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Ultilização de culturas celulares para a respiração de picobirnavirus

Vicentini, Fernando 30 October 1998 (has links)
Orientador: Maria Silvia Viccari Gatti / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-24T17:02:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vicentini_Fernando_M.pdf: 5263894 bytes, checksum: b013279a48870c4e8c1b6d4021cd6fb8 (MD5) Previous issue date: 1998 / Resumo: O picobirnavírus (PBV) foi descrito por H.G. Pereira em amostras fecais de humanos no Brasil. Posteriormente, outros pesquisadores também detectaram o ácido nucléico dos PBV por eletroforese em gel de poliacrilamida (EGPA), que foi caracterizado como RNAds (fita dupla) e bissegmentado. Através de microscopia eletrônica foram detectadas partículas virais com aproximadamente 35 nm, que cossedimentavam em gradientes de cloreto de césio com RNAds dos PBV, em uma densidade de 1,38-1,40g/ml. Com relação a sua patogenicidade, alguns autores têm tentado associa-los a quadros de gastroenterites. Entre outras características, conhece-se pouco sobre a constituição protéica do vírus e seu mecanismo de replicação. Essa falta de informações se deve em parte à dificuldade em purificar esses vírus de material fecal, onde os mesmos se apresentam em baixas concentrações. Nosso trabalho objetivou adaptar esse vírus para cultivo em sistemas de culturas celulares. Para tal, foram utilizadas culturas primárias de rim de rato e de camundongo, assim como as linhagens estabelecidas em rim de rato sómios LLC-M¿K IND. 2¿ e MA104, e as linhagens intestinais humanas HT-29 e 'CA¿¿CO IND. 2¿. Na tentativa de promover a ativação viral, as amostras fecais positivas para PBV foram tratadas com as proteases tripsina e pancreatina para a infecção em células... Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: The picobirnavirus (PBV) was described by H.G. Pereira from human fecal samples in Brazil. Later, other researchers also detected the nucleic acid of PBV by polyacrylamide gel eletrophoresis (PAGE). The nucleic acid was identified as RNAds (double-stranded) and bisegmented. Electron microscopy showed viral particles of approximately 35nm which co-sedimented in cesium chloride gradients together with the RNAds, at a density of 1.38-1.40g/ml. In relation to its pathogenicity, some authors have tried to associate this virus with gastroenteritis. Among other characteristics, very little is know about its protein composition and its replication mechanism. This lack of information is due in part to the difficulty in purifying this virus from fecal material, where it appears in very low concentrations. Our work was focused on adapting this virus to growth in cell culture systems. For this study, primary cultures of rat and mouse kidney cells were used , as well as established strains of monkey LLC-M¿K IND. 2¿ and MA104, human intestine HT-29 and 'CA¿¿CO IND. 2¿ cells. To try to promote viral activation, PBV positive fecal samples were treated with proteases (trypsin and pancreatin). Periodic shaking, centrifugation or ¿roller¿ culture systems were used to promote cell-virus attachment. Of the 51 murine and swine fecal sample used, four (3 murine and 1 swine) were positive for PBV nucleic acid... Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Mestrado / Microbiologia / Mestre em Ciências Biológicas
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Caracterização de partículas virais e RNA de dupla fita isolados do fungo entomopatogênico Matarhizium anisopliae / Characterization of viral particles and doublestranded RNA isolated from entomop a thogenic fungus Metarhizium anisopliae

Giménez-Pecci, María de la Paz January 1996 (has links)
Micovírus são freqüentemente encontrados infectando vários gêneros de fungos. Em alguns sistemas, bem caracterizados, foi demonstrada a interferência de genes virais com o fenótipo do fungo, sendo o caso melhor documentado a hipovirulência em fungos fitopatogênicos. Em nosso laboratório, seis linhagens de Metarhizium anisopliae, um fungo entomopatogênico usado no controle biológico de pragas importantes em agricultura, foram analisadas para a presença de dsRNA. Todas as linhagens foram isoladas de insetos e três apresentam dsRNA viral (linhagens Al, MS e RJ). Nosso objetivo é analisar a possível interferência dos micovírus (Ma V s) com a entomopatogenicidade de M anisopliae. Neste trabalho foram caracterizados três MaVs através de purificação em gradientes de CsCl, microscopia eletrônica, análise de proteínas, padrão eletroforético dos componentes dsRNA, sorologia e análise da homologia entre os componentes dsRNA individuais de um mesmo Ma V e entre os componentes dsRNA dos diferentes MaVs, utilizando sondas de cDNA. As partículas virais dos MaVs RJ, AI e MS são isométricas, com diâmetro médio de 3S nm e são separados em várias bandas em gradientes de CsCI nas densidades de flotação de 1,32 a 1,41 (MaV-RJ); 1,3S a 1,45 (MaV-Al) e 1,40 a 1,43 g/ml (MaV-MS). Espectros de absorção típicos de nucleoproteínas foram observados em todas estas bandas e nas preparações de micovírus. Após a dissociação das partículas virais foi observada a presença de componentes dsRNA com o mesmo perfil eletroforético obtido em extratos de micélio. Foi demonstrado que o ácido nucléico viral é composto por dsRNA, pela digestão enzimática específica e purificação em colunas de celulose CFll. MaV-RJ apresenta, pelo menos, treze componentes dsRNA, variando de 3,1 a 0,5 kb e um polipeptídeo majoritário do capsídeo de 46 kDa. Ma V-AI apresenta pelo menos, cinco componentes dsRNA variando de 4,1 a 1 kb e um polipeptldeo majoritário do capsídeo de 80 kDa. Ma V -MS é muito semelhante a Ma V -AI em relação ao componente dsRNA de 4,1 kb e polipeptídeo majoritário, entretanto apresenta um número menor de componentes dsRNA pequenos. Durante o desenvolvimento do trabalho, Ma V-AI e MaV-MS apresentaram um padrão instável de componentes dsRNA, progressivamente mais complexo em relação aos componentes dsRNA pequenos. Foi caracterizado um mutante estável (linhagem RJd), derivado espontaneamente da linhagem RJ que não apresenta os componentes dsRNA de maior peso molecular, tendo apenas os nove componentes menores presentes na linhagem parental RJ. Esta linhagem derivada, RJd, apresenta morfologia da colônia alterada, contudo não temos evidências experimentais para associar diretamente estas alterações com o padrão alterado de componentes dsRNA. Anticorpos policlonais foram produzidos contra os três Ma V s e mostramos que estes Ma V s são sorologicamente relacionados. Em testes de dupla difusão MaV-RJ reage com antisoro contra MaV-AL e MaV-M5 indicando relações sorológicas. Em Western, todos os polipeptídeos dos capsídeos dos três Ma V s, reagem com os antisoros contra MaV-Al e MaV-M5. Sondas de cDNA do componente dsRNA de 4,1 kb de MaV-Al hibridizam com os componentes de 4,1 kb de MaV-M5 e com os componentes dsRNA S2, M3 e Ml de MaV-RJ. Quando a sonda de cDNA é preparada a partir do componente dsRNA de 4,1 kb de MaV-M5 também ocorre hibridização com o componente dsRNA de mesmo tamanho de MaV-AL ~com o componente dsRNA S2 de MaV-RJ. Se conclui que os três micovírus são relacionados entre si em relação a pelo menos um componente dsRNA. Além disso, a análise de hibridização mostrou que existe homologia entre todos os componentes de Ma V-RJ mas sondas a partir do componente dsRNA de 4,1 kb de MaV-Al não hibridizam com nenhum outro componente da mesma linhagem. Nossas tentativas de transferir micovírus ou dsRNA a linhagens "livres de micovírus" utilizando biobalística falharam. / Micovirus are frequently found infecting severa! genus of fungi in nature. In some, well characterised systems, the interference of vira! genes with the fungai phenotype was demonstrated, as is the case of hypovirulence mediated by viral dsRNA in phytopathogenic fungi. In our laboratory, six strains of Metarhizium anisopliae, an entomopathogenic fungus used in biological control of agronomic important pests, were screened for the presence of dsRNA. The strains analysed were isolated from insects and three have vira! dsRNA (strains AI, M5 and RJ). We aim to access the possibility of interference o f micovirus (Ma V s) with the entomopathogenicity o f M anisopliae. In this work the Ma V s were characterised through purification by CsCl gradients, eletron microscopy, protein analysis, dsRNA pattem, serology and homology between individual dsRNA components within the same Ma V and among the Ma V s. The Ma V s parti eles are isometric, with an average diameter o f ca. 3 5 nm and are resolved into severa! bands in CsCl gradients at buoyant densities o f 1.32 to 1.41 (Ma V -RJ); 1.35 to 1.45 (MaV-Al) and 1.40 to 1.43 g/ml (MaV-M5). Absorbance spectra, typical of nucleoproteins, waS detected in ali vira! preparations. The vira! nucleic acid was shown to be dsRNA, by specific enzymatic digestions and celiulose-CF11 chromatography. Upon dissociation, the particles were shown to contain dsRNAs, with the same eletrophoretic pattem of dsRNA components as extracted from mycelium. MaV-RJ have, at least, thirteen dsRNA components, ranging from 3.1 to 0.5 kb and one major capsid polypeptide o f 46 kDa. Ma V -AI have, at least, five dsRNA components, ranging from 4.1 to 1 kb and one major capsid polypeptide of 80 kDa. MaV-M5 is very similar to MaV-Al, in respect to the dsRNA component of 4.1 kb and major polypeptide, however, has fewer smalier dsRNA components. During the development of the work, Ma V -Al and Ma V -MS displayed an unstable dsRNA pattem, progressively more complex in relation to the smaller components. A stable mutant (strain RJd), derived spontaneously from strain RJ, was characterised and it lacks some of the large dsRNA components and has only nine of the smali dsRNA components present in the parental strain RJ. This derived strain displays altered colony morphology, nevertheless we have no experimental data to associate these alterations directly to the altered dsRNA pattem. Polyclonal antibodies were produced against the three Ma V s and we show that the Ma V s are serologicaliy related to each other. In double-diffusion serological test Ma VRJ reacted with antiserum against MaV-Al and MaV-M5, indicating serological relationships. In Westem blot, ali capsid polypeptides of the three MaVs, reacted with both antiserum against MaV-Al and against MaV-M5. cDNA probes from the 4.1 kbdsRNA component of Ma V -Al hybridised with the 4.1 kb-dsRNA component from MaV-M5 and the S2, M3 and Ml-dsRNA components from MaV-RJ. Moreover, a cDNA probe from 4.1 kb-dsRNA component from MaV-M5 hybridised with both the 4.1 kb-dsRNA component from MaV-Al and S2-dsRNA component from MaV-RJ. lt was concluded that the three viroses are related to each other, at least in one dsRNA component. In addition, hybridisation analysis revealed sequence homology between all dsRNA components of MaV-RJ but probes from the 4.1 kb-dsRNA component from MaV-Al do not hybridise with any other dsRNA components of the same strain. Our attempts to transfer the Ma V s to different "free o f vírus" strains of M. anisopliae by biobalistic, using both micovirus and naked dsRNA, have failed.
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Ocorrência natural de espécies virais e avaliação de potenciais hospedeiras experimentais de begomovírus, potyvírus e tospovírus em plantas arbóreas e berinjela (Solanum melongena) / Assessment of the natural occurrence of viral species and evaluation of potential experimental hosts of begomovirus, potyvirus and tospovirus in woody plants and eggplant (Solanum melongena)

Batista, Josiane Goulart 07 May 2014 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2014-12-01T19:03:35Z No. of bitstreams: 1 2014_JosianeGoulartBatista.pdf: 4638200 bytes, checksum: 0eeef9e679c566b2ee50375e7f11d701 (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2014-12-02T11:39:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_JosianeGoulartBatista.pdf: 4638200 bytes, checksum: 0eeef9e679c566b2ee50375e7f11d701 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-12-02T11:39:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_JosianeGoulartBatista.pdf: 4638200 bytes, checksum: 0eeef9e679c566b2ee50375e7f11d701 (MD5) / As espécies arbóreas apresentam grande importância no âmbito econômico e social, entretanto, ainda é desconhecido o potencial destas plantas como reservatórios de novas espécies virais ou de vírus reportados em outras hospedeiras. Além disso, a diversidade de espécies virais presentes no Bioma Cerrado ainda tem sido muito pouco estudada. Desta forma, um dos objetivos deste trabalho foi prospectar a presença de vírus em associação com uma coleção de espécies arbóreas e arbustivas. Amostras de 78 espécies arbóreas e arbustivas foram coletadas em ambiente de Área de Proteção Ambiental (APA) e em condições de viveiro. Estas plantas foram avaliadas para doze espécies virais classificadas em cinco gêneros: [Cucumovirus (Cucumber mosaic virus - CMV), Tospovirus (Groundnut ringspot virus - GRSV, Tomato chlorosis spot virus - TCSV, Tomato spotted wilt virus - TSWV e Zucchini lethal chlorosis virus - ZLCV), Potyvirus (Potato virus Y - PVY, Watermelon mosaic virus - WMV, Papaya ringspot virus - PRSV, Zucchini yellow mosaic virus - ZYMV e Pepper yellow mosaic virus - PepYMV), Tobamovirus (Pepper mild mottle virus - PMMoV) e Begomovirus]. Os resultados mostraram que em torno de 61% espécies coletadas na APA apresentaram resultado positivo para pelo menos uma espécie viral. Das 27 espécies amostradas no viveiro do CRAD - UnB, 17 foram positivas para pelo menos uma espécie viral. Das 32 espécies coletadas no viveiro NOVACAP 20 foram positivas para pelo menos uma espécie viral. As espécies do gênero Tospovirus foram encontradas com maior frequência. Um grupo de 14 espécies arbóreas foi avaliado quanto ao potencial como hospedeiras de três espécies virais que infectam o tomateiro: Tomato chlorotic mottle virus - ToCMoV (Begomovirus transmitido pela mosca-branca Bemisia tabaci), PVY e GRSV. A inoculação com ToCMoV foi feita via B. tabaci e a avaliação foi feita pela observação de sintomas e PCR. Foram também realizadas contagens de adutos e das diferentes fases do ciclo de vida de B. tabaci. PVY e GRSV foram inoculados mecanicamente e as avaliações foram feitas por expressão de sintomas e detecção viral por Dot-Blot. Todas as espécies arbóreas foram negativas para ToCMoV. A avaliação para B. tabaci demonstrou que todas as plantas foram visitadas e algumas se mostraram altamente suscetíveis (ex. mutamba - Guazuma ulmifolia e quaresmeira - Tibouchina granulosa). O PVY somente foi detectado após a recuperação em planta indicadora, sendo encontrados resultados positivos para amburana (Amburana cearensis), ipê amarelo (Handroanthus serratifolius), ipê branco (Handroanthus roseo–albus), ipê caraíba (Tecoma aurea), cabeludinha (Eugenia tomantosa), copaíba (Copaifera langsdorfii), quaresmeira e jenipapo (Genipa americana). O GRSV foi detectado em plantas de baru (Coumarouna alata), carambola (Averrhoa carambola), ipê amarelo, ipê branco, ipê caraíba, jenipapo, mutamba, copaíba, quaresmeira e sucupira branca (Pterodon emarginatus). Para araçá (Psidium araca) e angico (Anadenanthera falcata) não houve detecção viral. Uma coleção de 93 acessos de berinjela (Solanum melongena) foi também avaliada para a resposta à B. tabaci, ToCMoV e PVY e 88 acessos foram avaliados para GRSV. A avaliação foi realizada essencialmente como descrita para as espécies arbóreas. Nenhum acesso se mostrou suscetível ao ToCMoV. Para B. tabaci, sete acessos apresentaram resistência. Como observado para ToCMoV, todos os acessos se mostraram livres de sintomas e foram negativos para PVY, mediante avaliação de sintomas e Dot-Blot, indicando uma resposta do tipo não-hospedeira para essas duas espécies virais. Para GRSV, 56 acessos tiveram pelo menos uma planta positiva mediante Dot-Blot. Alguns dos sintomas observados foram de lesões necróticas e bolhosidades. Dez acessos apresentaram um maior número de plantas positivas (mais de quatro) e os 46 acessos restantes apresentaram de uma a três plantas positivas na sorologia. Sintomas não foram observados e o Dot-Blot foi negativo para 32 acessos, sendo considerados promissoras fontes de resistência ao GRSV. ________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Tree species have major importance in the economic and social context, however, it is still unknown if these plants may function as potential reservoirs of new viral species or even of virus reported in other hosts. Moreover, the diversity of viral species naturally occurring in the Brazilian Cerrado flora remains to be described. Thus, one objective of the present study was the assessment of viruses occurring in association with a collection of tree and shrubs species. Samples of 78 tree and shrubs species were collected in the Environmental Protection Area (APA) and under nursery conditions. These plants were assessed for twelve virus species classified in five genera: [Cucumovirus (Cucumber mosaic virus - CMV), Tospovirus (Groundnut ringspot virus - GRSV, Tomato chlorosis virus spot - TCSV, Tomato spotted wilt virus - TSWV and Zucchini lethal chlorosis virus - ZLCV), Potyvirus (Potato virus Y - PVY, Watermelon mosaic virus - WMV, Papaya ringspot virus - PRSV, Zucchini yellow mosaic virus - ZYMV and Pepper yellow mosaic virus - PepYMV), Tobamovirus (Pepper mild mottle virus - PMMoV) and Begomovirus]. The results showed that 14 species collected in the APA were positive for at least one viral species. Of the 27 species sampled in the nursery of CRAD - UnB, 17 were positive for at least one viral species. Of the 32 species in the nursery of NOVACAP, 20 were positive for at least one viral species. The Tospovirus species were found to be the most frequent pathogens. A group of 14 tree species was evaluated as potential hosts of three viral species reported infecting tomatoes: Tomato chlorotic mottle virus - ToCMoV (Begomovirus transmitted by the whitefly Bemisia tabaci), PVY and GRSV. Inoculation of ToCMoV was carried out via B. tabaci and the evaluation was done by observing symptom development and PCR. The colonization levels of adults as well as the presence of distinct cycle life stages of of B. tabaci were also evaluated. All tree species were negative for ToCMoV. All plants were visited by B. tabaci and some of them were highly susceptible (e.g. mutamba - Guazuma ulmifolia and quaresmeira - Tibouchina granulosa). GRSV and PVY were inoculated mechanically and evaluations were made by observing symptom expression and via Dot-Blot detection assays. In tree species, PVY was detected only after transmission to herbaceous indicator plants, being positive for amburana (Amburana cearensis), ipê amarelo (Handroanthus serratifolius), ipê branco (Handroanthus roseo-albus), ipê caraíba (Tecoma aurea), cabeludinha (Eugenia tomantosa), copaíba (Copaifera langsdorfii), quaresmeira, and jenipapo (Genipa americana). The GRSV was detected in baru (Coumarouna alata), carambola (Averrhoa carambola), ipê amarelo, ipê branco, ipê caraiba, jenipapo, mutamba, copaíba, quaresmeira and sucupira branca (Pterodon emarginatus). For tree araçá (Psidium araca) and angico (Anadenanthera falcata) was the plant where no viral detection was observed. A collection of 93 accessions of eggplant (Solanum melongena) was also evaluated for response to B. tabaci, ToCMoV, and PVY, whereas 88 accessions were evaluated for GRSV. The evaluation was done essentially as described for the tree species. No accession was found to be susceptible to ToCMoV. Seven accessions displayed intermediate resistance to B. tabaci. As observed for ToCMoV, all accessions showed no symptoms and were negative for PVY in Dot-Blot, indicating a type of non-host reaction against both virus species. Fifty-six accessions had at least one positive plant to GRSV as indicated by Dot-Blot. Some of the observed symptoms were lesions necrotic and blistering. Ten accessions showed a higher number of positive plants (more than four) and the remaining 46 accessions had one to three plants positive in serological assays. Symptoms were not observed and Dot-Blot assays were negative for 32 accessions and they might be considered as promising sources of GRSV resistance.
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Produção e caracterização de anticorpos monoclonais específicos para o norovírus gii.4

Oliveira, Layssa Miranda de 25 February 2014 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-graduação em Patologia Molecular, 2014. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2014-05-12T12:48:47Z No. of bitstreams: 1 2014_LayssaMirandadeOliveira.pdf: 2324003 bytes, checksum: 14a8b4dda3a090b7582596c99233f6f5 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-05-23T16:05:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_LayssaMirandadeOliveira.pdf: 2324003 bytes, checksum: 14a8b4dda3a090b7582596c99233f6f5 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-05-23T16:05:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_LayssaMirandadeOliveira.pdf: 2324003 bytes, checksum: 14a8b4dda3a090b7582596c99233f6f5 (MD5) / Os Norovírus (NoV) são a principal causa de gastroenterites aguda não bacteriana no mundo. O genoma dos NoV consiste de um RNA fita simples o qual codifica uma poliproteína (clivada em seis proteínas não estruturais) e duas proteínas estruturais. A estrutura da proteína do capsídeo (VP1) é dividida dentro de dois principais domínios: O shell (S) e o protruding (P). Devido à incapacidade de cultivar estes vírus, o estudo morfológico e estrutural tem sido restrito a habilidade da VP1 de se montar em partículas semelhantes a vírus (VLP) as quais são morfológicas e antigenicamente indistinguíveis dos vírions nativo. O desenvolvimento do método de diagnóstico eficaz deste vírus, mesmo ocorrendo mutação rápida, tem desafiado a produção de anticorpos monoclonais (MAb) que reagem com epítopos de vários genótipos de NoV. Aqui foi relatado a produção de MAb contra a VLP de NoV GII.4 e a sua caracterização à partir dos domínios S, P1 e P2 expressos em sistema procariótico. Nesta abordagem, os MAb foram selecionados basea-se em sua reatividade obtida no ELISA utilizando VLP e MAb selecionados foram testados por Western blotting contra os domínios S, P1 e P2 expresso em E.coli. Nossos resultados demonstraram que todos os MAb selecionados nesse estudo reconheceram o domínio S, embora a densidade óptica obtida no ELISA indireto demonstraram baixa afinidade. Este resultado sugeriu que uma possível desnaturação ou degradação da VLP foi responsável pela fraca ligação observada no ELISA. Em conclusão, nossos resultados mostram uma possibilidade de que a preservação da VLP intacta consiste em etapa essencial para a seleção de MAb que possuem boa sensibilidade para posteriormente serem utilizado no diagnóstico de NoV por ELISA. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Norovirus (NoV) is the main cause of acute non-bacterial gastroenteritis worldwide. NoV genome consists of a single-stranded RNA which encodes one polyprotein (which is cleaved into six non-structural proteins) and two structural proteins. The capsid protein (VP1) structure is divided into two major domains: The Shell (S) and Protruding (P) domains. Due to the inability to propagate the virus in cell cultures, the structural and morphological study have been restricted using self-assembled virus-like particles (VLP) by expressing VP1 which are morphological and antigenically indistinguishable from native virions. The development of effective method of diagnosis of this virus, even occurring rapidly changing, has challenged aiming to produce monoclonal antibodies (MAb) that react to several different genotypes of NoV. Here, we report the production of MAb raised against the VLP of a NoV GII.4, and the selected MAb were characterized by Western blotting against S, P1 and P2 domains prepared through the prokaryotic expression system. Our results demonstrated that all MAb selected in this study recognized the S domain, however the optical density values achieved by the indirect ELISA demonstrated low affinity of MAb to the prepared VLP. This result suggests that possible denatured or degraded VLP were responsible for low reactivity in the ELISA. In conclusion, our results show a possibility that the preservation of intact VLP is an essential step to select MAb and posterior detection of NoV by ELISA for good sensibility.
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Caracterização de partículas virais e RNA de dupla fita isolados do fungo entomopatogênico Matarhizium anisopliae / Characterization of viral particles and doublestranded RNA isolated from entomop a thogenic fungus Metarhizium anisopliae

Giménez-Pecci, María de la Paz January 1996 (has links)
Micovírus são freqüentemente encontrados infectando vários gêneros de fungos. Em alguns sistemas, bem caracterizados, foi demonstrada a interferência de genes virais com o fenótipo do fungo, sendo o caso melhor documentado a hipovirulência em fungos fitopatogênicos. Em nosso laboratório, seis linhagens de Metarhizium anisopliae, um fungo entomopatogênico usado no controle biológico de pragas importantes em agricultura, foram analisadas para a presença de dsRNA. Todas as linhagens foram isoladas de insetos e três apresentam dsRNA viral (linhagens Al, MS e RJ). Nosso objetivo é analisar a possível interferência dos micovírus (Ma V s) com a entomopatogenicidade de M anisopliae. Neste trabalho foram caracterizados três MaVs através de purificação em gradientes de CsCl, microscopia eletrônica, análise de proteínas, padrão eletroforético dos componentes dsRNA, sorologia e análise da homologia entre os componentes dsRNA individuais de um mesmo Ma V e entre os componentes dsRNA dos diferentes MaVs, utilizando sondas de cDNA. As partículas virais dos MaVs RJ, AI e MS são isométricas, com diâmetro médio de 3S nm e são separados em várias bandas em gradientes de CsCI nas densidades de flotação de 1,32 a 1,41 (MaV-RJ); 1,3S a 1,45 (MaV-Al) e 1,40 a 1,43 g/ml (MaV-MS). Espectros de absorção típicos de nucleoproteínas foram observados em todas estas bandas e nas preparações de micovírus. Após a dissociação das partículas virais foi observada a presença de componentes dsRNA com o mesmo perfil eletroforético obtido em extratos de micélio. Foi demonstrado que o ácido nucléico viral é composto por dsRNA, pela digestão enzimática específica e purificação em colunas de celulose CFll. MaV-RJ apresenta, pelo menos, treze componentes dsRNA, variando de 3,1 a 0,5 kb e um polipeptídeo majoritário do capsídeo de 46 kDa. Ma V-AI apresenta pelo menos, cinco componentes dsRNA variando de 4,1 a 1 kb e um polipeptldeo majoritário do capsídeo de 80 kDa. Ma V -MS é muito semelhante a Ma V -AI em relação ao componente dsRNA de 4,1 kb e polipeptídeo majoritário, entretanto apresenta um número menor de componentes dsRNA pequenos. Durante o desenvolvimento do trabalho, Ma V-AI e MaV-MS apresentaram um padrão instável de componentes dsRNA, progressivamente mais complexo em relação aos componentes dsRNA pequenos. Foi caracterizado um mutante estável (linhagem RJd), derivado espontaneamente da linhagem RJ que não apresenta os componentes dsRNA de maior peso molecular, tendo apenas os nove componentes menores presentes na linhagem parental RJ. Esta linhagem derivada, RJd, apresenta morfologia da colônia alterada, contudo não temos evidências experimentais para associar diretamente estas alterações com o padrão alterado de componentes dsRNA. Anticorpos policlonais foram produzidos contra os três Ma V s e mostramos que estes Ma V s são sorologicamente relacionados. Em testes de dupla difusão MaV-RJ reage com antisoro contra MaV-AL e MaV-M5 indicando relações sorológicas. Em Western, todos os polipeptídeos dos capsídeos dos três Ma V s, reagem com os antisoros contra MaV-Al e MaV-M5. Sondas de cDNA do componente dsRNA de 4,1 kb de MaV-Al hibridizam com os componentes de 4,1 kb de MaV-M5 e com os componentes dsRNA S2, M3 e Ml de MaV-RJ. Quando a sonda de cDNA é preparada a partir do componente dsRNA de 4,1 kb de MaV-M5 também ocorre hibridização com o componente dsRNA de mesmo tamanho de MaV-AL ~com o componente dsRNA S2 de MaV-RJ. Se conclui que os três micovírus são relacionados entre si em relação a pelo menos um componente dsRNA. Além disso, a análise de hibridização mostrou que existe homologia entre todos os componentes de Ma V-RJ mas sondas a partir do componente dsRNA de 4,1 kb de MaV-Al não hibridizam com nenhum outro componente da mesma linhagem. Nossas tentativas de transferir micovírus ou dsRNA a linhagens "livres de micovírus" utilizando biobalística falharam. / Micovirus are frequently found infecting severa! genus of fungi in nature. In some, well characterised systems, the interference of vira! genes with the fungai phenotype was demonstrated, as is the case of hypovirulence mediated by viral dsRNA in phytopathogenic fungi. In our laboratory, six strains of Metarhizium anisopliae, an entomopathogenic fungus used in biological control of agronomic important pests, were screened for the presence of dsRNA. The strains analysed were isolated from insects and three have vira! dsRNA (strains AI, M5 and RJ). We aim to access the possibility of interference o f micovirus (Ma V s) with the entomopathogenicity o f M anisopliae. In this work the Ma V s were characterised through purification by CsCl gradients, eletron microscopy, protein analysis, dsRNA pattem, serology and homology between individual dsRNA components within the same Ma V and among the Ma V s. The Ma V s parti eles are isometric, with an average diameter o f ca. 3 5 nm and are resolved into severa! bands in CsCl gradients at buoyant densities o f 1.32 to 1.41 (Ma V -RJ); 1.35 to 1.45 (MaV-Al) and 1.40 to 1.43 g/ml (MaV-M5). Absorbance spectra, typical of nucleoproteins, waS detected in ali vira! preparations. The vira! nucleic acid was shown to be dsRNA, by specific enzymatic digestions and celiulose-CF11 chromatography. Upon dissociation, the particles were shown to contain dsRNAs, with the same eletrophoretic pattem of dsRNA components as extracted from mycelium. MaV-RJ have, at least, thirteen dsRNA components, ranging from 3.1 to 0.5 kb and one major capsid polypeptide o f 46 kDa. Ma V -AI have, at least, five dsRNA components, ranging from 4.1 to 1 kb and one major capsid polypeptide of 80 kDa. MaV-M5 is very similar to MaV-Al, in respect to the dsRNA component of 4.1 kb and major polypeptide, however, has fewer smalier dsRNA components. During the development of the work, Ma V -Al and Ma V -MS displayed an unstable dsRNA pattem, progressively more complex in relation to the smaller components. A stable mutant (strain RJd), derived spontaneously from strain RJ, was characterised and it lacks some of the large dsRNA components and has only nine of the smali dsRNA components present in the parental strain RJ. This derived strain displays altered colony morphology, nevertheless we have no experimental data to associate these alterations directly to the altered dsRNA pattem. Polyclonal antibodies were produced against the three Ma V s and we show that the Ma V s are serologicaliy related to each other. In double-diffusion serological test Ma VRJ reacted with antiserum against MaV-Al and MaV-M5, indicating serological relationships. In Westem blot, ali capsid polypeptides of the three MaVs, reacted with both antiserum against MaV-Al and against MaV-M5. cDNA probes from the 4.1 kbdsRNA component of Ma V -Al hybridised with the 4.1 kb-dsRNA component from MaV-M5 and the S2, M3 and Ml-dsRNA components from MaV-RJ. Moreover, a cDNA probe from 4.1 kb-dsRNA component from MaV-M5 hybridised with both the 4.1 kb-dsRNA component from MaV-Al and S2-dsRNA component from MaV-RJ. lt was concluded that the three viroses are related to each other, at least in one dsRNA component. In addition, hybridisation analysis revealed sequence homology between all dsRNA components of MaV-RJ but probes from the 4.1 kb-dsRNA component from MaV-Al do not hybridise with any other dsRNA components of the same strain. Our attempts to transfer the Ma V s to different "free o f vírus" strains of M. anisopliae by biobalistic, using both micovirus and naked dsRNA, have failed.
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Detecção de variantes metamórficas de Malware por Comparação de Códigos Normalizados / Detecting metamorphic Malware Using Code Normalization

Cozzolino, Marcelo Freire 27 February 2012 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Tecnologia, Departamento de Engenharia Elétrica, 2012. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2012-05-03T13:37:09Z No. of bitstreams: 1 2012_MarceloFreireCozzolino.pdf: 1250185 bytes, checksum: 05ca5f0495dc6b026246a64538ad2612 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2012-05-11T15:21:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_MarceloFreireCozzolino.pdf: 1250185 bytes, checksum: 05ca5f0495dc6b026246a64538ad2612 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-05-11T15:21:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_MarceloFreireCozzolino.pdf: 1250185 bytes, checksum: 05ca5f0495dc6b026246a64538ad2612 (MD5) / Malware é um termo usado para descrever todos os tipos de software maliciosos como vírus, worms ou trojan horses. Para combater tais ameaças, muitas técnicas e ferramentas têm sido empregadas como os anti-* (anti-virus, anti-malware, anti-phishing), os firewalls, sistemas de detecção de intrusão, entre outras. Contudo, novos artifícios têm sido empregados pelos desenvolvedores de malware para dificultar o processo de detecção. Um desses artifícios é proporcionar a alteração do código do malware à medida que sua propagação ocorre. Tal técnica, conhecida como “metamorfismo”, visa dificultar o processo de detecção por assinatura. Essas versões metamórficas do malware são usualmente geradas automaticamente por um componente do código (engine de metamorfismo) incorporado no próprio malware. Detecção de malware metamórfico é um desafio. O problema com scanner baseados em assinatura é que mesmo pequenas alterações no código do malware podem conduzir a falhas no processo de detecção e a base de assinaturas requer constante atualização para inserir as variantes recém-criadas. Este trabalho propõe uma metodologia que permite, a partir de um malware conhecido, reconhecer variantes metamórficas deste. O método proposto reverte às ações de metamorfismo para obter a versão original e, assim, facilitar o processo de identificação do mesmo. Um processo de comparação é feito visando determinar se o programa testado possui o malware buscado. Os resultados alcançados mostram a viabilidade da metodologia proposta, tendo identificado 100% dos malware testados sem a ocorrência de falsos positivos. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Malware is a term used to describe all types of malicious software such as viruses, worms or, Trojan horses. To combat these threats, many techniques and tools have been used as anti-* (anti-virus, anti-malware, anti-phishing), firewalls, intrusion detection systems, among others. However, new approaches have been used by malware developers to make them more difficult the detection process. One of them is to provide the code change every time it copies itself. This technique is known as "metamorphism" and aims to defeat string signature based detection. These versions of metamorphic malware are usually generated automatically by a component of the code (metamorphic engine) that is incorporated in the malware itself. Detection of metamorphic malware is a challenge. The problem with simple signature-based scanning is that even small changes in the malware code may cause a scanner to fail and the signature database requires constant updates to detect newly variants. This work proposes a methodology that allows, from a known malware, recognizing its metamorphic variants. The proposed method reverses the actions of metamorphism for the original version, and thus facilitates the process of identifying the same. A comparison process is done to determine if the tested file has the malware sought. To demonstrate the feasibility, the proposed methodology was applied to set metamorphic variants of a malware, which identified 100% of malware tested without the occurrence of false positives. Moreover, we also compare our approach with commercial antivirus and show that our approach is more effective than existing classification systems.
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Triagem de substancias como interferentes na aquisição e inoculação de virus de plantas por insetos vetores

Nardo, Elizabeth Aparecida Baptista 05 December 1989 (has links)
Orientador: Alvaro Santos Costa / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-14T03:47:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Nardo_ElizabethAparecidaBaptista_D.pdf: 2200785 bytes, checksum: 7f352c07d91d90e2f6ff0767f8ea0df2 (MD5) Previous issue date: 1989 / Resumo: o presente trabalho teve por objetivo fazer uma triagem das substâncias, das mais diversas origens, sem necessariamente ter um efeito inseticida que aplicadas nas plantas doentes fontes de vírus (aquisição) ou nas plantas sadias receptoras de vírus (inoculação), fossem capazes de interferir na transmissão de vírus por inseto vetor, alterando sua capacidade vetora com consequente redução da infecção viral. Na escolha das substâncias deu-se ênfase especial aos resíduos e subprodutos agrícolas e industriais, extratos vegetais, óleos e outras. O valor interferente das substâncias foi avaliado nas fases de aquisição e inoculação dos vírus separadamente / Abstract: An array of substances from varied sources, mostly without known insecticide action, were screened as to their interfering value in the transmission of plant viruses by their aphid or whitefly vector. When selecting substances for trials, preference was given to agricultural and industrial residues or by-products, plant extracts, vegetable and mineral oils, and others. Most of the tests were carried out in the greenhouse by applying the substance to be evaluated on the leaves of the virus donor plants prior to confining the non-viruliferous vector of them for acquisition and further testing on healthy untreated test plants; or were applied on leaves of healthy receptor test plants before caging on them viruliferous vectors that had acquired virus from untreated donor plants. In some field exposure tests, the substances were tried as interferers to vector inoculation only / Doutorado / Doutor em Biologia Vegetal
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Retirada da terapia de manutenção para retinite por citomegalovirus em pacientes com Aids e resposta imunologica a terapia anti-retroviral altamente eficaz (HAART)

Waib, Luis Fernando 22 May 2003 (has links)
Orientador: Sandra Cecilia Botelho Costa / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-04T19:12:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Waib_LuisFernando_M.pdf: 8669077 bytes, checksum: 73f501d02c8e6997923cee3069283d5f (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: A fim de determinar a segurança da retirada da terapia de manutenção para retinite por CMV em pacientes com AIDS com resposta imunológica decorrente da terapia antiretroviral altamente eficaz (HAART), 35 pacientes com retinite por CMV tratada, em terapia supressiva, com CD4+ maior ou igual a 100 células/mm3 por ao menos três meses e carga viral menor que 30.000 cópias/mm3, foram estudados prospectivamente quanto à recorrência da doença pelo CMV. A terapia de manutenção foi retirada à inclusão, e os pacientes foram monitorizados por ao menos 48 semanas, através de exames clínicos e oftalmológicos, e pela determinação de marcadores de viremia para CMV (antigenemia - pp65), contagem de células CD4+/CD8+ e determinação de carga viral plasmática do IDV. Estudos de resposta linfoproliferativa foram realizados em 26 dos 35 pacientes. Dos pacientes incluídos no estudo, apenas um teve reativação da retinite pelo CMV (retinite) no dia 120 do seguimento. Nenhum paciente apresentou antigenemias positivas, mesmo na presença de doença pelo CMV. Não foi observada correlação entre os resultados de estudos linfoproliferativos e a contagem de CD4+. A partir destes resultados e, de acordo com a literatura, pode-se concluir que a retirada da terapia supressiva é segura nos pacientes com resposta imunológica quantitativa após HAART / Abstract: To determine the safety of CMV maintenance therapy withdrawal in patients with immune recovery after HAART, 35 patients with treated CMV retinitis, on maintenance therapy, with CD4+ cell count greater than 100 cells/mm3 for at least three months and viral load<30000 copies, were prospectively evaluated for the recurrence of CMV disease. Maintenance therapy was withdrawn at inclusion, and patients were monitored for at least 48 weeks by clinical and ophtalmological evaluations, and by determination of CMV viremia markers (antigenemia-pp65), CD4+/CD8+ counts and plasma mv RNA levels. Lymphoproliferative assays were performed on 26/35 patients. From 35 patients included, only one had confirmed reactivation of CMV retinitis, at day 120 of follow-up. No patient returned positive antigenemia tests, even in presence of CMV disease. No correlation between lymphoproliferative assays and CD4+ counts was observed. CMV maintenance therapy discontinuation is safe for those patients with quantitative immune recovery after HAART / Mestrado / Clinica Medica / Mestre em Clinica Medica
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Caracterização de partículas virais e RNA de dupla fita isolados do fungo entomopatogênico Matarhizium anisopliae / Characterization of viral particles and doublestranded RNA isolated from entomop a thogenic fungus Metarhizium anisopliae

Giménez-Pecci, María de la Paz January 1996 (has links)
Micovírus são freqüentemente encontrados infectando vários gêneros de fungos. Em alguns sistemas, bem caracterizados, foi demonstrada a interferência de genes virais com o fenótipo do fungo, sendo o caso melhor documentado a hipovirulência em fungos fitopatogênicos. Em nosso laboratório, seis linhagens de Metarhizium anisopliae, um fungo entomopatogênico usado no controle biológico de pragas importantes em agricultura, foram analisadas para a presença de dsRNA. Todas as linhagens foram isoladas de insetos e três apresentam dsRNA viral (linhagens Al, MS e RJ). Nosso objetivo é analisar a possível interferência dos micovírus (Ma V s) com a entomopatogenicidade de M anisopliae. Neste trabalho foram caracterizados três MaVs através de purificação em gradientes de CsCl, microscopia eletrônica, análise de proteínas, padrão eletroforético dos componentes dsRNA, sorologia e análise da homologia entre os componentes dsRNA individuais de um mesmo Ma V e entre os componentes dsRNA dos diferentes MaVs, utilizando sondas de cDNA. As partículas virais dos MaVs RJ, AI e MS são isométricas, com diâmetro médio de 3S nm e são separados em várias bandas em gradientes de CsCI nas densidades de flotação de 1,32 a 1,41 (MaV-RJ); 1,3S a 1,45 (MaV-Al) e 1,40 a 1,43 g/ml (MaV-MS). Espectros de absorção típicos de nucleoproteínas foram observados em todas estas bandas e nas preparações de micovírus. Após a dissociação das partículas virais foi observada a presença de componentes dsRNA com o mesmo perfil eletroforético obtido em extratos de micélio. Foi demonstrado que o ácido nucléico viral é composto por dsRNA, pela digestão enzimática específica e purificação em colunas de celulose CFll. MaV-RJ apresenta, pelo menos, treze componentes dsRNA, variando de 3,1 a 0,5 kb e um polipeptídeo majoritário do capsídeo de 46 kDa. Ma V-AI apresenta pelo menos, cinco componentes dsRNA variando de 4,1 a 1 kb e um polipeptldeo majoritário do capsídeo de 80 kDa. Ma V -MS é muito semelhante a Ma V -AI em relação ao componente dsRNA de 4,1 kb e polipeptídeo majoritário, entretanto apresenta um número menor de componentes dsRNA pequenos. Durante o desenvolvimento do trabalho, Ma V-AI e MaV-MS apresentaram um padrão instável de componentes dsRNA, progressivamente mais complexo em relação aos componentes dsRNA pequenos. Foi caracterizado um mutante estável (linhagem RJd), derivado espontaneamente da linhagem RJ que não apresenta os componentes dsRNA de maior peso molecular, tendo apenas os nove componentes menores presentes na linhagem parental RJ. Esta linhagem derivada, RJd, apresenta morfologia da colônia alterada, contudo não temos evidências experimentais para associar diretamente estas alterações com o padrão alterado de componentes dsRNA. Anticorpos policlonais foram produzidos contra os três Ma V s e mostramos que estes Ma V s são sorologicamente relacionados. Em testes de dupla difusão MaV-RJ reage com antisoro contra MaV-AL e MaV-M5 indicando relações sorológicas. Em Western, todos os polipeptídeos dos capsídeos dos três Ma V s, reagem com os antisoros contra MaV-Al e MaV-M5. Sondas de cDNA do componente dsRNA de 4,1 kb de MaV-Al hibridizam com os componentes de 4,1 kb de MaV-M5 e com os componentes dsRNA S2, M3 e Ml de MaV-RJ. Quando a sonda de cDNA é preparada a partir do componente dsRNA de 4,1 kb de MaV-M5 também ocorre hibridização com o componente dsRNA de mesmo tamanho de MaV-AL ~com o componente dsRNA S2 de MaV-RJ. Se conclui que os três micovírus são relacionados entre si em relação a pelo menos um componente dsRNA. Além disso, a análise de hibridização mostrou que existe homologia entre todos os componentes de Ma V-RJ mas sondas a partir do componente dsRNA de 4,1 kb de MaV-Al não hibridizam com nenhum outro componente da mesma linhagem. Nossas tentativas de transferir micovírus ou dsRNA a linhagens "livres de micovírus" utilizando biobalística falharam. / Micovirus are frequently found infecting severa! genus of fungi in nature. In some, well characterised systems, the interference of vira! genes with the fungai phenotype was demonstrated, as is the case of hypovirulence mediated by viral dsRNA in phytopathogenic fungi. In our laboratory, six strains of Metarhizium anisopliae, an entomopathogenic fungus used in biological control of agronomic important pests, were screened for the presence of dsRNA. The strains analysed were isolated from insects and three have vira! dsRNA (strains AI, M5 and RJ). We aim to access the possibility of interference o f micovirus (Ma V s) with the entomopathogenicity o f M anisopliae. In this work the Ma V s were characterised through purification by CsCl gradients, eletron microscopy, protein analysis, dsRNA pattem, serology and homology between individual dsRNA components within the same Ma V and among the Ma V s. The Ma V s parti eles are isometric, with an average diameter o f ca. 3 5 nm and are resolved into severa! bands in CsCl gradients at buoyant densities o f 1.32 to 1.41 (Ma V -RJ); 1.35 to 1.45 (MaV-Al) and 1.40 to 1.43 g/ml (MaV-M5). Absorbance spectra, typical of nucleoproteins, waS detected in ali vira! preparations. The vira! nucleic acid was shown to be dsRNA, by specific enzymatic digestions and celiulose-CF11 chromatography. Upon dissociation, the particles were shown to contain dsRNAs, with the same eletrophoretic pattem of dsRNA components as extracted from mycelium. MaV-RJ have, at least, thirteen dsRNA components, ranging from 3.1 to 0.5 kb and one major capsid polypeptide o f 46 kDa. Ma V -AI have, at least, five dsRNA components, ranging from 4.1 to 1 kb and one major capsid polypeptide of 80 kDa. MaV-M5 is very similar to MaV-Al, in respect to the dsRNA component of 4.1 kb and major polypeptide, however, has fewer smalier dsRNA components. During the development of the work, Ma V -Al and Ma V -MS displayed an unstable dsRNA pattem, progressively more complex in relation to the smaller components. A stable mutant (strain RJd), derived spontaneously from strain RJ, was characterised and it lacks some of the large dsRNA components and has only nine of the smali dsRNA components present in the parental strain RJ. This derived strain displays altered colony morphology, nevertheless we have no experimental data to associate these alterations directly to the altered dsRNA pattem. Polyclonal antibodies were produced against the three Ma V s and we show that the Ma V s are serologicaliy related to each other. In double-diffusion serological test Ma VRJ reacted with antiserum against MaV-Al and MaV-M5, indicating serological relationships. In Westem blot, ali capsid polypeptides of the three MaVs, reacted with both antiserum against MaV-Al and against MaV-M5. cDNA probes from the 4.1 kbdsRNA component of Ma V -Al hybridised with the 4.1 kb-dsRNA component from MaV-M5 and the S2, M3 and Ml-dsRNA components from MaV-RJ. Moreover, a cDNA probe from 4.1 kb-dsRNA component from MaV-M5 hybridised with both the 4.1 kb-dsRNA component from MaV-Al and S2-dsRNA component from MaV-RJ. lt was concluded that the three viroses are related to each other, at least in one dsRNA component. In addition, hybridisation analysis revealed sequence homology between all dsRNA components of MaV-RJ but probes from the 4.1 kb-dsRNA component from MaV-Al do not hybridise with any other dsRNA components of the same strain. Our attempts to transfer the Ma V s to different "free o f vírus" strains of M. anisopliae by biobalistic, using both micovirus and naked dsRNA, have failed.
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Identificação e caracterização de um coronavirus murino (MHV-CAM) atraves da comparação com o virus da hepatite murina tipo 3

Grippo, Mariangela Carnivalli 01 August 2018 (has links)
Orientador : Liana Verinaud / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-01T04:18:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Grippo_MariangelaCarnivalli_M.pdf: 2518447 bytes, checksum: d792efe7772fb817f298d4c6888c9952 (MD5) Previous issue date: 2002 / Mestrado

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