Orientador: Rejane Maria Tommasini Grotto / Resumo: A progressão da fibrose hepática somada à infecção pelo vírus da hepatite C (VHC) tem sido associada à resposta imunológica permanente. O estudo no repertório de anticorpos Anti-VHC na progressão da fibrose hepática foi explorado através de ferramentas de sequenciamento em larga escala (NGS) possibilitando uma análise de repertórios altamente variáveis como as porções variáveis VH (cadeia pesada) e Vk (cadeia leve) das imunoglobulinas, e a determinação de famílias e subfamílias dos genes V-D-J associadas à resposta humoral encontrada nas diferentes fases da doença proporcionam uma ferramenta importante no entendimento da resposta imune frente à infecção viral pelo VHC. As porções VH e Vk das imunoglobulinas foram obtidas a partir da amplificação de RNA de sangue de paciente VHC positivos e com diferentes graus de fibrose, e sequenciadas na plataforma Illumina® Miseq, fornecendo uma grande variabilidade de sequências que foram pré-processadas por ferramentas de bioinformática e analisadas em dois bancos de anticorpos diferentes: IgBlast (NCBI) e IMGT® quanto às famílias e subfamílias mais expressas. A expressão restrita de algumas famílias e subfamílias: IGHV1, IGHV3, IGHV4 e subfamílias já descritas em vários estudos associados ao VHC corrobora com nossos achados de que existe uma tendência do uso de algumas subfamílias como: IGHV1-2, IGHV1-8, IGVH1-69, IGHV3-11, IGHV3-21, IGHV3-23, IGVH3-30, IGHV4-4, IGHV4-34 IGHV4-39 na cadeia pesada; assim como IGkV3-15 e IGkV3-20 na cadei... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The progression of hepatic fibrosis in the hepatitis C virus (HCV) infection has been linked with permanent immune response. The study in the repertoire of Anti-HCV antibodies in the progression of hepatic fibrosis was analysed for large-scale sequencing (NGS) tools enabling a highly variable analysis such as the VH (heavy chain) and Vk (light chain) portions of immunoglobulins and the determination of families and subfamilies of the V-D-J genes in the humoral response found in the different phases of the disease, a great tool in the understanding of the immune response to HCV viral infection. The VH and V portions of the immunoglobulins were obtained from the amplification of HCV positive HCV patient blood with different degrees of fibrosis and sequenced on the Illumina® Miseq platform, providing a large sequence variability that was preprocessed by tools of bioinformatics and analyzed in two different antibody banks: IgBlast (NCBI) and IMGT® for the most expressed families and subfamilies. The restricted expression of some families: IGHV1, IGHV3, IGHV4 and subfamilies already described in several HCV-related studies confirm our findings that there is a tendency to use some subfamilies, such as: IGHV1-2, IGHV1-8, IGVH1- 69, IGHV3-11, IGHV3-21, IGHV3-23, IGVH3-30, IGHV4-4, IGHV4-34 IGHV4-39 in the heavy chain; as well as IGkV3-15 and IGkV3-20 in the light chain, but the subfamilies: IGHV1-8, IGHV3-11, IGHV4-39, IGkV1-5, IGkV1-12, IGkV1-39 were also among the most expressed, i... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Made available in DSpace on 2016-04-15T13:03:38Z (GMT). No. of bitstreams: 2 gentil_vasconcelos_ioc_dout_2015.pdf: 3238898 bytes, checksum: 4b0a8f2422705d1ca8dfa7ae9a2ca1da (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A produção de anticorpos em aves imunizadas seguida da extração desses anticorpos da gema dos ovos (IgY), tem atraído o interesse da comunidade científica, como pode ser demonstrado pelo aumento significativo da literatura sobre a IgY. Esta abordagem, que é apropriada à produção em larga escala, oferece inúmeras vantagens, tais como, baixo custo e alta eficiência da técnica, em vista do extraordinário rendimento de IgY em somente uma ave (20-40 g IgY por ano), e é mais adequada ao conceito bioético quando trata-se da manutenção e do manejo das aves. Destaca-se que a tecnologia da IgY oferece novas possibilidades de aplicação em imunoterapia e métodos de diagnóstico, tanto para aplicação humana quanto veterinária, incluindo estratégias de tratamento de doenças intestinais graves em crianças, particularmente em países pobres. Neste presente estudo, objetivou-se avaliar a eficiência terapêutica da IgY utilizando macacos cynomolgus (Macaca fascicularis) jovens desafiados com o rotavírus do grupo A (RVA) humano, a maior causa de morbidade e mortalidade de crianças em todo o mundo, especialmente em países em desenvolvimento. Para esta proposta, anticorpos IgY específicos contra o RVA foram produzidos em aves, purificados por polietileno glicol, caracterizados por eletroforese em gel de poliacrilamida, western blotting e um teste de neutralização em cultura de células (MA-104). Este experimento preliminar rendeu uma suspensão altamente concentrada de IgY específica anti-rotavírus (IgY anti-RVA) (média de 37 mg/mL) O macaco cynomolgus foi estabelecido como modelo de infecção experimental após uma única administração de suspensão de rotavírus humano (3,1x106 FFU/mL) por sonda gástrica. Os animais foram acompanhados durante onze dias, sendo observadas as manifestações clínicas, cargas virais sérica e fecal, hematologia e dosagem de eletrólitos séricos. O principal sinal clínico (observado em dois dos sete animais inoculados) foi diarreia associada com diminuição dos níveis séricos de potássio durante três dias, seguido de recuperação. O RNA viral foi detectado nas fezes e no soro dos animais infectados, além de partículas infecciosas encontradas nas fezes, sugerindo replicação viral. Na imunoterapia experimental, os macacos foram inoculados com RVA humano (3,1x107 FFU/mL), desafiados com a suspensão de IgY anti-RVA obtida previamente, e foram monitorados durante cinco dias pelos parâmetros observados no experimento anterior. A eficiência terapêutica da imunoterapia com IgY foi confirmada pela ausência de episódios de diarreia, que é reconhecida como \201Cpadrão ouro\201D para eficácia clínica, apesar do RNA viral ter sido detectado nas fezes de 11 de 12 animais inoculados com o RVA. A duração da detecção do RNA foi reduzida em dois dos três grupos de animais tratados com IgY, quando comparado ao grupo controle positivo. Em um animal que foi tratado com IgY pelas vias oral e intravenosa, não foi detectado genoma viral nas fezes. Como conclusão, a aplicação de anticorpos IgY anti-RVA específicos produzidos em aves, apresenta eficácia no tratamento de gastroenterite aguda causada pelo rotavírus do grupo A humano Nossos resultados também confirmam que macacos cynomolgus podem ser considerados hospedeiros suscetíveis à infecção com RVA humano, e apontam para a necessidade de controle sanitário da rotavirose humana em colônias de criação de macacos cynomolgus. Esses resultados preliminares sugerem um papel promissor da imunoterapia passiva utilizando IgY anti-RVA em infecção experimental com o rotavírus do grupo A humano. No entanto, um enfoque direto na patogênese da infecção no trato entérico fornecerá informações adicionais para confirmar a eficácia do tratamento com a IgY / The production of antibodies in chickens and the extraction of specific antibody suspensions from egg yolk (IgY) are increasingly attracting the interest of the scientific community, as demonstrated by the significant growth of the IgY literature. This approach, which is suitable to a large - scal e production, offers several advantages such as the low cost and high efficiency of the technique, in view of the extraordinary yield of IgY by a one hen (20 g – 40 g IgY per year), and its suitability to a more bioethical manner for hen keeping. Of note, the IgY - technology offers new possibilities for application in human and veterinary diagnostics and therapeutics, including strategies for the treatment of severe intestinal diseases in children, particularly in poor countries. In this study, we aimed to e valuate the therapeutic efficacy of the IgY by using young cynomolgus monkeys ( Macaca fascicularis ) challenged with human rotavirus group A (RVA), a major cause of morbidity and mortality in children worldwide, especially in developing countries. For this purpose, specific IgY antibodies against RVA were produced in hens, purified by polyethylene glycol, characterized by polyacrylamide gel electrophoresis, western blotting and a neutralization assay in a cell culture system (MA - 104). This preliminary experi ment has yielded a high concentrated suspension of anti - rotavirus specific IgY (anti - RVA IgY) (average 37 mg/ml). The cynomolgus experimental infection model was established after a single administration of a human rotavirus suspension (3.1x10 6 FFU/ml) by oral gavage. The confined animals were followed during a period of eleven days, observed for clinical signs, measurement of serum and faecal viral load, and evaluation of hematology and serum electrolytes. The main clinical sign (observed in two of the sev en inoculated monkeys) was diarrhea associated with a decrease in serum potassium during three days, followed by recovery. Viral RNA was detected in both serum and faeces of the infected animals, thus suggesting viral replication. In cynomolgus experimenta l immunotherapy, the monkeys were inoculated with human RVA (3.1x10 7 FFU/ml), challenged with the anti - RVA IgY suspension previously obtained, and monitored during five days by using the same clinical and biochemical parameters, as previously established. The therapeutic efficacy of the immunotherapy with IgY was confirmed by the absence of episodes of diarrhea, which is recognized as the "gold standard" for clinical efficacy, although viral RNA had been detected in faeces of all but one of the inoculated m onkeys. The duration of RNA detection was shortened in two of the three groups of animals treated with IgY, when compared to the positive control. One animal, which was orally and intravenously treated with the anti - RVA IgY, had no RNA detected in faeces. In conclusion, the application of specific anti - RVA IgY antibodies, produced in hens, presents efficacy in the treatment of acute gastroenteritis caused by human rotavirus group A. Our results also confirm that cynomolgus monkeys can be considered suscepti ble hosts to infection with human RVA, and pointed to the necessity of sanitary control of human rotavirus disease in the breeding colonies of cynomolgus monkeys. Our preliminary results suggest the promising role of passive immunotherapy using anti - RVA Ig Y in experimental infection with human rotavirus group A. However, a direct approach to the pathogenesis of enteric tract infection will provide additional data to confirm the effectiveness of the IgY treatment.

DAMASCENO, Juliana Ximenes. Níveis de imunoglobulinas na saliva de crianças e adolescentes portadores de hepatite auto-imune. 2012. 110 f. Dissertação (Mestrado em Odontologia) - Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2012. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2015-10-21T13:32:42Z No. of bitstreams: 1 2012_dis_jxdamasceno.pdf: 2682775 bytes, checksum: 9d31d129b511ba7318644215ea132e8b (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2015-10-21T13:33:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_dis_jxdamasceno.pdf: 2682775 bytes, checksum: 9d31d129b511ba7318644215ea132e8b (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-21T13:33:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_dis_jxdamasceno.pdf: 2682775 bytes, checksum: 9d31d129b511ba7318644215ea132e8b (MD5) Previous issue date: 2012 / Autoimmune hepatitis (AIH) is an inflammatory chronic liver disease of unknown etiology found predominantly in females, leading when untreated, to cirrhosis. It is a rare disease in the childhood, corresponding to about 10% of patients with chronic hepatitis, but exhibits high mortality. It is characterized by hipergammaglobulinemia, organ nonspecific circulating autoantibodies, and an inflammatory liver-infiltrating lymphocytes and plasma cells. The use of saliva as a diagnostic tool has advanced exponentially within recent years. Unbalance in the amount and composition of saliva may generate oral diseases and may also indicate important systemic alterations. This study has aimed to investigate the parameters of immunoglobulins and human whole saliva in patients with AIH. Our study sample consisted of 12 individuals with AIH (experimental group) and 12 healthy individuals without AIH (control group). Salivary flow rate, Ph, immunoglobulins and protein profile were evaluated in this population. Non stimulated whole saliva was collected and centrifuged. The supernatant was separated and lyophilized and stored at -80°C for posterior total protein, unidimensional electroforetic analysis and ELISA. Statistically significant differences were observed between groups (p ≤ 0, 05) for the analyzed salivary parameters. When compared to the control group, individuals with HAI presented elevated IgG level and protein bands with specific expression. The results of this study suggest the existence of important differences within the pattern of salivary protein composition between groups. / A hepatite autoimune (HAI) é uma doença inflamatória crônica do fígado, de etiologia desconhecida, que acomete preferencialmente mulheres, com destruição progressiva do parênquima hepático e que, sem tratamento imunossupressor, evolui frequentemente para cirrose. Consiste em uma doença rara na infância, com menos de 10% dos pacientes com doença hepática crônica, porém de alta mortalidade. Caracteriza-se pela presença de hipergamaglobulinemia, autoanticorpos não órgãos - específicos e infiltrado inflamatório portal linfoplasmocitário. O uso da saliva como um método de diagnóstico avançou exponencialmente nos últimos anos. Desequilíbrios na quantidade e qualidade da saliva podem tanto gerar afecções bucais quanto ser indicativo de alguma alteração sistêmica importante. Este trabalho objetivou estudar parâmetros de imunoglobulinas salivares e saliva total humana em pacientes portadores de hepatite autoimune. A amostra consistiu em doze indivíduos com HAI (grupo experimental) e doze indivíduos sadios (grupo controle), tendo sido avaliado o fluxo salivar, pH, níveis de imunoglobulinas e perfil proteico. Saliva total não estimulada foi coletada e centrifugada; o sobrenadante foi retido, liofilizado, armazenado a -80°C e analisado para contagem de proteínas totais, eletroforese unidimensional e ELISA. Foi possível detectar diferenças estatisticamente significativas entre os grupos (p ≤ 0,05) para os parâmetros salivares analisados. Quando comparados com o grupo controle, portadores de hepatite autoimune apresentaram aumento no número de imunoglobulinas IgG e bandas proteicas com expressão diferenciada. Os resultados deste estudo sugerem haver padrões diferenciados na composição salivar entre os grupos avaliados.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2017. / Submitted by Gabriela Lima (gabrieladaduch@gmail.com) on 2017-10-30T16:15:01Z No. of bitstreams: 1 2017_AdrielleVelosoCaixeta.pdf: 10460144 bytes, checksum: fd3c3fd66f6bfe53c45f00c2e5d79086 (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva (patricia@bce.unb.br) on 2017-11-12T14:08:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_AdrielleVelosoCaixeta.pdf: 10460144 bytes, checksum: fd3c3fd66f6bfe53c45f00c2e5d79086 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-12T14:08:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_AdrielleVelosoCaixeta.pdf: 10460144 bytes, checksum: fd3c3fd66f6bfe53c45f00c2e5d79086 (MD5) Previous issue date: 2017-11-12 / A criptococose é uma doença com mais de 223 mil novos casos por ano, acarretando a morte de aproximadamente 181 mil pessoas, principalmente indivíduos HIV positivos. Cryptococcus neoformans e C. gattii são as principais espécies causadora da meningoencefalite criptocócica, dentre outras complicações. Os tratamentos utilizados atualmente são antifúngicos como anfotericina B, flucitosina e fluconazol. Contudo, essas drogas possuem limitações como toxicidade, custo e o surgimento de resistência em algumas linhagens. Dessa forma, terapias alternativas como uso de citocinas e anticorpos monoclonais vem sendo criados no intuito de desenvolver novas ferrramentas para o tratamento e diagnóstico desta doença. Alguns estudos mostram que mAbs (IgGs) contra glicuronoxilomanana (GXM) da cápsula de C. neoformans podem proteger contra a infecção em camundongos, mas que variantes isotípicas IgG3 podem na verdade agravar a doença, diminuindo assim a sobrevida desses animais. Além disso, já foi descrito que diferenças na região constante de IgGs com paratopos idênticos podem levar a alterações no padrão de ligação ao antígeno, o que contrasta com a definição já consolidada de que a região variável é a única responsável pela afinidade ao antígeno. O mecanismo molecular da diversidade de ligação aos antígenos da cápsula de C. neoformans por esses anticorpos de diferentes isotipos ainda é desconhecido e seu estudo possui grande importância, já que parece promover alteração na resposta imunitária, tendo assim um grande potencial para terapia da doença. No intuito de produzir variantes de anticorpos recombinantes para elucidar quais regiões são responsáveis pela mudança no padrão de ligação à cápsula de C. neoformans, foram desenvolvidos, construídos e sintetizados quatorze vetores que codificam híbridos entre isotipos IgG1 e IgG3, sendo 7 derivados do anticorpo 2H1 (um hibridoma secretor de IgG contra GXM) e sete dos anticorpos 3E5 (outro hibridoma secretor de anticorpo contra GXM). Sua produção foi realizada por meio de expressão heteróloga em células CHO DHFR-/- e HEK 293F. Por fim, foram realizados ensaios de imunofluorescência indireta para observar seu padrão de ligação à cápsula de C. neoformans. Neste foi observado que os anticorpos recombinantes 2H1 produzidos são funcionais e que as alterações realizadas em 2H1 CH1, geraram padrões de ligação de puntiforme (IgG3) e anular (IgG1), como esperado. Porém, quando a dobradiça do anticorpo 2H1 IgG3 foi substituída pela dobradiça de IgG1, o padrão de ligação à cápsula parece mudar de puntiforme para anular. Quando o inverso é feito, substituindo em um anticorpo IgG1 a dobradiça de IgG3, o padrão continua anular. Estes resultados indicam que a dobradiça é uma região necessária, mas não suficiente para determinar o padrão de ligação de um anticorpo à cápsula do fungo. / Cryptococcosis is a disease with more than 223 thousand new cases per year, resulting in the death of approximately 181 thousand people, mainly HIV positive individuals. Cryptococcus neoformans and C. gattii are the main species responsible for cryptococcal meningoencephalitis, among other complications. The treatments currently used for this desease involves the antifungals amphotericin B, flucytosine and fluconazole. However, these drugs have limitations such as toxicity, cost and the emergence of resistance in some strains. Thus, alternative therapies such as the use of cytokines and monoclonal antibodies have been created in order to develop new tools for the treatment and diagnosis of this disease. Some studies show that mAbs (IgGs) against C. neoformans capsule glucuronoxylomannan (GXM) may protect against infection in mice, but that IgG3 isotypic variants may actually enhance the disease, thereby decreasing the survival of these animals. In addition, it has been described that differences in the constant region of IgGs with identical paratopes may lead to changes in the antigen binding pattern, which contrasts with the already established definition that the variable region is the only one responsible for the antigen affinity. The molecular mechanism of C. neoformans capsule antigen-binding diversity by these antibodies of different isotypes is still unknown and its study is of great importance, since it seems to affect the immune response and thus have therapeutic potential. In order to produce recombinant antibody variants to elucidate which regions are responsible for the change in C. neoformans capsule binding pattern, fourteen vectors encoding hybrids between IgG1 and IgG3 isotypes were developed, constructed and synthesized, 7 of which were derived from 2H1 antibody (IgG secreting hybridoma against GXM) and seven of the 3E5 antibodies (another GXM antibody secreting hybridoma). The antibodies were produced by heterologous expression in CHO DHFR -/- and HEK 293F cells. Finally, indirect immunofluorescence assays were performed to observe their binding patterns to the C. neoformans capsule. We observed that the 2H1 recombinant antibodies are functional and that the changes made in 2H1 CH1 have generated punctate (IgG3) and annular (IgG1) binding patterns, as expected. However, when we replaced the hinge of the 2H1 IgG3 antibody with its IgG1 counterpart, the capsule binding pattern appeared to change from punctate to annular. When the reverse is done by substituting the hinge in an IgG1 antibody for its IgG3 counterpart, the pattern remained annular. These results indicate that the hinge is necessary but not sufficient to determine the pattern by which an antibody binds to the C. neoformans capsule.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2016. / Submitted by Camila Duarte (camiladias@bce.unb.br) on 2016-07-21T16:19:42Z No. of bitstreams: 2 2016_HeideMunizSilva.pdf: 6047221 bytes, checksum: 393ff7b5b49bc2e5512f55136faab835 (MD5) 2016_HeideMunizSilva.pdf: 6047221 bytes, checksum: 393ff7b5b49bc2e5512f55136faab835 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-02-22T20:05:48Z (GMT) No. of bitstreams: 2 2016_HeideMunizSilva.pdf: 6047221 bytes, checksum: 393ff7b5b49bc2e5512f55136faab835 (MD5) 2016_HeideMunizSilva.pdf: 6047221 bytes, checksum: 393ff7b5b49bc2e5512f55136faab835 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-22T20:05:48Z (GMT). No. of bitstreams: 2 2016_HeideMunizSilva.pdf: 6047221 bytes, checksum: 393ff7b5b49bc2e5512f55136faab835 (MD5) 2016_HeideMunizSilva.pdf: 6047221 bytes, checksum: 393ff7b5b49bc2e5512f55136faab835 (MD5) / Com o advento das plataformas de sequenciamento de alto desempenho (HTS), tornou-se possível obter amplas amostragens das bibliotecas produzidas por phage display, cujo enorme volume dificulta a análise da diversidade das bibliotecas bem como a detecção de clones selecionados, a qual classicamente é realizada por ensaios de afinidade do anticorpo pelo antígeno. Considerando tal desafio, foi desenvolvido um método in silico automatizado para a análise de sequências de imunoglobulinas produzidas por phage display, que permite encontrar clones selecionados, a partir de bibliotecas sequenciadas por plataformas HTS. O método é composto por 6 etapas: montagem de reads, filtragem de sequências, tradução, análise de enriquecimento, numeração de resíduos e classificação de germlines. Para validar o método, foram analisados três conjuntos de dados, cada um contendo as bibliotecas original e final, sendo dois deles sequenciados pela plataforma Illumina, e o terceiro pela plataforma 454 Roche. A análise completa de cada par de bibliotecas foi executada em menos de 3 horas. Os tempos de execução promissores devem-se principalmente aos programas de tradução e cálculo de frequência dos clones, os quais foram desenvolvidos com estratégias inteligentes para analisar bibliotecas contendo mais de 106 reads, em menos de 5 minutos. Como saída final, é produzida uma lista de clones candidatos, enriquecidos e reconhecidos como domínio variável de imunoglobulina, ordenados por fold change de frequência e com sua respectiva classificação de germlines, os quais muito provavelmente foram selecionados pelo experimento de phage display. Além da eficiência do método no que diz respeito ao curto tempo necessário para sua execução, a abordagem utiliza um critério biológico para detectar clones candidatos, baseando-se nas marcas canônicas de domínio variável de imunoglobulina. / Since high-throughput sequencing (HTS) platforms provide larger sampling of phage display libraries, the amount of data imposes challenges to analyze libraries diversity and to find selected clones, which are traditionally tested by antibody affinity assays. Considering that, we developed an automated in silico method to analyze immunoglobulin sequences produced by phage display, which allows the detection of selected clones, from libraries sequenced by HTS platforms. The method consists of 6 steps: reads joining, sequence filtering, translation, enrichment analysis, residues numbering and germline classification. In order to validate the method, 3 sets of data were analysed, each containing initial and final phage display libraries, being 2 sets sequenced by Illumina and one by 454 Roche platform. The complete analysis of each pair of libraries was performed in less than 3 hours. The promising execution time is mainly due to the translation and frequency calculation programs, which were developed with intelligent strategies to process libraries composed of more than 106 reads, in less than 5 minutes. As final output, the method creates a list of candidate clones, enriched and recognized as immunoglobulin variable domain, sorted by fold change of frequency and classified by germline, which probably were selected by phage display experiments. Besides the efficiency of the method concerning the fast performance, the present approach uses a biological criterion to find candidate clones, based on canonical signature of immunoglobulin variable domain.

Orientador : Prof. Dr. Wanderson Duarte da Rocha / Coorientadora : Profª. Drª. Larissa Magalhães Alvarenga / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciencias Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba, 14/05/2014 / Inclui referências : f. 71-82 / Resumo: A doença de Chagas, causada pelo Trypanosoma cruzi, é uma doença parasitária que afeta em torno de 12 a 14 milhões de indivíduos, causando um importante impacto econômico. Uma vez que as formas de tratamento disponíveis apresentam eficiência questionáveis e sérios efeitos colaterais, a busca de formas alternativas à terapêutica atual se faz necessária. A melhoria na "entrega" de fármacos pode ser uma estratégia interessante para redução dos efeitos colaterais dos tratamentos utilizados. Além disso, os fármacos ideais são aqueles que interferem em mecanismos específicos do parasito, que são essenciais para sua sobrevivência no hospedeiro mamífero. Nesse sentido, foi demostrado previamente que as mucinas denominadas gp35/50 participam no processo de adesão e invasão celular possibilitando o estabelecimento da infecção, tornando-se candidatos interessantes para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas no tratamento desta parasitose. Adicionalmente, anticorpos monoclonais anti-gp35/50 (mAb-10D8) são capazes de interferir com o mecanismo de virulência de formas tripomastigotas metacíclicas. Conciliando todas as características, decidimos obter anticorpo recombinante anti-gp35/50 (scFv-10D8) para fins terapêuticos, uma vez que estas moléculas são específicas e tem sido utilizadas com sucesso em outras patologias. Desta forma, a tecnologia de anticorpos recombinantes a partir RNA total de hibridoma (mAb-10D8) foi utilizada aqui para obtenção das regiões variáveis das cadeias leves e pesada de mAb-10D8 por RT-PCR utilizando iniciadores específicos. Os fragmentos obtidos foram sequenciados e utilizados para síntese de um gene sintético de scFv (scFv-10D8) otimizado para expressão em E. coli. O gene de scFv-10D8 foi subclonado em vetor de expressão procariótico fusionado à cauda de histidinas (pET22b). Após otimização das condições de indução e enriquecimento de uma fração contendo scFv-10D8, foi demonstrado que a proteína recombinante é capaz de reconhecer as mesmas proteínas identificadas pelo mAb-10D8. Diante destes resultados, especula-se que esse anticorpo recombinante anti-gp35/50 de T. cruzi manterá as mesmas propriedades descritas para o mAb-10D8 e seu fragmento Fab na redução da virulência. Sendo assim, é provável que o scFv-10D8 poderá ser utilizado sozinho ou associado a outras moléculas tóxicas ao parasito. Palavras-chave: Trypanosoma cruzi, scFv-10D8, gp35/50, anticorpos recombinantes. / Abstract: Chagas disease is a parasitic disease caused by Trypanosoma cruzi, and affects approximately 10 million individuals causing a major economic impact. Since the available therapeutic approaches have questionable effectiveness and serious side effects, the search for alternatives to the current therapeutic strategies is required. The improvement on drug delivery can reduce the side effects caused by the treatment. Moreover, the ideal drugs are the ones that interfere with specific mechanisms from the parasite that is essential for its survival in the mammalian host. Thus, it was previously shown that the mucins called gp35/50 are involved in cell adhesion and invasion processes enabling the establishment of infection and become interesting candidates for the development of new chemotherapeutic agents. Additionally, it was published that anti-gp35/50 monoclonal antibodies (mAb-10D8) are capable of interfering with the virulence mechanisms of trypomastigotes. Combining all the features we decided to obtain anti-gp35/50 recombinant antibody (scFv-10D8) for therapeutic purposes, since these molecules are specific and have been successfully used in other pathologies. Here, the technology of recombinant antibodies was used to obtain the regions encoding the variable light and heavy chains of mAb-10D8 by RT-PCR using specific primers and total RNA from hybridoma cells. The fragments were sequenced and used for the synthesis of a synthetic gene of scFv (scFv- 10D8) optimized for E. coli expression. The scFv-10D8 gene was subcloned fused to a histidine tag into a prokaryotic expression system (pET22b). After testing some induction conditions and enriching a fraction containing scFv-10D8, it was demonstrated that the recombinant antibody is able to recognize in the same fashion as mAb-10D8 the parasite protein. These results encourage us to speculate that this scFv anti-T.cruzi gp35/50 can be used in a new therapeutic strategy for Chagas disease, since it may retain the features previously described for mAb-10D8 and its Fab fragment. Thus, scFv-10D8 may be used alone or conjugated to a known drug against T. cruzi. Keywords: Trypanosoma cruzi, scFv-10D8, Recombinant antibodies, gp35/50

Resumo: Nove fêmeas bovinas canuladas no rúmen foram utilizadas para avaliar um preparado de anticorpos policlonais (PAP) de origem aviária contra as bactérias ruminais Streptococcus bovis, Fusobacterium necrophorum, Clostridium aminophilum, Peptostreptococcus anacrobius e Clostridium sticklandii. O delineamento experimental foi o quadrado latino 3 X 3 replicado 3 vezes, em arranjo fatorial de tratamentos 3 X 3 referente a 2 modificadores ruminais, monensina (MON) e PAP mais o grupo controle (CON) e 3 fontes energéticas, milho seco moído (MSM), silagem de grão úmido de milho (SGUM) e polpa cítrica (PC). Cada subperíodo experimental foi composto de 21 dias, onde a coleta de líquido ruminal foi realizada às 0, 2, 4, 6, 8, 10 e 12 h após a alimentação no último dia do período. Foram avaliados o consumo de matéria seca e os parâmetros de fermentação ruminal pH, concentração total de ácidos graxos de cadeia curta (AGCCt), lactato total e nitrogênio amoniacal (N-NH3). O PAP mostrou-se tão eficaz como a monensina em elevar o pH ruminal de bovinos alimentados com dietas ricas em concentrados, às 4 h após a alimentação, sem contudo, alterar (P>0,05) o consumo de matéria seca, a concentração total de ácidos graxos de cadeia curta, a proporção molar de acetato ou as concentrações de lactato total e nitrogênio amoniacal. Foi observada diminuição (P<0,05) na proporção molar de propionato com a utilização do PAP em relação a monensina, porém não em relação ao controle. / Abstract: Nine ruminally cannulated cows were used to test an avianderived polyclonal antibody preparation (PAP) against the specific ruminal bacterias Streptococcus bovis, Fusobacterium necrophorum, Clostridium aminophilum, Peptostreptococcus anacrobius and Clostridium sticklandii. The experimental design was a 3 X 3 latin square replicated 3 times with a factorial arrangement of treatments 3 X 3 regarding 2 rumen modifiers (monensin (MON) and PAP) plus control group (CON) and 3 energetic sources. The energetic sources utilized were dry-grounded corn grain (CG), high moisture corn silage (HMCS) and citrus pulp (CP). Each trial had 21 days; the ruminal fluid sampling was carried out on the last day of the period at 0, 2, 4, 6, 8, 10 and 12 h after morning meal. Dry matter intake and rumen fermentation parameters such as pH, total short chain fatty acids (tSCFA), lactic acid and ammoniacal nitrogen (NH3-N) concentration were analyzed in this trial. PAP was as effective as monensin in increasing ruminal pH of cattle fed high concentrate diets, 4 h after feeding, without interfering (P>0.05) on dry matter intake, total short chain fatty acids concentration, molar proportion of acetate, lactic acid and ammoniacal nitrogen (NH3-N) concentration. A decrease (P<0.05) in molar proportion of propionate was observed with PAP utilization compared to monensin but not in relation to control. / Orientador: Mário de Beni Arrigoni / Coorientador: Paulo Henrique Mazza Rodrigues / Banca: Rafael da Costa Cervieri / Banca: Renata Helena Branco Arnandes / Banca: Flávio Augusto Portela Santos / Banca: Telma Teresinha Berchiell / Doutor

Submitted by Marcelo Andrade Silva (marcelo.andradesilva@ufpe.br) on 2015-03-09T13:48:22Z No. of bitstreams: 2 Frederico Leite Gouveia - Doutorado 2013.pdf: 10012101 bytes, checksum: 9f6ae7e1916a9efe6b41bca525dfaac9 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-09T13:48:22Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Frederico Leite Gouveia - Doutorado 2013.pdf: 10012101 bytes, checksum: 9f6ae7e1916a9efe6b41bca525dfaac9 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2013 / FACEPE / Imunoglobulinas intravenosas (IGIVs) têm um grande número de aplicações clínicas. O uso de imunoglobulinas é útil em reduzir infecções por alguns Flavivirus e aparece como um tratamento atualmente disponível para infecção viral, capaz de proporcionar um estado de imunidade passiva. A dengue representa um importante problema de saúde no Brasil, pois atualmente não há vacina ou tratamento eficaz disponível comercialmente para combater a infecção. Sendo assim, podemos supor que a terapia com IGIV específica desponta como uma estratégia promissora. Porém, apesar de atraente, a segurança desta estratégia, deve ser considerada, devido à possibilidade de ocorrência do fenômeno de facilitação por anticorpos da penetração viral em macrófagos (antibody dependent enhancement - ADE). Mediante o objetivo de realizar estudos referentes às novas aplicações das IGIVs, no presente trabalho descrevemos a preparação de IGIV polivalente e pela primeira vez, a preparação de imunoglobulina específica para o vírus dengue, além da produção dos seus fragmentos F(ab’)2 específicos. A produção foi realizada utilizando o método clássico de Cohn-Oncley. As IGIVs foram bioquimicamente e biofisicamente caracterizadas e os resultados foram condizentes com os protocolos definidos pela Farmacopeia Europeia e pela Agência Regulatória Nacional. Após o tratamento com IGIV anti-dengue (Dose de 10 mg/Kg administrada 4 horas antes, 24 e 72 horas após a infecção pelo DENV-3) os camundongos infectados apresentaram exacerbação de todos os parâmentros clínicos, bioquímicos e virológicos investigados. Esses resultados sugerem, portanto, que a penetração viral em macrófagos foi facilitada pelo tratamento com IVIG específica. Imunoglobulinas intravenosas também são utilizadas na insuficiência cardíaca crônica. A doença de Chagas afeta cerca de 16 à 18 milhões de pessoas, nos quais cerca de 30% dos pacientes evoluem para uma cardiomiopatia chagásica. Considerando que a cardiomiopatia chagásica é do tipo dilatada, a hipótese de que a terapia com IGIV poderia diminuir a cardiomiopatia chagásica também foi estudada. O tratamento com IGIV polivalente (Dose de 1mg/Kg/dia durante 5 dias) em camundongos com cardiomiopatia chagásica não demonstrou melhora da função cardiovascular. Deste modo, concluímos que, nas condições utilizadas, a terapia com imunoglobulina humana não possui eficácia na cardiomiopatia chagásica em camundongos.

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-01-18T12:36:44Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) FLÁVIA FONSÊCA - Avaliação do uso de imunoglobulinas poliespecíficas em um hospital geral.pdf: 1585583 bytes, checksum: 678bb7a45819ef2310c2774286ef4e42 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-01-18T12:36:44Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) FLÁVIA FONSÊCA - Avaliação do uso de imunoglobulinas poliespecíficas em um hospital geral.pdf: 1585583 bytes, checksum: 678bb7a45819ef2310c2774286ef4e42 (MD5) Previous issue date: 2014-08-27 / CAPEs / Neste estudo, buscamos conhecer as condições de saúde para as quais imunoglobulina intravenosa (IGIV) é utilizada em um hospital de grande porte no Nordeste do Brasil. Foi realizado um estudo descritivo, retrospectivo, onde foram incluídos todos os pacientes que fizeram uso de IGIV no período de janeiro/2011 a dezembro/2012. Comparamos as indicações encontradas com as indicações propostas pela consulta pública n°36/2004 e pelo Clinical Guidelines for Immunoglobulin Use. Durante o estudo, foram analisados 49 prontuários, dentre os quais, a Dengue hemorrágica, alcançou o maior número de diagnósticos apresentados 12 (24,5%). Foram utilizados 559 frascos de IGIV, destes 118 (21,1%) foram direcionados para o tratamento da Síndrome de Guillian-Barré. O estudo revelou um alto percentual 18 (36,7%) de utilização de IGIV em casos sem respaldo na literatura científica, estando a dengue hemorrágica incluída nestes. Sendo a IGIV um medicamento hemoderivado e, portanto, de difícil obtenção e alto valor associado a sua fabricação, seu uso deve ser embasado cientificamente. / In this study, we aimed to know the health conditions for which intravenous immunoglobulin (IVIG) is used at a large hospital in the northeast part of Brazil. A descriptive, retrospective, study was performed in which all patients who used the IVIG from January,2011 until December, 2012 were included. We compared the indications found with the proposed indications for public consultation n° 36/2004 and by the Clinical Guidelines for Immunoglobulin Use. During the study, 49 records were analyzed, among which, the dengue hemorrhagic fever, achieved the highest number of diagnoses presented 12 (24.5%). 559 vials of IVIG were used, among these, 118 (21.1%) were directed to the treatment of Guillain-Barre syndrome . The study revealed a high percentage 18 (36.7%) of use of IVIG in cases without support in the scientific literature, and the dengue hemorrhagic fever is included in these. IVIG being a drug difficult to obtain and with a high value associated with its manufacture, its use should be supported scientifically.

Orientador: Antonio Olavo Cardoso Jorge / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-07-22T05:18:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ito_CristianeYumiKoga_D.pdf: 3417745 bytes, checksum: 6a4a0cac3afe3b23a6d8bf982b3e331f (MD5) Previous issue date: 1997 / Resumo: Existem vários estudos sobre 19A secretora anti-Streptococcus mutans, porém ainda. não existem evidências conclusivas da sua participação efetiva no controle da cárie. Muitos também são os trabalhos com relação à imunologia das infecções causadas pelas espécies do gênero Candída. O objetivo do presente trabalho foi correlacionar a presença de estreptococos do grupo mutans e de Candída com níveis de 19A na saliva de indivíduos de faixas etárias e condições bucais diferentes. Foram estudados 320 indivíduos divididos em 7 grupos: I - adulto jovem com cárie; II- adulto, jovem livre de cárie; II- crianças com cárie; IV- crianças livres de cárie; Vadultos com cárie; VI- adultos com candidose e VII- crianças com cárie ativa. Os indivíduos foram examinados quanto ao Índice CPOD, Índice de higiene bucal simplificado (IHBS) e fluxo salivar. Foram realizadas contagem total de microrganismos aer6bios e facultativos, contagem de estreptococos do grupo mutans e Candida na saliva. A quantificação dos níveis de 19A anti-Streptococcus mutans e anti-Candida na saliva foi realizada utilizando-se a técnica ELISA. Não houve cOlTelação estatística na população dos níveis de 1gA anti-S. mutans com as contagens de estreptococos do grupo mutans na saliva. Correlação estatística na população foi observada entre os títulos de anticorpos anti-Candida e as contagens de leveduras no grupo adultos com candidose (VI). Nos demais grupos não foi observada correlação / Abstract: Several studies have been done about 19A against Streptococcus mutans but there are no conclusive evidences about the effective participation in caries control. There are also many studies about the immunity involved with infections caused by Candida species. The aim of this work was to cOITelate the presence of mutans streptococci and Candida with levels of 19A in saliva of individuals with diferent age and oral conditions. Three-hundred-twenty individuals were divided in 7, groups: 1- young adult with caries; II-caries free young adult ; III- children with caries; IV- caries free children ; V- adults with caries; VI- adults with candidosis and VII- children with active caries. AlI the individuaIs were examined for DMFT, oral hygiene index-simplified and salivary flow. Total counts of microrganisms, mutans streptococci and Candida counts were also done. The quantification of 19A levels against Streptococcus mutans and Candida was done through ELISA technique. There was no statistical cOITelation for the population between the levels of 19A against S. mutans and counts of these microrganisms in saliva. Statistical cOITelation for the population was observed between titres of antibodies against Candida and counts of yeasts in candidosis group (VI). No cOITelation was found for the other groups / Doutorado / Biologia e Patologia Buco-Dental / Doutor em Ciências