CoordenaÃÃo de AperfeÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Nos Ãltimos anos, diversos estudos tÃm considerado os fungos do gÃnero Trichosporon como patÃgenos oportunistas emergentes em pacientes imunocomprometidos. Embora a dinÃmica nÃo seja bem compreendida, sabe-se que eventos associados à formaÃÃo de biofilme nestes fungos tÃm papel importante no processo infeccioso. Desta forma, o presente estudo analisou aspectos morfofisiolÃgicos dos biofilmes produzidos por T. inkin, bem como o papel de um inibidor de proteases sobre as cÃlulas e biofilmes de T. asahii e T. inkin. Na primeira parte da pesquisa, foi investigada a formaÃÃo de biofilmes de T. inkin (n=7) nos meios RPMI, Caldo CLED e Caldo Sabouraud, em pH 5,5 e pH 7,0, com inÃculos iniciais de 1x104, 1x105 e 1x106 cÃlulas/mL, incubados a 28ÂC e 35ÂC, de forma estÃtica ou agitaÃÃo a 80 rpm, por 48h. Os biofilmes formados foram avaliados quanto à biomassa e atividade metabÃlica, contagem de cÃlulas viÃveis, quantificaÃÃo de Ãcidos nuclÃicos e atividade proteÃsica. Investigou-se ainda a sensibilidade dos biofilmes frente à anfotericina B, caspofungina, fluconazol, itraconazol e voriconazol. Para avaliaÃÃo da atividade inibitÃria do ritonavir sobre a estrutura e o funcionamento dos biofilmes de T. asahii e T. inkin, biofilmes foram formados na presenÃa de ritonavir e avaliados quanto à adesÃo celular, desenvolvimento estrutural e atividade proteÃsica. Adicionalmente, o ritonavir foi avaliado sobre biofilmes maduros, composiÃÃo de matriz e alteraÃÃes estruturais. CÃlulas planctÃnicas de T. asahii e T. inkin (n=2 cada) tambÃm foram investigadas quanto à sensibilidade ao ritonavir isolado e em combinaÃÃo com antifÃngicos. Por fim, cÃlulas planctÃnicas foram prÃ-expostas ao ritonavir e avaliadas quanto à capacidade de formaÃÃo de biofilmes, sensibilidade a antifÃngicos e alteraÃÃo na hidrofobicidade de suas superfÃcies. A produÃÃo de biofilmes foi mÃxima em RPMI pH 7,0, em inÃculo de 1x106 cÃlulas/mL, e incubaÃÃo a 35ÂC, sob agitaÃÃo. Os biofilmes produzidos nessas condiÃÃes sÃo formados por comunidades dinÃmicas, associadas a uma matriz extracelular, e mostram aumento da atividade metabÃlica e biomassa ao longo do tempo, atingindo estabilidade apÃs 48 h de cultivo. Durante o desenvolvimento dos biofilmes, ocorre liberaÃÃo de cÃlulas viÃveis e Ãcidos nuclÃicos para o ambiente circundante. Os biofilmes de T. inkin produzem mais proteases e toleram maiores concentraÃÃes de antifÃngicos que as cÃlulas planctÃnicas relacionadas. Dada à presenÃa de proteases durante o desenvolvimento do biofilme de T. inkin, foi hipotetizado que essas enzimas poderiam ser consideradas alvos importantes no controle dos biofilmes. Os resultados mostraram que o ritonavir diminuiu a adesÃo celular e formaÃÃo de biofilmes maduros, alÃm de reduzir a atividade proteÃsica e alterar a estrutura dos biofilmes. O ritonavir nÃo interferiu na atividade metabÃlica de biofilmes maduros, mas alterou a composiÃÃo da matriz extracelular dos biofilmes, as quais apresentaram diferentes espectros protÃicos em comparaÃÃo com o grupo controle. O ritonavir inibiu o crescimento planctÃnico de T. asahii e T. inkin a 100 μg/mL. Entretanto, nÃo foi observado sinergismo entre o ritonavir e os antifÃngicos testados. Em cÃlulas planctÃnicas, a prÃ-exposiÃÃo ao ritonavir reduziu significativamente os valores de concentraÃÃo inibitÃria mÃnima da anfotericina B em T. asahii e T. inkin, embora nÃo tenha alterado a resposta aos azÃlicos. A prÃ-incubaÃÃo com ritonavir reduziu a adesÃo das cÃlulas, mas nÃo a formaÃÃo de biofilmes maduros, alÃm de alterar a hidrofobicidade da superfÃcie celular. O presente artigo detalhou caracterÃsticas dos biofilmes de T. inkin e mostrou o potencial do uso de um inibidor de proteases no controle dos biofilmes de T. asahii e T. inkin. / In recent years, several studies have considered Trichosporon genus as emerging opportunistic pathogens in immunocompromised patients. Although the dynamics are not well understood, it is known that events associated with biofilm formation on these fungi play an important role in the infectious process. Thus, the present study analyzed morphophysiological aspects of biofilms produced by Trichosporon spp., as well as the role of a protease inhibitor on T. asahii and T. inkin cells and biofilms. In the first part of the study, we investigated the biofilm formation of T. inkin (n=7) in RPMI broth, CLED broth and Sabouraud broth at pH 5.5 and pH 7.0, with initial inoculum of 1x104, 1x105 and 1x106 cells/ml, incubated at 28ÂC and 35ÂC in static or shaking at 80 rpm. Biofilms were evaluated for their biomass and metabolic viability, viable cell counts, quantification of nucleic acids and proteinase activity. It was also investigated the sensitivity of the biofilm front of amphotericin B, caspofungin, fluconazole, itraconazole and voriconazole. To evaluate the inhibitory activity of ritonavir on the structure and functioning of T. asahii and T. inkin biofilms, biofilms were formed in the presence of ritonavir and evaluated for cell adhesion, structural development and proteinase activity. Additionally, ritonavir was assessed on mature biofilms, matrix composition and structural changes. Planktonic cells of T. asahii and T. inkin (n=2 each) were also investigated for sensitivity to ritonavir alone and in combination with antifungals. Finally, planktonic cells were pre-exposed to ritonavir and evaluated for biofilm formation capacity, susceptibility to antifungal agents, and changes in their surface hydrophobicity. Maximum biofilms growth in RPMI pH 7.0 for inoculation of 1x106 cells/ml and incubation at 35ÂC under stirring. Biofilms produced under these conditions are formed by dynamic communities associated with an extracellular matrix, and show increased viability and biomass over time, reaching stability after 48 hours of cultivation. During the development of biofilms occurs release of viable cells and nucleic acids into the surrounding environment. T. inkin biofilms produce more proteases and tolerate higher concentrations of antifungals that planktonic cells related. Due to the presence of proteases in the development of T. inkin biofilm, it was hypothesized that these enzymes could be considered important targets in controlling biofilms. The results showed that ritonavir decreased cell adhesion and formation of mature biofilms, and reduce protease activity and change the structure of biofilms. Ritonavir did not affect the viability of mature biofilms, but changed the composition of the extracellular matrix of biofilms, which showed different protein spectra compared to the control group. Ritonavir was able to inhibit planktonic growth of T. asahii and T. inkin approximately 50%. However, there was no synergism between ritonavir and tested antifungals. In planktonic cells, pre-exposure to ritonavir significantly reduced values of minimum inhibitory concentration of Amphotericin B in T. asahii and T. inkin, although not change the response to azoles. Preincubation with ritonavir reduced cell adhesion, but not the formation of mature biofilms, in addition to changing the hydrophobicity of the cell surface. The article detailed characteristics of T. inkin biofilms and showed the potential use of a protease inhibitor in controlling these biofilms.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.teses.ufc.br:11623 |
| Date | 27 July 2016 |
| Creators | Rosana Serpa |
| Contributors | Rossana de Aguiar Cordeiro, Lidiany Karla Azevedo Rodrigues, Cristiane Yumi Koga-Ito, Lucas Pereira de Alencar, DÃbora Castelo Branco de Souza Collares Maia |
| Publisher | Universidade Federal do CearÃ, Programa de PÃs-GraduaÃÃo em Microbiologia MÃdica, UFC, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFC, instname:Universidade Federal do Ceará, instacron:UFC |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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