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Clonagem molecular e expressão dos genes do cristal proteico de Bacullus thuringiensis subsp. israelensis em Escherichia coli

Castro, Rejane Maria Cassia de 09 March 1990 (has links)
Orientador : Yoko Bomura Rosato / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-14T01:08:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Castro_RejaneMariaCassiade_M.pdf: 3202849 bytes, checksum: 5a7abf9078929075d930eaec0b931bb7 (MD5) Previous issue date: 1990 / Resumo: Bacillus thuringiensis subsp. Israelensis é uma bactéria entomopatogênica que produz cristais protéicos durante o processo de esporulação. Com o objetivo de se determinar a atividade biológica das proteínas constituintes do cristal foi feita a clonagem molecular dos genes da toxina. A estratégia de clonagem consistiu-se na inserção de fragmentos de DNA plasmidial de B. thuringiensis subsp israelensis no plasmídio pUC8, resultando em plasmídios híbridos. Foram obtidos 8 clones recombinantes com atividade contra larvas de ª fluviatilis e hemolíticos para eritrócitos de carneiros e um clone recombinante com atividade larvicida e não hemolítico. Após análise imunológica com anticorpos produzidos contra as principais frações protéicas de B. thuringiensis subsp israelensis, verificou-se a produção dos peptídeos de 28, 33 e 38 kD nos clones recombinantes larvicidas e hemolíticos e a ausência do peptídeo de 33 kD no clone não hemolítico / Abstract: Bacillus thuringiensis subsp. Isralensis is a bacteria entomopathogenic that produce proteins crystals during the process of sporulation. The molecular cloning of the toxin genes was carried out to determine the biological activities of the crystal proteins. Fragments of DNA plasmids of Bacillus thuringiensis subsp. Israelensis coli were inserted in the vector pUC8 and cells of Escherichia coli were transformed with the hybrid plasmids. Eight of the recombinants obtained were active against larvae of A.fluviatilis and hemolytic for sheep red blood cells, while one of the recombinants showed larvicidal activity but did not show hemolytic activity. Antibodies were produced against the major proteins of Bacillus thuringiensis subsp. israelensis crystal and the immunodection test showed the presence of three types of proteins with 28, 33 and 38 kD, respectively. While the clones with IarvicidaI and hemolytic activity contained all three types of proteins, the one with no hemolytic activity lacked the 33 kD protein / Mestrado / Genetica / Mestre em Ciências Biológicas
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Análise do desempenho da técnica de clonagem celular por micromanipulação versus diluição limitante

Jesuino, Daniel Bassetto [UNESP] 22 February 2011 (has links) (PDF)
Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:06Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-02-22Bitstream added on 2014-06-13T20:29:53Z : No. of bitstreams: 1 jesuino_db_me_botfm.pdf: 3747670 bytes, checksum: f0d0340cc56341df27b2574498d32310 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Anticorpos monoclonais (mAbs) são ferramentas-chave na investigação de fenômenos biológicos e uma promissora alternativa para o tratamento de muitas doenças, em especial os tumores. A cadeia produtiva de mAbs apresenta pontos cruciais para o desenvolvimento de um produto de qualidade que justifique os altos custos de produção. O procedimento de clonagem celular é a etapa de produção que garante a monoclonalidade das células produtoras, assegurando a especificidade do mAb. Desde os anos 80 existem tentativas de otimização e automação deste procedimento visando a garantia da monoclonalidade e aumento na eficiência de clonagem. A captura celular sob observação direta ao microscópio pode ser considerada a única metodologia de clonagem celular que garante 100% de crescimento monoclonal. Neste trabalho avaliamos indicadores de eficiência de clonagem, tempo de execução e custos de uma metodologia de clonagem celular por micromanipulação em comparação com a metodologia de diluição limitante. Hibridomas murinos secretores de mAbs de diversas especificidades foram clonados em paralelo por ambas as técnicas. Não houve diferença no tempo de execução das metodologias embora a observação dos clones da micromanipulação seja de 4 a 6 vezes mais rápida. A produção de clones por micromanipulação é 4 vezes superior à diluição limitante com redução de 60% no consumo de meio de cultura, o que justifica os custos da metodologia. Concluímos que a clonagem celular por micromanipulação é uma técnica precisa e que garante 100% de crescimento monoclonal podendo vir a substituir a diluição limitante. Esta garantia elimina testes de comprovação da monoclonalidade e reduz o tempo de cultura necessário para obtenção de mAbs. / Monoclonal antibodies (mAbs) are outstanding tools for investigating biological phenomena and a promising alternative to treat several diseases, specially tumors. Production of mAbs has settled critical milestones at the production chain which justifies high development costs. Cell cloning procedure is the milestone that guarantees monoclonality and assures antibody specificity. Since the 80’s there have been attempts to optimize and automate this procedure aiming to guarantee monoclonality and enhance cloning efficiency. Celular capture under direct microscope observation is the only method considered to guarantee 100% monoclonal growth. On this work we evaluated cloning efficiency, working time and costs of a micromanipulating cloning technique compared with gold-standard limiting dilution. Murine secretor hybridomas of various specificity were cloned by both techniques in parallel. No differences were observed at both working times although observation of micromanipulated clones was 4 to 6 times faster. Cloning efficiency of micromanipulation cloning was 4 times higher than limiting dilution with 60% reduction on media consume what justifies methodology costs. Cell cloning by micromanipulation is a precise procedure that guarantees 100% monoclonal growth and could substitute limiting dilution. This guarantee eliminates additional tests to assure monoclonality and reduces culture working time on mAbs production.
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Clonagem e expressão de uma α-amilase de Cryptococcus flavus e sua aplicação na degradação do amido.

Galdino, Alexsandro Sobreira 02 1900 (has links)
Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2008. / Submitted by Kelly Marques (pereira.kelly@gmail.com) on 2009-11-03T18:29:13Z No. of bitstreams: 1 TESE DE DOUTORADO.pdf: 9729892 bytes, checksum: 86dc32db2bd0d4bbddc8a4764a79ab08 (MD5) / Approved for entry into archive by Gomes Neide(nagomes2005@gmail.com) on 2010-10-27T14:40:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TESE DE DOUTORADO.pdf: 9729892 bytes, checksum: 86dc32db2bd0d4bbddc8a4764a79ab08 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-10-27T14:40:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESE DE DOUTORADO.pdf: 9729892 bytes, checksum: 86dc32db2bd0d4bbddc8a4764a79ab08 (MD5) Previous issue date: 2008-02 / α-Amilases têm aplicações nas indústrias de processamento do amido, produção de álcool, têxtil e outras. Na busca por fontes de amilases na biodiversidade do cerrado, uma levedura foi isolada e classificada como Cryptococcus flavus. Embora esta levedura seja capaz de metabolizar amido, ela não pode ser usada na indústria por não possuir status GRAS. Por outro lado, S. cerevisiae, amplamente utilizada na indústria de etanol, não é capaz de degradar amido para produzir açúcares fermentescíveis, sendo necessária a clonagem e expressão heteróloga de enzimas amilolíticas nesse microrganismo. Neste trabalho, o gene da amilase de C. flavus (AMY1) codificando uma amilase extracelular foi clonado e expresso com sucesso em S. cerevisiae. A seqüência de nucleotídeos do cDNA revelou uma ORF de 1896 pb codificando uma cadeia polipeptídica de 631 aminoácidos apresentando uma homologia (97%) com a amilase da levedura Cryptococcus sp S-2. A presença das quatro regiões conservadas, (I) 144DVVVNH149, (II) 235GLRIDSLQQ243, (III) 263GEVFN267 e (IV) 327FLENQD332 classificou essa enzima na família 13 das glicosil hidrolases (G13). A cinética de produção da amilase recombinante alcançou a atividade amilolítica máxima (3,93 U/mL) em 60 horas de cultivo. A proteína recombinante apresentou uma massa molecular similar a amilase nativa (~ 67 kDa), parte devido à N-glicosilação. Além disso, a amilase recombinante foi caracterizada bioquimicamente apresentando um pH ótimo de 5,5, temperatura ótima de 60 °C e Km= 0,37 mg/mL para o amido. Com o objetivo de desenvolver uma cepa de S. cerevisiae capaz de degradar o amido de forma mais eficiente, o gene da glicoamilase de Aspergillus awamori foi clonado no vetor YEp352-PGK para co-expressão com o gene da amilase de C. flavus, clonado previamente no vetor YEp351-PGK. O clone de S. cerevisiae expressando as duas enzimas foi capaz de crescer em meio contendo amido como única fonte de carbono. Dados preliminares de fermentação em frasco mostraram que esse clone é capaz de produzir 116 g de ethanol/L durante 120 horas de cultivo. _____________________________________________________________________________ ABSTRACT / α-Amylases have applications in starch processing, alcohol production, textile and others industries. On screening for amylolytic yeasts in the Brazilian Cearrado, a yeast was isolated and classified as Cryptococcus flavus. Although C. flavus is able to metabolize starch, it cannot be used in industry because it does not possess GRAS status. On the other hand, S. cerevisiae, which is widely used in ethanol industry, cannot degrade starch to fermentable sugars, requiring for that the cloning and heterologous expression of amylolytic enzymes from other microrganisms. In this work, a C. flavus α-amylase gene (AMY1) encoding an extracelullar α-amylase has been cloned and successfully expressed in S. cerevisiae. The nucleotide sequence of the cDNA revealed an ORF of 1896 pb coding for a 631 amino acid polypeptide with high identity (97%) to a homologous protein isolated from Cryptococcus sp S-2. The presence of four conserved regions, (I) 144DVVVNH149, (II) 235GLRIDSLQQ243, (III) 263GEVFN267 and (IV) 327FLENQD332, places the enzyme in the GH13 α-amylase family. The assessment of the time course of amylase secretion in S. cerevisiae revealed a maximal extracellular amylolytic activity (3.93 U/mL) at 60 hours of incubation. The recombinant protein had an apparent molecular mass similar to the native enzyme (~67 kDa), part of which was due to N-glycosylation. On further characterization it was found that the recombinant amylase has optimal activity on pH 5.5 at 60 °C. Its for starch is Km= 0.37 mg/mL . In order to develop a S. cerevisiae strain able to degrade starch more efficiently, the Aspergillus awamori glucoamylase gene was cloned into the YEp352-PGK vector with a view to co-expression with the C. flavus α-amylase gene, previously cloned into YEp351-PGK. This new strain expressing both enzymes was able to grow in medium containg starch as sole carbon source. Preliminary data of flask fermentation suggest that this strain is able to produce 116g ethanol/L in 120 h of incubation.
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Clonagem, caracterização e expressão de genes envolvidos na síntese de compostos isoprenóides em Eucalyptus grandis

Athaydes, Genaro Azambuja January 2010 (has links)
Os isoprenóides são compostos essenciais a todos os organismos e representam um grupo extremamente amplo estruturalmente e funcionalmente. Em plantas, mais de 30.000 compostos desta classe foram identificados até hoje. Todas as plantas produzem isoprenóides que desempenham papéis essenciais como os carotenóides, as clorofilas e as plastoquinonas (fotossíntese); ubiquinona (respiração); citocininas, brassinosteróides, giberelinas, ácido abscísico (regulação do crescimento e desenvolvimento). No entanto, a maior variedade de isoprenóides é representada pelos metabólitos secundários (óleos essenciais como eucaliptol, cineol, citronelal). Os isoprenóides possuem papel marcante nas relações da planta com o ambiente onde estão inseridas, já que medeiam as relações planta-inseto, planta-microorganismo e planta-planta. Devido ao valor comercial dos compostos isoprenóides, há grande interesse em produzi-los por bioengenharia em bactérias ou em plantas e o entendimento do papel dos genes e proteínas codificadas na rota de síntese dessas unidades básicas de formação de terpenóides é extremamente importante. Nesse trabalho, nós recuperamos, a partir da seleção dos plasmídios de clonagem pSPORT1 (Invitrogen) purificados do Projeto “Genolyptus: Rede Brasileira de Pesquisa do Genoma de Eucalyptus”, os clones selecionados e potencialmente codificadores de 1-desoxi-D-xilulose-5-fosfato redutoisomerase (DXR) e de outras enzimas atuantes nas rotas de síntese de isoprenóides, como 1-desoxi-D-xilulose 5-fosfato sintase (DXS), mevalonato difosfato descarboxilase (MDC), isopentenil difosfato isomerase 1 (IPPI1) e isopentenil difosfato isomerase 2 (IPPI2). Nos estoques de plasmídios do projeto Genolyptus, foi possível encontrar as sequências completas dos genes dxr, ippi1 e ippi2. Os genes foram analisados in silico e a sequência de ippi1 foi utilizada na modelagem molecular e dinâmica molecular para avaliação de características peculiares do folding protéico desse tipo de proteína eucariótica. Os genes foram clonados em vetores pGEX-4T (GE Healthcare) e heterologamente expressos em Escherichia coli. Foi realizada, também, uma análise transcricional comparativa dos genes selecionados pela técnica de microarranjos. / Isoprenoids are essential to all organisms and are the most structurally and functionally diverse group of plant metabolites. In plants, more than 30,000 compounds of this class were identified to date. All plants produce isoprenoids that can play essential roles as carotenoids, chlorophylls and plastoquinone (photosynthesis); ubiquinone (respiration); regulation of growth and development (cytokinins, brassinosteroids, gibberellins, abscisic acid). However, the majority of isoprenoids is represented by secondary metabolites (essential oils like eucaliptol, cineol, citronelal). Isoprenoids have important roles in the relationships between plants and the environment, since they can mediate plant-insect, plant-microorganism and plant-plant interactions, as well as participate in abiotic stress responses. Due to the high value of isoprenoid compounds, there is great interest in producing them by bioengineering in bacteria or plants. Understanding the role of genes and proteins related to the biosynthetic pathway of isoprenoids is extremely important. In this work, we retrieved, from the collection of cloning plasmids pSPORT1 (Invitrogen) generated in the “Genolyptus Project: The Brazilian Research Network on the Eucalytpus Genome”, selected clones that potentially codified the 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase (DXR) and other enzymes from the isoprenoid biosynthetic pathway including 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase (DXS), mevalonate disphosphate decarboxilase (MDC), isopentenil disphosphate isomerase 1 (IPPI1) and isopentenil disphosphate isomerase 2 (IPPI2). Complete sequences of the dxr, ippi1 and ippi2 genes were succesfully recovered from the Genolyptus stocks. The genes were analyzed in silico and the ippi1 sequence was used in studies of molecular modeling and molecular dynamics in order to evaluate specific folding characteristics of this kind of eukaryotic IPPI. The genes were cloned into pGEX-4T vectors (GE Healthcare) and expressed in Escherichia coli. Also, the transcriptional analysis of the selected genes was performed by microarray analysis.
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Sequenciamento, análise, clonagem e expressão de genes de celulases e hemicelulases oriundos de bibliotecas metagenômicas de solo e rúmen

Ramos, Talita Gabriela Salles January 2014 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Microbiana, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2014-12-04T13:46:14Z No. of bitstreams: 1 2014_TalitaGabrielaSallesRamos.pdf: 6564871 bytes, checksum: 97af53846f0978f00977d0a6418d9ddf (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2014-12-04T18:59:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_TalitaGabrielaSallesRamos.pdf: 6564871 bytes, checksum: 97af53846f0978f00977d0a6418d9ddf (MD5) / Made available in DSpace on 2014-12-04T18:59:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_TalitaGabrielaSallesRamos.pdf: 6564871 bytes, checksum: 97af53846f0978f00977d0a6418d9ddf (MD5) / A celulose é o polissacarídeo mais abundante da Terra e pode ser encontrada na parede celular das plantas. Para hidrolisar a celulose em resíduos de glicose é necessário um complexo de enzimas hidrolíticas envolvendo as enzimas endoglucanases, celobiohidrolases ou exoglucanases e as β- glicosidases. O uso industrial dessas celulases é bem diverso, abrangendo desde o processamento de algodão, a fabricação de papel, produção de detergentes, extração de polpa de frutas para a fabricação de sucos, o enriquecimento de ração para animais e na produção de bioetanol a partir da biomassa. Devido a essa grande variedade de usos para celulases é que a contínua busca por enzimas que sejam cada vez mais vantajosas na relação custo-benefício e eficiência se faz tão necessária. Uma técnica que pode ser usada na busca por essas novas enzimas é a metagenômica que permite o acesso ao material genético de micro-organismos não cultiváveis. Para a produção industrial dessas proteínas recombinantes, vários sistemas biológicos são empregados, principalmente a bactéria Escherichia coli e a levedura Pichia pastoris. Nesse trabalho foi feita a triagem de clones provenientes de uma biblioteca metagenômica de rúmen de caprino com fenótipo de degradação de celulases em 4 diferentes substratos: CMC LV, CMC HL, avicel e bagaço de cana pré-tratado. Desses clones 4 foram completamente sequenciados e analises de suas prováveis ORFs e proteínas, foi feita em comparação com bancos de dados existentes. Foi realizada a clonagem do gene endo 03, proveniente da biblioteca metagenômica de solo da Amazônia, no vetor de clonagem pJET e posterior clonagem no vetor de expressão pPICαA, para P. pastoris, e expressão em placa. A clonagem dos genes cbh I e cbh II provenientes da biblioteca metagenômica de rúmen de caprino, no vetor de clonagem pJET e posterior clonagem no vetor de expressão pET21a, para E. coli, e expressão das proteínas CBH I e CBH II. Também foi realizada a purificação parcial da proteína CBH II que permitiu a caracterização da temperatura ótima como 50ºC e do pH ótimo na faixa entre 5,0 e 6,0 para a proteína parcialmente purificada. ___________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Cellulose is the most abundant polysaccharide on the Earth and it can be found at cell wall of plants. To hydrolyze cellulose into glucose, a hydrolytic enzyme complex is needed. This enzymatic complex includes endoglucanases, celobiohydrolases or exoglucanases and β-glycosidases. The industrial use of cellulases is quite diverse, including cotton processing, paper manufacture, detergent production, extraction of fruits pulp for juice production, enrichment of animal feed and cellulosic ethanol production. Because of its large variety of uses cellulases continued search for even better enzymes with favorable cost-benefit is necessary. Metagenomics is a technique that allows access to genetic material of microorganisms not cultured yet. Different biological systems are used in industrial applications, especially the bacterium Escherichia coli and the yeast Pichia pastoris. On this work made a screening of 10 clones provinents of a goat rumen metagenomic librarie, with a cellulose degradation phenotype on 4 different substrates: CMC LV, CMC HL, avicel and pre-treated sugar-cane bagasse, of these clones, 4 were completely sequenced and analysis of probable ORFs and proteins comparing with the existing databanks. The cloning of gene endo 03, provinent of Amazon soil metagenomic librarie, in the cloning vector pJET and posterior cloning at expression vector pPICαA, to P. pastoris, and expression at plate. The cloning of genes cbh I e cbh II, provinent of goat rumen metagenomic librarie, at the cloning vector pJET and posterior cloning at expression vector pET21a, to E. coli, and expression of CBH I and CBH II proteins. The partial purification of CBH II protein and characterization of ideal temperature of 50ºC with an ideal pH between 5,0 and 6,0 to the protein partly purified.
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Clonagem, caracterização e expressão de genes envolvidos na síntese de compostos isoprenóides em Eucalyptus grandis

Athaydes, Genaro Azambuja January 2010 (has links)
Os isoprenóides são compostos essenciais a todos os organismos e representam um grupo extremamente amplo estruturalmente e funcionalmente. Em plantas, mais de 30.000 compostos desta classe foram identificados até hoje. Todas as plantas produzem isoprenóides que desempenham papéis essenciais como os carotenóides, as clorofilas e as plastoquinonas (fotossíntese); ubiquinona (respiração); citocininas, brassinosteróides, giberelinas, ácido abscísico (regulação do crescimento e desenvolvimento). No entanto, a maior variedade de isoprenóides é representada pelos metabólitos secundários (óleos essenciais como eucaliptol, cineol, citronelal). Os isoprenóides possuem papel marcante nas relações da planta com o ambiente onde estão inseridas, já que medeiam as relações planta-inseto, planta-microorganismo e planta-planta. Devido ao valor comercial dos compostos isoprenóides, há grande interesse em produzi-los por bioengenharia em bactérias ou em plantas e o entendimento do papel dos genes e proteínas codificadas na rota de síntese dessas unidades básicas de formação de terpenóides é extremamente importante. Nesse trabalho, nós recuperamos, a partir da seleção dos plasmídios de clonagem pSPORT1 (Invitrogen) purificados do Projeto “Genolyptus: Rede Brasileira de Pesquisa do Genoma de Eucalyptus”, os clones selecionados e potencialmente codificadores de 1-desoxi-D-xilulose-5-fosfato redutoisomerase (DXR) e de outras enzimas atuantes nas rotas de síntese de isoprenóides, como 1-desoxi-D-xilulose 5-fosfato sintase (DXS), mevalonato difosfato descarboxilase (MDC), isopentenil difosfato isomerase 1 (IPPI1) e isopentenil difosfato isomerase 2 (IPPI2). Nos estoques de plasmídios do projeto Genolyptus, foi possível encontrar as sequências completas dos genes dxr, ippi1 e ippi2. Os genes foram analisados in silico e a sequência de ippi1 foi utilizada na modelagem molecular e dinâmica molecular para avaliação de características peculiares do folding protéico desse tipo de proteína eucariótica. Os genes foram clonados em vetores pGEX-4T (GE Healthcare) e heterologamente expressos em Escherichia coli. Foi realizada, também, uma análise transcricional comparativa dos genes selecionados pela técnica de microarranjos. / Isoprenoids are essential to all organisms and are the most structurally and functionally diverse group of plant metabolites. In plants, more than 30,000 compounds of this class were identified to date. All plants produce isoprenoids that can play essential roles as carotenoids, chlorophylls and plastoquinone (photosynthesis); ubiquinone (respiration); regulation of growth and development (cytokinins, brassinosteroids, gibberellins, abscisic acid). However, the majority of isoprenoids is represented by secondary metabolites (essential oils like eucaliptol, cineol, citronelal). Isoprenoids have important roles in the relationships between plants and the environment, since they can mediate plant-insect, plant-microorganism and plant-plant interactions, as well as participate in abiotic stress responses. Due to the high value of isoprenoid compounds, there is great interest in producing them by bioengineering in bacteria or plants. Understanding the role of genes and proteins related to the biosynthetic pathway of isoprenoids is extremely important. In this work, we retrieved, from the collection of cloning plasmids pSPORT1 (Invitrogen) generated in the “Genolyptus Project: The Brazilian Research Network on the Eucalytpus Genome”, selected clones that potentially codified the 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase (DXR) and other enzymes from the isoprenoid biosynthetic pathway including 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase (DXS), mevalonate disphosphate decarboxilase (MDC), isopentenil disphosphate isomerase 1 (IPPI1) and isopentenil disphosphate isomerase 2 (IPPI2). Complete sequences of the dxr, ippi1 and ippi2 genes were succesfully recovered from the Genolyptus stocks. The genes were analyzed in silico and the ippi1 sequence was used in studies of molecular modeling and molecular dynamics in order to evaluate specific folding characteristics of this kind of eukaryotic IPPI. The genes were cloned into pGEX-4T vectors (GE Healthcare) and expressed in Escherichia coli. Also, the transcriptional analysis of the selected genes was performed by microarray analysis.
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Expressão de fragmentos de anticorpos que reconhecem o antígeno CD20 humano

Lopes, Tarcila Zuleica Zaparolli 25 February 2016 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-03-24T15:13:59Z No. of bitstreams: 1 2016_TarcilaZuleicaZaparolliLopes.pdf: 1936810 bytes, checksum: 868908728b6e0749bcb8cd9988271b4c (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2016-04-02T13:05:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_TarcilaZuleicaZaparolliLopes.pdf: 1936810 bytes, checksum: 868908728b6e0749bcb8cd9988271b4c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-02T13:05:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_TarcilaZuleicaZaparolliLopes.pdf: 1936810 bytes, checksum: 868908728b6e0749bcb8cd9988271b4c (MD5) / Em 1997, foi aprovado especificamente para o tratamento de pacientes com LNH de baixo grau (folicular) ou linfomas foliculares agressivos non-Hodgkin, o anticorpo recombinante anti-CD20: Rituximabe (MabThera®, Rituxan). Esse anticorpo, causa uma depleção seletiva e transitória de ambas subpopulações de células B CD20 positivas, normais ou malignas, dentro de etapas chaves da ontogenia das células B. Neste trabalho, objetivou-se a expressão, produção e purificação de fragmentos de anticorpos na forma FvFc específicos para o antígeno humano CD20, por meio de células de ovário de hamster chinês versão K1 (CHO-K1). Foram selecionadas duas versões scFvs humanizadas, contendo as CDRs do anticorpo monoclonal quimérico Rituximabe e uma versão scFv murina similar ao anticorpo original. Posteriormente, essas versões foram transferidas para o vetor de expressão em células de mamíferos pCOMIRES∆600. Esse vetor possui os genes que codificam os domínios CH2 e CH3 do fragmento cristalizável de imunoglobulina humana IgG, de forma que a proteína liberada pela célula de mamífero corresponda ao fragmento FvFc do anticorpo. Após a finalização das etapas de clonagens, as células CHO-K1 foram utilizadas como sistema de expressão e produção de anticorpos. Essas células foram mantidas na presença do antibiótico geneticina para a seleção da população mista de células CHO-K1 produtoras dos FvFcs recombinantes. Os sobrenadantes de cultura foram avaliados quanto á presença de FvFc por meio de imunodetecção ELISA. Posteriormente, foram submetidos a uma cromatografia de afinidade, utilizando a coluna HITRAP protein A HP. Após a purificação as frações coletadas da coluna, foram analisadas quanto ao grau de pureza destes fragmentos por meio do gel SDS-PAGE e Wersten-Blot. Com esses resultados foi possível realizar análises da capacidade de ligação das proteínas recombinantes por meio de citometria de fluxo. Os resultados também sugerem que é possível propor avaliações das proteínas recombinantes quanto à estabilidade conformacional, e em relação as funções efetoras realizadas pelo rituximabe. ______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / In 1997 was approved specifically for treating patients with low-grade NHL (follicular) or aggressive follicular non-Hodgkin lymphomas, anti-CD20 recombinant antibody: Rituximab (MabThera, Rituxan). This antibody causes a selective and transient depletion of both subpopulations of CD20 positive, normal or malignant, within key steps of B cell ontogeny This study aimed to expression, production and purification of antibody fragments in the form FvFc specific to human CD20 antigen, using Chinese hamster ovary cells version K1 (CHO-K1). Two versions of humanized scFvs were selected, containing the CDRs of the chimeric monoclonal antibody Rituximab and a scFv version similar to the original murine antibody. Subsequently, these versions were transferred to the expression vector into mammalian cells pCOMIRES∆600. This vector has the gene encoding the CH2 and CH3 domains of the crystallizable fragment of human immunoglobulin IgG, so that the protein released from the mammalian cell FvFc corresponds to the fragment of the antibody. After completion of cloning steps, the CHO-K1 cells were used as expression system and production of antibodies. These cells were maintained in the presence of the antibiotic geneticin for selecting the mixed population of CHO-K1 cells producing the recombinant FvFcs. The culture supernatants were evaluated for the presence of FvFc by immunodetection ELISA. Subsequently, they were subjected to affinity chromatography using a HiTrap Protein A HP column. After purification the fractions collected from the column were analyzed for purity of these fragments by means of SDS-PAGE and gel blot Wersten. With these results it was possible to perform analyzes of the binding capacity of the recombinant proteins by flow cytometry. The results also suggest that it is possible to propose reviews of recombinant proteins for the conformational stability, and for the effector functions performed by rituximab.
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Aspectos anatomopatológicos de clones bovinos abortados e neonatos

Pereira, Lídia dos Santos 22 July 2013 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Programa de Pós-Graduação em Saúde Animal, 2013. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2013-10-10T15:09:37Z No. of bitstreams: 1 2013_LidiadosSantosPereira.pdf: 4102262 bytes, checksum: 9a6e3ff147d2c0bf78c11d8fac8c63b2 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-10-10T15:35:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_LidiadosSantosPereira.pdf: 4102262 bytes, checksum: 9a6e3ff147d2c0bf78c11d8fac8c63b2 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-10T15:35:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_LidiadosSantosPereira.pdf: 4102262 bytes, checksum: 9a6e3ff147d2c0bf78c11d8fac8c63b2 (MD5) / A transferência nuclear de células somáticas ou clonagem é um técnica que permite produzir um indivíduo geneticamente igual a um outro indivíduo adulto. Esta técnica abre inúmeras possibilidades para a medicina e para a reprodução animal. Porém, existem inúmeros relatos de problemas associados à clonagem. A taxa de perda nos períodos embrionário e fetal ainda é muito alta quando comparado a outras biotécnicas, além disso, há uma maior incidência de hidropisias e distocias, diminuindo a eficiência e aumentando o custo da técnica. Os animais que vem a termo frequentemente apresentam uma síndrome chamada de macrossomia e apresentam dificuldades de adaptação à vida extrauterina e por isso muitas vezes vem a óbito. No presente trabalho realizou-se necropsia e coleta de fragmentos de órgãos para avaliação histopatológica de 69 bezerros clonados, destes, 28 foram abortados e 41 com óbito neonatal. As principais alterações observadas foram no fígado, rins e pulmões tanto nos animais abortados quanto com óbito neonatal. No fígado, 85% dos animais avaliados apresentaram degeneração hepática. Nos rins identificou-se a presença de um pigmento acastanhado no interior dos túbulos corticais em aproximadamente 90% das amostras avaliadas, a presença deste pigmento não relatada anteriormente em animais clonados. Nos pulmões o achado que mais chamou atenção foi o grande número de animais que apresentaram lesões características de pneumonia (55%). Alterações nestes órgãos foram cruciais para que os animais viessem a óbito. Isto aconteceu, sobretudo devido a problemas na adaptação ao ambiente extrauterino e em decorrência de infecções adquiridas no período neonatal. Os achados encontrados no presente trabalho denotam a necessidade de investigação anatomopatológica detalhada de animais clonados que não foram viáveis, na tentativa de mapear as anormalidades apresentadas por estes animais. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The somatic-cell nuclear transfer or cloning is a technique that allows a donor adult individual to produce another genetically identical individual. This technique opens numerous possibilities for medicine and animal reproduction. However, several reports describe cloning-associated issues. Embryo and fetal loss is still very high when compared to other techniques, furthermore, there is high incidence of dystocia and hydrops, which decreases efficiency and increases costs. Animals that come to term often exhibit a syndrome called macrosomia and have difficulties in adapting to life outside the uterus and death is a common consequence. In this study 69 (28 aborted and 41 neonatal death) cloned bovines were submitted to gross and histopathological examination. The main findings were in the liver, kidneys and lungs from both aborted and neonatal animals. In the liver, 85% of the animals evaluated showed hepatic degeneration. Kidney was identified the presence of a pigment brownish within the cortical tubules in approximately 90% of the samples, the presence of this pigment does not reported previously cloned. In the lungs the finding that more attention was the large number of animals showing lesions characteristic of pneumonia (55%). These changes were crucial for the animals to come to death. This was mainly due to problems in adapting outside the uterus and infections in the neonatal period. Further investigation focusing on anatomic pathology changes are necessary to map the abnormalities in cloned animals.
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Genômica comparativa de isolados de Condylorrhiza vestigialis MNPV com ênfase no seu provável locus v-cath/chiA e caracterização de clones purificados e mutantes FP gerados

Tagliari, Marina 03 1900 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2013. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2013-10-29T13:51:11Z No. of bitstreams: 1 2013_MarinaTagliari.pdf: 6194299 bytes, checksum: acf4157c8673383ce7571bb7098e8789 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-10-30T11:21:20Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_MarinaTagliari.pdf: 6194299 bytes, checksum: acf4157c8673383ce7571bb7098e8789 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-30T11:21:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_MarinaTagliari.pdf: 6194299 bytes, checksum: acf4157c8673383ce7571bb7098e8789 (MD5) / O lepidóptero Condylorrhiza vestigialis é uma das principais pragas desfolhadoras da cultura de álamo no Brasil. Como uma alternativa de controle desta praga, o baculovírus Condylorrhiza vestigialis multiple nucleopolyhedrovirus (CoveMNPV) vem sendo aplicado em plantações de Álamo na região de Cascavel-PR. Devido à ocorrência no campo de lagartas mortas por infecção viral apresentando tegumento liquefeito e intacto, os genes virais catepsina (v-cath) e quitinase (chiA), essenciais para a liquefação do tegumento da lagarta morta por vírus, foram investigados quanto a sua presença ou ausência nos genomas de dois isolados de campo de CoveMNPV. A amplificação destes genes por PCR usando oligonucleotídeos degenerados foi altamente inespecífica em ambas as amostras. Embora os produtos detectados em gel de agarose fossem dos tamanhos esperados, as suas sequências não corresponderam aos genes v-cath e chiA, indicando uma possível ausência desses genes no genoma de CoveMNPV. Bioensaios demonstraram um comportamento semelhante para ambas às amostras de campo, onde à maioria das lagartas mortas apresentou o tegumento íntegro. Os perfis de restrição do DNA viral, gerados pela clivagem com cinco endonucleases de restrição (BamHI, BstEII, EcoRI, HindIII e PstI), foram idênticos para ambos os isolados, tanto para bandas principais como submolares. Para melhor entender as diferenças nos dois isolados de campo de CoveMNPV, seus genomas foram sequenciados utilizando o sequenciador automático FLX 454 (Roche). Após a montagem, anotação e análise, os dois isolados foram comparados por meio da avaliação de polimorfismos, onde o percentual de similaridade entre eles foi de 99.97%. O genoma do CoveMNPV é de 125.767 pares de base (pb) e tem um conteúdo G+C de 42.9%, e contém 138 fases abertas de leitura (ORFs), 9 bros e 4 hrs. Análise filogenética baseada nas sequências deduzidas de aminoácidos do genoma completo e nas sequências nucleotídicas de 11 genes comuns a todos os baculovírus (core genes) classificou o CoveMNPV como espécie irmã do clado AgMNPV/CfDEFMNPV. A ausência dos genes v-cath e chiA foi confirmada no genoma de ambos os isolados, e análise filogenética do locus lef-7/gp64 sugere que este evento tenha ocorrido no ancestral do AgMNPV, CfDEFMNPV e CoveMNPV. Com base na presença de bandas submolares no perfil de restrição do DNA dos isolados de CoveMNPV, clones virais foram purificados por plaque assay a partir de uma das misturas de genótipos de campo. Três destes clones, nomeados CoveMNPV-C2, -C6 e -C8, foram selecionados e amplificados in vivo e in vitro. Análise comparativa dos DNAs não mostrou qualquer alteração entre os perfis de restrição gerados por BstEII, HindIII e PstI, sugerindo a não recuperação do genótipo de campo após a primeira passagem dos clones in vivo. Os clones foram submetidos a ensaios de infectividade in vivo e in vitro, evidenciando diferenças nos seus graus de virulência. Além disto, os OBs dos clones demonstraram diferenças na morfologia do poliedro como revelado por microscopia eletrônica de transmissão. Com base nestes dados, os genes polh e fp25k responsáveis pela formação do poliedro, antes e após a passagem dos clones in vivo, foram amplificados e sequenciados. Nenhuma alteração no gene polh foi detectada, mas o gene fp25k do C8 e C6 apresentou uma mutação frameshift pela inserção de um único nucleotídeo resultando em uma proteína truncada. Após a passagem destes clones in vivo houve uma diminuição na frequência do mutante com relação ao selvagem. Os OBs do C8 apresentaram poucos ou nenhum ODV no seu interior, fenótipo este esperado para um fp25k mutado, e o que também justifica sua menor virulência observada em ensaios in vivo. O clone que se mostrou mais virulento em ensaios in vivo, CoveMNPV-C2, foi similar ao isolado de campo após passagem in vitro, não mostrando qualquer mutação no gene fp25k e produzindo ODVs oclusos. Estas evidências sugerem que este clone é geneticamente mais estável, uma vez que não houve alteração em consequência da passagem em cultura de células, enquanto que os outros clones foram identificados como mutantes de poucos poliedros (FP: few polyhedra). _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The lepidopteran, Condylorrhiza vestigialis is a major defoliating pest of poplar in Brazil. The baculovirus Condylorrhiza vestigialis multiple nucleopolyhedrovirus (CoveMNPV) has been applied in poplar plantations in the region of Cascavel-PR as an alternative to chemical control of this pest. Due to the occurrence of dead caterpillars in the field with either intact or liquefied integument, the presence or absence of virus-encoded cathepsin (v-cath) and chitinase (chiA) genes, essential for the liquefaction of the integument of caterpillars killed by virus, were investigated in the genomes of two CoveMNPV field isolates. Amplification of these genes by PCR using degenerate primers was highly nonspecific in both samples. Although some products detected by agarose gel electrophoresis were of the expected sizes, their sequences did not correspond to the v-cath and chiA genes, indicating a possible lack of these genes in the CoveMNPV genome. Bioassays showed a similar behavior for both field samples, where most killed caterpillars possessed an intact integument. The restriction profiles of the viral DNA, generated by cleavage with five restriction endonucleases (BamHI, BstEII, EcoRI, HindIII and PstI), was identical in the two isolates, for both major and submolar bands. To better understand the differences in the two CoveMNPV field isolates, their genomes were sequenced using the 454 FLX automated sequencer (Roche). Following assembly, annotation and analysis, the two genomes were compared to evaluate polymorphisms, where the percentage similarity between them was 99.97%. The CoveMNPV genome is 125,767 base pairs (bp) and has a G+C content of 42.9%, and contains 138 open reading frames (ORFs), 9 bros and 4 hrs. Phylogenetic analysis based on deduced amino acid sequences of the complete genome and nucleotide sequence of 11 core genes placed CoveMNPV as sister to AgMNPV and CfDEFMNPV. The absence of v-cath and chiA genes was confirmed in the genome of both isolates, and phylogenetic analysis of the lef-7/gp64 locus suggests that this event occurred in the ancestor of AgMNPV, CfDEFMNPV and CoveMNPV. Based on the presence of submolar bands in DNA restriction profiles of CoveMNPV isolates, viral clones were purified by plaque assay from a mixture of field genotypes. Three of these clones, named CoveMNPV-C2, -C6-and -C8, were selected and amplified in vivo and in vitro. Comparative DNA analyses showed no change in the restriction profiles generated by BstEII, HindIII and PstI suggesting the no recovery of field genotype after the first passage of the clones in vivo. The clones were also subjected to in vivo and in vitro infectivity assays, showing differences in their degree of virulence. Furthermore, the OBs of the clones also demonstrated differences in polyhedron morphology as revealed by transmission electron microscopy. Based on these data, the polh and fp25k genes responsible for polyhedron formation, before and after passage of the clones in vivo, were amplified and sequenced. No change in the polh gene was detected, but the fp25k gene of C8 and C6 showed a frameshift mutation by insertion of a single nucleotide resulting in a truncated protein. After the passage of these clones in vivo there was a decrease in the frequency of the mutant relative to the wild-type. The OBs of C8 had few or no ODVs inside, which is the expected phenotype for an fp25k-defective mutant, and also explains its lower observed virulence in in vivo assays. The clone showing greater virulence in in vivo assays, CoveMNPV-C2, was similar to the field isolate after passage in vitro, did not show any mutation in the fp25k gene and produced occluded ODVs. This evidence suggests that this clone is genetically more stable, since it did not change as a result of passage in cell culture, whereas other clones were identified as few polyhedra (FP) mutants.
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Construção de um vetor integrativo em múltiplas cópias para Saccharomyces cerevisiae utilizando seqüências delta

Borges, Theyssa Fernanda Barbosa 13 February 2009 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2009. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2010-04-16T11:48:41Z No. of bitstreams: 1 2009_TheyssaFernandaBarbosaBorges.pdf: 1589278 bytes, checksum: 9ed964216329f161a08ac2c9b4fd1e06 (MD5) / Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2010-04-19T20:06:53Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_TheyssaFernandaBarbosaBorges.pdf: 1589278 bytes, checksum: 9ed964216329f161a08ac2c9b4fd1e06 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-04-19T20:06:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_TheyssaFernandaBarbosaBorges.pdf: 1589278 bytes, checksum: 9ed964216329f161a08ac2c9b4fd1e06 (MD5) Previous issue date: 2009-02-13 / Atualmente, o mercado tornou-se favorável para a produção de etanol a partir de biomassa. E o Brasil já tem considerável experiência na produção de bioetanol a partir de cana-de-açúcar, no entanto ela é uma planta sazonal e requer terra de plantio de alta qualidade para seu crescimento. Como substrato alternativo para produção de etanol no Brasil a baixo custo, temos a mandioca. O grupo de biotecnologia molecular da UnB possui uma linha de pesquisa que visa diminuir os custos da produção de etanol a partir de amido de mandioca. Em 1995, Moraes et al. construiu oito linhagens de Saccharomyces cerevisiae capazes de converter amido a etanol, no entanto o vetor utilizado nas construções é epissomal e por não ser estável pode ser facilmente perdido durante o processo industrial onde há o stress ambiental e competição entre as linhagens. Para reverter este quadro, este trabalho visou a construção de um vetor integrativo baseado na seqüência δ do transposon Ty de Saccharomyces cerevisiae no qual foram inseridos os cassetes de expressão de α-amilase de Bacillus subtilis e glicoamilase de Aspergillus awamori, gerando três diferentes vetores: pTA (contendo o cassete da α-amilase), pTGA (contendo o cassete da glicoamilase) e pTAGA (contendo ambos os cassetes). A linhagem semi-industrial MFL e a linhagem industrial JP1 foram transformadas com os vetores construídos. Foram encontrados cinco clones positivos para atividade amilolítica nas transformações da MFL e dois na JP1, a baixa eficiência de seleção de transformantes deve-se ao fato de a marca de seleção não estar inserida no vetor integrativo. As curvas de crescimento dos clones positivos mostraram que não houve alterações no crescimento das linhagens após integração dos vetores e os testes de atividade enzimática mostraram que os clones estão produzindo as enzimas de interesse. Além disso, os testes de estabilidade mitótica mostraram alta estabilidade do vetor nos clones positivos da linhagem JP1, o que torna este sistema de expressão atrativo para produção industrial. ________________________________________________________________________________ ABSTRACT / At present, the market became favorable for ethanol production from biomass. And Brazil already has considerable experience in the bioethanol production from sugar-cane, however it is a seasonal plant and it requires land of planting of high quality for his growth. As alternative substrate for low cost ethanol production in Brazil, we have the cassava. The molecular biotechnology group of UnB has a line of research that aims to reduce the costs of ethanol production from cassava starch . In 1995, Moraes et al. built eight Saccharomyces cerevisiae strains able to convert starch to ethanol, however the vector used in this constructions is epissomal and because of not being stable it can be easily lost during the industrial process where there is the environmental stress and competition between strains. To revert this picture, this work aimed the construction of an integrative vector based on sequence δ of the Saccharomyces cerevisiae transposon Ty in which the cassettes of expression of Bacillus subtilis α-amilase and Aspergillus awamori glicoamilase were inserted, resulting three different vectors: pTA (containing the cassette of α-amilase), pTGA (containing the cassette of the glicoamilase) and pTAGA (containing both cassettes). The semi-industrial strain MFL and the industrial strain JP1 were transformed by these vectors. Five positive clones were found with amylolytic activity in the MFL transformations and two in the JP1, the low selection efficiency of positive clones is due to the fact that the selection mark wasnt inserted in the integrative vector. The positive clones growth curves showed that there were no alterations in the strains growth after vectors integration and the tests of enzymatic activity showed that the clones are producing the enzymes of interest. Moreover, the mitotic stabilitys tests showed high stability of the vector in the positive clones of the strain JP1, which makes this system of expression attractive for industrial production.

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