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Purificação e caracterização imunoquimica parcial das imunoglobulinas tipo IgG de Tayassu tajacu (L.)

Arita, Maria Sumiko, 1950- 14 July 2018 (has links)
Orientador : Benedito Oliveira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-14T03:32:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Arita_MariaSumiko_M.pdf: 4935325 bytes, checksum: fc8877fe537576a558710e9741a9b68d (MD5) Previous issue date: 1978 / Resumo: 1. A resposta imune de Tayassu tajacu (L.), segundo o esquema descrito, leva a uma síntese preferencial de imunoglobulinas tipo IgGl. 2. por cromatografia em troca iônica e filtração em gel foram separadas três populações de anticorpos designadas, frações A, C e IgG-RC, com mobilidade eletroforética característica das imunoglobulinas IgG2C e IgGl de cobaia. 3. A precipitação específica em gel de agar, imunoeletroforese e hemaglutinação passiva, mostraram ser estas proteínas capazes de reconhecimento específico do antígeno. 4. Em função de seu comportamento em cromatografia de troca iônica, sua mobilidade eletroforética, precipitação específica, coeficiente de sedimentação, peso molecular e análise global de amino ácidos, estas três populações moleculares podem ser qualificadas de anticorpos IgG2A 7S, IgG2C 7S e IgGl. 5. os anticorpos específicos de Tayassu tajacu (L.), isolados do soro imune por meio de cromatografia de afinidade, mostraram-se resistentes ao tratamento ácido, utilizado para eluição da coluna de imunoadsorvente. 6. A técnica de hemaglutinação passiva, demonstrou título maior de anticorpos hemaglutinantes na região de IgGl, o que corrobora os resultados da análise eletroforética da resposta imune de Tayassu tajacu (L.). 7. A degradação proteolítica dos anticorpos tipo IgG2 de Tayassu tajacu (L.), apresentou os fragmentos Fab, Fc e Fc' característicos da digestão pela papaína de imunoglobulinas extensamente estudadas do ponto de vista estrutural tais como a IgG2 de cobaia e a IgG de coelho; os fragmentos Fab foram separados por cromatografia de troca iônica... Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Not informed. / Mestrado / Mestre em Ciências Biológicas
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Pontes dissulfeto inter cadeia de uma paraproteina M(JJO) IgG1 Glm(zax)

Marangoni, Sérgio, 1951- 08 November 1983 (has links)
Orientador: Benedito de Oliveira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-14T19:05:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marangoni_Sergio_D.pdf: 3995575 bytes, checksum: 388ae640ac8a953933cbb8c0647c8dae (MD5) Previous issue date: 1983 / Resumo: De paciente (JJO) da Faculdade de Medicina da Unicamp com quadro clínico característico de mieloma múltiplo foi obtido plasma com alta concentração de paraproteina M. A presença uma banda compacta indicativa de homogeneidade molecular característica de plasma patológico mielomatoso e de mobilidade eletroforetica tipo gamaglobulina lenta, foi detectada através de análise eletroforetica seguida de densitometria. O fracionamento do plasma JJO em DEAE celulose, levou a obtenção da fração A, cujo controle eletroforético evidenciou a purificação do componente M mielomatoso, livre de contaminações de outras proteinas plasmáticas. A fração A foi tipificada sorologicamente como uma imunoglobulina IgG do tipo IgGl com cadeias leves do isotipo lambda. O grau de pureza da proteina (JJO) (fração A) foi confirmado em eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS. A amostra, analisada na forma reduzida, mostrou a presença de bandas eletroforéticas com peso molecular em torno de 50000 e 25000 daltons em relação aos marcadores e que correspondem as cadeias pesada (H) e leve (L) respectivamente. A proteina M(JJO) foi caracterizada quimicamente como uma imunoglobulina IgGl com cadeias leves do isotipo lambda,através de autoradiografia da eletroforese em pH 3.5 do digesto péptico-tríptico da proteina JJO,reduzida e carboximetilada.Deste tratamento químico foram obtidas as bandas radioativas Jl, J2 e J3 de mobilidade eletroforética dos peptideos H-L, H-H e L respectivamente, e que caracterizam o padrão IgGl lambda / Abstract: Plasma from a patient (JJO) with multiple myeloma showing high levels of M paraprotein was obtained from the faculdade de Medicina, Universidade Estadual de Campinas.The results of electrophoretic analysis followed by densitometry showed a compact band indicative of molecular homogeneity characteristic of patient presenting monoclonal gamopathy. Fraction A containing myeloma protein was isolated from the pathologyc serum JJO by ion exchange chomatografy in DEAE celulose. Electrophoretic control of this fraction indicates the purification of the M component, without contamination with other plasma proteins. Fraction A was typed serologicaly as an IgGl immunoglobulin with lambda light chains. The purity of JJO protein (fraction A) was confirmed in SDS-polyacrylamide gel electroforesis. The reduced JJO protein showed two bands of 50 and 25K corresponding to heavy and light chains respectively. The M (JJO) paraprotein in was chemically typed as an IgGl protein with lambda light chains by autoradiography of high voltage electrophoresis of a pepsin-trypsin digests of myeloma protein partially reduced and alkylated with iodoacetate-C14. This material produces a consistent autoradiographic pattern. Which shows radioactives bands Jl, J2 andJ3 of electrophoretic mobility characteristic the H-L, H-H and L. peptides respectively / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Ciências Biológicas
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Avaliação da produção de anticorpos especificos, citocinas e quimiocinas na paracoccidioidomicose : correlação com a forma clinica e o tempo de tratamento

Mamoni, Ronei Luciano 09 January 2000 (has links)
Orientador: Maria Heloisa Souza Lima Blotta / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-07-27T01:46:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mamoni_RoneiLuciano_M.pdf: 2683040 bytes, checksum: acc6036324a8a945cb8ab134ec3c5f40 (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: A paracoccidioidomicose (pCM) é uma doença sistêmica, crônica e progressiva, causada pelo fungo Paracoccidioides brasiliensis, que apresenta-se sob duas formas clínicas principais: a forma Adulta ou Crônica (F A) e a forma Juvenil ou Aguda (FI). O presente trabalho teve por objetivo estudar a correlação entre as formas clínicas e o padrão da resposta imunológica apresentada pelo hospedeiro na infecção humana pelo P. brasiliensis ¿Observação: O resumo, na íntegra poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Paracoccidioidomycosis (pCM) is a systemic, chronic disease caused by the dimorphic fungus ParacoccidioÜks brasiliensis, which may be classified in two polar forms: acute or juvenile (JF) and chronic or adult form (AF) ...Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas
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Tipificação quimica da cadeia Kappa de imunoglobulina G de Tayassu tajacu.

Novello, Jose Camillo, 1955- 17 July 2018 (has links)
Orientador: Benedito de Oliveira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-17T15:18:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Novello_JoseCamillo_M.pdf: 2523038 bytes, checksum: 89617109190ae943c0206453619e00a1 (MD5) Previous issue date: 1987 / Resumo: De soro de Tayassu tajacu imunizado com gama globulina Bovina (BGG) foram isoladas duas populações de imunoglobulinas IgGl e IgG2. Seu grau de pureza foi avaliado através de imunoeletroforese em agar e eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SUS. A composição global de aminoácidos das proteínas IgGl e IgG2 mostrou: a) presença de 39 meia cistinas para ambas moléculas b) o número total de resíduos (excluindo o triptofano) igual a 1314 para IgGl e 1308 para IgG2. c) um padrão de resíduos compatível com as IgG. Os resultados do número de resíduos de meia cistinas sugerem um número de cinco meia cistinas na região da dobradiça. O pentapeptídeo PTl de seqüência de aminoácidos Asp ¿ Glu ¿ Cys ¿ Gln - Ala isolado do digesto péptico-tríptico da proteína IgG2 típica quimicamente a proteína IgG2 como uma proteína do isso tipo Kappa / Abstract: Not informed. / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Ciências Biológicas
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Purificação de imunoglobulina G a partir do plasma ou soro humano utilizando cromatografia de afinidade com ions metalicos imobilizados

Vançan, Sandra 25 July 2018 (has links)
Orientador: Sonia Maria Alves Bueno / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-07-25T23:25:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vancan_Sandra_M.pdf: 6213983 bytes, checksum: 026f117cf0c98455d786a9868057d851 (MD5) Previous issue date: 1999 / Resumo: Atualmente, a purificação de proteínas do plasma utilizando métodos seletivos (cromatográficos) tem sido visto pela indústria farmacêutica como uma operação necessária, uma vez que proteínas altamente purificadas limitam os riscos de efeitos colaterais em pacientes. Por isso, o desenvolvimento de métodos seletivos de purificação em larga escala são hoje indispensáveis para aumentar a diversidade, melhorar o rendimento e o grau de pureza das proteínas terapêuticas extraídas do plasma. No presente trabalho estuda-se a viabilidade de separar imunoglobulina G (IgG) a partir do plasma humano utilizando cromatografia de afinidade com íons metálicos imobilizados, IMAC. Esta técnica explora a afinidade de proteínas por íons metálicos imobilizados e tem sido utilizada para purificar várias proteínas e peptídeos. Experimentos cromatográficos foram realizados com IgG humana pura para selecionar o íon metálico entre Cu2+, Ni2+, Zn2+ e Co2+, a ser imobilizado no agente quelante (IDA) e vários tampões foram testados na etapa de adsorção. As proteínas adsorvidas no suporte foram eluídas pela protonação dos grupos doadores de elétrons da proteína reduzindo-se o pH do meio ou por competição com outra espécie doadora de elétrons (gradiente crescente da concentração de imidazol). Estes íons metálicos imobilizados no agente quelante EDA apresentaram diferentes forças de retenção da proteína (IgG humana pura). Selecionado o íon metálico Ni2+, a seletividade do suporte em adsorver IgG foi determinada empregando plasma humano de indivíduos sadios. Como IgG não foi purificada em IDA-Ni2" a níveis expressivos, utilizou-se uma segunda coluna em série com a primeira, a fim de obter maior pureza de IgG. Análises nefelométricas da fiação retida em colunas IDA-Zn em série com IDA-Ni2" e eluída a pH 5,0 mostraram a presença de 41,90% de IgG, 1,34% de IgM, 2,10% de IgA e 54,69% de transferrina. As proteínas contaminantes, transferrina e IgM, podem ser removidas da amostra por cromatografia de filtração em gel. A análise realizada por focalização isoelétrica das frações de lavagem e de eluição dos experimentos conduzidos com IgG humana Sigma, mostrou que a distribuição de pontos isoelétricos nas frações de lavagem e eluição não dependeu do íon metálico imobilizado (dentre os estudados), nem do sistema tamponante utilizado. Observou-se que as frações não retidas (lavagem) apresentaram IgG de baixo pi (entre 5,0 e 6,0). Não obteve-se seletividade na eluição de IgG por decréscimo de pH (íons Ni2^ imobilizado) ou incrementos na concentração de imidazol (íons Ni2+ e Zn2+ imobilizados), todas as frações apresentaram pi de 6,0 a 8,65, não sendo observado a separação / Abstract: Purification of plasma proteins through selective methods, such as cromatography, has been recognised in nowadays as an important operation by pharmaceutical industry as the highly purified proteins reduce side effects. Therefore, the development of purificaton selective methods for large scale operations are extremely important to broad diversity, improve the yield and purity of therapeutic proteins extracted from plasma. In this work a flexibility study on the separation of immunoglobulin G (IgG) from human plasma through immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC) is carried out. This technique exploit the protein affinity for immobilized metal ion and has been used to purity several proteins and peptides. Chromatography were carried out with pure human IgG in order to select the metal ion amongst Cu2+, Ni2+, Zn2+ e Co2", to be immobilized on IDA. Several buffers were tested in the adsorption stage as well. The proteins adsorbed on the support were eluted by the protonation of the electron-donating species on the protein using a decreasing pH step gradient or increasing imidazole concentration. The metal ion bonding chelating agents (IDA) showed distinct interactions with protein (pure human IgG). Since Ni2+ was selected, the support selectivity to adsorb IgG was determined with human plasma from healthy people. As IgG has not been completely purified on IDA-Ni2^, a second column (containing immobilized Ni2") has been used in series with the first one (containing immobilized Zn2") in order to achieve a ligher purity degree of IgG. Nephelometric analysis of the retained fraction on ID A-Zn2" columns in series with IDA-Ni2+, and eluted at pH 5.0 determinated 41.90% of IgG, 1.34% of IgM, 2.10% of IgA and 54.69% of transferrin. The contaminant proteins (transferrin and IgM) could be removed using gel filtration. The analysis carried out by isoelectric focusing of wash e elution fractions using human IgG (Sigma), showed that the isoelectric point distribution in the wash and elution fractions were not dependent neither on the immobilized metal ion or the buffer used. It could be observed that the non-retained fractions (wash) contained IgG with low pi (between 5.0 e 6.0). Selectivity in IgG elution by decreasing pH step gradient (immobilized Ni2+) or increasing imidazole concentration (immobilized Ni2r and Zn2+) was not reached, all retained fractions contained IgG with pi between 6.0 and 8.65, and separation was not observed / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Mestre em Engenharia Química
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Obtenção de anticorpos para moleculas de expressão especifica em celulas natural Killer uterinas (NKu) de camundongos

Bizinotto-Assunção, Marcia Cristina 13 August 2001 (has links)
Orientadores: Aureo Tatsumi Yamada, Wirla Maria da Silva Cunha Tamashiro / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-28T21:05:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bizinotto-Assuncao_MarciaCristina_M.pdf: 6104041 bytes, checksum: 3ffb92d94cec782124d560cb2a5a0ffb (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: Durante a gestação de roedores é observado, na região mesometria! de cada sítio de desenvolvimento embrionário, um acúmulo transitório de células linfocitárias da Hnhagem natural killer (NK). Estas células Natural Ki!ler de ambiente uterino (NK-u) apesar de expressarem antígenos de superfície semelhante as demais Nk, não desencadeiam a atividade cito!ítica como as Nk de sangue circulante. Este comportamento peculiar não foi ainda explicado o que vem dificultando a compreensão das possíveis participações destas células na imunoiogia da reprodução. A citoquímica de lectina OSA (Dofichos bíflorus aggfutin), tem sido utilizada para a marcação se!etiva das células NK-u de camundongos. Uma vez que esta lectina não reage com outros linfócitos, os glicoconjugados reativos a [ectina OBA, localizados na superfície das NK-u, poderiam ser moléculas especificas desta Hnhagem celular. Porém estes glicoconjugados não foram ainda isolados ou caracterizados. Neste trabalho, propôs-se a obtenção de anticorpos específicos para o reconhecimento de céiulas Nku de camundongos além de procurar identificar moléculas de expressão específica destas células. Para tanto as cé!ulas NK-u, isoladas de úteros de camundongos prenhes foram utilizadas como inócu!o antigênico em machos da mesma espécie. Apenas um dentre os seis camundongos imunizados produziu anticorpos que reagiram com as células NK_u, por meio de testes imunocitoquímícos. Do animal receptor que apresentou resposta imune, produzindo anticorpos reativos às células NK-u, foram obtidos os linfócitos espJênicos empregados na obtenção de hibridomas através da fusão com céluJas tumorais. Quatro hibridomas foram selecionados para a obtenção de líquido ascítico contendo anticorpos monoclonais. A especifiddade dos antícorpos obtidos foi avaliada por métodos imunocitoquímicos e imunoquímicos (westem b/otting). Entre os quatro clones selecionados (2C6.289, 2C6.2E4 2C4.1C10 e 2C4.5A10), dois apresentaram marcação tanto na superfície quanto no conteúdo citoplasmátíco das NK-u (2C4.1C10. 2C4.5A10), enquanto os outros dois marcaram apenas o conteúdo citoplasmático (2C6.2S9, 2C6.2E4). Pelos testes imunoquímícos realizados, os antícorpos produzidos pelos dones 2C4.1C10 e 2C4.5A 10 identificaram bandas de 52,0 KDa e 53,8 KOa e os anticorpos dos dones 2C6.289 e 2C6.2E4 identificaram uma banda de 41,4 KDa, que apresentam correspondência com bandas positivas à lectina DBA. o fato da imunização intraespécíe, com o uso de células NK-u inteiras ter resultado na produção de anticorpos contra estas células, toma-se a primeira evidência direta de que as células NK-u fazem parte de uma linhagem específica da gestação, as quais expressam moléculas exclusivas, reconhecidas como "non-self' pelos machos da mesma espécie. Dentre os c!ones de hibridomas produtores de anticorpos monoclonais aqueles que reconhecem estruturas de superfície das células NK-u podem ser utilizados como potenciais marca dores dessas células em camundongos, uma vez que reconhecem giicoconjugados também reativos à Jectina DBA, que seriam expressos exclusivamente por estas células / Abstract: During the pregnancy in the rodents a transient accumulation of natural killer (NK) cells 1s seen In the uterus. These cells found in the uterine environment express the surface antigen common to drculating NK (cNK) cells, but they do not show some cytokine receptors and do not trigger the cytoJytíc activity during normal pregnancy. Such a peculiar behavior of uNK ceH has not beeo fuUy explained aod their role io the immunoiogy of reproduction 1s stH! unc!ear. It has been reported the use of OBA (Dofichos bifJorus) lectin cytochernistry for selective staining of mouse uNK cel!. Since thís lectin does not react with othar !ymphocytes, the g!ycoconjugates reactive to OBA iectin localized on uNK cel! surface could be specific mo!ecules of such a cal! lineage. However, the glycoconjugates reactive to OBA lectin have no! been isolated ar characterized yet. The present work was proposed to obtain antibodies specific agaínst mouse uNK cel! and iooking identify mo!ecules of specific expression for. In this aim, the whole uNK ce!ls isolated from pregnant mice uterus were used as antigen and male mice of sarne strain, as host. From the animal producing antibodies against mouse uNK cell were collected the spleen and further processed to isolate the Iymphoeytes dones producing the monoclonal antibody (mAb) and the hybridomas of four clones were producad the ascites. The specificities of antibodies were evaluated by immunocytochemistry and immunoblotting. Only one among six immunized miee produced antibody against mouse uNK eells evaluated by immunocytochemistry. Four dones showing two different JabeJing pattern by immunocytochemistry were chosen to obtain ascites. The two (2C6.2B9, 2C6.2E4) clones producing mAS against uNK ceU cytop!asm eontents showed one positive band (41,4 KDa) in the westem blot matched to the DBA lectin positive bands. The other two ciones (2C4.1C10 e 2C4.5A 10) producJng mAb reacting on ceil surface and cytoplasm contents showed two positive bands (52,0 KDa and 53,8 KDa) corresponding to OBA lectin positive bands. Therefore, the antibody production against uNK cells afier intra-specie inoculation is the first direct evidence showíng uNK cells as being a cel! !ineage specific of pregnancy, which express specific molecules recognízed as non-self by male of the sarne strains. Among the mAb obtained, those reactive to antigen localized on call surface could be used as specific ceH marker of uNK once recognize the same glycoconjugates reactive to DBA lectin tha! seems to be expressed only by this cell / Mestrado / Histologia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural
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Avaliação de elementos formadores de Z-DNA como potenciais reguladores da expressão de biofármacos em células CHO-k1 / Evaluation elements forming Z-DNA as potential regulators of the expression of biopharmaceuticals in CH0-K1 cells

Sousa, Herdson Renney de January 2013 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-graduação em Patologia Molecular, 2013. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2014-01-13T11:52:09Z No. of bitstreams: 1 2013_HerdsonRenneydeSousa.pdf: 2689685 bytes, checksum: 872d1a2ad8abc84c2d12fe88886b1e2c (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2014-01-13T14:43:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_HerdsonRenneydeSousa.pdf: 2689685 bytes, checksum: 872d1a2ad8abc84c2d12fe88886b1e2c (MD5) / Made available in DSpace on 2014-01-13T14:43:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_HerdsonRenneydeSousa.pdf: 2689685 bytes, checksum: 872d1a2ad8abc84c2d12fe88886b1e2c (MD5) / Introdução: o grupo de Imunologia Molecular/UnB já produziu anticorpos recombinantes e humanizados de interesse comercial como o anti-CD18, anti-CD3, ou acadêmico como o anti-Z22,assim como fatores plasmáticos humanos. Os vetores de expressão utilizados contêm o promotor de CMV-IA. O objetivo desse trabalho foi explorar regiões formadoras de Z-DNA, e testar diretamente o papel do anticorpo estabilizador de Z-DNA (antiZ22NLS - Z22) no efeito transcricional do promotor CMV modificado (zCMV-IA). Material e Métodos: O primeiro passo foi reconstruir o cassete de expressão dos vetores tradicionais utilizados nesse trabalho, pCO e pCO?600. Para isso, fusionamos o gene GFP ao anticorpo recombinante aCD3. Os passos seguintes foram a introdução de sequências formadoras de Z-DNA (Z1, Z3 e Z4) e controles não formadores de Z-DNA (Z2 e Z5) a montante do promotor CMV-IA. Resultados e Discussão: foram construídos 10 vetores de expressão: 5 construções pCO (pZ1, pZ2, pZ3, pZ4 e pZ5) e 5 construções pCO?600 (?Z1, ?Z2, ?Z3, ?Z4 e ?Z5); transfecção de células CHO-K1 com as construções utilizando Lipofectamina LTX na proporção 1:1 de DNA e reagente LTX; Por fim co-transfecção de células com cada vetor de expressão e vetor pMacZ22NLS e como controle de cada vetor de expressão também foi feita transfecção com vetor pMac vazio. Em comparação aos controles em todas as construções a presença do pMacZ22 NLS aumentou a eficiência de transfecção. Através de citometria de fluxo se verificou aumento da MFI no gate das células GFP+ em até 25 % quando foi co-transfectado vetor com anti-Z-DNA. Conclusão: foi mostrado o papel de anti Z22 como indutor e estabilizador de Z-DNA e seu efeito facilitador da transcrição. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Introduction: Recombinant antibodies are now a reality in therapeutics. But its production is still a challenging issue. We have been developing expression vectors for heterologous expression of recombinant antibodies based on the CMV promotor. We had previously shown that a Z-DNA forming region upstream the promotor/enhancer enhances luciferase expression in a repórter vector. The aim of this study was to explore Z-DNA forming regions, and directly test the role of a Z-DNA stabilizing antibody on a modified CMV promoter (zCMV). Material and Methods: Initially, the GFP gene was fused with a recombinant antibody anti-CD3 and the fusion cassette was introduced in both pCO and pCO?6OO. Then we introduced the Z-DNA forming sequences (Z1, Z3 and Z4) and control sequences (Z2 and Z5) upstream of the CMV promoter. CHO cells were transfected using Lipofectamine LTX 1:1, DNA and LTX reagent. To provide the trans acting anti-Z-DNA antibody, we cotransfect cells with the vector pMACZ22NLS, that produces a scFv of the anti-Z-DNA mAb Z22 fused to a nuclear localization signal (Intrabody). Flow cytometry was use to follow GFP expression. Results and Discussion: 10 expression vectors were constructed: 5 pCO constructs (pZ1, pZ2, pZ3, pZ4 and pZ5) and 5 pCO?600 constructs (AZ1, AZ2, AZ3, AZ4 and AZ5); The constructions with Z-DNA forming sequences showed an improvement of expression of the reporter gene when compared to the control sequences. Moreover the co-transfection with the anti-Z-DNA vector enhances the MFI of gated GFP+ cells by 25%. Conclusion: The Z-DNA forming sequences improve heterologous gene expression and the presence of anti-Z-DNA in trans was shown to enhance the Z-DNA effect probably due to a stabilization effect.
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Efeitos da clonagem de elementos de DNA anti-repressores em vetor de expressão na produção de anti-CD3 em CHO-K1

Alcântara, Paulo Henrique de Franco 14 September 2010 (has links)
Dissertação (mestrado)-Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2010. / Submitted by Débora Amorim Romcy Pereira (deboraromcy@bce.unb.br) on 2011-06-21T14:46:30Z No. of bitstreams: 1 2010_PauloHenriqueDeFrancoAlcantara.pdf: 1343956 bytes, checksum: b896748355ffd9fb18333e0a2c3b538f (MD5) / Approved for entry into archive by Eveline Gonçalves(eveline@bce.unb.br) on 2011-06-21T15:07:40Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_PauloHenriqueDeFrancoAlcantara.pdf: 1343956 bytes, checksum: b896748355ffd9fb18333e0a2c3b538f (MD5) / Made available in DSpace on 2011-06-21T15:07:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_PauloHenriqueDeFrancoAlcantara.pdf: 1343956 bytes, checksum: b896748355ffd9fb18333e0a2c3b538f (MD5) / Nos últimos anos o grupo de Imunologia Molecular da Universidade de Brasília tem humanizado anticorpos de interesse clínico visando a sua aplicação terapêutica. A produção de proteínas terapêuticas como essas é de grande interesse para a indústria biofarmacêutica. Com intuito de produzir glicoproteínas estáveis, têm-se utilizado células de mamíferos como sistema de expressão heteróloga, pois estas possuem uma maquinaria pós-transcricional necessária para estabilizar biomoléculas complexas. No entanto, a produção de tais moléculas é geralmente dificultada pela imprevisibilidade e instabilidade da expressão ao longo do tempo. Isso se deve à alta probabilidade de silenciamento dos transgenes ao serem integrados na cromatina das células de mamíferos. Uma das alternativas para contornar esse problema é o melhoramento de vetores de expressão com o emprego de pequenos elementos de DNA (menores que 2100 pares de bases) que atuam como anti-repressores. No presente trabalho foram isolados quatro elementos de DNA humanos semelhantes às sequências dos elementos anti-repressores 35 e 40 identificados por Kwaks e colaboradores em 2003. Um elemento semelhante ao anti-repressor 35 e outro semelhante ao anti-repressor 40 foram clonados no vetor de expressão em células de mamíferos pMIRES anti-CD3 FvFc humanizado (Silva et al., 2009). O elemento anti-repressor 35 apresentou vários alinhamentos no cromossomo 7 humano. Já o elemento 40 pôde ser alinhado com diversas regiões de vários cromossomos, destacando-se os alinhamentos nos cromossomos 14 e 22. Esses elementos de DNA são sequências repetitivas presentes ao longo do genoma humano. Além disso, substituiu-se o promotor de citomegalovírus (CMV) deste mesmo vetor por um promotor CMV otimizado contendo a sequência do intron A (IA). As novas construções de vetores foram transfectadas em células de ovário de hamster chinês (CHO) e clones estáveis foram isolados para posterior caracterização da produção de anticorpos. Devido a sua similaridade com sequências anti-repressoras e o seu predomínio em regiões subcentroméricas, sugere-se que os elementos de DNA isolados sejam importantes na modulação da cromatina exercendo atividade anti-repressora. Outra hipótese é que, devido ao fato de serem elementos repetitivos no genoma humano, tais elementos podem ter sua origem em regiões altamente transcritas de retrotransposons. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Recently, the Molecular Immunology group of Universidade de Brasília has humanized clinical antibodies aiming their therapeutic applications. These therapeutic proteins production is of great interest to the biopharmaceutical industry. In order to produce stable glycoproteins, mammalian cells have been used as heterologous expression system since they possess post-translational machinery to stabilize those complex biomolecules. However, the production of such molecules is often hampered down by the unpredictability and instability of expression over time. This is due to the high probability of silencing of transgenes integrated into the chromatin of mammalian cells. One way to overcome this problem is the use of small elements of DNA (less than 2100 base pairs) that act as anti-repressors. In this work we have isolated four DNA human elements similar to the anti-repressors 35 and 40 sequences identified by Kwaks and collaborators in 2003. An element similar to the anti-repressor 35 and other similar to the anti-repressor 40 were cloned into the expression vector for mammalian cells pMIRES humanized anti-CD3 FvFc (Silva et al., 2009). The anti-repressor element 35 presented several alignments on human chromosome 7. Moreover, the element 40 was aligned with different regions on several chromosomes, particularly on chromosomes 14 and 22. These DNA elements are repetitive sequences present throughout the human genome. Additionally, we substituted the vector cytomagalovirus (CMV) promoter by the optimized CMV promoter containing the intron A (IA) sequence. These new vectors constructions were transfected into Chinese hamster ovary cells (CHO) and stable clones were isolated to acccess the antibody production. Due to its similarity to anti-repressor sequences and its prevalence in sub centromeric regions, it is suggested that the isolated DNA elements are important in the chromatin modulation by exerting anti-repressor activity. Another hypothesis is that, due to the fact that they are repetitive elements in the human genome, these elements may have their origin in retrotransposon’s highly transcribed regions.
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Contribuição do segmento VH e da CDRH3 no reconhecimento antigênico de ácidos nucléicos

Guedes, Leonardo January 2009 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2009. / Submitted by Larissa Ferreira dos Angelos (ferreirangelos@gmail.com) on 2010-03-30T15:15:38Z No. of bitstreams: 1 2009_LeonardoGuedes.pdf: 5624272 bytes, checksum: 75f7b4a1facc94065376aad00f058fb4 (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2010-05-12T14:36:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_LeonardoGuedes.pdf: 5624272 bytes, checksum: 75f7b4a1facc94065376aad00f058fb4 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-05-12T14:36:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_LeonardoGuedes.pdf: 5624272 bytes, checksum: 75f7b4a1facc94065376aad00f058fb4 (MD5) Previous issue date: 2009 / As imunoglobulinas são moléculas com capacidade de ligação a uma grande diversidade de antígenos. Estudos de variabilidade mostram que três regiões em cada cadeia variável, leve (L) e pesada (H), apresentam um maior grau de variabilidade, sendo por isso denominadas Regiões Determinantes de Complementaridade (CDR). Dentre essas, a CDR3 de ambas cadeias (H e L) é a que apresenta maior variabilidade. O objetivo deste trabalho é estudar anticorpos com capacidade de reconhecimento de ácidos nucléicos. Análises em bancos de dados revelaram que dentre as diversas famílias de genes que codificam as cadeias variáveis pesadas de camundongos, a pequena família VH10 destaca-se por ter sido identificada principalmente em anticorpos anti-DNA. Essa observação nos levou a postular que determinantes estruturais codificados por segmentos da família VH10 poderiam estar envolvidos nesse reconhecimento. Assim, nesse trabalho, construíu-se bibliotecas de scFvs de camundongos apresentadas na superfície de fagos filamentosos, contendo CDRH3s variáveis, no contexto de segmentos gênicos germinais da família VH10 e da família VH4 (que não apresenta nenhum Ac descrito como ligante a ácidos nucléicos depositado em banco de dados). A abordagem experimental consistiu basicamente na comparação do grau de variabilidade das CDRH3s selecionadas pela capacidade de reconhecimento a DNA de fita simples utilizando-se o procedimento de seleção (biopanning) preconizado na técnica de Phage Display As bibliotecas apresentavam tamanhos na ordem de 107 diferentes scFvs. Elas eram selecionadas pela capacidade de ligação a oligodT - celulose e os títulos de entrada e de saída foram obtidos em três ciclos de seleção. Foram realizados imunoensaios com as partículas virais selecionadas dos ciclos 2 e 3, tanto para a detecção da expressão dos scFvs como também para a verificação da capacidade de reconhecimento ao antígeno (oligodT - biotinilado). Os resultados obtidos com a análise de clones aleatoriamente escolhidos do ciclo 2 e 3 revelaram 12 sequências de CDR3Hs associadas a ligação a ácidos nucléicos e dessas, 9 são provenientes da família VH10 e 3 da família VH4. As três sequências obtidas no contexto de VH4 também estão presentes no contexto VH10. Os resultados sugerem que scFvs no contexto da família VH10, podem apresentar uma maior variabilidade CDR3Hs para o reconhecimento de ácidos nucléicos do que aqueles que apresentam o segmento da famíliaVH4, corroborando a hipótese de que determinantes estruturais codificados pelo segmento gênico VH10 participam do processo de reconhecimento antigênico. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The immunoglobulins are molecules with the capacity to recognize a variety of antigens. Variability studies show that three regions in each variable chain, light (L) and heavy (H), have a greater degree of variability and is therefore called Complementarity Determinants Regions (CDR). Among these, the CDR3 of both chains (H and L) are the ones that show the greatest variabilities. The aim of this work is study the antibodies able to recognize nucleic acids. Analysis in databases revealed that among the different families that are gene that encode the murine variable heavy chains, the small VH10 family stands out in terms of such kind of antigen recognition. This observation led us to postulate that structural determinants encoded by the V segment of the VH10 family could be specially involved in this binding ability. Thus, we built two scFvs phage display libraries, containing variable CDRH3, in the context of germinal V gene from family VH10 and the family VH4 (which presents no antibody described as ligand to nucleic acid in databank). The experimental approach was basically the biopanning of phages from those two libraries, using oligo-dT celulose as ligand. After three selection rounds, phages from round 2 and 3 were analyzed in terms of CDR3H composition and the ability to bind to the antigen in immunoassays.The analysis of randomly selected clones revealed 12 sequences of CDR3Hs able to bind to nucleic acids. From these, 9 were from the VH10 family and 3 were VH4 phages. The three sequences obtained in the context of VH4 were also present in VH10 phages. The results suggested that VH10 scFvs may allow greater CDR3H variability than VH4 ones, corroborating the hypothesis that structural determinants encoded by the V gene segment from VH10 contributes significatively for the recognition of nucleic acids.
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Produção e purificação parcial de IgY anti-lectina de sementes de Canavalia brasiliensis (ConBr) (Leguminosae) em galinhas poedeiras / Production and partial purification of IgY anti- lectin of Canavalia brasiliensis seeds (ConBr) (Fabaceae) in laying hens

Correia Neto, Cornevile January 2015 (has links)
CORREIA NETO, Cornevile. Produção e purificação parcial de IgY anti-lectina de sementes de Canavalia brasiliensis (ConBr) (Leguminosae) em galinhas poedeiras. 2015. 72 f. Dissertação (mestrado em biotecnologia de recursos naturais)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2015. / Submitted by Elineudson Ribeiro (elineudsonr@gmail.com) on 2016-03-31T18:35:56Z No. of bitstreams: 1 2016_dis_ccorreianeto.pdf: 1670684 bytes, checksum: 825c0b40271bc72b068773e82944d3c8 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-05-18T20:14:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_dis_ccorreianeto.pdf: 1670684 bytes, checksum: 825c0b40271bc72b068773e82944d3c8 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-18T20:14:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_dis_ccorreianeto.pdf: 1670684 bytes, checksum: 825c0b40271bc72b068773e82944d3c8 (MD5) Previous issue date: 2015 / Lectins are a group of proteins present in various living organisms, particularly in plants and especially in Leguminosae seeds. Among this family, a species that stands out for having large amount of lectin in the seed is the Canavalia brasiliensis. One approach for the investigation of lectins on biological systems is the detection there of by techniques involving antibody. Such techniques may include from classical immunochemical assays (immunodiffusion, immunoelectrophoresis and rocketimunoeletroforese) to ELISA experiments and advanced microscopy techniques. In this sense, antibodies become biotechnological tools invaluable since they are capable of specifically recognizing epitopes of the target molecules. Immunoglobulins (Igs) are proteins present in high concentration in the blood plasma of mammals. They are vectors of humoral immunity, with the primary function to join the foreign antigens to the individual so as to neutralize them. In the case of poultry the main immunoglobulin class (IgYs) can be found not only in blood, but also in egg yolk. This fact enables fast and efficient purification of these molecules facilitating its use as biotechnological inputs. Thus, this study aimed to produce antibodies against the lectin extracted from Canavalia brasiliensis seed (ConBr) (Fabaceae) in laying hens, implementing production methodology of new biotechnological inputs for the study of lectins. For this laying hens were immunized with 200 or 400μg of lectin Canavalia brasiliensis (ConBr) for 15 weeks at 10-day intervals. Collected eggs from vaccinated birds had their isolated and precipitated yolk in 0-30% fraction with ammonium sulfate for partial purificaçãoo of IgYs. Confirmation of the presence of antibodies was made by immunodiffusion assays agarose gel. The fraction showed 0-30%, from the first week after the immunization, capable of recognizing ConBr IgYs. This profile appeared in all groups over the 15-week experiment. The production of specific IgYs against the lectin from Canavalia brasiliensis (ConBr) proved feasible and remained throughout the experiment, possibly in reasonable quantities. In this sense, IgYs produced in this work provide a powerful biotechnological tool to be made available for future studies. / As lectinas constituem um grupo de proteínas presentes em diversos organismos vivos, sobretudo em vegetais e especialmente em sementes de Leguminosae. Dentre essa família, uma espécie que se destaca por possuir grande quantidade de lectina na semente é a Canavalia brasiliensis. Uma das possíveis abordagens para a investigação de lectinas em sistemas biológicos é a detecção das mesmas através de técnicas que envolvam anticorpos. Tais técnicas podem incluir desde ensaios clássicos de imunoquímica (imunodifusão, imunoeletroforese e rocketimunoeletroforese), até experimentos de ELISA e técnicas avançadas de microscopia. Neste sentido, os anticopos tornam-se ferramentas biotecnológicas de grande valia uma vez que são capazes de reconhecer especificamente epítopos das moléculas alvo. As imunoglobulinas (Igs) são proteínas presentes em grande concentração no plasma sanguíneo de mamíferos. São os vetores da imunidade humoral, tendo como função principal unir-se aos antígenos estranhos ao indivíduo, de modo a neutralizá-los. No caso das aves a principal classe de imunoglobulinas (IgYs) pode ser encontrada não somente no sangue mas também nas gemas dos ovos. Esse fato permite purificação rápida e eficiente dessas moléculas facilitando seu uso como insumos biotecnológicos. Dessa forma, este trabalho teve por objetivo produzir anticorpos contra a lectina extraída da semente de Canavalia brasiliensis (ConBr) (Leguminosae) em galinhas poedeiras, implementando metodologia de produção de novos insumos biotecnológicos para o estudo de lectinas. Para tanto galinhas poedeiras foram imunizadas com 200 ou 400μg da lectina de Canavalia brasiliensis (ConBr) por 15 semanas em intervalos de 10 dias. Ovos coletados das aves imunizadas tiveram suas gemas isoladas e precipitadas na fração 0-30% com sulfato de amônio para a purificação parcial das IgYs. A confirmação da presença dos anticorpos foi feita por ensaios de imunodifusão em gel de agarose. A fração 0-30% apresentou, a partir da primeira semana após a imunização, as IgYs capazes de reconhecer ConBr. Esse perfil se apresentou em todos os grupos ao longo das 15 semanas de experimento. A produção das IgYs específicas contra a lectina de Canavalia brasiliensis (ConBr) se mostrou viável e permaneceu durante todo experimento, possivelmente em quantidades razoáveis. Neste sentido, as IgYs produzidas nesse trabalho constituem uma potente ferramenta biotecnológica a ser disponibilizada para estudos futuros.

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