e avaliadas quanto à capacidade de formaÃÃo de biofilmes, sensibilidade a antifÃngicos e alteraÃÃo na hidrofobicidade de suas superfÃcies. A produÃÃo de biofilmes foi mÃxima em RPMI pH 7,0, em inÃculo de 1x106 cÃlulas/mL, e incubaÃÃo a 35ÂC, sob agitaÃÃo. Os biofilmes produzidos nessas condiÃÃes sÃo formados por comunidades dinÃmicas, associadas a uma matriz extracelular, e mostram aumento da atividade metabÃlica e biomassa ao longo do tempo, atingindo estabilidade apÃs 48 h de cultivo. Durante o desenvolvimento dos biofilmes, ocorre liberaÃÃo de cÃlulas viÃveis e Ãcidos nuclÃicos para o ambiente circundante. Os biofilmes de T. inkin produzem mais proteases e toleram maiores concentraÃÃes de antifÃngicos que as cÃlulas planctÃnicas relacionadas. Dada à presenÃa de proteases durante o desenvolvimento do biofilme de T. inkin, foi hipotetizado que essas enzimas poderiam ser consideradas alvos importantes no controle dos biofilmes. Os resultados mostraram que o ritonavir diminuiu a adesÃo celular e formaÃÃo de biofilmes maduros, alÃm de reduzir a atividade proteÃsica e alterar a estrutura dos biofilmes. O ritonavir nÃo interferiu na atividade metabÃlica de biofilmes maduros, mas alterou a composiÃÃo da matriz extracelular dos biofilmes, as quais apresentaram diferentes espectros protÃicos em comparaÃÃo com o grupo controle. O ritonavir inibiu o crescimento planctÃnico de T. asahii e T. inkin a 100 &#956;g/mL. Entretanto, nÃo foi observado sinergismo entre o ritonavir e os antifÃngicos testados. Em cÃlulas planctÃnicas, a prÃ-exposiÃÃo ao ritonavir reduziu significativamente os valores de concentraÃÃo inibitÃria mÃnima da anfotericina B em T. asahii e T. inkin, embora nÃo tenha alterado a resposta aos azÃlicos. A prÃ-incubaÃÃo com ritonavir reduziu a adesÃo das cÃlulas, mas nÃo a formaÃÃo de biofilmes maduros, alÃm de alterar a hidrofobicidade da superfÃcie celular. O presente artigo detalhou caracterÃsticas dos biofilmes de T. inkin e mostrou o potencial do uso de um inibidor de proteases no controle dos biofilmes de T. asahii e T. inkin. / In recent years, several studies have considered Trichosporon genus as emerging opportunistic pathogens in immunocompromised patients. Although the dynamics are not well understood, it is known that events associated with biofilm formation on these fungi play an important role in the infectious process. Thus, the present study analyzed morphophysiological aspects of biofilms produced by Trichosporon spp., as well as the role of a protease inhibitor on T. asahii and T. inkin cells and biofilms. In the first part of the study, we investigated the biofilm formation of T. inkin (n=7) in RPMI broth, CLED broth and Sabouraud broth at pH 5.5 and pH 7.0, with initial inoculum of 1x104, 1x105 and 1x106 cells/ml, incubated at 28ÂC and 35ÂC in static or shaking at 80 rpm. Biofilms were evaluated for their biomass and metabolic viability, viable cell counts, quantification of nucleic acids and proteinase activity. It was also investigated the sensitivity of the biofilm front of amphotericin B, caspofungin, fluconazole, itraconazole and voriconazole. To evaluate the inhibitory activity of ritonavir on the structure and functioning of T. asahii and T. inkin biofilms, biofilms were formed in the presence of ritonavir and evaluated for cell adhesion, structural development and proteinase activity. Additionally, ritonavir was assessed on mature biofilms, matrix composition and structural changes. Planktonic cells of T. asahii and T. inkin (n=2 each) were also investigated for sensitivity to ritonavir alone and in combination with antifungals. Finally, planktonic cells were pre-exposed to ritonavir and evaluated for biofilm formation capacity, susceptibility to antifungal agents, and changes in their surface hydrophobicity. Maximum biofilms growth in RPMI pH 7.0 for inoculation of 1x106 cells/ml and incubation at 35ÂC under stirring. Biofilms produced under these conditions are formed by dynamic communities associated with an extracellular matrix, and show increased viability and biomass over time, reaching stability after 48 hours of cultivation. During the development of biofilms occurs release of viable cells and nucleic acids into the surrounding environment. T. inkin biofilms produce more proteases and tolerate higher concentrations of antifungals that planktonic cells related. Due to the presence of proteases in the development of T. inkin biofilm, it was hypothesized that these enzymes could be considered important targets in controlling biofilms. The results showed that ritonavir decreased cell adhesion and formation of mature biofilms, and reduce protease activity and change the structure of biofilms. Ritonavir did not affect the viability of mature biofilms, but changed the composition of the extracellular matrix of biofilms, which showed different protein spectra compared to the control group. Ritonavir was able to inhibit planktonic growth of T. asahii and T. inkin approximately 50%. However, there was no synergism between ritonavir and tested antifungals. In planktonic cells, pre-exposure to ritonavir significantly reduced values of minimum inhibitory concentration of Amphotericin B in T. asahii and T. inkin, although not change the response to azoles. Preincubation with ritonavir reduced cell adhesion, but not the formation of mature biofilms, in addition to changing the hydrophobicity of the cell surface. The article detailed characteristics of T. inkin biofilms and showed the potential use of a protease inhibitor in controlling these biofilms.
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Atividade da molÃcula tirosol, vancomicina e antibiÃticos beta-lactÃmicos sobre o crescimento de candida spp. resistentes a derivados azÃlicos, na forma planctÃnica e biofilme / Atividade da molÃcula tirosol, vancomicina e antibiÃticos beta-lactÃmicos sobre o crescimento de Candida spp. Resistentes a derivados azÃlicos, na forma planctÃnica e biofilme

Carlos Eduardo Cordeiro Teixeira 26 September 2014 (has links)
Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Diversos sÃo os relatos de resistÃncia in vitro de cepas de Candida spp a fÃrmacos antifÃngicos, em especial a derivados azÃlicos A produÃÃo de biofilme à um importante fator de virulÃncia e traz grandes repercussÃes clÃnica devido ao aumento da resistÃncia à terapia antifÃngica Deste modo a prospecÃÃo de novos compostos com propriedade antifÃngica se faz necessÃria Alguns estudos tÃm evidenciado a atividade das molÃculas de quorum-sensing farnesol e tirosol e de antibiÃticos beta-lactÃmicos e glicopeptÃdeos contra espÃcies de Candida. Por conseguinte o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da molÃcula quorum-sensing tirosol associados ou nÃo a antifÃngicos clÃssicos e dos antimicrobianos vancomicina meropenem cefepime e piperacilina-tazobactam sobre o crescimento de Candida spp resistentes a derivados azÃlicos nas formas planctÃnicas e em biofilme Para tanto foram utilizadas cepas de C albicans (n=10) e C tropicalis (n=10) A concentraÃÃo inibitÃria mÃnima (CIM) foi determinada por meio da tÃcnica de microdiluiÃÃo preconizada pelo CLSI Adicionalmente foi investigada a aÃÃo do tirosol e dos antibacterianos sobre o biofilme em formaÃÃo e maduro de Candida spp As CIMÂs para tirosol variaram de 2,5 a 5 mM e para os antibiÃticos variaram de 500 a 2000 Âg/mL para ambas as espÃcies Foi observado efeito sinÃrgico na associaÃÃo entre itraconazol e tirosol (18/20 cepas) e entre o fluconazol e tirosol (18/20 cepas) enquanto a associaÃÃo anfotericina B e tirosol apresentou sinergismo em 5 cepas de C tropicalis e 6 cepas de C albicans O tirosol isolado apresentou efeito sobre a formaÃÃo de biofilme de ambas as espÃcies na concentraÃÃo 50XMIC (P<0,0001) Em relaÃÃo ao efeito do tirosol sobre biofilme formado observou-se um aumento na concentraÃÃo 10XMIC e uma diminuiÃÃo na concentraÃÃo 50XMIC A combinaÃÃo entre tirosol e drogas antifÃngicas apresentou um aumento na atividade do biofilme maduro diretamente proporcional à concentraÃÃo testada quando o tirosol foi associado a derivados azÃlicos e uma diminuiÃÃo quando associado com anfotericina B Todos os antibacterianos apresentaram efeito estatisticamente significativo sobre o biofilme em de Candida spp em formaÃÃo (P<0,0001) Em relaÃÃo ao efeito dos antibiÃticos vancomicina meropenem piperacilina/tazobactam e cefepime sobre o biofilme formado de Candida spp foram observadas reduÃÃes estatisticamente significativa na atividade celular nas concentraÃÃes MIC/10 (P<0,0001) MIC (P<0,0001) 10XMIC (P<0,0001) e 50XMIC (P<0,0001) Este estudo apresenta uma possÃvel aÃÃo do tirosol isolado ou combinado com drogas antifÃngicas e de antibacterianos sobre Candida spp na forma planctÃnica e em biofilme / Diversos sÃo os relatos de resistÃncia in vitro de cepas de Candida spp. a fÃrmacos antifÃngicos, em especial a derivados azÃlicos. A produÃÃo de biofilme à um importante fator de virulÃncia e traz grandes repercussÃes clÃnica devido ao aumento da resistÃncia à terapia antifÃngica. Deste modo, a prospecÃÃo de novos compostos com propriedade antifÃngica se faz necessÃria. Alguns estudos tÃm evidenciado a atividade das molÃculas de quorum-sensing farnesol e tirosol e de antibiÃticos beta-lactÃmicos e glicopeptÃdeos contra espÃcies de Candida. Por conseguinte, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da molÃcula quorum-sensing tirosol associados ou nÃo a antifÃngicos clÃssicos, e dos antimicrobianos vancomicina, meropenem, cefepime e piperacilina-tazobactam, sobre o crescimento de Candida spp., resistentes a derivados azÃlicos, nas formas planctÃnicas e em biofilme. Para tanto, foram utilizadas cepas de C. albicans (n=10) e C. tropicalis (n=10). A concentraÃÃo inibitÃria mÃnima (CIM) foi determinada por meio da tÃcnica de microdiluiÃÃo, preconizada pelo CLSI. Adicionalmente foi investigada a aÃÃo do tirosol e dos antibacterianos sobre o biofilme em formaÃÃo e maduro de Candida spp. As CIMÂs para tirosol variaram de 2,5 a 5 mM e para os antibiÃticos variaram de 500 a 2000 Âg/mL, para ambas as espÃcies. Foi observado efeito sinÃrgico na associaÃÃo entre itraconazol e tirosol (18/20 cepas) e entre o fluconazol e tirosol (18/20 cepas), enquanto a associaÃÃo anfotericina B e tirosol apresentou sinergismo em 5 cepas de C. tropicalis e 6 cepas de C. albicans. O tirosol isolado apresentou efeito sobre a formaÃÃo de biofilme de ambas as espÃcies na concentraÃÃo 50XMIC (P<0,0001). Em relaÃÃo ao efeito do tirosol sobre biofilme formado, observou-se um aumento na concentraÃÃo 10XMIC e uma diminuiÃÃo na concentraÃÃo 50XMIC. A combinaÃÃo entre tirosol e drogas antifÃngicas apresentou um aumento na atividade do biofilme maduro diretamente proporcional à concentraÃÃo testada, quando o tirosol foi associado a derivados azÃlicos e uma diminuiÃÃo quando associado com anfotericina B. Todos os antibacterianos apresentaram efeito estatisticamente significativo sobre o biofilme em de Candida spp. em formaÃÃo (P<0,0001). Em relaÃÃo ao efeito dos antibiÃticos vancomicina, meropenem, piperacilina/tazobactam e cefepime sobre o biofilme formado de Candida spp., foram observadas reduÃÃes estatisticamente significativa na atividade celular nas concentraÃÃes MIC/10 (P<0,0001), MIC (P<0,0001), 10XMIC (P<0,0001) e 50XMIC (P<0,0001). Este estudo apresenta uma possÃvel aÃÃo do tirosol isolado ou combinado com drogas antifÃngicas e de antibacterianos, sobre Candida spp. na forma planctÃnica e em biofilme.
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Pesquisa de substâncias antifúngicas provenientes de madeiras duráveis da Amazônia

Basset, Charlie 15 November 2011 (has links)
Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, Université des Antilles et de La Guyane, Faculté de sciences, Technologies et Santé École Doctorale Santé, Environnement et Sociétés dans les Amériques Spécialité Chimie des Substances Naturelles, 2011. / Submitted by Sabrina Silva de Macedo (sabrinamacedo@bce.unb.br) on 2012-06-28T16:19:24Z No. of bitstreams: 1 2011_CharlieBasset.pdf: 16646080 bytes, checksum: 202b47b76e9f64d6a4083eb5ff9d032a (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-07-04T12:05:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_CharlieBasset.pdf: 16646080 bytes, checksum: 202b47b76e9f64d6a4083eb5ff9d032a (MD5) / Made available in DSpace on 2012-07-04T12:05:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_CharlieBasset.pdf: 16646080 bytes, checksum: 202b47b76e9f64d6a4083eb5ff9d032a (MD5) / Hoje em dia, a descoberta de novos agentes terapêuticos para o tratamento de doenças fúngicas torna-se essencial. Algumas árvores da Amazônia desenvolveram ao longo daevolução metabólitos secundários de defesa, para proteger-se contra a degradação. Estas mesmas substâncias vegetais podem tornar-se candidatas potenciais para o desenvolvimento de compostos antifúngicos. Esta tese de doutorado descreve a seleção bio-inspirada e a coletade espécies da floresta amazônica da Guiana Francesa possuidoras de madeira altamente resistente aos fungos; a partir das quais é proposto isolar, identificar e valorizar os metabólitos secundários responsáveis da durabilidade natural, e estudar as suas propriedades em fungos patogénicos humanos. O estudo levou ao isolamento de substâncias inéditas e forneceu informações adicionais quimiotaxonômicas importantes para as espécies estudadas. No mais,foi possível estabelecer que duas substâncias podem ser relevantes para o desenvolvimento de terapias antimicóticas. ______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / It is now essential to discover new therapeutic agents against the increase of human fungal infections. On the other hand, some Amazonian trees have succeeded to develop a chemical defense arsenal to protect themselves against fungal degradation. These compounds of plantorigin could become potential candidates for the development of antifungal compounds forthe treatment of human fungal diseases. The refore, this manuscript describes the bio-inspiredselection and collection of Amazonian tree species capable of specializing a highly fungi resistant wood; from which it is proposed to isolate, identify and valorize the secondary metabolites responsible for the natural durability, and study their properties on human pathogenic fungi. Ultimately, this study led to the isolation of new compounds and providingad ditional important chemotaxonomic information for the species studied. In addition, it asbeen established that two compounds could be relevant for the development of antimitotic therapies.
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Análise da expressão de genes envolvidos na interação inicial entre macrófagos murinos e Fonsecaea pedrosoi ou suas frações

Nóbrega, Yanna Karla de Medeiros January 2011 (has links)
Tese (Doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2011. / Submitted by Guimaraes Jacqueline (jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-11-26T10:59:37Z No. of bitstreams: 1 2011_Yanna Karla de Medeiros Nóbrega.pdf: 5544359 bytes, checksum: 01418a2067021b2e3180c45b348f3394 (MD5) / Rejected by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br), reason: on 2013-11-26T11:01:07Z (GMT) / Submitted by Guimaraes Jacqueline (jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-11-26T11:06:06Z No. of bitstreams: 1 2011_Yanna Karla de Medeiros Nóbrega.pdf: 5544359 bytes, checksum: 01418a2067021b2e3180c45b348f3394 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-11-26T11:06:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_Yanna Karla de Medeiros Nóbrega.pdf: 5544359 bytes, checksum: 01418a2067021b2e3180c45b348f3394 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-11-26T11:06:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_Yanna Karla de Medeiros Nóbrega.pdf: 5544359 bytes, checksum: 01418a2067021b2e3180c45b348f3394 (MD5) / A cromoblastomicose é uma micose crônica, supurativa e granulomatosa desenvolvida no tecido cutâneo e subcutâneo, causada por vários fungos dematiáceos sendo o Fonsecaea pedrosoi, o principal fungo isolado de pacientes acometidos por esta doença. A parede celular deste fungo é composta pelas frações F1 (ß 1 3 glicana e quitina) e F2 (a 1 3 glicana e melanina), sendo importantes estruturas de reconhecimento pelo hospedeiro. Os eventos iniciais da ativação das células da resposta imune inata após a interação com o patógeno tem despertado grande interesse. Na resposta imune ao F. pedrosoi os macrófagos têm um papel fundamental no curso da infecção, pois estão envolvidas no desenvolvimento da resposta inflamatória granulomatosa e nos mecanismos microbicidas. Para que essas células produzam intermediários reativos microbicidas é necessário que sejam ativados, no curso da cromoblastomicose, F. pedrosoi é capaz de modular a ativação dos macrófagos, tornando os apenas fungistático. Uma forma de avaliar o padrão de ativação dos macrófagos, após contato com o patógeno, é analisar a expressão de genes envolvidos no reconhecimento, adesão do fungo e na produção de citocinas. Considerando que o perfil da expressão gênica de macrófagos após a interação com F. pedrosoi até o momento não foi analisado, o objetivo deste trabalho foi definir o padrão de expressão dos genes (Itga5, Clec2, Cd14, Tlr2, Tlr4, Myd88, Nf?b, N?rf e Tnf$a ) envolvidos nas etapas iniciais de interação (30min, 1h, 3h, 6h e 24h) com o fungo ou seus componentes de parede isolados. Quando analisamos a modulação da expressão de genes pela interação entre macrófagos e os conídios, os resultados demonstram que houve o aumento no número de transcritos do gene Tlr4 e Myd88 (em 30min) e Cd14 e Tlr2 (em 6h), embora os transcritos dos genes que participam da ativação da via de sinalização do NF ?B (Nf?B, Tnf$a e N?rf) não tenham sido detectados. Quando analisamos a interação entre macrófagos e a fração F1 de F. pedrosoi, vimos que houve aumento do número de transcritos nos genes Cd14, Tlr2, Nf?B e Tnf$a (em 6h) e repressão para o gene N?rf, apontando para uma sinalização da via de NF ?B, sendo possível sugerir que a interação entre o macrófago e essa fração pode modular a ativação dessa célula. Para a interação entre macrófagos e a fração F2, o tempo mais expressivo também foi de 6h, quando houve aumento no número de transcritos dos genes Clec$2, Nf?B e Tnf$a, com repressão do gene N?rf, sugerindo que essa fração parece modular a resposta do macrófago ao fungo, através do indução de transcritos do gene Clec$2 inicialmente. Os resultados sugerem que os componentes de parede celular do fungo F. pedrosoi após interagirem com macrófagos são capazes de modular os genes destas células, aumentando a capacidade destas células de reconhecer os componentes da parede celular do fungo, com subseqüentes mudanças funcionais, que a tornam incapaz de eliminar esse fungo. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The chromoblastomycosis is a chronic, suppurative and granulomatous mycosis that affects the skin and subcutaneous tissue and is caused by various different dematiaceous fungi. Fonsecaea pedrosoi is the main fungus isolated from patients suffering from this disorder. The cell wall of this fungus is composed by two fractions – the F1 fraction (β- 1-3-glucan and chitin) and the F2 fraction (α-1-3-glucan and melanin). These structures are important in the recognition of the fungus by the host immune system. Macrophages play a key role in the initial events of the innate immune reaction to this pathogen since they are involved in the developmental of a granulomatous inflammatory response and bactericidal activity. The macrophage microbicidal activity depends on reactive intermediates that need to be activated during the course of chromoblastomycosis. However, F. Pedrosoi is capable to modulate the activation of the macrophages reducing their activity only to fungistatic. The analysis of the expression of the genes involved in the recognition and adhesion of the fungus and the production of cytokines is a way to assess the pattern of activation of macrophages after their contact with the pathogen. The gene expression profile of the macrophages after their interaction with F. pedrosoi has not been analyzed so far. Consequently the aim of the present study was to define the expression pattern of the genes (Itga5, Clec2, Cd14, Tlr2, Tlr4, Myd88, Nfκb, Nκrf and Tnf-α) involved in the initial stages of interaction of the macrophage with the fungus or the distinct components of its wall (at 30min, 1h, 3h, 6h and 24h). The analysis of the modulation genes expression caused by the interaction between macrophages and conidia disclosed an increase in the number of transcripts Tlr4 and Myd88 (at 30min) and of Cd14 and Tlr2 (at 6h), although transcripts of genes participating in the activation of the signaling pathway of NF-κB (Nfκb, Tnf-α and Nκrf) could not been detected. In addition, the analysis of the interaction between macrophages and the fraction F1 of F. pedrosoi showed an increased in transcripts of the genes Cd14, Tlr2, Nfκb and Tnf-α (at 6h) and inhibition of the gene Nκrf, pointing to a signaling pathway of NF-κB, which suggests that the interaction between this fraction and the macrophage can modulate the activation of this cell. The analysis of the interaction between macrophages and the fraction F1 of F. pedrosoi, disclosed an increased numbers of transcribed genes Cd14, Tlr2, Nfκb and Tnf-α (at 6h) and repression of the gene Nκrf, pointing to a signaling pathway of NF-κB, which might suggest that the interaction between this fraction and the macrophage can modulate the activation of this cell. In considering the interaction between macrophages and the fraction F2 the time with more expression was also at 6 hours when an increase in the number of transcripts of the genes Clec-2, Nfκb and Tnf-α was detected, with simultaneous repression of the Nκrf gene, which suggests that this fraction apparently initially modulate the macrophage response to the fungus through the induction of the gene transcript Clec-2. These results suggest that components of the fungal cell wall of F. pedrosoi, after interacting with macrophages are able to modulate the genes of these cells, increasing their capacity to recognize the components of the fungal cell wall, with subsequent functional changes, which result in their inability to eliminate the fungus.
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Micologia forense : a dinâmica da microbiota fúngica na investigação do período post mortem

Moreira Filho, Renato Evando January 2008 (has links)
MOREIRA FILHO, Renato Evando. Micologia forense : a dinâmica da microbiota fúngica na investigação do período post mortem. 2008. 133 f. Dissertação (Mestrado em Microbiologia Médica) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2008. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-01-05T16:01:17Z No. of bitstreams: 1 2008_dis_remfilho.pdf: 8656233 bytes, checksum: 4e34b497cad879dbdcf63b864157b866 (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-02-02T14:07:31Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_dis_remfilho.pdf: 8656233 bytes, checksum: 4e34b497cad879dbdcf63b864157b866 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-02-02T14:07:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_dis_remfilho.pdf: 8656233 bytes, checksum: 4e34b497cad879dbdcf63b864157b866 (MD5) Previous issue date: 2008 / With developing of forensic observations, certain species of insects and microorganisms were described as indicators of periods of the degradation of the body. However, the literature is still scarce in the field of Forensic Mycology. It was investigated the microbiological characteristics of fungi presence in the post mortem change, as well as, it esteemed the value of the mycology exams in the study. 400 collections was accomplished in 60 human bodies (34 of the bloated stage, 06 of the putrefaction stage and 20 of the skeletonization stage) at the Fortaleza city morgue and public cemeteries in the state of Ceará, The picked material was analyzed through macro/microcharacteristics and specific biochemical tests. Ally to such analyses, was also accomplished the test of the perforation of the hair in vitro in hair of corpses in the bloated stage and in hair of healthy adults. The material gathered was analyzed at the Specialized Medical Mycology Center of the Federal University of Ceará. With the anthropological results, it was observed that male, in the interval of the 31 to the 40 years, was more commonly attacked, being the capital (Fortaleza) the more involved in the number of deaths. In the bloated stage, among the identified filamentous fungi, the presence of four orders was observed: Order Eurotiales (63 isolated Aspergillus spp and 21 isolated Penicillium spp), Order Mucorales (4 Mucor spp), Order Hypocreales (2 Acremonium spp, 1 Trichoderma spp and 1 Fusarium spp) and Order Saccharomycetales (2 Geotrichum spp). In the yeast distribution, it was observed the orders:Saccharomycetales (44 Candida spp) and Tremellales (5 Trichosporon spp). In the putrefaction stage, it was isolated the following orders: Eurotiales (Penicillium spp 2 and Aspergillus 2) and Hypocreales 1 (Acremonium spp). Regarding the yeasts, it was just isolated the Order Saccharomycetales (Candida spp 3). In the eskeletonization stage, the following orders were observed: Order Eurotiales (Aspergillus spp 22 and Penicillium spp 18), Order Mucorales (Mucor spp 10) and Order Hypocreales (Acremonium spp 2 and Trichoderma spp 1). Regarding the yeasts, two orders were found: Tremellales (Trichosporon spp 1) and Saccharomycetales (Candida spp 1). In the hair perforation test in vitro, it was positive in the bloated stage, differing of healthy adults,where the test was negative. For conclusion, Forensic Micology is still a rich field in data and fungi can come to be a tool in the aid of human post mortem diagnosis. / Com o evoluir das observações médico-legais, determinadas espécies de insetos e microrganismos foram descritos como indicadores de períodos da degradação do corpo. Entretanto, a literatura científica ainda é escassa no campo da Micologia Forense. Assim, investigaram-se as características microbiológicas dos fungos partícipes na mudança de flora post mortem em humanos, bem como estimou-se o valor da realização de exames micológicos no estudo cronotanatológico. Foram realizadas um total de 400 coletas em 60 corpos humanos (34 do período gasoso, 06 do coliquativo e 20 do esqueletizado) examinados no Instituto Médico-Legal de Fortaleza e em cemitérios do Estado do Ceará. Foram realizados estudos macro/micromorfólogicos e testes bioquímicos específicos para cada grupamento fúngico isolado. Aliado a tais análises, foi também realizado o teste da perfuração do pêlo in vitro em pêlos de cadáveres no período gasoso e em pêlos de adultos hígidos. Estas identificações foram realizadas no Centro Especializado em Micologia Médica da Universidade Federal do Ceará. Com os resultados antropológicos, foi observado que o sexo masculino, dos 31 aos 40 anos, foi o mais comumente acometido, sendo a capital (Fortaleza) a mais envolvida no número de mortes. No período gasoso, dentre os fungos filamentosos identificados, foi observada a presença de quatro ordens: Eurotiales (63 isolados de Aspergillus spp e 21 de Penicillium spp), Mucorales (4 Mucor spp) e Hypocreales (2 Acremonium spp, 1 Trichoderma spp e 1 Fusarium spp) e Saccharomycetales (2 Geotrichum spp). No referente às leveduras, verificaram-se as ordens: Saccharomycetales (Candida spp 44) e Tremellales (Trichosporon spp 5). No período coliquativo, registraram-se as ordens: Eurotiales (Penicillium spp 2 e Aspergillus 2) e Hypocreales 1 (Acremonium spp). No referente às leveduras, isolou-se apenas a Ordem Saccharomycetales (Candida spp 3). No período de esqueletização, verificaram-se as seguintes ordens: Eurotiales (Aspergillus spp 22 e Penicillium spp 18), Mucorales (Mucor spp 10) e Hypocreales (Acremonium spp 2 e Trichoderma spp 1). No referente às leveduras, registraram-se duas ordens: Tremellales (Trichosporon spp 1) e Saccharomycetales (Candida spp 1). Quanto ao teste de perfuração do pêlo in vitro, a positividade foi observada no período gasoso, diferindo de adultos hígidos, em que foi negativa. Conclui-se que o estudo da Micologia Forense ainda é um campo rico em dados e que os fungos poderão vir a ser uma ferramenta complementar no estudo do tempo de morte em Medicina Legal.
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Suporte cerâmico para imobilização de basidiomicetos em biorremediação de solos.

Compart, Luciana Cristina Amaral January 2004 (has links)
Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Materiais. Rede Temática em Engenharia de Materiais, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto. / Submitted by Marise Leite (marise_mg@yahoo.com.br) on 2016-02-29T12:41:36Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) DISSERTAÇÃO_SuporteCerâmicoImobilização.pdf: 1573561 bytes, checksum: 17913c0266fe0cce055fa399b92bc745 (MD5) / Approved for entry into archive by Oliveira Flávia (flavia@sisbin.ufop.br) on 2016-04-11T13:22:06Z (GMT) No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO_SuporteCerâmicoImobilização.pdf: 1573561 bytes, checksum: 17913c0266fe0cce055fa399b92bc745 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-11T13:22:06Z (GMT). No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO_SuporteCerâmicoImobilização.pdf: 1573561 bytes, checksum: 17913c0266fe0cce055fa399b92bc745 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2004 / Entre os compostos sintéticos mais poluentes, podemos citar os organoclorados. A vida extremamente longa desses compostos, em ambientes naturais, amplifica a sua toxicidade e os problemas de riscos à saúde humana. No Brasil, fungos basidiomicetos estão sendo avaliados para a biorremediação de solos contaminados com organoclorados empregando-se biorreatores com 400kg de solo. Na etapa da inoculação ocorre perda de 70% da viabilidade do inóculo, devido ao atrito ocasionado pela mistura do micélio ao solo. O presente trabalho teve como objetivo desenvolver e caracterizar um suporte para a imobilização do inóculo fúngico, visando diminuir o atrito e manter a viabilidade do inóculo. Dentre as diversas matérias-primas avaliadas (bucha vegetal, compósito celulose/caramelo, pó de ardósia e de alumina) foi selecionado o pó de ardósia. A forma de esfera oca (de ~16mm, ~22mm e ~49mm de diâmetro) foi considerada a mais apropriada para a elaboração dos suportes. A densidade real da ardósia estudada foi de 2,70g/cm3. As barbotinas (suspensão de pó de ardósia em água) nas concentrações de sólido de 40% e 50% v/v foram analisadas quanto à viscosidade e ao potencial Zeta, sendo a concentração de 40% v/v a que apresentou menor viscosidade e maior valor de potencial Zeta. A sinterização foi realizada nas temperaturas de 850°C, 950°C, 1000°C, 1050°C e 1070°C. O produto sinterizado foi analisado por difração de Raios-X (DRX), microscopia eletrônica de varredura (MEV), e porosidade por intrusão de mercúrio (PIM). O DRX mostrou que as fases presentes no pó de ardósia são quartzo, clorita, moscovita e albita, enquanto nas peças sinterizadas a 1050°C são quartzo, microclínio e albita. A temperatura de 1050°C é a mais indicada para a sinterização dos suportes cerâmicos, porque permite a obtenção dos suportes com porosidade menor que 1%, sem que ocorra a deformação dos mesmos. A imobilização de Psilocybe castanella CCB444 foi realizada por meio da inoculação de discos de crescimento obtidos em meio agar extrato de malte (MEA) nos suportes contendo o substrato lignocelulósico, previamente esterilizado. Os suportes colonizados foram incubados a 28°C. A biomassa fúngica foi estimada pela quantificação do ergosterol (conversão ergosterol-biomassa). O crescimento exponencial de P. castanella, imobilizado nos suportes, foi observado a partir do 14° dia. As atividades de fenoloxidases e de lacases foram determinadas em diferentes tempos de cultivo, empregando-se metodologias padronizadas. Estas atividades foram detectadas a partir do quinto dia de crescimento do inóculo imobilizado. Os suportes colonizados foram submetidos a teste de eficiência mecânica em moinho (75rpm), contendo areia grossa. O desgaste dos suportes, determinado por avaliação visual antes e após o teste, não foi influenciado pelo tamanho da esfera, nem pelo tempo de duração do ensaio. O teste de viabilidade consistiu em colocar o suporte (na proporção de 3%) no moinho contendo areia, por 45’ a 75rpm, e determinar a biomassa fúngica e as atividades enzimáticas, antes e após o ensaio. O inoculo não imobilizado também foi avaliado. O fungo imobilizado no suporte cerâmico teve uma perda de atividade enzimática de 5%, enquanto para o fungo não imobilizado esta perda foi de 88%. Os resultados evidenciaram o potencial dos suportes cerâmicos, produzidos com o pó de ardósia, para imobilização de inóculo fúngico, visando sua utilização em processos de biorremediação de solos. ____________________________________________________________________________________ / ABSTRACT: Among the most pollutant synthetic compounds we can mention the organochlorines. The extremely long duration of these substances in the environment amplifies their toxicity and the risks for the human health. In Brazil, the basidiomycetes fungi are being evaluated for the bioremediation of contaminated soil using bioreactors with capacity of handling 400kg of soil. During the inoculation stage there is a loss of ~70% of the inoculum due to friction during mixing of the mycelia to the soil. The objective of the present work was to develop and characterize a support for fungi inoculum immobilization aiming to avoid the direct friction between inoculum and soil. We have investigated some raw materials (vegetable sponge, cellulose/caramel composite, alumina and slate powder for ceramics) for the support prodution. The slate powder was selected as the raw material for the ceramic support. The hollow sphere form (of ~16mm, ~22mm and ~49mm of diameter) was considered the most appropriate for the ceramic supports. The true density of the slate powder was mesured as 2.7g/cm3. The viscosity and the Zeta potential of the slips made with concentrations of 40% and 50% v/v of the slate powder were measured. The 40% v/v slip presented the lowest viscosity and the highest module of Zeta potential. The sintering was performed in an eletric muffle at 850°C, 950°C, 1000°C, 1050°C and 1070°C during 60 minutes. The sintered materials were analyzed used X-ray diffraction (XRD), scanning eletron microscopy (SEM) and mercury intrusion porosimetry (MIP). The XRD showed that the phases in the slate powder are quartz, chlorite, muscovite and albite while in the ceramic sample sinterized at 1050°C the phases were quartz, microcline and albite. The sintering temperature of 1050°C was selected for the production of ceramic support since we obtained samples with porosity < 1% and no cracks or warping. The immobilization of the Psilocybe castanella CCB444 was made by inoculating the mycelial disks into the ceramic supports with lignocellulose substrate. Colonized supports were incubated at 28°C. The fungal biomass was calculated by the quantification of ergosterol (ergosterol-to-biomass conversion). The exponential growth of P. castanella immobilized in the supports was observed after the day 14. The phenoloxidases and laccases activities have been determined at different time intervals and these activities have been detected after the 5th day of growth of immobilized inoculum. The colonized supports have been tested for mechanic resistence in a milling mill (75rpm) containing coarse sand. The abrasion of the supports determined by visual inspection before and after the test was not influenced neither by the size of the sphere nor by the testing time duration. In the viability test we have added 3% of the support spheres in the milling mill (75rpm during 45'). The determination of the fungic biomass and the enzymatic activities were measured before and after the assay. Immobilized fungus in the ceramic support had a 5% loss in the enzymatic activity while not immobilized fungus had a 88% loss. The results commfirm the great potential of the ceramic supports for fungal inoculum immobilization.
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Estudo de fatores associados à virulência e imunidade na interação entre macrófagos e Cryptococcus neoformans

Nicola, André Moraes 01 October 2011 (has links)
Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular. 2011. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2012-05-04T11:00:25Z No. of bitstreams: 1 Tese versao final.pdf: 34222648 bytes, checksum: 674bc4915b3bdf2d82beeb39a1bcfb06 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2012-05-07T14:37:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese versao final.pdf: 34222648 bytes, checksum: 674bc4915b3bdf2d82beeb39a1bcfb06 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-05-07T14:37:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese versao final.pdf: 34222648 bytes, checksum: 674bc4915b3bdf2d82beeb39a1bcfb06 (MD5) / Cryptococcus neoformans é uma levedura encapsulada patogênica, causadora de meningoencefalite severa. Estima-se uma incidência anual de um milhão de casos de criptococose no mundo, com mais de 600.000 mortes. O desenvolvimento da criptococose se correlaciona fortemente com o estado imunitário do paciente, sendo os macrófagos as principais células efetoras na resposta imune contra esse fungo. O objetivo desta tese é estudar fatores do hospedeiro e do patógeno que sejam importantes durante a interação entre C. neoformans e macrófagos. Os trabalhos desta tese foram divididos em quatro capítulos baseados em quatro objetivos específicos. O primeiro objetivo foi estudar vesículas extracelulares de C. neoformans, utilizadas pelo fungo para secretar polissacarídeos capsulares e outros fatores de virulência. Sondas lipofílicas mostraram vesículas na superfície da cápsula e sugeriram que estas estruturas possuem RNA. Outros dois projetos também mostraram a importância das vesículas na melanização de C. neoformans e na secreção de toxinas por Bacillus anthracis. Outro tema abordado foi o mecanismo de ação de anticorpos monoclonais contra a cápsula de C. neoformans. Experimentos de expressão gênica feitos com fungos expostos a anticorpos monoclonais sugeriram indução da biossíntese de ácidos graxos. Esta alteração metabólica foi confirmada por métodos bioquímicos e se correlacionou com um aumento na susceptibilidade ao antifúngico anfotericina B, sugerindo que anticorpos ajam também alterando o metabolismo do patógeno. Em outro trabalho, foi feita uma varredura com biblioteca de RNAs de interferência para identificar o receptor de superfície do isotipo IgG3 murino. A interferência com um dos genes identificados na varredura, a integrina beta 1 (Itgb1), levou a diminuição da ligação deste isotipo à superfície de macrófagos e da fagocitose mediada por IgG3, sem nenhum efeito na função do isotipo IgG1. Estes resultados sugerem que Itgb1 possa ser o receptor específico deste isotipo de IgG murino, que vem sendo procurado há três décadas. Foram também estudadas por citometria de fluxo a cinética da fagocitose e a exocitose não-lítica de C. neoformans, um fenômeno descrito recentemente pelo qual o fungo é expelido pelo macrófago sem que nenhuma das duas células morra. Drogas que neutralizam a acidez do fagolisossomo alteraram a taxa de exocitose não-lítica, indicando que o pH deste compartimento é importante para a liberação do fungo. Adicionalmente, a metodologia citométrica foi utilizada para medir exocitose não-lítica em pulmões de camundongo, com aproximadamente 45% em comparação com taxa de pouco menos de 10% in vitro. Estes resultados sugerem que a exocitose não-lítica ocorra durante a criptococose, com importantes implicações no entendimento desta doença. Por fim foi testada a hipótese de que a autofagia do macrófago seja importante na resposta imune contra C. neoformans. A autofagia é um mecanismo conservado em eucariotos para a reciclagem de material intracelular que tem sido implicado na imunidade contra um número cada vez maior de patógenos intracelulares. Experimentos de imunofluorescência mostraram fagossomos contendo C. neoformans positivos para o marcador de autofagossomos LC3. RNA de interferência contra ATG5, um gene essencial para autofagia, diminuiu a atividade antifúngica de macrófagos e as taxas de exocitose não-lítica e aumentou a secreção de citocinas pró-inflamatórias como IL-6, TNF-α, IL-12 e IFN-γ. Camundongos com nocaute condicional de ATG5 não apresentaram nenhuma diferença de sobrevida em relação aos controles após infecção por C. neoformans. Entretanto, estes animais tiveram uma resposta imune com melhor balanço Th1/Th2 que resultaram em menor carga fúngica e diferenças no padrão histopatológico pulmonar. Estes resultados sugerem que a autofagia tem múltiplos papéis na imunidade contra C. neoformans. Em conjunto, estes trabalhos esclarecem alguns pontos na importante relação entre C. neoformans e macrófagos do hospedeiro e podem servir como base para trabalhos translacionais que melhorem a profilaxia ou terapêutica da criptococose. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Cryptococcus neoformans is an encapsulated pathogenic yeast that causes severe meningoencephalitis. It is estimated that over one million cases of cryptococcosis occur each year, with about 600,000 deaths. Macrophages are the main effector cells in immunity against this fungus. The objective of this thesis is to study host and pathogen factors that are important during the interaction between C. neoformans and macrophages. The work described in this thesis has been divided in four chapters based in four specific objectives. The first objective was to study C. neoformans extracellular vesicles, used by the fungus to secrete capsular polysaccharide and several other virulence factors. Lipophilic probes revealed vesicles on the capsule surface and suggested that they may carry RNA. Two other projects also showed the importance of extracellular vesicles in C. neoformans melanization and Bacillus anthracis toxin secretion. Another subject was the mechanism of action of monoclonal antibodies to the C. neoformans capsule. Gene expression studies made with C. neoformans that had been exposed to monoclonal antibodies suggested an induction of fatty acid biosynthesis. This metabolic alteration was confirmed using biochemical methods and correlated with increased susceptibility to the antifungal amphotericin B, suggesting that antibodies also act by altering the metabolism of the pathogen. Another project involved screening an RNAi library to search for the cell surface receptor of murine IgG3. Interference with one of the genes identified in the screening, integrin beta 1 (Itgb1), resulted in decreased binding of this antibody to macrophage surface and impaired IgG3-mediated phagocytosis, with no effect in the function of IgG1. These results suggest that Itgb1 may be the specific murine IgG3 receptor, which has been pursued for over three decades. The kinetics of phagocytosis and non-lytic exocytosis, a recently described phenomenon in which C. neoformans is expelled from macrophages without harm to either cell type, were also studied using flow cytometry. Drugs that neutralize the phagolysosomal acidity altered the non-lytic exocytosis rates, indicating that the pH inside this compartment influences fungal release. Additionally, the cytometric methodology was used to measure non-lytic exocytosis in mouse lungs, with a rate of approximately 45% in comparison with 10% in vitro. The suggestion that non-lytic exocytosis happens during cryptococcosis could have important implications in understanding this disease. Lastly, the hypothesis that macrophage autophagy is involved in the immune response against C. neoformans was tested. Autophagy is a mechanism conserved in all eukaryotes to recycle intracellular material and has been implicated in immunity against an ever-growing list of intracellular pathogens. Immunofluorescence showed C. neoformans-containing phagosomes positive for the autophagosome marker LC3. RNA interference against ATG5, a gene that is essential for autophagy, decreased macrophage antifungal activity and non-lytic exocytosis and increased secretion of pro-inflammatory cytokines such as IL-6, TNF-α, IL-12 e IFN-γ. ATG5 conditional knockout mice had no survival difference compared to controls after infection with C. neoformans. However, these animals had an immune response with better Th1/Th2 balance that resulted in lower fungal burden and different histopathological pattern in the infected lungs. These results suggest that autophagy has multiple roles in immunity against C. neoformans. As a whole, the work described in this thesis clarify some points in the important interaction between C. neoformans and host macrophages and could be the basis for future translational studies that could improve cryptococcosis prophylaxis or therapy.
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Meliolaceae em plantas do Cerrado

Soares, William Rosa de Oliveira 29 February 2012 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, 2012. / Submitted by Tania Milca Carvalho Malheiros (tania@bce.unb.br) on 2012-05-11T16:14:42Z No. of bitstreams: 1 2012_WilliamRosaOliveiraSoares_Parcial.pdf: 9914177 bytes, checksum: 03281b5c24a571a50d595d3978a5f926 (MD5) / Rejected by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br), reason: inserir resumo. on 2012-05-14T16:41:38Z (GMT) / Submitted by Tania Milca Carvalho Malheiros (tania@bce.unb.br) on 2012-05-15T12:55:26Z No. of bitstreams: 1 2012_WilliamRosaOliveiraSoares.pdf_Parcial.pdf: 9938693 bytes, checksum: f4411fea09fdf2a22b5cd4b945dc5cb7 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2012-05-16T17:44:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_WilliamRosaOliveiraSoares.pdf_Parcial.pdf: 9938693 bytes, checksum: f4411fea09fdf2a22b5cd4b945dc5cb7 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-05-16T17:44:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_WilliamRosaOliveiraSoares.pdf_Parcial.pdf: 9938693 bytes, checksum: f4411fea09fdf2a22b5cd4b945dc5cb7 (MD5) / Vinte espécies diferentes pertencentes à família Meliolaceae foram documentadas parasitando membros de treze famílias de plantas hospedeiras, provenientes de diversas regiões do cerrado brasileiro. Desse total, doze são prováveis espécies novas, três são prováveis variedades novas e cinco espécies já conhecidas. Das doze primeiras, nove espécies pertencem ao gênero Meliola, duas ao gênero Appendiculella e uma ao gênero Irenopsis, Já as variedades, pertencem ao gênero Meliola. Além disso, Anemopaegma acutifolium, Merremia contorquens, Sweetia fruticosa, Eriosema congestrum, Albizia polyantha, Sorocea guilleminiana e Psycotria melaneoides, foram, pela primeira vez, relatados como hospedeiras de melioláceos. Além disso, nove das espécies estudadas se constituíram em novos registros para os estados em que foram coletadas. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Twenty different fungal species collected in several areas of the Brazilian Cerrado, belonging in family Meliolaceae and infecting members of thirteen plant families were described, illustrated, and identified. Twelve samples belong probably in new species, three new varieties, and finally five were known species. Among the first group nine are Meliola, three Appendiculella species and one Irenopsis. All varieties detected are Meliola species. The host plants, Anemopaegma acutifolium, Merremia contorquens, Sweetia fruticosa, Eriosema congestrum, Albizia polyantha, Sorocea guilleminiana and Psycotria melaneoides, for the first time listed as hosts of meliolaceous fungi. Also, nine of the species studied are new records for the states where they were collected.

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