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Caracterização da N-acetil-ß-D-glicosaminidase de Paracoccidioides brasiliensis

Santos, Mônica de Oliveira 12 December 2007 (has links)
Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2007. / Submitted by Larissa Ferreira dos Angelos (ferreirangelos@gmail.com) on 2010-01-07T22:03:45Z No. of bitstreams: 1 2007_MonicadeOliveiraSantos.PDF: 948235 bytes, checksum: 8bcc87f3398c3399d83dc39e4e2a3cba (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2010-01-07T22:39:25Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2007_MonicadeOliveiraSantos.PDF: 948235 bytes, checksum: 8bcc87f3398c3399d83dc39e4e2a3cba (MD5) / Made available in DSpace on 2010-01-07T22:39:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007_MonicadeOliveiraSantos.PDF: 948235 bytes, checksum: 8bcc87f3398c3399d83dc39e4e2a3cba (MD5) Previous issue date: 2007-12-12 / Um cDNA (Pbnag, nº de acesso GenBank AF 419158) codificante para N-acetil-β-D-glicosaminidase (NAG) de Paracoccidioides brasiliensis, isolado Pb 01 (ATCC MYA826) foi caracterizado e classificado como uma enzima pertencente à família 20 de glicosil hidrolase. PbNAG foi clonado em pGEX-4T3 e expresso em Escherichia coli. A análise em gel apresentou a presença de uma proteína de massa molecular estimada em 64,8 kDA. A proteína expressa foi purificada em resina glutationa-sepharose 4B e utilizada para produção de anticorpo policlonal. O anticorpo produzido anti-PbNAG apresentou reação com a proteína nativa, em extrato total, de micélio e levedura de P. brasiliensis. Na imunocitolocalização o anticorpo anti-PbNAG reagiu com a proteína NAG nativa presente na parede de células leveduriformes P. brasiliensis. A enzima recombinante PbNAG foi caracterizada apresentando afinidade pelo substrato ρ-nitrofenil-β-D-N-acetilglucosamina (ρNP-GlcNAc), com Km de 0.112 mM, Vmax de 0.0017 mM min-1 mg proteina-1, temperatura ótima de 37ºC e pH ótimo de 4.4. A enzima foi pouco inibida por glicose e apresentou inibição por glicosamina, N-acetilglicosamina. Os estudos mostram que PbNAG está presente na parede celular de células leveduriformes de P. brasiliensis, sugerindo seu papel no metabolismo da parede fúngica. ____________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The full-length cDNA Pbnag enconding a N-acetyl-β-Dglucosaminidase (NAG) GeneBank accession number AF 419158 of Paracoccidioides brasiliensis was characterized and classified as a NAG belonging to the glycosil hydrolase family 20. The PbNAG was expressed in Escherichia coli and purified to homogeneity by affinity chromatography on glutathione-Sepharose 4B. SDS-PAGE analysis revealed the presence of one protein species with molecular mass estimated of 64.8 kDa. Immunoelectron microscopy demonstrated the presence of the native protein in the cell wall of P. brasiliensis. The recombinant protein was evaluated regarding to its kinetics properties The Km and Vmax values for the enzyme using ρ- nitrophenyl-β-D-N-acetylglucosamine (ρNP-GlcNAc) as substrate, were 0.112 mM and 0.0017 mM, respectively. The pH optimum for the enzyme was 4.4 and maximum activity was obtained at 37 °C. The enzyme activity was poorly affected by glucose and was inhibited by glucosamine, Nacetylglucosaminide. The studies show that PbNAG is present in the cell wall of yeast cells of P. brasiliensis suggesting its potential role in the fungal cell wall additionally.
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Identificação e caracterização funcional de atividade apirásica nas salivas de triatomíneos vetores da Doença de Chagas

Pires, Danielle Lacerda January 2006 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2006. / Submitted by Natália Cristina Ramos dos Santos (nataliaguilera3@hotmail.com) on 2009-10-31T17:28:44Z No. of bitstreams: 1 2006_Danielle Lacerda Pires.pdf: 4562953 bytes, checksum: 1c871e5bdd732392ec55d433358b37b4 (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Maia(luanna@bce.unb.br) on 2011-01-19T13:28:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_Danielle Lacerda Pires.pdf: 4562953 bytes, checksum: 1c871e5bdd732392ec55d433358b37b4 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-01-19T13:28:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006_Danielle Lacerda Pires.pdf: 4562953 bytes, checksum: 1c871e5bdd732392ec55d433358b37b4 (MD5) Previous issue date: 2006 / Os artrópodes hematófagos são capazes de neutralizar defesas do hospedeiro durante repasto, devido à presença de ampla variedade de fatores anti-hemostáticos presentes em suas salivas como vasodilatadores, fatores antiplaquetários e anticoagulantes. O principal mecanismo de transmissão da Doença de Chagas é a contaminação do hospedeiro por excretas de triatomíneos infectados. O Triatoma infestans Klug, 1834, o principal vetor do mal de Chagas no Brasil, possui várias apirases em sua saliva que inibem a agregação plaquetária do hospedeiro. Neste estudo, nós mostramos que as apirases de 88, 82 e 79 kDa desse inseto são antigenicamente distintas e localizam-se na unidade D2 de sua glândula salivar. O conteúdo de uma unidade D2, e não os das outras, foi capaz de inibir a agregação de plaquetas, induzida por ADP, presentes em 1 mL de sangue. Em adição, identificamos pela primeira vez atividades apirásicas nos conteúdos de glândulas salivares de Rhodnius brethesi Matta, 1919; Rhodnius milesi Carcavallo, Rocha, Galvão, Jurberg & Valente 2001; Rhodnius pictipes Stal, 1872 e Rhodnius robustus Larrousse, 1927 por meio de testes enzimáticos utilizando ATP e ADP como substratos. Os ensaios enzimáticos, realizados a 37 °C e pH 8,3, revelaram que as atividades apirásicas são dependentes de cálcio. As atividades apirásicas das glândulas salivares de R. brethesi e R. pictipes foram parcialmente purificadas em coluna de Oligo dT Celulose. Para identificação de proteínas relacionadas com essa atividade, extratos glandulares e frações eluídas da coluna de Oligo dT, não fervidos e não reduzidos, foram submetidos à enzimografia após separação em SDS-PAGE. Este experimento revelou bandas de proteínas com atividades ATPásicas e ADPásicas de aproximadamente 44-45 kDa. Adicionalmente, experimentos de agregação plaquetária realizados in vitro demonstraram que 0,5 par de glândula salivar de R. brethesi, R. milesi, R. pictipes e R. robustus inibiram totalmente a agregação plaquetária induzida por ADP. Diferentemente das apirases de T. infestans, as de Rhodnius spp. são de baixa massa molecular e não fazem parte da família das 5´nucleotidases. A ampla distribuição das apirases nas salivas dos vetores da doença de Chagas e de outros artrópodes indica que estas enzimas têm importância fundamental na hematofagia. / Blood-feeding arthropods are able to constraints barriers imposed by host defenses, due to the presence of a wide range of antihemostatic factors in their saliva, including vasodilators, antiplatelet factors and anticoagulant. The main Chagas disease transmission mechanism is contamination of a host by faeces from triatominae infected. Triatoma infestans Klug, 1834, the main vector of Chagas disease in Brazil, expresses several apyrases in its saliva that inhibit the vertebrate host platelet aggregation. We show in this report that the 88, 82 E 79 kDa apyrases of the insect are antigenically different and localize within the salivary gland D2 unit. The content of one D2 unit, and not that of the others, was able to mediate fully inhibition of platelet aggregation induced by ADP, from 1 mL of human blood. In addition, we identified for the first time apyrase activities in the saliva of Rhodnius brethesi Matta, 1919; Rhodnius milesi Carcavallo, Rocha, Galvão, Jurberg & Valente 2001; Rhodnius pictipes Stal, 1872 e Rhodnius robustus Larrousse, 1927. The tests, which were accomplished at 37 °C and pH 8,3, revealed that these apyrase activities are dependent upon Ca+2 . The apyrase activities present in the salivary glands of R. brethesi e R. pictipes were then partially purified on an Oligo dT Cellulose® column. To identify proteins related to apyrase activity, salivary gland content and eluted fractions from the Oligo dT column were submitted to SDS-PAGE enzimography without previous boiling or reduction of the samples. This experiment allowed the identification of 44-45 kDa protein bands displaying both ATPase and ADPase activities. In vitro platelet aggregation assays showed that the content of 0,5 salivary gland pair R. brethesi, R. milesi, R. pictipes e R. robustus completely abolished platelets aggregation induced by ADP. Differently fromf T. infestans apirases, Rhodnius spp. express apyrases of low molecular masses that aren’t members of the 5´nucleotidase family. The wide distribution of apyrases in the saliva of Chagas disease vectors and other arthropods indicate that these enzymes play an important role during the hematophagous process.
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Patogênese de Escherichia coli enteroagregativa : o papel de supostos pili F na intensificação de biofilmes mistos e na adesão a células HeLa

Pereira, Alex Leite 29 May 2009 (has links)
Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2009. / Submitted by Larissa Ferreira dos Angelos (ferreirangelos@gmail.com) on 2010-03-02T17:23:51Z No. of bitstreams: 1 2009_AlexLeitePereira.pdf: 8066623 bytes, checksum: 7ecf0efab2fe486b439721642be48825 (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2010-05-12T13:38:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_AlexLeitePereira.pdf: 8066623 bytes, checksum: 7ecf0efab2fe486b439721642be48825 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-05-12T13:38:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_AlexLeitePereira.pdf: 8066623 bytes, checksum: 7ecf0efab2fe486b439721642be48825 (MD5) Previous issue date: 2009-05-29 / Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) é uma categoria diarreiogênica composta por isolados que expressam o característico padrão de adesão agregativa (AA) em associação com células epiteliais. Nas cepas protótipo de EAEC, o fenótipo AA está associado à presença dos plasmídios pAA que codificam para fímbrias de adesão agregativa (AAF). Não obstante, o padrão AA é um evento multifatorial influenciado pela expressão de adesinas afimbriais, de pili e de fimbriais não associadas aos plasmídios AA. Cepas de EAEC típicas (pAA+) são proficientes na formação de biofilmes, característica considerada fator de virulência consensual desta categoria. Durante um estudo epidemiológico, o isolado C. freundii (Cf) 205 demonstrando fenótipo AA foi isolado de uma criança diarréica juntamente com a cepa de EAEC 205-1. Em ensaios preliminares, foi mostrado que a adesão bacteriana a células epiteliais era intensificada em decorrência da co-infecção por Cf 205 e cepas de EAEC. Este estudo tem por objetivo determinar características de patogenicidade em cepas de C. freundii e definir os eventos biológicos mediadores da ação sinérgica de adesão descrita. Ensaios de adesão a células HeLa e de formação de biofilme, bem como a detecção de marcadores de virulência de E. coli, foram realizados para determinar possíveis associações entre cepas de C. freundii e diarréia. Todas as 28 cepas de C. freundii utilizadas no estudo foram negativas para os fatores de virulência pesquisados. Isolados de C. freundii recuperados exclusivamente de diarréia foram caracterizados pela expressão do padrão AA e pela formação de intenso biofilme, e, então, foram denominados C. freundii agregativo formadores de biofilme (BACF). Para determinar a natureza do efeito sinérgico desenvolvido por C. freundii e cepas de EAEC, ensaios de pré-condicionamento de meio de cultura foram conduzidos com o intuito de verificar a ocorrência eventos de sinalização química. Adicionalmente, análises de ultra-estrutura baseadas em microscopia eletrônica de varredura foram realizadas em complemento a ensaios de agregação bacteriana e de formação de biofilme para verificar o envolvimento de apêndices bacterianos na ação sinérgica descrita. A cepa de BACF 205 mostrou-se capaz de induzir agregação bacteriana quando na presença de cepas de EAEC. Os agregados bacterianos eram mediados por apêndices flexíveis expressos por cepas de EAEC que portavam genes para pilina F (traA). Estruturas semelhantes foram visualizadas nos biofilmes simples formados por cepas de EAEC traA-positivas, como também nos biofilmes mistos intensificados em decorrência da co-cultura de BACF 205 e cepas de EAEC traApositivas. O aumento dos biofilmes mistos produzidos pela combinação BACF 205-EAEC traA-positiva foi abolido por zinco, um inibidor específico de pili F. Complementarmente foi mostrado que zinco inibe seletivamente a maioria dos biofilmes formados por cepas de EAEC típicas isoladas de crianças diarréicas. Em conclusão, supostos pili F expressos por cepas típicas de EAEC incrementam a formação de biofilmes mistos quando na presença de BACF. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Enteroaggregative Escherichia coli (EAEC) are enteropathogenic strains that display the distinctive aggregative adhesion (AA) when in association with cultured cells. In typical EAEC strains, the AA phenotype is associated with specific fimbriae (AAFs) encoded by plasmids (pAA). However, other factors, including afimbrial adhesins and pili, are also associated with this adherence pattern, indicating its complex nature. The expression of biofilms has been considered a consensual virulence factor among typical (pAA+) EAEC isolates. During an epidemiologic study focusing infantile diarrhea, AA-positive Citrobacter freundii (Cf) 205 and EAEC strains were concomitantly recovered from a severe case of mucous diarrhea. Preliminary assays showed that the coinfection of epithelial cells with Cf 205 and EAEC strains led to an increase in the bacterial adhesion. The aim of this study was to verify the occurrence of pathogenic traits in C. freundii strains as well as to identify the biological events underlying the increase in bacterial adherence. Biofilm and adhesion assays showed that C. freundii strains that displayed aggregative adhesion to HeLa cells and formed strong biofilms were exclusively isolated from diarrhea. This subset of strains was then named biofilm-forming aggregative C. freundii (BACF). All C. freundii strains were tested negative for the EAEC fimbrial genes as well as for others E. coli virulence markers. In attempt to define the nature of the synergic events developed by C. freundii and EAEC strains, pre-conditioned media were used to verify the role of chemical signals in the studied events. Additionally, bacterial aggregation and biofilm assays were carried out and ultrastructurally analyzed employing electron microscopy. The increased adherence was mediated by physical interactions among the bacteria and primed in the absence of chemical signaling. Thus, significant increases in bacterial adhesion were also observed during the formation of mixed biofilms on abiotic surfaces. Bacterial settling assays showed that EAEC strains harboring F-pili genes (traA) were capable of forming bacterial aggregates only in the presence of BACF. In scanning electronic microscopy analyses, it was observed that bacterial aggregates as well as enhanced biofilms formed by BACF and traA-positive EAEC were mediated by non-bundle forming, flexible pili. Moreover, mixed biofilms formed by BACF and traA-positive EAEC strains were significantly reduced using nonlethal concentration of zinc, a specific inhibitor of F pili. In addition, EAEC strains isolated from diarrheic children frequently produced single biofilms sensitive to zinc. In conclusion, putative F pili expressed by EAEC strains boosted the mixed biofilm formation when in presence of biofilm-forming aggregative C. freundii.
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Caracterização molecular e funcional do gene vosa de Cryptococcus neoformans

Peconick, Luísa Defranco Ferreira 29 July 2013 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ceilândia, Programa de Pós-Graduação em Ciências e Tecnologias em Saúde, 2013. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2014-01-02T10:23:34Z No. of bitstreams: 1 2013_LuisaDefrancoFerreiraPeconick_Parcial.pdf: 855251 bytes, checksum: bb95fc3c687f69b402e9466503c903f5 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2014-01-02T13:07:31Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_LuisaDefrancoFerreiraPeconick_Parcial.pdf: 855251 bytes, checksum: bb95fc3c687f69b402e9466503c903f5 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-01-02T13:07:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_LuisaDefrancoFerreiraPeconick_Parcial.pdf: 855251 bytes, checksum: bb95fc3c687f69b402e9466503c903f5 (MD5) / O basidiomiceto Cryptococcus neoformans, é um fungo oportunista, que comumente infecta pacientes portadores do vírus da imunodeficiência humana (HIV) e imunocomprometidos em geral. É o agente etiológico da criptococose, doença potencialmente fatal e cosmopolita cuja incidência mundial vem se aproximando da de doenças como a tuberculose. O gene VOSA pertence à família velvet, exclusiva de fungos e primeiramente descrita em Aspergillus, e está envolvido na viabilidade dos esporos e na regulação das fases assexuada e sexuada. Proteínas dessa família são fatores transcricionais altamente conservados entre ascomicetos e basidiomicetos que regulam diferentes processos em resposta a estímulos ambientais. A análise in silico do gene VOSA de C. neoformans mostrou sua conservação entre os fungos. Construiu-se um cassete de deleção do gene VOSA contendo o gene de resistência à higromicina B por PCR double joint. O cassete foi transformado por biobalística nas linhagens selvagens KN99a/α (soroA) que permitiu a obtenção de mutantes vosAaΔ e vosAαΔ. Da mesma forma, o fragmento contendo o locus VOSA foi transformado para obtenção do reconstituído tipo a (vosAaΔ::VOSA). Confirmou-se a deleção e a reconstituição de VOSA por PCR comum. Os mutantes vosAaΔ e vosAαΔ foram submetidos aos testes de fenótipo: crescimento a 30°C e 37°C, formação de cápsula, produção de urease e fosfolipase, alterações de parede celular e produção de melanina, no entanto não foram observadas quaisquer alterações no fenótipo quando comparados com a linhagem selvagem. Quanto à capacidade de realizar acasalamento, os mutantes vosAaΔ e vosAαΔ foram submetidos a acasalamento com linhagem selvagem de tipo sexual oposto e apresentaram diminuição na formação de hifas e alteração morfológica significativa de sua estrutura. Mutantes de tipo sexual opostos (vosAaΔ vs. vosAαΔ) também foram submetidos a acasalamento e não apresentaram qualquer formação de hifas. Acredita-se que VOSA seja um regulador positivo da reprodução sexuada, e que controle a formação de estruturas sexuais. A expressão de genes velvet foi analisada no mutante vosAaΔ em comparação à cepa selvagem sem indicação de qualquer alteração transcricional. Os resultados até agora obtidos em C. neoformans colaboram para um melhor entendimento do papel de VOSA na patobiologia deste patógeno. Pretende-se identificar em detalhe o papel deste gene no ciclo de vida de C. neoformans, em especial na produção de esporos, que são as formas infectivas e de disseminação deste patógeno. Os dados moleculares gerados neste trabalho servem como ponto de partida para elucidar a complexa regulação do ciclo sexual de C. neoformans e pela primeira vez descreve o envolvimento de um gene velvet na biologia de um basidiomiceto. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The basidiomycete fungus Cryptococcus neoformans is an opportunistic organism which commonly infects HIV and immunocompromised patients. It is the etiological agent of cryptococcosis, a potentially fatal and cosmopolitan disease, whose world’s incidence is approaching from diseases such as tuberculosis. VOSA gene belongs to the velvet family, fungal exclusive and primarily described in Aspergillus, involved in the regulation of sexual and asexual development as well as in the viability of the spores. Proteins of this family are transcriptional factors highly conserved among ascomycetes and basidiomycetes regulating different process in response to environmental stimuli. In silico analysis of VOSA gene showed its conservation among the fungi. A VOSA disruption cassette containing the hygromycin reistance gene was assembled by Double Joint PCR. The cassette was transformed by biolistic in KN99a/α (soroA) wild type strains that allowed obtaining the vosAaΔ and vosAαΔ mutants. Likewise, the fragment containing the VOSA locus was transformed to obtain a mating type a reconstituted strain (vosAaΔ::VOSAa). Both disruption and reconstitution were confirmed by traditional PCR. The mutants vosAαΔ and vosAaΔ were tested for various phenotypes: growth at 30 and 37°C, capsule formation, urease and phospholipase production, changes in cell wall and melanin production, however no phenotypic changes were observed compared to the wild type strains. Regarding the ability to mate, vosAaΔ and vosAαΔ mutants were crossed with wild type strain of opposite mating type and the crosses showed decreased hyphae formation and significant morphological alteration of its structure. Mutants of opposite mating type (vosAaΔ vs. vosAαΔ) were subjected to mating and showed no formation of hyphae. VOSA is believed to be a positive regulator of sexual reproduction, and that controlling the formation of sexual structures. Expression of velvet genes was analyzed in vosAaΔ mutant in comparison with wild type strain and any significant transcriptional changes were noticed. The results obtained so far in C. neoformans collaborate for a better understanding of its role in the pathobiology of this pathogen. It is intended to identify in detail the role of VOSA in C. neoformans lyfe cycle, in particular spore production, the infective and dissemination form of the pathogen. The molecular data generated in this study are starting point for a research to elucidate the molecular mechanism of the sexual cycle regulation on C. neoformans and for the first time describ a velvet gene involved in the biology of a basidiomycete.
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Avaliação de elementos formadores de Z-DNA como potenciais reguladores da expressão de biofármacos em células CHO-k1 / Evaluation elements forming Z-DNA as potential regulators of the expression of biopharmaceuticals in CH0-K1 cells

Sousa, Herdson Renney de January 2013 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-graduação em Patologia Molecular, 2013. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2014-01-13T11:52:09Z No. of bitstreams: 1 2013_HerdsonRenneydeSousa.pdf: 2689685 bytes, checksum: 872d1a2ad8abc84c2d12fe88886b1e2c (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2014-01-13T14:43:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_HerdsonRenneydeSousa.pdf: 2689685 bytes, checksum: 872d1a2ad8abc84c2d12fe88886b1e2c (MD5) / Made available in DSpace on 2014-01-13T14:43:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_HerdsonRenneydeSousa.pdf: 2689685 bytes, checksum: 872d1a2ad8abc84c2d12fe88886b1e2c (MD5) / Introdução: o grupo de Imunologia Molecular/UnB já produziu anticorpos recombinantes e humanizados de interesse comercial como o anti-CD18, anti-CD3, ou acadêmico como o anti-Z22,assim como fatores plasmáticos humanos. Os vetores de expressão utilizados contêm o promotor de CMV-IA. O objetivo desse trabalho foi explorar regiões formadoras de Z-DNA, e testar diretamente o papel do anticorpo estabilizador de Z-DNA (antiZ22NLS - Z22) no efeito transcricional do promotor CMV modificado (zCMV-IA). Material e Métodos: O primeiro passo foi reconstruir o cassete de expressão dos vetores tradicionais utilizados nesse trabalho, pCO e pCO?600. Para isso, fusionamos o gene GFP ao anticorpo recombinante aCD3. Os passos seguintes foram a introdução de sequências formadoras de Z-DNA (Z1, Z3 e Z4) e controles não formadores de Z-DNA (Z2 e Z5) a montante do promotor CMV-IA. Resultados e Discussão: foram construídos 10 vetores de expressão: 5 construções pCO (pZ1, pZ2, pZ3, pZ4 e pZ5) e 5 construções pCO?600 (?Z1, ?Z2, ?Z3, ?Z4 e ?Z5); transfecção de células CHO-K1 com as construções utilizando Lipofectamina LTX na proporção 1:1 de DNA e reagente LTX; Por fim co-transfecção de células com cada vetor de expressão e vetor pMacZ22NLS e como controle de cada vetor de expressão também foi feita transfecção com vetor pMac vazio. Em comparação aos controles em todas as construções a presença do pMacZ22 NLS aumentou a eficiência de transfecção. Através de citometria de fluxo se verificou aumento da MFI no gate das células GFP+ em até 25 % quando foi co-transfectado vetor com anti-Z-DNA. Conclusão: foi mostrado o papel de anti Z22 como indutor e estabilizador de Z-DNA e seu efeito facilitador da transcrição. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Introduction: Recombinant antibodies are now a reality in therapeutics. But its production is still a challenging issue. We have been developing expression vectors for heterologous expression of recombinant antibodies based on the CMV promotor. We had previously shown that a Z-DNA forming region upstream the promotor/enhancer enhances luciferase expression in a repórter vector. The aim of this study was to explore Z-DNA forming regions, and directly test the role of a Z-DNA stabilizing antibody on a modified CMV promoter (zCMV). Material and Methods: Initially, the GFP gene was fused with a recombinant antibody anti-CD3 and the fusion cassette was introduced in both pCO and pCO?6OO. Then we introduced the Z-DNA forming sequences (Z1, Z3 and Z4) and control sequences (Z2 and Z5) upstream of the CMV promoter. CHO cells were transfected using Lipofectamine LTX 1:1, DNA and LTX reagent. To provide the trans acting anti-Z-DNA antibody, we cotransfect cells with the vector pMACZ22NLS, that produces a scFv of the anti-Z-DNA mAb Z22 fused to a nuclear localization signal (Intrabody). Flow cytometry was use to follow GFP expression. Results and Discussion: 10 expression vectors were constructed: 5 pCO constructs (pZ1, pZ2, pZ3, pZ4 and pZ5) and 5 pCO?600 constructs (AZ1, AZ2, AZ3, AZ4 and AZ5); The constructions with Z-DNA forming sequences showed an improvement of expression of the reporter gene when compared to the control sequences. Moreover the co-transfection with the anti-Z-DNA vector enhances the MFI of gated GFP+ cells by 25%. Conclusion: The Z-DNA forming sequences improve heterologous gene expression and the presence of anti-Z-DNA in trans was shown to enhance the Z-DNA effect probably due to a stabilization effect.
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Caracterização da participação do sistema de ubiquitinação e degradação proteassômica no bloqueio do ciclo celular mediado pela proteína Vpr do HIV-1

Rego Filho, Carlos Maximiliano Monteiro January 2008 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2008. / Submitted by Allan Wanick Motta (allan_wanick@hotmail.com) on 2010-07-08T19:32:20Z No. of bitstreams: 1 2008_CarlosMaximilianoRMFilho.pdf: 1415168 bytes, checksum: 458bfff36d1c3017ce67dc4f8ca8205a (MD5) / Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2010-07-14T22:23:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_CarlosMaximilianoRMFilho.pdf: 1415168 bytes, checksum: 458bfff36d1c3017ce67dc4f8ca8205a (MD5) / Made available in DSpace on 2010-07-14T22:23:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_CarlosMaximilianoRMFilho.pdf: 1415168 bytes, checksum: 458bfff36d1c3017ce67dc4f8ca8205a (MD5) Previous issue date: 2008 / A proteína acessória do HIV-1 Vpr ativa ATR induzindo um estresse replicativo do DNA. A ativação de ATR resulta num prolongamento da fase G2 do ciclo celular e termina induzindo a célula entrar em apoptose. No presente estudo investigou-se a função do sistema ubiquitina/proteassoma no contexto da atividade de Vpr. Reporta-se que esse sistema essencial para Vpr disparar o ponto de checagem de dano ao DNA na fase G2. Também investigou-se em detalhes as E3 ligases manipuladas por Vpr nesse processo. Foi encontrado que Vpr se liga a DCAF1, uma subunidade de Cul4-A/DDB1 E3 ligase. Mutações no domínio C-terminal da Vpr(R80A) mutante, a qual é capaz de se ligar à DCAF1, é incapaz de realizar a ativação do ponto de checagem do ciclo celular e possui um caráter dominante negativo. Em contraste, a mutação Q65R, na cadeia rica em leucina de Vpr inibe a interação com DCAF1, resultando numa forma inativa de Vpr; portanto, considerar-se-ia, então, que essa interação é requerida porém não suficiente para Vpr induzir o prolongamento de G2. Foi, então, proposto um modelo no qual Vpr recruta, através do seu domínio C-terminal, uma proteína celular desconhecida para ser degradada pelo sistema de ubiquitina- proteassoma e isto causaria o bloqueio do ciclo celular. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / HIV-1 Vpr is a viral accessory protein that activates ATR through the induction of DNA replication stress. ATR activation results in cell cycle arrest in G2 and induction of apoptosis. In the present study, we investigate the role of the ubiquitin/proteasome system (UPS) in the above activity of Vpr. We report that the general function of the UPS is required for Vpr to induce G2 checkpoint activation. We further investigated in detail the specific E3 ubiquitin ligase subunits that Vpr manipulates. We found that Vpr binds to the DCAF1 subunit of a cullin 4a/DDB1 E3 ubiquitin ligase. The carboxyterminal domain Vpr(R80A) mutant, which is able to bind DCAF1, is inactive in checkpoint activation and has dominant-negative character. In contrast, the mutation Q65R, in the leucine-rich domain of Vpr that mediates DCAF1 binding, results in an inactive Vpr devoid of dominant negative behavior. Thus, the interaction of Vpr with DCAF1 is required, but not sufficient, for Vpr to cause G2 arrest. We propose that Vpr recruits, through its carboxy terminal domain, an unknown cellular factor that is required for G2- to-M transition. Recruitment of this factor leads to its ubiquitination and degradation, resulting in failure to enter mitosis.
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Estudo de fatores associados à virulência e imunidade na interação entre macrófagos e Cryptococcus neoformans

Nicola, André Moraes 01 October 2011 (has links)
Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular. 2011. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2012-05-04T11:00:25Z No. of bitstreams: 1 Tese versao final.pdf: 34222648 bytes, checksum: 674bc4915b3bdf2d82beeb39a1bcfb06 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2012-05-07T14:37:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese versao final.pdf: 34222648 bytes, checksum: 674bc4915b3bdf2d82beeb39a1bcfb06 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-05-07T14:37:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese versao final.pdf: 34222648 bytes, checksum: 674bc4915b3bdf2d82beeb39a1bcfb06 (MD5) / Cryptococcus neoformans é uma levedura encapsulada patogênica, causadora de meningoencefalite severa. Estima-se uma incidência anual de um milhão de casos de criptococose no mundo, com mais de 600.000 mortes. O desenvolvimento da criptococose se correlaciona fortemente com o estado imunitário do paciente, sendo os macrófagos as principais células efetoras na resposta imune contra esse fungo. O objetivo desta tese é estudar fatores do hospedeiro e do patógeno que sejam importantes durante a interação entre C. neoformans e macrófagos. Os trabalhos desta tese foram divididos em quatro capítulos baseados em quatro objetivos específicos. O primeiro objetivo foi estudar vesículas extracelulares de C. neoformans, utilizadas pelo fungo para secretar polissacarídeos capsulares e outros fatores de virulência. Sondas lipofílicas mostraram vesículas na superfície da cápsula e sugeriram que estas estruturas possuem RNA. Outros dois projetos também mostraram a importância das vesículas na melanização de C. neoformans e na secreção de toxinas por Bacillus anthracis. Outro tema abordado foi o mecanismo de ação de anticorpos monoclonais contra a cápsula de C. neoformans. Experimentos de expressão gênica feitos com fungos expostos a anticorpos monoclonais sugeriram indução da biossíntese de ácidos graxos. Esta alteração metabólica foi confirmada por métodos bioquímicos e se correlacionou com um aumento na susceptibilidade ao antifúngico anfotericina B, sugerindo que anticorpos ajam também alterando o metabolismo do patógeno. Em outro trabalho, foi feita uma varredura com biblioteca de RNAs de interferência para identificar o receptor de superfície do isotipo IgG3 murino. A interferência com um dos genes identificados na varredura, a integrina beta 1 (Itgb1), levou a diminuição da ligação deste isotipo à superfície de macrófagos e da fagocitose mediada por IgG3, sem nenhum efeito na função do isotipo IgG1. Estes resultados sugerem que Itgb1 possa ser o receptor específico deste isotipo de IgG murino, que vem sendo procurado há três décadas. Foram também estudadas por citometria de fluxo a cinética da fagocitose e a exocitose não-lítica de C. neoformans, um fenômeno descrito recentemente pelo qual o fungo é expelido pelo macrófago sem que nenhuma das duas células morra. Drogas que neutralizam a acidez do fagolisossomo alteraram a taxa de exocitose não-lítica, indicando que o pH deste compartimento é importante para a liberação do fungo. Adicionalmente, a metodologia citométrica foi utilizada para medir exocitose não-lítica em pulmões de camundongo, com aproximadamente 45% em comparação com taxa de pouco menos de 10% in vitro. Estes resultados sugerem que a exocitose não-lítica ocorra durante a criptococose, com importantes implicações no entendimento desta doença. Por fim foi testada a hipótese de que a autofagia do macrófago seja importante na resposta imune contra C. neoformans. A autofagia é um mecanismo conservado em eucariotos para a reciclagem de material intracelular que tem sido implicado na imunidade contra um número cada vez maior de patógenos intracelulares. Experimentos de imunofluorescência mostraram fagossomos contendo C. neoformans positivos para o marcador de autofagossomos LC3. RNA de interferência contra ATG5, um gene essencial para autofagia, diminuiu a atividade antifúngica de macrófagos e as taxas de exocitose não-lítica e aumentou a secreção de citocinas pró-inflamatórias como IL-6, TNF-α, IL-12 e IFN-γ. Camundongos com nocaute condicional de ATG5 não apresentaram nenhuma diferença de sobrevida em relação aos controles após infecção por C. neoformans. Entretanto, estes animais tiveram uma resposta imune com melhor balanço Th1/Th2 que resultaram em menor carga fúngica e diferenças no padrão histopatológico pulmonar. Estes resultados sugerem que a autofagia tem múltiplos papéis na imunidade contra C. neoformans. Em conjunto, estes trabalhos esclarecem alguns pontos na importante relação entre C. neoformans e macrófagos do hospedeiro e podem servir como base para trabalhos translacionais que melhorem a profilaxia ou terapêutica da criptococose. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Cryptococcus neoformans is an encapsulated pathogenic yeast that causes severe meningoencephalitis. It is estimated that over one million cases of cryptococcosis occur each year, with about 600,000 deaths. Macrophages are the main effector cells in immunity against this fungus. The objective of this thesis is to study host and pathogen factors that are important during the interaction between C. neoformans and macrophages. The work described in this thesis has been divided in four chapters based in four specific objectives. The first objective was to study C. neoformans extracellular vesicles, used by the fungus to secrete capsular polysaccharide and several other virulence factors. Lipophilic probes revealed vesicles on the capsule surface and suggested that they may carry RNA. Two other projects also showed the importance of extracellular vesicles in C. neoformans melanization and Bacillus anthracis toxin secretion. Another subject was the mechanism of action of monoclonal antibodies to the C. neoformans capsule. Gene expression studies made with C. neoformans that had been exposed to monoclonal antibodies suggested an induction of fatty acid biosynthesis. This metabolic alteration was confirmed using biochemical methods and correlated with increased susceptibility to the antifungal amphotericin B, suggesting that antibodies also act by altering the metabolism of the pathogen. Another project involved screening an RNAi library to search for the cell surface receptor of murine IgG3. Interference with one of the genes identified in the screening, integrin beta 1 (Itgb1), resulted in decreased binding of this antibody to macrophage surface and impaired IgG3-mediated phagocytosis, with no effect in the function of IgG1. These results suggest that Itgb1 may be the specific murine IgG3 receptor, which has been pursued for over three decades. The kinetics of phagocytosis and non-lytic exocytosis, a recently described phenomenon in which C. neoformans is expelled from macrophages without harm to either cell type, were also studied using flow cytometry. Drugs that neutralize the phagolysosomal acidity altered the non-lytic exocytosis rates, indicating that the pH inside this compartment influences fungal release. Additionally, the cytometric methodology was used to measure non-lytic exocytosis in mouse lungs, with a rate of approximately 45% in comparison with 10% in vitro. The suggestion that non-lytic exocytosis happens during cryptococcosis could have important implications in understanding this disease. Lastly, the hypothesis that macrophage autophagy is involved in the immune response against C. neoformans was tested. Autophagy is a mechanism conserved in all eukaryotes to recycle intracellular material and has been implicated in immunity against an ever-growing list of intracellular pathogens. Immunofluorescence showed C. neoformans-containing phagosomes positive for the autophagosome marker LC3. RNA interference against ATG5, a gene that is essential for autophagy, decreased macrophage antifungal activity and non-lytic exocytosis and increased secretion of pro-inflammatory cytokines such as IL-6, TNF-α, IL-12 e IFN-γ. ATG5 conditional knockout mice had no survival difference compared to controls after infection with C. neoformans. However, these animals had an immune response with better Th1/Th2 balance that resulted in lower fungal burden and different histopathological pattern in the infected lungs. These results suggest that autophagy has multiple roles in immunity against C. neoformans. As a whole, the work described in this thesis clarify some points in the important interaction between C. neoformans and host macrophages and could be the basis for future translational studies that could improve cryptococcosis prophylaxis or therapy.
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Vacinação com a proteína de choque térmico HSP60 induz resposta imune protetora contra a infecção pulmonar induzida pelo Paracoccidioides brasiliensis e transformação em Paracoccidioides brasiliensis

Soares, Renata de Bastos Ascenço 06 1900 (has links)
Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2007. / Submitted by Natália Cristina Ramos dos Santos (nataliaguilera3@hotmail.com) on 2009-10-16T14:15:13Z No. of bitstreams: 1 Tese_RenataBastosAscencoSoares.pdf: 925364 bytes, checksum: 1f337752deeaae2fd63914bbfbd608e8 (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Maia(luanna@bce.unb.br) on 2011-01-19T11:44:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_RenataBastosAscencoSoares.pdf: 925364 bytes, checksum: 1f337752deeaae2fd63914bbfbd608e8 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-01-19T11:44:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_RenataBastosAscencoSoares.pdf: 925364 bytes, checksum: 1f337752deeaae2fd63914bbfbd608e8 (MD5) Previous issue date: 2007-06 / Paracoccidioides brasiliensis causa uma micose crônica granulomatosa prevalente na América Latina. O sucesso da resolução da infecção por este fungo é dependente da ativação da imunidade celular. Nós identificamos previamente a proteína de choque térmico 60 (HSP60) como um alvo da resposta humoral na paracoccidioidomicose. Neste trabalho nós expressamos o gene codificante para a proteína de choque térmico 60 em Escherichia coli e a atividade imunobiológica deste antígeno recombinante foi analisada. A imunização de camundongos BALB/c com a proteína recombinante emulsificada em adjuvante estimulou a resposta immune celular como acessado pela proliferação e produção de interferon-gama. A vacinação com a HSP60 reduziu a carga fúngica em camundongos infectados com f 106 ou 107 leveduras. As células T CD4+ foram necessárias para a eficácia da vacinação e ambas as fases: aferente e eferente. Contudo, nós demonstramos que o antígeno imunodominante é um candidato para o desenvolvimento de uma vacina contra este fungo. Na segunda parte do trabalho, leveduras de P. brasiliensis foram convertidas em resistentes a higromicina B pelo sistema de transformação mediado por Agrobacterium-tumefaciens utilizando um vetor binário plasmidial pCB301 contendo os genes da higromicina B fosfotransferase (hph) e o repórter green fluorescent protein (GFP) controlados pelo promotor CBP1 de Histoplasma capsulatum e o terminador Ura5. A transformação mediada por Agrobacteriumtumefaciens produziu transformates estáveis capazes de crescer em altas concentrações de higromicina B. A expressão de GFP foi analisada por microscopia confocal e a variação da intensidade de fluorescência sugeriu a integração do TDNA em sítios randômicos do genoma do fungo. _____________________________________________________________________________ ABSTRACT / Paracoccidioides brasiliensis causes a chronic granulomatous mycosis prevalent in Latin America. Successful resolution of infection with this fungus is dependent on activation of cellular immunity. We previously identified heat shock protein 60 as a target of the humoral response in paracoccidioidomycosis. Herein we expressed the gene encoding the heat shock protein 60 in Escherichia coli and analyzed the immunological activity of this recombinant antigen. Immunization of BALB/c mice with recombinant protein emulsified in adjuvant stimulated a cellular immune response as assessed by proliferation and interferon-gamma production. Vaccination with heat shock protein 60 reduced fungal burden in mice given 106 or 107 yeasts. CD4+ cells were necessary for the efficacy of vaccination in both the afferent and efferent phases. Thus, we have demonstrated that this immunodominant antigen is a candidate for development of a vaccine against this fungus. In a second part of this work, yeasts of P. brasiliensis were transformed to hygromycin B resistance by a Agrobacterium-tumefaciens-mediated transformation system using a binary plasmid vector pCB301 containing the hygromycin B phosphotransferase hph) and the enhanced green fluorescent protein (GFP) genes controlled by the CBP1 promoter from Histoplasma capsulatum and the Ura5 terminator. Agrobacterium-tumefaciens-mediated transformation yielded stable transformants capable of growing on increased concentrations of hygromycin B. The expression of GFP was analyzed by confocal microscopy and the intensity fluorescence variation suggested an integration of the T-DNA at random sites in the genome of the fungus.
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Expressão da proteína do envelope do vírus da febre amarela em células de inseto

Machado, Tatiane Guerreiro Campanhoni 15 May 2007 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2007. / Submitted by Fabrícia da Silva Costa Feitosa (fabriciascf@gmail.com) on 2010-01-13T22:18:05Z No. of bitstreams: 1 2007_TatianeGuerreiroCMachado.pdf: 2409688 bytes, checksum: 7c7a021f2c710fa7e040d98e17b5cc62 (MD5) / Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2010-01-13T22:36:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2007_TatianeGuerreiroCMachado.pdf: 2409688 bytes, checksum: 7c7a021f2c710fa7e040d98e17b5cc62 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-01-13T22:36:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007_TatianeGuerreiroCMachado.pdf: 2409688 bytes, checksum: 7c7a021f2c710fa7e040d98e17b5cc62 (MD5) Previous issue date: 2007-05-15 / A febre amarela é uma doença hemorrágica causada por um vírus pertencente à família Flavivirus que é transmitido aos humanos através de picada por mosquitos. O vírus possui RNA fita simples, sentido positivo, com genoma de 10.862 nucleotídeos e uma única fase aberta de leitura ou ORF (do inglês: "Open Reading Frame") de cerca de 10.233 nucleotídeos. A ORF codifica três proteínas estruturais (capsídeo, pré-M e envelope) e 7 não estruturais (NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b, NS5), sendo que destas, a proteína do envelope é uma das mais estudadas devido ao seu alto potencial antigênico O isolamento de partes virais pode ser importante na utilização de antígenos para o desenvolvimento de novas vacinas e métodos diagnósticos. Na tentativa de isolar partes virais e expressá-las em separado são utilizados diferentes sistemas de expressão e dentre eles pode ser utilizado o sistema de expressão baseado em Baculovírus e células de inseto, que é um dos sistemas de expressão mais popular e eficiente. Baculovírus são vírus de DNA circular, dupla fita, que infectam artrópodes, principalmente os insetos. Existem muitas vantagens em se usar o sistema de expressão baseado em baculovírus e células de inseto, como altos níveis de expressão e modificações pós-traducionais, que permitem às proteínas recombinantes, serem montadas corretamente e biologicamente ativas. O gene do envelope do vírus da Febre Amarela foi isolado por técnica de RT-PCR, apresentando um tamanho de aproximadamente 1.600 pares de base. Em seguida, foi clonado em dois diferentes + plasmídeos de transferência: pSynXIV VI X3 e p2100, os quais foram co-transfectados, em células de inseto, com DNA de baculovírus recombinantes (vSynVI-gal, derivado do Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV), para o pSynXIV + X3 e vAgGalA2, derivado do Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV), para o p2100. Sete dias após a transfecção o sobrenadante da cultura celular foi coletado e utilizado para purificar o vírus recombinante pelo método de diluição seriada em placa de 96 poços. Os vírus recombinantes vSynYFE e vAgGalA2 foram, então, utilizados para infectar células de Trichopluisa ni em cultura (BTI- Tn5B1-4) e lagartas de Spodoptera frugiperda (para o vSynYFE) e Anticarsia gemmatalis (para o vAgYFE). Células de inseto infectadas com o vírus vSynYFE mostraram efeitos citopáticos manifestados pela formação de sincício celular (que é típico da infecção por flavivirus) e a análise desse extrato celular por SDS-PAGE detectou a presença de um polipeptídeo de aproximadamente 50 kDa, similar ao tamanho da proteína do envelope do vírus da Febre Amarela. Entretanto, extratos de tecido adiposo de lagartas infectadas (96 h p. i.) analisadas por SDS-PAGE e western blot detectaram um polipeptídeo por volta de 70 kDa, maior do que o esperado para a proteína do envelope da Febre Amarela. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Yellow fever is an haemorrhagic disease caused by a virus that belongs to the genus Flavivirus (Flaviviridae family) and is transmitted by mosquitoes. It is a positive- sense, single-stranded, enveloped RNA virus, and its genome consists of 10,862 nucleotides coding for a single ORF of 10,233 nucleotides. This ORF encodes three structural proteins (capsid, pre-M, and envelope) and seven non-structural proteins (NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b, NS5). Among the viral proteins, the envelope protein is the most studied one, due to its high antigenic potencial. Isolated recombinant viral antigens may be useful in new vaccine and/or diagnosis development. On the purpose of isolating viral parts and expressing them separately, different heterologous expression systems may be used and within these, the Baculovirus Expression System in insect cells is one of the most popular and efficient. Baculoviruses have a circular, double stranded DNA genome and infect arthropodes, mainly insects. There are many advantages of using the baculovirus expression system such as high expression levels and post-translational modifications that allow the expressed proteins to be correctly folded and biologically active. The Yellow fever envelope gene was isolated by RT- PCR (1,600 base pairs). This fragment was cloned into two different transfer vectors: + pSynXIV VI X3 and p2100, that were co-transfected, in insect cells, with DNA from recombinant baculoviruses vSynVI-gal, derived from Autographa californica multiple + nucleopolyhedrovirus (AcMNPV), for the pSynXIVVI X3 and vAgGalA2, derived from Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV), for the p2100]. Seven days after transfection, the cell culture supernatant was collected and used to purify the recombinant virus by the end-point dilution method in 96-well plates. The recombinant viruses, vSynYFE e vAgGalA2 were used to infect Trichopluisa ni insect cells (BTI-Tn5B1-4) and Spodoptera frugiperda larvae (for vSynYFE) and Anticarsia gemmatalis larvae (for vAgYFE). Insect cells infected with vSynYFE virus showed cytopathic effects manifested by multinucleated syncytial cells (which is typical of Flavivirus infection) and analysis of these cells extracts by SDS-PAGE detected the presence of a polypeptide around 50 kDa, similar to the size of the original Yellow fever envelope protein. However, fat body extracts of infected larvae (96 h p.i.) analysed by SDS-PAGE and Western blot detected a polypeptide around 70 kDa, different from the predicted size of the envelope protein.
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Expressão heteróloga, citolocalização e modelagem molecular da otubaína, uma deubiquitinase predita de Leishmania chagasi

Guido, Bruna Cândido 03 April 2011 (has links)
Dissertação (mestrado)-Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2011. / Submitted by claudia teixeira (claudiadtx@gmail.com) on 2011-06-22T01:12:53Z No. of bitstreams: 1 2011_BrunaCândidoGuido.pdf: 2583425 bytes, checksum: 6da0d341ca671f7a9832a6e4581fc86b (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2011-06-22T15:03:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_BrunaCândidoGuido.pdf: 2583425 bytes, checksum: 6da0d341ca671f7a9832a6e4581fc86b (MD5) / Made available in DSpace on 2011-06-22T15:03:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_BrunaCândidoGuido.pdf: 2583425 bytes, checksum: 6da0d341ca671f7a9832a6e4581fc86b (MD5) / As leishmanioses, doenças infecciosas causadas por protozoários intracelulares do gênero Leishmania, apresentam manifestações clínicas diversas e tratamento de difícil administração com efeitos colaterais severos. Estas doenças ainda representam um relevante problema de saúde pública que somado a questão do tratamento, refletem a necessidade de se avançar na pesquisa e na busca por novos fármacos. As proteases, enzimas que catalisam a hidrólise de ligações peptídicas de proteínas e cadeias polipeptídicas, desempenham alguns papéis chaves nos parasitos protozoários como na transição do ciclo de vida, invasão do hospedeiro, evasão imune do parasito e na patogênese de doenças parasitárias. Neste contexto, este trabalho se focaliza no estudo da otubaína de Leishmania chagasi, uma cisteíno protease pertencente às enzimas deubiquitinantes (DUBs). Algumas DUBs são essenciais na imunomodulação e regulação da resposta inflamatória. A otubaína 1 de humanos, por exemplo, possui como substrato a proteína E3 GRAIL associada à anergia dos linfócitos. Este trabalho teve como objetivo a clonagem e expressão da otubaína recombinante de L. chagasi (rOtuLc) bem como sua citolocalização, caracterização de sua atividade e proposição da sua estrutura por modelagem e dinâmica molecular. O gene da OtucLc foi amplificado e seu produto clonado no vetor de expressão, pET-19b, expresso em E. coli BL21 (DE3). A rOtuLc foi induzida com 0,1 mM IPTG, a 16 ºC por 16 h. A proteína recombinante solúvel foi purificada em coluna de agarose-níquel. Anticorpos anti-OtuLc foram produzidos em camundongos e sua especificidade foi confirmada por immunoblot. A imunocitolocalização da OtuLc em promastigotas de L. chagasi revelou sua localização em vesículas e uma marcação pontual de forte intensidade na região anterior, próximo ao cinetoplasto. Testes de atividade da rOtuLc contra os substratos Ub-AMC e Z-LRGG-AMC foram realizados e a rOtuLc mostrou-se inativa. Finalmente, a modelagem molecular por homologia e os ensaios de dinâmica molecular de equilíbrio indicaram que a OtuLc é composta por 10 hélices ? e 1 folha ?, de 4 fitas, e mantém conservado o posicionamento dos resíduos da tríade catalítica, estando o resíduo Cys81 no início de uma hélice ? direita próxima à fita ? onde se encontram os resíduos His261 e Asn263. Estes resultados iniciais poderão servir como ferramentas de grande valia para uma avaliação futura do potencial quimioterápico da OtuLc. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Leishmaniasis are infectious diseases caused by intracellular protozoa of the genus Leishmania which have different clinical manifestations and treatment difficult to administer with serious secondary effects. These diseases still represent a significant public health problem and together with the difficulties encountered in the current treatment reflect the need to advance the search for new drugs. Proteases, enzymes that catalyze the hydrolysis of peptide bonds of proteins and polypeptide chains, play key roles in some protozoan parasites such as life cycle transition, host invasion, parasite immune evasion and parasitic diseases pathogenesis. In this context, this work focuses on studing Leishmania chagasi otubain, a cysteine protease belonging to deubiquitinating enzyme (DUBS). Some DUBs are essential in immunomodulation and regulation of the inflammatory response. The human otubain 1, for example, has the GRAIL E3 protein as substrate, associated with anergy in lymphocytes. The aim of this work was the cloning and expression of recombinant L. chagasi otubain (rOtuLc), the verification of its cytolocalization, the activity characterization and the structure proposition by molecular modeling and dynamics. The OtuLc gene was amplified and the product cloned into the expression vector pET-19b expressed in E. coli BL21 (DE3). Expression of recombinant protein condition was 0,1 mM IPTG, 16 °C for 16 h. The soluble recombinant protein was purified by nickel-agarose column. Anti-OtuLc antibodies were produced in mice and its specificity was confirmed by immunoblot. Cytolocalization of OtuLc in L. chagasi promastigotes revealed vesicular pattern localization and a high-intensity point labeled in the anterior region near the kinetoplast. rOtuLc activity tests against Ub-AMC and Z-LRGG-AMC substracts were performed and the recombinant protein was found to be inactive. Finally, homology molecular modeling and molecular dynamics assay indicated that OtuLc is composed of 10 α helices and 1 β sheet and retains the conserved residues of catalytic triad positioning with Cys81 residue at the beginning of a right handed α helix near to His261 and Asn263 at the β sheet. These initial results may serve as valuable tools for future assessement of the chemotherapeutic potential of OtuLc.

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