Resumo: Miosinas são motores moleculares envolvidas com diferentes formas de movimentação celular, como fagocitose, citocinese, contração muscular, batimento de cílios e tráfego de organelas e partículas. Elas usam a energia derivada da hidrólise do ATP para realizar esses movimentos e possuem um domínio motor comum. A diversidade dos membros da família nos permite agrupá-las em classes. A miosina muscular foi definida como convencional (classe 2), enquanto outros tipos são referidos coletivamente como miosinas não-convencionais (agrupadas em várias classes). Miosinas que filogeneticamente não se agrupam com qualquer outra miosina são denominadas miosinas órfãs. T. cruzi possui, além dos genes que codificam para duas miosinas (uma presente em quase todos os organismos – classe 1 – e uma presente apenas em outros tripanosomatídeos – classe 13), outros sete genes identificados que codificam para miosinas órfãs, chamadas de MyoA, MyoB, MyoC, MyoD, MyoE , MyoF, MyoG, que são o foco deste trabalho. Para iniciar a caracterização destas miosinas, experimentos foram delineados visando elucidar a localização celular e as proteínas que interagem com as miosinas. Para alcançar estes objetivos foi necessária a expressão de proteínas recombinantes para a produção de anticorpos em camundongos que foram utilizados para ensaios de imunolocalização e imunoprecipitação. Em paralelo, a transfecção do parasita para a expressão da proteína fusionada ao GFP e identificação da sua localização foi realizada. Os resultados nos confirmam que cinco das sete miosinas identificadas in silico são encontradas nos extratos protéicos das formas epimastigotas do parasita, mas que essa expressão deva ocorrer em baixos níveis. A localização celular visualizada através da utilização de anticorpos foi realizada para a MyoC, MyoD e MyoE. As miosinas C e E se concentram na região anterior do parasita, compatível com a bolsa flagelar e base do flagelo respectivamente e a miosina D tem uma localização granular dispersa pelo citoplasma. As demais miosinas tiveram sua localização visualizada somente quando expressas fusionadas à etiqueta de GFP, através da captação da fluorescência da etiqueta. A maioria dessas localizações apresentaram um padrão disperso pelo corpo celular, com exceção da MyoF que apresentou uma localização filamentar concentrada da porção anterior do parasita. Estamos trabalhando para identificar as proteínas que possam estar interagindo com as miosinas órfãs de T. cruzi. O nocaute gênico foi realizado para MyoC e ocorreu morte da cultura celular após o provável silenciamento de um dos alelos desta proteína. Estamos investigando se o hemizigoto realmente não é viável ou se não houve a adequada recombinação do cassete de resistência nessa primeira tentativa de transfecção. O estudo das miosinas de T. cruzi, suas funções e suas interações dentro da célula irá contribuir para a avaliação do papel do citoesqueleto em Trypanosoma cruzi.

Resumo: O protozoario Trypanosoma cruzi controla sua expressao genica principalmente por mecanismos pos-transcricionais como, por exemplo, a estabilidade de mRNAs. Em trabalho anterior, foram realizados experimentos de microarranjos, para avaliar o decaimento de mRNA de epimastigotas de T. cruzi Dm28c, tratados por 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180 e 240 minutos com 10 ƒÊg/mL e 50 ƒÊg/mL de actinomicina D (pontos em replicata, totalizando 40 amostras). Comparando-se os pontos temporais extremos, observou-se de 2 a 3 mil genes diferencialmente expressos para estabilidade de mRNA. Devido as limitacoes inerentes a tecnica de microarranjos, e a possibilidade de se utilizar sequenciamento de DNA como abordagem, a qual possui diversas vantagens em relacao aos microarranjos, foi idealizado o presente trabalho, que foi replanejado de acordo com as informacoes colhidas no trabalho citado acima. Foram analisados pontos temporais de decaimento menores (0, 5, 10, 15, 20 e 25 minutos) com a tecnica de sequenciamento RNA-Seq WT. As vantagens em relacao aos microarranjos sao: medida absoluta (quantitativa), maiores alcance dinamico, resolucao e cobertura genomica, sem hibridizacao cruzada e com pouco ruido de fundo. A dose efetiva do inibidor actinomicina foi fixada em 10 ƒÊg / mL / 107 celulas e foi acrescido sinefungina a 1 ƒÊg / mL / 107 celulas para as analises de decaimento dos mRNAs de T. cruzi. Em conjunto, nossos dados mostram que uma pequena parte da regulacao da expressao genica desse parasito durante o seu ciclo de vida pode ser explicada pela estabilidade de suas moleculas de mRNA. Ja que, foi possivel relacionar a velocidade de decaimento dos transcritos maduros com grupos funcionais envolvidos com montagem e manutencao do citoesqueleto, de ribossomos e de utros tipos de complexos ribonucleoproteicos.

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Orientador : Humberto de Araujo Rangel / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-14T03:27:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bonfitto_Mario_M.pdf: 4747866 bytes, checksum: 8cb40ebc82a342c228408741d069abc3 (MD5) Previous issue date: 1980 / Resumo: Resumo: O presente trabalho teve por finalidade verificar se a proteína isolada das formas epimastigotas de cultura, da cepa Y do T. cruzi, estava presente nas formas tripomastigotas do sangue circulante e nas formas anastigotas do tecido, no hospedeiro vertebrado. A proteinase obtida do extrato bruto das formas epimastigotas apresentou características semelhantes às descritas por Araújo (1979). O imunessoro anti-F3 produzido em coelhos revelou 4 sistemas precipitantes na FS, sendo que apenas um deles mostrou atividade caseinolítica. As reações de aglutinação do imunossoro anti-F3 com as formas epimastigotas foram positivas, sendo inibidas pela fração F3.2, o que sugere a presença da proteinase na superfície do parasito. As reações imunocitoquímicas de epimastigotas e tripomastigotas da cepa Y, e de amastigotas das cepas Y, CL, Colombiana, Peruana e Argentina, de T. curzi com o imunossoro anti-F3 foram positivas, sendo inibidas pela fração F3.2, sugerindo a presença da proteinase nas diferentes formas evolutivas e em outras cepas do t. cruzi. Pels microscopia eletrônica das secções do coração de camundongos infectados, após a reação de imunoperoxidase, observou-se perda da estrutura normal da musculatura cardíaca na proximidade das formas amastigotas de T. cruzi, com destruição do tecido. A reação revelou-se positiva especialmente na superfície do parasito... Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Not informed. / Mestrado / Mestre em Ciências Biológicas

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Resumo: O citoesqueleto dos organismos da família Trypanosomatidae é muito pouco estudado. Esta família inclui organismos que causam doenças em humanos, como doença de Chagas e doença do sono – Trypanosoma cruzi e T.brucei, respectivamente – e leishmaniose – causada por diferentes espécies do gênero Leishmania. Microtúbulos são os principais filamentos dos tripanossomatídeos e ainda não foi detectada a presença dos filamentos de actina, embora já tenha sido mostrada a presença desta proteína por imunoensaios. Microtúbulos e filamentos de actina podem funcionar como trilhos para motores moleculares, responsáveis pelo transporte de carga. As miosinas são as proteínas motoras que se movem ao longo dos filamentos de actina e são classificadas de acordo com suas similaridades. Os tripanossomatídeos possuem a miosina de classe I, presente em quase todos os organismos eucarióticos, e uma miosina exclusiva da família, a de classe XIII. A presença desta miosina de tripanossomatídeos é bastante intrigante, principalmente porque pouco se sabe sobre o citoesqueleto de actina destes organismos. Este trabalho visa à caracterização funcional das duas miosinas de T.cruzi comuns aos tripanossomatídeos – myo1 e myo13 – e tem como propostas: verificação da expressão destas proteínas pelo parasita, localização celular e identificação de complexos proteicos ligados às miosinas obtidos por imunoprecipitação, utilizando anticorpos produzidos em camundongos; localização através da expressão da miosina inteira e cauda fusionadas à GFP em T.cruzi; remoção ou inibição da atividade funcional da proteína através de nocaute e ensaio dominante-negativo. Anticorpos foram produzidos em camundongos inoculados com os fragmentos cabeça e cauda das miosinas expressas em E.coli. Os soros produzidos se mostraram específicos para proteínas de tamanho esperado, porém os produzidos contra myo1 reagiram também contra outras bandas. Estes resultados de ligação cruzada podem ser explicados devido à baixa expressão desta proteína pelo parasita, como mostrado em estudos de proteômica e transcriptômica. Resultados de imunofluorescência da myo1 mostraram uma concentração da proteína próxima ao cinetoplasto, podendo ser a bolsa flagelar. Esta localização é semelhante à myo1 de T.brucei, que está envolvida com a endocitose. A imunolocalização realizada com o soro contra a myo13 marcou uma região na base do flagelo, a mesma região da myo13 de L.donovani, que está envolvida na montagem do flagelo. A cauda da myo1-GFP se localizou na mesma região da imunofluorescência, compatível com a bolsa flagelar, indicado que a carga pode ser a responsável pela localização desta miosina. Experimentos estão em andamento para a identificação dos complexos proteicos nos quais as miosinas estão interagindo. A superexpressão da cauda para promoção de um fenótipo dominante negativo não teve efeito morfológico visível a microscópio óptico ou na taxa de replicação de epimastigotas. Estamos trabalhando para a geração de parasitas nocaute. Baseando-se nas localizações e nos trabalhos publicados com T.brucei e L.donovani, sugerimos que a myo1 esteja envolvida com endocitose e tráfego de vesículas, e que a myo13 esteja envolvida com a montagem do flagelo. Assim, com este trabalho, iniciamos a caracterização das miosinas de T.cruzi, o que pode contribuir para um maior conhecimento do processo de transporte intracelular destes parasitas.

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Resumo: Em tripanossomatídeos, a regulação da expressão gênica ocorre principalmente em nível pós-transcricional. A associação entre mRNAs e determinadas proteínas determinam o destino de um mRNA, direcionando-o à tradução, repressão ou degradação. Para caracterizar complexos proteicos associados a mRNAs traduzidos ou não-traduzidos, um trabalho prévio isolou mRNPs de epimastigotas e epimastigotas sob estresse nutricional utilizando microesferas poli-(T) e os complexos proteicos ligados a mRNAs poli-(A+) foram analisados por espectrometria de massas. Dentre estas proteínas, uma proteína poli-Q com função desconhecida, ortóloga à TbGAP2 em T. brucei, foi identificada, presente nas frações polissomal e pós-polissomal de epimastigotas e epimastigotas sob estresse nutricional. O objetivo deste estudo é caracterizar esta proteína e determinar se esta está envolvida com a regulação da expressão gênica. O gene codificador desta proteína foi clonado e expresso para produzir anti-soro policlonal. O anti-soro contra a proteína TcGAP2 mostrou especificidade e identificou uma proteína de tamanho esperado em extratos de T. cruzi. TcGAP2 está presente no cinetoplasto e no citoplasma. Além disso, análises por Western blotting mostraram que TcGAP2 está diminuída nas formas metacíclicas, corroborando a marcação de imunofluorescência mais fraca nestas formas. Quando lisados de epimastigotas e epimastigotas sob estresse nutricional foram aplicados em gradiente de sacarose 15-55% e as frações foram analisados por imunoblotting, a proteína foi detectada em polissomos apenas nas últimas formas. Marcação in situ de nicks e gaps nas redes de minicírculos com a terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) e dUTP fluorescente seguida de imunofluorescência mostrou co-localização parcial indicando certo envolvimento com replicação de minicírculo. Para identificar mRNAs e proteínas associadas a complexos mRNPs contendo TcGAP2, foram realizados ensaios de imunoprecipitação com o soro contra TcGAP2 usando lisados de epimastigotas e epimastigotas sob estresse nutricional. Os RNAs alvo de TcGAP2 foram identificados por sequenciamento de RNA em larga escala e as proteínas, por espectrometria de massas. Os transcritos dos complexos contendo TcGAP2 mudam entre as duas formas, entretanto eles são funcionalmente relacionados, estando enriquecidos em ligação a ATP, fosforilação de proteínas, processo metabólico, dentre outros. Análises utilizando o algoritmo MEME foram realizadas para identificar motivos de sequência comuns dentre os alvos identificados. Nenhum motivo aparente foi encontrado nas regiões 3' não-traduzidas nem nas regiões codificadoras. Entretanto, dois motivos foram encontrados na região 5' nãotraduzida. Assim como os RNAs alvo mudam entre os dois estágios, as proteínas parceiras também. Algumas das proteínas identificadas em epimastigotas como parte dos complexos contendo TcGAP2 incluem proteínas ribossomais e proteínas de ligação a RNA e em epimastigotas sob estresse nutricional, várias proteínas hipotéticas. Já GAP1 foi identificada em ambas formas e, juntamente com GAP2, está envolvida com estabilização de gRNA em T. brucei. O duplo nocaute do gene de TcGAP2 não se mostrou viável sugerindo que este gene seja essencial. Estes dados sugerem que esta proteína pode ter diferentes funções dependendo de sua localização e que TcGAP2 é um componente de complexos ribonucleoprotéicos no citoplasma que podem estar regulando o processamento de mRNAs específicos.

Orientador: Ruberval Armando Lopes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-27T09:11:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Abrahao_AnaAmeliaCarraro_D.pdf: 13831431 bytes, checksum: a8c4226be6ce519f5a65b64455d312fa (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: O presente trabalho teve como objetivo estudar as alterações morfológicas das placentas e dos fetos de camundongos Mus musculus, Swiss, infectados com a cepa RAL de Trypanosoma cruzi, durante a prenhez, através de métodos histopatológicos, morfométricos e estereológicos. Fêmeas prenhas, pesando aproximadamente 30-35 gramas, foram inoculadas i.p. com 2 x 105 tripomastigotas sangüícolas da cepa RAL de T.cruzi, no 70 dia da prenhez e sacrificadas por inalação com éter etílico no 190 dia da prenhez. Os animais do grupo controle foram inoculados com solução fisiológica e mantidos nas mesmas condições ambientais dos infectados. Foram determinados o peso e comprimento fetais, o peso e diâmetro placentários, bem como o comprimento do cordão umbilical dos animais pertencentes aos dois grupos experimentais. Além do exame histopatológico do material foram estudadas a cariometria e a estereologia das placentas e tecidos fetais (pâncreas, fígado e coração). Também estudou-se cariometricamente as células gigantes e os espongiotrofoblastos. Nos animais infectados, ocorreu uma queda no peso e diâmetro das placentas, bem como uma redução no tamanho e peso dos fetos, com diminuição do comprimento do cordão umbilical. Histopatologicamente, os animais infectados apresentaram parasitismo nas camadas decídua, esponjosa e labiríntica das placentas, com escassa reação inflamatória na decídua. As células gigantes apresentaram ninhos de amastigotas e mostraram pouca degeneração. Nos órgãos fetais estudados (pâncreas, fígado e coração) não foram encontrados ninhos de parasita. Os parâmetros nucleares das células gigantes mostraram-se significantemente diminuídos nos animais infectados quando comparados aos animais controles. O estudo estereológico da placenta mostrou que a região esponjosa apresentou volume relativo e volume absoluto menor no grupo infectado, sendo a diferença estatisticamente significante. Os volumes absolutos das regiões decídua e labiríntica das placentas dos animais infectados também apresentaram valores menores. O volume relativo, celular e citoplasmático das células gigantes das placentas dos animais infectados mostrou valores significantemente menores quando comparados com os animais do grupo controle. A densidade numérica e o número de células gigantes por placenta também foi significantemente menor no grupo infectado. Deste modo, as alterações funcionais provocadas por Trypanosoma cruzi sobre as células trofoblásticas gigantes e sobre os espongioblastos, podem atuar diretamente sobre o crescimento fetal, mediante uma perda de homeostasia da produção de lactogênio placentário, ou indiretamente mediante uma vascularização útero-placentária ineficiente, prejudicando desta maneira a nutrição fetaL / Abstract: Morphologic alterations of placentas and foetus of Mus musculus infected with RAL strain of Trypanosoma cruzi were investigated by histopathological, morphometrical and stereological methods. On the 7th day of pregnancy, ten female swiss mice, weighing approximately 30-35gr were i.p. inoculated with 2x105 blood trypomastigotes of RAL strain. The animals were sacrified with ethylic ether on the 19th day of pregnancy. Control group (non infected pregnant females) were i.p. inoculated with saline solution and kept in the same enviroment conditions of the infected counterparts. In both experimental groups, weight and lenght of foetus, diameter and weight of placenta as well as umbilical cord lenght were assessed. Histopathology, cariometry and stereology of placentas and fetal tis sues (liver, heart and pancreas) were performed. Cariometry of giant cells and spongyotrophoblasts were assessed too. Infected animals showed reduction of fetal weight and lenght, as well as the diameter and weight of placentas, with enshortened umbilical cord. Histopathologicaly, infected group displayed amastigote burdens in decidua, spongy and labyrinthic zone with scarce inflamatory reaction. Giant cells showed also amastigote burdens with few tissue disorganization. No parasite burdens were found in fetal organs (pancreas,liver and heart).Giant cells of infected animals showed significant reduction of nuclear parameters when compared to control group. The stereological study of placenta from infected animals revealed a spongy region with a smaller relative volume when compared to non infected counterparts although the absolute volume displayed significant differences in all regions of the placenta. The relative cellular and cytoplasmatic volume of giant cells as well as the number / mm3 and the total number / placenta, were significantly lower in infected group whencompared to non infected control animals. We conclude that, the functional alterations on spongioblasts and giant trophoblastic cells caused by RAL strain of T.cruzi can direct1y impair intrauterine fetal development through two distinct ways: directly by depressing production of placental lactogen or indirectly by leading to an inefficient uterus placental vascularization, impairing fetal nutrition / Doutorado / Doutor em Parasitologia

Orientador : Humberto de Araujo Rangel / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-14T03:30:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bellucci_SilviaBrandaoBertazzoli_M.pdf: 2992038 bytes, checksum: 2f82e35b82ac50c78a23e66252e1754c (MD5) Previous issue date: 1979 / Resumo: Uma fração solúvel com atividade enzimática, obtida de formas de cultivo do T. cruzi foi investigada quanto a sua atividade biológica através de diferentes testes. Durante esta investigação, pesquisou-se também a ocorrência de inibidores da atividade enzimática da fração em diferentes soros normais. Os resultados obtidos permitiram concluir que: 1. A fração FS é capaz de alterar a permeabilidade capilar de cobaias normais, quando injetada subcutâneamente. Esta ação se deve à atividade enzimática de FS. 2. A fração FS não mostrou atividade enzimática, sobre componentes do complemento humano, embora estes tenham sido parcialmente absorvidos por constituintes da fração. 3. A fração FS não alterou a permeabilidade da membrana de hemácias normais de carneiro. 4. Não foi possível detectar-se substâncias farmacologicamente ativas liberadas de soros ou plasmas normais por ação de FS, capazes de contrair o íleo de cobaia ou de modificar a sua resposta à histamina. 5. Diferentes soros normais tem uma intensa ação inibidora sobre a atividade caseinolítica de FS, que no entanto está diminuída em soros obtidos na vigências da infecção, pelo T. cruzi. 6. Constituintes de FS estão presentes nas formas tripomastigotas, detectados pelas reações de imunoflorescencia / Abstract: Not informed. / Mestrado / Imunologia / Mestre em Ciências Biológicas