Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2013. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2013-10-29T13:51:11Z No. of bitstreams: 1 2013_MarinaTagliari.pdf: 6194299 bytes, checksum: acf4157c8673383ce7571bb7098e8789 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-10-30T11:21:20Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_MarinaTagliari.pdf: 6194299 bytes, checksum: acf4157c8673383ce7571bb7098e8789 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-30T11:21:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_MarinaTagliari.pdf: 6194299 bytes, checksum: acf4157c8673383ce7571bb7098e8789 (MD5) / O lepidóptero Condylorrhiza vestigialis é uma das principais pragas desfolhadoras da cultura de álamo no Brasil. Como uma alternativa de controle desta praga, o baculovírus Condylorrhiza vestigialis multiple nucleopolyhedrovirus (CoveMNPV) vem sendo aplicado em plantações de Álamo na região de Cascavel-PR. Devido à ocorrência no campo de lagartas mortas por infecção viral apresentando tegumento liquefeito e intacto, os genes virais catepsina (v-cath) e quitinase (chiA), essenciais para a liquefação do tegumento da lagarta morta por vírus, foram investigados quanto a sua presença ou ausência nos genomas de dois isolados de campo de CoveMNPV. A amplificação destes genes por PCR usando oligonucleotídeos degenerados foi altamente inespecífica em ambas as amostras. Embora os produtos detectados em gel de agarose fossem dos tamanhos esperados, as suas sequências não corresponderam aos genes v-cath e chiA, indicando uma possível ausência desses genes no genoma de CoveMNPV. Bioensaios demonstraram um comportamento semelhante para ambas às amostras de campo, onde à maioria das lagartas mortas apresentou o tegumento íntegro. Os perfis de restrição do DNA viral, gerados pela clivagem com cinco endonucleases de restrição (BamHI, BstEII, EcoRI, HindIII e PstI), foram idênticos para ambos os isolados, tanto para bandas principais como submolares. Para melhor entender as diferenças nos dois isolados de campo de CoveMNPV, seus genomas foram sequenciados utilizando o sequenciador automático FLX 454 (Roche). Após a montagem, anotação e análise, os dois isolados foram comparados por meio da avaliação de polimorfismos, onde o percentual de similaridade entre eles foi de 99.97%. O genoma do CoveMNPV é de 125.767 pares de base (pb) e tem um conteúdo G+C de 42.9%, e contém 138 fases abertas de leitura (ORFs), 9 bros e 4 hrs. Análise filogenética baseada nas sequências deduzidas de aminoácidos do genoma completo e nas sequências nucleotídicas de 11 genes comuns a todos os baculovírus (core genes) classificou o CoveMNPV como espécie irmã do clado AgMNPV/CfDEFMNPV. A ausência dos genes v-cath e chiA foi confirmada no genoma de ambos os isolados, e análise filogenética do locus lef-7/gp64 sugere que este evento tenha ocorrido no ancestral do AgMNPV, CfDEFMNPV e CoveMNPV. Com base na presença de bandas submolares no perfil de restrição do DNA dos isolados de CoveMNPV, clones virais foram purificados por plaque assay a partir de uma das misturas de genótipos de campo. Três destes clones, nomeados CoveMNPV-C2, -C6 e -C8, foram selecionados e amplificados in vivo e in vitro. Análise comparativa dos DNAs não mostrou qualquer alteração entre os perfis de restrição gerados por BstEII, HindIII e PstI, sugerindo a não recuperação do genótipo de campo após a primeira passagem dos clones in vivo. Os clones foram submetidos a ensaios de infectividade in vivo e in vitro, evidenciando diferenças nos seus graus de virulência. Além disto, os OBs dos clones demonstraram diferenças na morfologia do poliedro como revelado por microscopia eletrônica de transmissão. Com base nestes dados, os genes polh e fp25k responsáveis pela formação do poliedro, antes e após a passagem dos clones in vivo, foram amplificados e sequenciados. Nenhuma alteração no gene polh foi detectada, mas o gene fp25k do C8 e C6 apresentou uma mutação frameshift pela inserção de um único nucleotídeo resultando em uma proteína truncada. Após a passagem destes clones in vivo houve uma diminuição na frequência do mutante com relação ao selvagem. Os OBs do C8 apresentaram poucos ou nenhum ODV no seu interior, fenótipo este esperado para um fp25k mutado, e o que também justifica sua menor virulência observada em ensaios in vivo. O clone que se mostrou mais virulento em ensaios in vivo, CoveMNPV-C2, foi similar ao isolado de campo após passagem in vitro, não mostrando qualquer mutação no gene fp25k e produzindo ODVs oclusos. Estas evidências sugerem que este clone é geneticamente mais estável, uma vez que não houve alteração em consequência da passagem em cultura de células, enquanto que os outros clones foram identificados como mutantes de poucos poliedros (FP: few polyhedra). _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The lepidopteran, Condylorrhiza vestigialis is a major defoliating pest of poplar in Brazil. The baculovirus Condylorrhiza vestigialis multiple nucleopolyhedrovirus (CoveMNPV) has been applied in poplar plantations in the region of Cascavel-PR as an alternative to chemical control of this pest. Due to the occurrence of dead caterpillars in the field with either intact or liquefied integument, the presence or absence of virus-encoded cathepsin (v-cath) and chitinase (chiA) genes, essential for the liquefaction of the integument of caterpillars killed by virus, were investigated in the genomes of two CoveMNPV field isolates. Amplification of these genes by PCR using degenerate primers was highly nonspecific in both samples. Although some products detected by agarose gel electrophoresis were of the expected sizes, their sequences did not correspond to the v-cath and chiA genes, indicating a possible lack of these genes in the CoveMNPV genome. Bioassays showed a similar behavior for both field samples, where most killed caterpillars possessed an intact integument. The restriction profiles of the viral DNA, generated by cleavage with five restriction endonucleases (BamHI, BstEII, EcoRI, HindIII and PstI), was identical in the two isolates, for both major and submolar bands. To better understand the differences in the two CoveMNPV field isolates, their genomes were sequenced using the 454 FLX automated sequencer (Roche). Following assembly, annotation and analysis, the two genomes were compared to evaluate polymorphisms, where the percentage similarity between them was 99.97%. The CoveMNPV genome is 125,767 base pairs (bp) and has a G+C content of 42.9%, and contains 138 open reading frames (ORFs), 9 bros and 4 hrs. Phylogenetic analysis based on deduced amino acid sequences of the complete genome and nucleotide sequence of 11 core genes placed CoveMNPV as sister to AgMNPV and CfDEFMNPV. The absence of v-cath and chiA genes was confirmed in the genome of both isolates, and phylogenetic analysis of the lef-7/gp64 locus suggests that this event occurred in the ancestor of AgMNPV, CfDEFMNPV and CoveMNPV. Based on the presence of submolar bands in DNA restriction profiles of CoveMNPV isolates, viral clones were purified by plaque assay from a mixture of field genotypes. Three of these clones, named CoveMNPV-C2, -C6-and -C8, were selected and amplified in vivo and in vitro. Comparative DNA analyses showed no change in the restriction profiles generated by BstEII, HindIII and PstI suggesting the no recovery of field genotype after the first passage of the clones in vivo. The clones were also subjected to in vivo and in vitro infectivity assays, showing differences in their degree of virulence. Furthermore, the OBs of the clones also demonstrated differences in polyhedron morphology as revealed by transmission electron microscopy. Based on these data, the polh and fp25k genes responsible for polyhedron formation, before and after passage of the clones in vivo, were amplified and sequenced. No change in the polh gene was detected, but the fp25k gene of C8 and C6 showed a frameshift mutation by insertion of a single nucleotide resulting in a truncated protein. After the passage of these clones in vivo there was a decrease in the frequency of the mutant relative to the wild-type. The OBs of C8 had few or no ODVs inside, which is the expected phenotype for an fp25k-defective mutant, and also explains its lower observed virulence in in vivo assays. The clone showing greater virulence in in vivo assays, CoveMNPV-C2, was similar to the field isolate after passage in vitro, did not show any mutation in the fp25k gene and produced occluded ODVs. This evidence suggests that this clone is genetically more stable, since it did not change as a result of passage in cell culture, whereas other clones were identified as few polyhedra (FP) mutants.

Os isoprenóides são compostos essenciais a todos os organismos e representam um grupo extremamente amplo estruturalmente e funcionalmente. Em plantas, mais de 30.000 compostos desta classe foram identificados até hoje. Todas as plantas produzem isoprenóides que desempenham papéis essenciais como os carotenóides, as clorofilas e as plastoquinonas (fotossíntese); ubiquinona (respiração); citocininas, brassinosteróides, giberelinas, ácido abscísico (regulação do crescimento e desenvolvimento). No entanto, a maior variedade de isoprenóides é representada pelos metabólitos secundários (óleos essenciais como eucaliptol, cineol, citronelal). Os isoprenóides possuem papel marcante nas relações da planta com o ambiente onde estão inseridas, já que medeiam as relações planta-inseto, planta-microorganismo e planta-planta. Devido ao valor comercial dos compostos isoprenóides, há grande interesse em produzi-los por bioengenharia em bactérias ou em plantas e o entendimento do papel dos genes e proteínas codificadas na rota de síntese dessas unidades básicas de formação de terpenóides é extremamente importante. Nesse trabalho, nós recuperamos, a partir da seleção dos plasmídios de clonagem pSPORT1 (Invitrogen) purificados do Projeto “Genolyptus: Rede Brasileira de Pesquisa do Genoma de Eucalyptus”, os clones selecionados e potencialmente codificadores de 1-desoxi-D-xilulose-5-fosfato redutoisomerase (DXR) e de outras enzimas atuantes nas rotas de síntese de isoprenóides, como 1-desoxi-D-xilulose 5-fosfato sintase (DXS), mevalonato difosfato descarboxilase (MDC), isopentenil difosfato isomerase 1 (IPPI1) e isopentenil difosfato isomerase 2 (IPPI2). Nos estoques de plasmídios do projeto Genolyptus, foi possível encontrar as sequências completas dos genes dxr, ippi1 e ippi2. Os genes foram analisados in silico e a sequência de ippi1 foi utilizada na modelagem molecular e dinâmica molecular para avaliação de características peculiares do folding protéico desse tipo de proteína eucariótica. Os genes foram clonados em vetores pGEX-4T (GE Healthcare) e heterologamente expressos em Escherichia coli. Foi realizada, também, uma análise transcricional comparativa dos genes selecionados pela técnica de microarranjos. / Isoprenoids are essential to all organisms and are the most structurally and functionally diverse group of plant metabolites. In plants, more than 30,000 compounds of this class were identified to date. All plants produce isoprenoids that can play essential roles as carotenoids, chlorophylls and plastoquinone (photosynthesis); ubiquinone (respiration); regulation of growth and development (cytokinins, brassinosteroids, gibberellins, abscisic acid). However, the majority of isoprenoids is represented by secondary metabolites (essential oils like eucaliptol, cineol, citronelal). Isoprenoids have important roles in the relationships between plants and the environment, since they can mediate plant-insect, plant-microorganism and plant-plant interactions, as well as participate in abiotic stress responses. Due to the high value of isoprenoid compounds, there is great interest in producing them by bioengineering in bacteria or plants. Understanding the role of genes and proteins related to the biosynthetic pathway of isoprenoids is extremely important. In this work, we retrieved, from the collection of cloning plasmids pSPORT1 (Invitrogen) generated in the “Genolyptus Project: The Brazilian Research Network on the Eucalytpus Genome”, selected clones that potentially codified the 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase (DXR) and other enzymes from the isoprenoid biosynthetic pathway including 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase (DXS), mevalonate disphosphate decarboxilase (MDC), isopentenil disphosphate isomerase 1 (IPPI1) and isopentenil disphosphate isomerase 2 (IPPI2). Complete sequences of the dxr, ippi1 and ippi2 genes were succesfully recovered from the Genolyptus stocks. The genes were analyzed in silico and the ippi1 sequence was used in studies of molecular modeling and molecular dynamics in order to evaluate specific folding characteristics of this kind of eukaryotic IPPI. The genes were cloned into pGEX-4T vectors (GE Healthcare) and expressed in Escherichia coli. Also, the transcriptional analysis of the selected genes was performed by microarray analysis.

Orientador: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-03T16:10:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bogo_Eliane_M.pdf: 6070806 bytes, checksum: af60bcf86017001374916b61216b223b (MD5) Previous issue date: 2003 / Mestrado

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-12-19Bitstream added on 2014-06-13T18:41:11Z : No. of bitstreams: 1 silva_gp_dr_rcla.pdf: 1260750 bytes, checksum: f19ff28f2ada22b250d02543a6ad96ca (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Hialuronidases pertencem a um grupo de enzimas hidrolíticas, as quais degradam o ácido hialurônico, um polissacarídeo de alta massa molecular, encontrado em todos os tecidos de mamíferos e fluídos corpóreos. O ácido hialurônico é um componente da matriz extracelular de vertebrados, que preenche os espaços entre células e fibras, e age como lubrificante, bem como uma barreira à penetração de partículas estranhas. Os níveis de ácido hialurônico são marcadamente aumentados durante a embriogênese, inflamação, transformação maligna e em qualquer lugar que seja requerido a rápida substituição de tecido e remodelamento. Os defeitos no metabolismo do ácido hialurônico parecem relacionar-se a várias doenças sugerindo que o seu nível seja altamente controlado. No entanto, surpreendentemente, o estudo de enzimas envolvidas na síntese e degradação do ácido hialurônico tem sido negligenciado. Em venenos de insetos Hymenoptera (abelhas, formigas e vespas), a hialuronidase é uma enzima comum e um dos mais importantes alérgenos, sendo também, o único em potencial, que pode promover reatividade-cruzada entre os venenos de abelhas e vespas, como também entre os de diferentes gêneros e espécies de vespídeos, levando à produção de reações alérgicas mediadas por IgE, umas das maiores causas de anafilaxia em pacientes alérgicos ao veneno. Neste trabalho, através da metodologia de RACE-PCR, foi determinada e caracterizada, a seqüência completa de cDNA do alérgeno - hialuronidase - do veneno da vespa urbana Polybia paulista, a qual, é bastante agressiva e abundante no Estado de São Paulo, sendo responsável por muitos acidentes de importância médica, devido ao seu veneno que, assim como em outros vespídeos, apresenta três conhecidos alérgenos - hialuronidase, fosfolipase e antígeno 5. O cDNA foi obtido a partir do mRNA extraído dos abdomens dos insetos e amplificado por iniciadores gene-específicos.... / Hyaluronidases are a group of hydrolytic enzymes which degrade Hyaluronic acid (HA), the most abundant glycocaminoglycan of vertebrate extracellular space. HA is a high molecular weight polysaccharide found in virtually all mammalian tissues and body fluids, where it fills the space between cells and fibers and acts as a lubrificant as well as a barrier to penetration by foreign particles. Hyaluronic acid levels are markedly increased during the embryogenesis, inflammation, malignant transformation and whenever fast tissue turnover and remodeling is required. Defects in HA metabolism appear to be related to various diseases suggesting that the level of HA must be tightly controlled. Surprisingly, the study of the enzymes involved in HA synthesis and degradation has been greatly neglected. In venoms of Hymenoptera insects (bees, ants and wasps), the hyaluronidase is a common enzyme and one of the most important allergen, being potentially the unique that are able to promote immunological cross-reactivity between venoms from bees and wasps, and also among vespid venoms from different genus and species, producing allergic reactions IgE-mediated, one of the main causes of anaphylaxis in venom-allergic patients. In this work, by the RACE-PCR methodology, the hyaluronidase cDNA complete sequence from the urban wasp Polybia paulista was determined and characterized. This wasp is very aggressive and abundant in the São Paulo state, being responsible for many accidents of medical importance due its venom, which contains, like other vespids, three well known allergens- hyaluronidase, phospholipase and antigen 5. The cDNA was obtained from mRNA extracted from insect abdomens and amplified by gene-specific primers. At first, two consecutive sequences of about 800 and 600 bp were obtained, purified, cloned and sequenced. After, the hyaluronidase cDNA complete sequence of 991pb was obtained, purified and directly sequenced The resulting data were analyzed .

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:53Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-06-21Bitstream added on 2014-06-13T19:43:43Z : No. of bitstreams: 1 000737473.pdf: 4424353 bytes, checksum: 83d4de348d8c1081e547b22ff3eab4d2 (MD5) / Lipoxigenases são enzimas que catalizam a oxido-redução de ácidos graxos poliinsaturados que contém em sua estrutura um ou mais grupos cis 1,4- pentadieno, produzindo hidroperóxidos através da incorporação de um oxigênio molecular. Durante anos a presença de lipoxigenase foi considerada exclusivamente eucariótica, presente em mamíferos, plantas, pequenos invertebrados marinhos e fungos. A função biológica dessas enzimas tem sido amplamente estudada. Porém, pouco tem sido descrito em organismos procariotos. O presente estudo teve por objetivos clonar e caracterizar bioquimicamente duas lipoxigenases de Shewanella woodyi ATCC 51908, caracterizar os produtos de reação destas enzimas e realizar um estudo filogenético e estrutural, comparando-as com lipoxigenases de eucariotos e procariotos. Parâmetros enzimáticos dessas enzimas foram descritos. A influência do pH e temperatura na atividade catalítica foram estudadas. Também foi determinado a preferência por substrato e o efeito da adição de vários íons divalentes que podem interferir na atividade catalítica. A enzima SWPrecLox de S. woodyi apresentou temperatura e pH ótimos de 31ºC e 8,0, respectivamente. Demonstrou afinidade por ácido linoleico, com uma Km de 0,47 mM e Vmax de 2,78 mmols min-1 mg-1. A enzima SWAracLOX teve ácido araquidônico como substrato preferente, com valores de Km 0,20 mM e Vmax 1,6 mmols min-1 mg-1. Atividade ótima foi alcançada com 27ºC e pH 7,0. A partir das estruturas moleculares das lipoxigenases de Plexaura homomalla e Pseudomonas aeruginosa, foram criados hipotéticos modelos estruturais de SWPrecLOX e SWAracLOX. / Lipoxygenases are enzymes that catalyze the oxido-reduction of polyunsaturated fatty acids in their structure that contains one or more groups cis 1,4- pentadiene, producing hydroperoxides from the incorporation of molecular oxygen. For years, the presence of lipoxygenases was considered a eukaryotic feature, present in mammals, plants, small marine invertebrates and fungi. The present study aimed to clone and characterize biochemically two lipoxygenases from Shewanella woodyi ATCC 51908, characterize the reaction products of these enzymes and conduct a phylogenetic and structural analysis, comparing them with eukaryotes and prokaryotes lipoxygenases. The biological function of these lipoxygenases has been widely studied. However, only few have been described in prokaryotes. Enzymatic parameters of these enzymes have been described. The influence of the pH and the temperature on the catalytic activity has been studied. Also has been studied the substrate preference and the effect of the addition of several divalent cations that can enhance or eliminate the catalytic activity. The enzyme SWPrecLox of S. woodyi showed temperature and pH optimum were 31 ºC and 8,0, respectively. Demonstrated substrate affinity for linoleic acid, with Km 0,47 mM and Vmax 2,78 mmols min-1 mg-1. The enzyme SWAracLox has arachidonic acid as preferred substrate, with Km 0,20 mM and Vmax 1,6 mmols min-1 mg-1. Optimum activity was reached at 27 ºC and pH 7,0. From the molecular structures of lipoxygenase Plexaura homomalla and Pseudomonas aeruginosa, were created a hypothetical structural model of the SWPrecLox and SWAracLox.

Orientador: Elenice Deffune / Banca: Wirla Maria da Silva Cunha Tamashiro / Banca: Wagner José Fávoro / Resumo: Anticorpos monoclonais (mAbs) são ferramentas-chave na investigação de fenômenos biológicos e uma promissora alternativa para o tratamento de muitas doenças, em especial os tumores. A cadeia produtiva de mAbs apresenta pontos cruciais para o desenvolvimento de um produto de qualidade que justifique os altos custos de produção. O procedimento de clonagem celular é a etapa de produção que garante a monoclonalidade das células produtoras, assegurando a especificidade do mAb. Desde os anos 80 existem tentativas de otimização e automação deste procedimento visando a garantia da monoclonalidade e aumento na eficiência de clonagem. A captura celular sob observação direta ao microscópio pode ser considerada a única metodologia de clonagem celular que garante 100% de crescimento monoclonal. Neste trabalho avaliamos indicadores de eficiência de clonagem, tempo de execução e custos de uma metodologia de clonagem celular por micromanipulação em comparação com a metodologia de diluição limitante. Hibridomas murinos secretores de mAbs de diversas especificidades foram clonados em paralelo por ambas as técnicas. Não houve diferença no tempo de execução das metodologias embora a observação dos clones da micromanipulação seja de 4 a 6 vezes mais rápida. A produção de clones por micromanipulação é 4 vezes superior à diluição limitante com redução de 60% no consumo de meio de cultura, o que justifica os custos da metodologia. Concluímos que a clonagem celular por micromanipulação é uma técnica precisa e que garante 100% de crescimento monoclonal podendo vir a substituir a diluição limitante. Esta garantia elimina testes de comprovação da monoclonalidade e reduz o tempo de cultura necessário para obtenção de mAbs. / Abstract: Monoclonal antibodies (mAbs) are outstanding tools for investigating biological phenomena and a promising alternative to treat several diseases, specially tumors. Production of mAbs has settled critical milestones at the production chain which justifies high development costs. Cell cloning procedure is the milestone that guarantees monoclonality and assures antibody specificity. Since the 80's there have been attempts to optimize and automate this procedure aiming to guarantee monoclonality and enhance cloning efficiency. Celular capture under direct microscope observation is the only method considered to guarantee 100% monoclonal growth. On this work we evaluated cloning efficiency, working time and costs of a micromanipulating cloning technique compared with gold-standard limiting dilution. Murine secretor hybridomas of various specificity were cloned by both techniques in parallel. No differences were observed at both working times although observation of micromanipulated clones was 4 to 6 times faster. Cloning efficiency of micromanipulation cloning was 4 times higher than limiting dilution with 60% reduction on media consume what justifies methodology costs. Cell cloning by micromanipulation is a precise procedure that guarantees 100% monoclonal growth and could substitute limiting dilution. This guarantee eliminates additional tests to assure monoclonality and reduces culture working time on mAbs production. / Mestre

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2016. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2016-06-07T16:14:22Z No. of bitstreams: 1 2016_FelipeManoelCostaCaixeta.pdf: 989887 bytes, checksum: bf7e6c590aca3cc27224da7baf564dd3 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2016-07-28T11:44:18Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_FelipeManoelCostaCaixeta.pdf: 989887 bytes, checksum: bf7e6c590aca3cc27224da7baf564dd3 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-28T11:44:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_FelipeManoelCostaCaixeta.pdf: 989887 bytes, checksum: bf7e6c590aca3cc27224da7baf564dd3 (MD5) / O presente estudo teve o objetivo de avaliar o efeito do bloqueio meiótico utilizando inibidores da fosfodiesterase do tipo 3A (PDE 3A) na produção de embriões clones. Para tanto, foram realizados dois experimentos utilizando dois inibidores da retomada da meiose: cilostamida, um inibidor específico da Fosfodiesterase do tipo 3 (PDE3A), e o Peptídeo Natriurético do tipo C (NPPC), um sinalizador para liberação de guanilato ciclase (cGMP) que bloqueia atividade da PDE3A. Ovócitos provenientes de ovários de abatedouro foram divididos em dois grupos para cada experimento: Controle (maturação por 20 horas) e Pré-Maturados (PM) por 6 horas com 5 μM de cilostamida ou 100 nM de NPPC e, posteriormente maturados por 20 horas. Os ovócitos foram avaliados quanto à cinética de maturação nuclear e desenvolvimento embrionário na produção in vitro de embriões (PIVE) e na clonagem por TNCS e, número total de células. Para a avaliação da Transferência Nuclear com Células Somáticas (TNCS) em cada tratamento, foi adicionado um grupo controle que foi ativado partenogeneticamente (PA). Os resultados foram avaliados pelo teste de Chi-quadrado e Kruskal-Wallis com P<0.05 considerado como significativo. No primeiro experimento, em que a PM foi realizado com 5μM de cilostamida, aproximadamente 87,8% dos ovócitos submetidos à Pré- maturação se mantiveram em estágio de Vesícula Germinativa (VG) após 6 horas de PM, confirmando o bloqueio meiótico. Quanto ao desenvolvimento embrionário na PIVE, não houve diferença (P>0,05) entre os grupos controle e PM quanto à taxa de clivagem em D2 (78,2% e 76,9%) e Blastocisto em D7 (35,5% e 29,3%). No desenvolvimento embrionário após a TNCS, a PM não afetou a taxa de clivagem em D2 dos grupos controle e PM respectivamente (66% e 51,9%), mas causou uma redução (P<0,05) na taxa de blastocisto em D7 (7,4% e 30,2%, respectivamente). No segundo experimento, foi utilizado NPPC para a PM dos ovócitos, sendo que após 6 horas de PM 84,9% estavam em estágio de VG. Quanto ao desenvolvimento embrionário na PIVE, os grupos controle e PM apresentaram taxa de clivagem em D2 (76,4% e 77,8%) e de blastocisto em D7 (48,3% e 45,6%) semelhantes (P>0,05). Na clonagem por TNCS, não houve diferença (P>0,05) na taxa de clivagem (69,2% e 68,4%) e de blastocisto (24,4% e 21,5%) entre o PM e controle. Os embriões clones e PA dos grupos PM e controle não diferiram quando ao número total de células (P>0,05). Concluise que a PM por 6 horas com 100 nM de NPPC é viável para a produção de embriões clones sem efeito deletério na qualidade e nas taxas de produção. _____________________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / This study aimed to evaluate the effect of meiotic arrest using phosphodiesterase type 3A (PDE 3A) inhibitors in the production of clones embryos. Two experiments were performed using two inhibitors of meiotic resumption: cilostamide, a specific inhibitor of phosphodiesterase type 3 (PDE3A), and natriuretic peptide type C (NPPC), a peptide that induces the production of guanylate cyclase (cGMP ) that blocks the activity of PDE3A. Oocytes obtained from slaughterhouse ovaries were divided into two groups for each experiment: control (maturation for 20 hours) and Pre-Maturarion (PM) for 6 hours with 5μM of cilostamide or 100 nM of NPPC and then maturation for 20 hours. The oocytes were evaluated for nuclear maturation, embryonic development after in vitro embryo production (IVP),and after SCNT, and total cells number. For SCNT evaluation in each treatment a control group that was activated parthenogenetically (PA) was added. The results were evaluated by Chi-square and Kruskal-Wallis test with P <0.05 considered significant. In the first experiment, where the PM was carried out with 5μM of cilostamide, approximately 87.8% of the oocytes that have undergone PM remained at germinal vesicle stage (GV) after 6 hours of PM, confirming the meiotic block. Embryo development in IVP was similar (P> 0.05) between control and PM, either for cleavage rate on D2 (78.2% and 76.9%) or blastocyst rate on D7 (35, 5% to 29.3%). After SCTN, cleavage rate on D2 was also similar (P>0.05) between control and PM (66% and 51.9%) however, blastocyst rate on D7, was much lower (P<0.05) in PM than on control group (7.4% and 30.2%). In the second experiment, NPPC was used for 6 hours of PM. After PM approximately 84.9% of the oocytes remained at VG stage. Results of IVP showed no difference between control and PM on cleavage (76.4% and 77.8%) and blastocyst rates (48.3% and 45.6%). Similarly, no diferences between PM and control groups were observed for cleavage (69.2% and 68.4%) and blastocyst (24.4% and 21.5%) rates. SCNT and PA embryos from control or PM oocytes showed no diferences in the total cell number. It can be concluded that PM for 6 hours with 100nM NPPC is feasible for embryos cloned production without deleterious effect on the outcome and embryo.

O carrapato Boophilus microplus, um ectoparasita hematófago, está presente em áreas tropicais e subtropicais no mundo todo. Atualmente, seu controle é baseado no uso de pesticidas. Para auxiliar no desenvolvimento de novas vacinas para este parasita, é importante compreender melhor sua fisiologia. A coronina, uma proteína de citoesqueleto, pertence à Família das Proteínas G. Está localizada no córtex celular e apresenta várias funções, desde locomoção celular, fagocitose, macropinocitose a ligação de microtúbulos, orientação da polaridade de embriões, citocinese, polimerização dos filamentos de actina e regulação da organização do citoesqueleto. No presente trabalho, o cDNA de uma proteína semelhante a coronina foi isolado de uma biblioteca de cDNA de glândulas salivares de partenóginas por triagem imunológica. A análise de seqüência mostrou que o clone SG5 possui identidade entre 15 e 17% com seqüências de proteínas semelhantes a coronina de outras espécies, como as de humanos e de camundongo, e possui um tamanho de 1.938 pb, com uma suposta ORF de 960 nucleotídeos. Na análise da expressão do gene, verificouse que o mRNA deste gene está presente em ovos e larvas de 15 dias e glândulas salivares, intestino e ovário de teleógina e partenógina; em corpo gorduroso sua presença não foi detectada. Um estudo mais detalhado do papel da proteína semelhante a coronina nas glândulas salivares de B. microplus pode auxiliar em uma melhor compreensão da fisiologia deste parasita.

O Echinococcus granulosus é um platelminto parasita da classe Cestoda, que tem, como hospedeiros definitivos, os canídeos, e, como hospedeiros intermediários mais comuns, ungulados domésticos e o homem. Este parasito é o agente etiológico da hidatidose cística, zoonose hiperendêmica no Cone Sul da América do Sul, incluindo o sul do Brasil. Para o estabelecimento e manutenção do cisto hidático por longos períodos de tempo (infecção crônica), o parasito secreta e expõe ao seu hospedeiro numerosas proteínas, que podem apresentar tanto atividade imunomoduladora, como estar relacionadas a atividades fisiológicas do parasito. As proteínas 14-3-3 constituem uma família altamente conservada de moléculas reguladoras eucarióticas, que são capazes de interagir com diferentes proteínas ligantes em diversos contextos celulares, regulando funções biológicas complexas. Em E. granulosus, foram identificadas cinco proteínas 14-3-3, sendo três isoformas ζ e duas isoformas ε. Essas proteínas podem estar envolvidas em interações parasito-hospedeiro que propiciam o estabelecimento e o desenvolvimento da forma larval patogênica (metacestódeo). Para a futura caracterização funcional da proteína 14-3-3e1 de E. granulousus (Eg14-3-3ε1), já detectada em componentes do metacestódeo, a sua sequência codificadora foi expressada em Escherichia coli. A clonagem foi realizada em dois vetores plasmidiais distintos (pGEX-TEV e pET-26b), para permitir a expressão em E. coli da proteína Eg14-3-3ε1 recombinante no citoplasma, em fusão com a GST, e no espaço periplásmatico, com cauda de histidina, respectivamente. A solubilização da Eg14-3-3ε1 em fusão com a GST foi obtida com 0,5% de sarcosil, mas no entanto não foi possível a sua purificação. A proteína Eg14-3-3ε1 com cauda de histidina foi obtida por extração da fração periplasmática seguida da purificação por cromatografia de afinidade, tendo sido obtido um rendimento final de 0,5 mg/l de cultura. A proteína Eg14-3-3ε1 recombinante purificada será futuramente utilizada em ensaios funcionais, buscando inicialmente a identificação de seus ligantes proteicos dentre o repertório de proteínas do parasito e do hospedeiro, no contexto da infecção crônica. / Echinococcus granulosus is a parasitc platyhelminth of the Cestoda class, wich has, canids as definitive hosts, domestic ungulates and humans as intermediate hosts. This parasite is the causative agent of cystic hydatid disease, a hyperendemic zoonosis in the Southern Cone of South America, including Southern Brazil. In order to the establishment and maintenance of hydatid cyst for a long period of time, the parasite secrets and exposes to its host numerous proteins, which may have immunomodulatory activity as well to be related to physiological activities of the parasite. The 14-3-3 proteins are a family of highly conserved eukaryotic regulatory molecules that are able to interact with different partner proteins in different cellular contexts, regulating complex biological functions. In E. granulosus five 14-3-3 proteins have been identified, three ζ isoform and two ε isoform. These proteins may be involved in host-parasite interactions that favor the establishment and growth of the pathogenic larval form (metacestode). For future functional characterization of the 14-3-3ε1 protein from E. granulousus (Eg14-3-3ε1) previously detected in metacestode components, its coding sequence was expressed in Escherichia coli. The cloning was done into two different plasmid vectors (pGEX-TEV and pET-26b), to produce recombinant Eg14-3-3ε1 protein in E. coli, in the cytoplasm, in fusion with GST, and periplasmatic with histidine tail, respectively. Solubilization of Eg14-3-3ε1 fused with GST was achieved with 0.5% sarcosil, yet it was not possible to purify it. The Eg14-3-3ε1 protein with histidine tail was obtained by extracting the periplasmic fraction from E. coli cultures, followed of purification by affinity chromatography, yielding 0.5 mg/l. The recombinant Eg14-3-3ε1 protein will be used in functional assays, initially aiming at the identification of protein ligands from the repertoire of proteins from the parasite and from host in the context of chronic infection.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-09-15T17:47:24Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 315529 bytes, checksum: a7356a6cb2109a90e8e46c6fece9a4dd (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-15T17:47:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 315529 bytes, checksum: a7356a6cb2109a90e8e46c6fece9a4dd (MD5) Previous issue date: 1999-08-06 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A família Geminiviridae é constituída por vírus de plantas que possuem genomas de DNA circular de fita simples. Atualmente, está dividida em três gêneros, Mastrevirus, Curtovirus e Begomovirus, de acordo com o inseto transmissor, o tipo de hospedeiro e a organização do genoma, possuindo um ou dois componentes. A presença de geminivírus em plantas de Sida rhombifolia com sintomas de infecção viral foi detectada, em nível molecular, por PCR e “Southern blot”. O vírus proveniente de uma das amostras de Sida rhombifolia foi propagado em Nicotiana benthamiana via biolística, induzindo o sintoma de mosqueado. O componente A desse vírus foi clonado, seqüenciado e submetido à análise de comparação de seqüências, a qual indicou tratar-se de um novo Begomovirus. Pela análise filogenética, esse componente foi classificado como pertencente a um Begomovirus do hemisfério ocidental, que foi denominado vírus do mosqueado de Sida, SMoV. Entretanto, o componente B cognato desse vírus não foi encontrado. Uma segunda amostra de Sida rhombifolia com sintoma de mosaico foi utilizada para clonagem direta do componente A, por meio de amplificação do componente genômico completo, utilizando-se iniciadores específicos. O componente A foi clonado e seqüenciado, e a análise da seqüência indicou a classificação como Begomovirus do hemisfério ocidental, sendo denominado vírus do mosaico amarelo de Sida, SYMV. Ambos os vírus (SMoV-A e SYMV-A) foram inoculados em plantas indicadoras por biolística, mas nenhuma planta apresentou sintoma de infecção viral. Tais resultados foram coerentes com a classificação filogenética dos dois novos Begomovirus, indicando que, provavelmente, SMoV e SYMV possuem dois componentes, embora o componente B de SYMV e SMoV não tenham sido detectado em amostras de Sida com sintomas. Ensaios de infecção mista evidenciaram que SMoV-A é funcional e se move sistemicamente em Nicotiana benthamiana na presença de proteínas de movimento heterólogas, fornecidas in trans. SMoV-A foi detectado por “Southern blot” em folhas apicais de N. benthamiana infectada com TGMV-A, TGMV-B e SMoV-A. A identificação de pelo menos dois novos Begomovirus em Sida rhombifolia indicou que esses vírus são facilmente adaptados a essas plantas. A ocorrência de ambos os vírus em uma mesma planta pode facilitar a recombinação interespécie, contribuindo para o processo evolutivo dessa família de fitovírus. / The Geminiviridae family comprises a group of plant viruses that are packaged as single-stranded circular DNA in virions. The species of this family fall into three genus, Mastrevirus, Curtovirus and Begomovirus, based on the insect vector, host range and genome organization which can be either monopartite or bipartite. We have detected geminivirus in Sida rhombifolia plants by PCR and Southern Blots. The virus from one of the Sida samples has been successfully propagated in Nicothiana benthamiana using a biolistic infection assay and developed a mottle symptom phenotype in these plants. I have cloned and sequenced the A-component of the Sida rhombifolia mottle geminivirus and showed by sequence comparison analysis that it is a new species of Begomovirus from West Hemisphere. The taxonomy of the new virus was confirmed by phylogenetic analysis and the virus was named SMoV, Sida mottle virus. However, attempts to clone its B component have not been succeeded. A second sample of DNA from infected Sida rhombifolia showing mosaic symptoms was directly used to amplify the full genome of the virus with specific primers, which were designed from partial sequencing analysis. Sequence comparison and phylogenetic analyses of the cloned viral component classified the Sida rhombifolia mosaic geminivirus as new specie of the Begomovirus genus, also from the West Hemisphere, named SYMV, Sida yellow mosaivc virus. The cloned components of the viruses SMoV and SYMV failed to infect and develop symptoms in several plants, including S. rhombifolia and N. benthamiana. These results are consistent with the taxonomic classification of the new viruses, indicating that most likely these viruses are bipartite, even though previous results have failed to detect a SYMV B-component in infected Sida. Multiple infection assays demonstrated that the cloned SMoV-A component is infectious, if compatible movement functions are provided in trans. In fact, SMoV-A DNA was detected in young non-inoculated leaves of N. benthamiana, which were infected with the combination of TGMV-A, TGMV-B and SMoV-A. The detection of at least two new Sida rhombifolia-infecting geminivirus indicated that these viruses are well adapted to this host. Therefore, the possible co-existence of the two viruses in the same host may facilitate interspecies recombination, which has been proposed to contribute majority to the evolution and emergence of new species of geminivirus. / Não foi localizado o cpf do autor.