Tese (doutorado)-Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, 2010 / Submitted by claudia teixeira (claudiadtx@gmail.com) on 2011-06-22T00:41:02Z No. of bitstreams: 1 2010_MichelledeSouzaFayadAndré.pdf: 2189113 bytes, checksum: 4432047fddc05f57223bc21a6ba9e232 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2011-06-22T13:50:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_MichelledeSouzaFayadAndré.pdf: 2189113 bytes, checksum: 4432047fddc05f57223bc21a6ba9e232 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-06-22T13:50:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_MichelledeSouzaFayadAndré.pdf: 2189113 bytes, checksum: 4432047fddc05f57223bc21a6ba9e232 (MD5) / A produção do alho em todo o mundo tem sido afetada por diversos patógenos, dentre eles destaca-se o complexo viral que infecta a cultura causando significativa redução na produção de alho no Brasil. Várias espécies foram identificadas no país, no entanto, os danos causados pelo complexo viral nas células e na fisiologia das plantas infectadas ainda é pouco estudado. São também escassas as informações sobre a ocorrência e prevalência desses patógenos nos diferentes sistemas produtivos de alho no país, estudo que demanda o desenvolvimento de um sistema de detecção viral específico e eficiente. Nesse contexto, o presente trabalho visou desenvolver e adaptar métodos de detecção específicos para as espécies virais do complexo do alho e determinar a ocorrência e prevalência desses patógenos nas regiões produtoras de alho no país. Também foram estudadas as principais alterações fisiológicas morfológicas, bioquímicas e citológicas causadas pelo complexo viral nas plantas infectadas, possibilitando a associação dessas informações com as perdas de produção causadas pela infecção viral. O Capítulo I apresenta uma revisão atualizada dos temas abordados no trabalho com o referencial teórico e as informações científicas disponíveis até o presente. O Capítulo II mostra o desenvolvimento de seis sondas não-radioativas espécie-específicas e uma gênero-específico confeccionadas para a detecção das espécies do complexo viral utilizando hibridização em “Dot-Blot” em membrana de nitrocelulose. Reações de PCR, utilizando primers específicos para as sequencias da CP de seis vírus detectados no país (Potyvirus: Onion yellow dwarf virus- OYDV, Leek yellow stripe virus- LYSV; Allexivirus: Garlic virus C- GarV-C, Garlic virus D- GarV-D e Garlic mite-borne filamentous virus- GarMbFv e Carlavirus: Garlic common latent virus- GarCLV), foram efetuadas para a síntese das sondas específicas marcadas com digoxigenina. Os resultados mostraram que as sondas foram específicas para a detecção do gene da capa protéica de cada espécie viral. Todas as sondas espécie-específicas foram sensíveis para detectar o cDNA do gene da capa protéica de suas respectivas espécies a uma concentração de 0,03 ng/ μL. Entretanto, as mesmas não permitiram a detecção de amostras provenientes de RNA total. Foi demonstrado também, que a técnica de hibridização aumentou a capacidade de visualização dos produtos da PCR auxiliando na maior sensibilidade de detecção dos vírus. Paralelamente ao desenvolvimento das sondas, a técnica de RT-PCR foi desenvolvida para a detecção de amostras provenientes de RNA total, sendo estes resultados, comparados com a detecção sorológica via ELISA. Os resultados obtidos indicaram a maior sensibilidade da RT-PCR na detecção de diversas espécies virais em plantas matrizes provenientes de limpeza clonal, que supostamente deveriam estar livres de vírus. No Capítulo III foi estudada a prevalência e a ocorrência das seis espécies virais em regiões produtoras de alho no Brasil sob diferentes sistemas produtivos. Para isso, amostras de alho foram coletadas nas regiões produtoras para análise via RT-PCR com primers específicos. Os resultados revelaram a ocorrência de Potyvirus (OYDV e LYSV) em todas as regiões. O Carlavirus (GarCLV) ficou restrito as regiões de produção de Cerrado (MG, BA e GO). Em todas as regiões amostradas foi observada, no mínimo, uma espécie de Allexivirus (GarMbFV, GarV-C e GarV-D). A prevalência desses vírus nas regiões produtoras foi relacionada principalmente ao tipo de sistema produtivo e as variedades de alho utilizadas pelos produtores rurais. Foram realizadas avaliações em planta de alho sadias (PS), livres de vírus, e infectadas (PI), com um complexo viral com a finalidade de estudar os efeitos fisiológicos, morfológicos, bioquímicos e citológicos causados pelos vírus. Bulbilhos foram semeados em vasos e 30, 60, 90 dias após plantio (DAP) foram realizadas as avaliações de várias variáveis fisiológicas e bioquímicas durante 3 anos e comparadas estatisticamente. As plantas sadias apresentaram desenvolvimento superior em relação às plantas infectadas. A análise fotossintética revelou que as plantas sadias assimilaram 20% a mais de CO2, do que as plantas infectadas, somente aos 30 DAP. Houve uma redução nos teores de clorofilas a e b, nas três épocas de avaliação, durante os três anos, mas não no teor de carotenóides, para as plantas infectadas. Não se observou diferença significativa na atividade da Rubisco, na produção de açúcares solúveis totais e proteínas totais. A avaliação de amido revelou que as plantas de alho não acumulam amido ou o fazem em baixas concentrações. Este resultado foi confirmado pelas análises citológicas em células de plantas sadias. Além disso, foi observada a presença de aglomerações de compostos lipídicos fora dos cloroplastos normais das células sadias. Em contrapartida, os cloroplastos das células infectadas apresentaram deformação estrutural, acúmulo de substâncias lipídicas, no interior dos mesmos e aumento de volume. Os estudos realizados permitiram desenvolver duas técnicas sensíveis e específicas para auxiliar na diagnose das espécies do complexo viral, determinar a distribuição das espécies do complexo viral prevalente nas regiões produtoras do Brasil em diferentes sistemas produtivos e auxiliar na compreensão das respostas das plantas de alho na ativação de processos metabólicos e possíveis mecanismos envolvidos na defesa contra infecções virais. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Garlic production worldwide is affected by several plant pathogens. Among them, viruses represent one of the main pathogens causing significant crop losses. Several virus species were identified infecting garlic in Brazil, however, the damages caused by the viral complex on the physiology of infected plant and on the host responses to virus infection is poorly understood. The occurrence and prevalence of these virus species in the different garlic-growing regions in Brazil is unknown. For this purpose an efficient and specific-detection method is necessary. Based on the lacking of information, this work aimed to develop a specific technique to detect the virus species infecting garlic, to determine the occurrence and prevalence of these species in the country. In addition, the main physiological, biochemical and cytological alterations caused by virus infection in diseased plants were investigated. The Chapter I present an up-to-date review and the state of the art on this topic. The Chapter II shows the development of six non-radioactive virus-specific probes and one potyvirus-specific probe to detect the virus complex by Dot-blot hybridization. PCR reactions using coat protein specific-primers to the viruses detect in Brazil (Potyvirus: Onion yellow dwarf virus- OYDV, Leek yellow stripe virus- LYSV; Allexivirus: Garlic virus C- GarV-C, Garlic virus D- GarV-D and Garlic mite-borne filamentous virus- GarMbFV and Carlavirus: Garlic common latent virus- GarCLV) were performed to obtain virus-specific Dig-labeled probes. The results showed that the probes were able to specifically detect the viruses (cDNA samples) at a concentration of 0,03 ng/μL. However, this efficiency was limited to detect viruses out of total RNA extracts. The hybridization technique was also able to increase the detection capacity of PCR products by gel-hybridization. Simultaneously, the PCR technique was develop to detect samples of total RNA extracts and these results were compared to serological detection by ELISA. PCR was able to detect several viruses even in tissue culture samples, presumable representing virus-free plants. In Chapter III, the prevalence and occurrence of the six virus species in different garlic-growing areas in Brazil were determined. Garlic bulbs were collected in different producing areas and analyzed by RT-PCR with specific primers. The results revealed the occurrence of Potyvirus (OYDV e LYSV) in all regions. The carlavirus (GarCLV) was restricted to the Cerrado area (MG, BA and GO). In all regions sampled at least one Allexivirus species (GarMbFV, GarV-C and GarV-D) was detected. The virus prevalence in the different regions of Brazil was related with the growing system and garlic varieties employed by the growers. Healthy (HP) and infected (IP) garlic plant were studied in order to elucidate the main physiological, biochemical and cytological alterations caused by virus infection. Plants were analyzed at 30, 60 and 90 days after plantio (DAP) and several physiological and biochemical characteristics were determined and compared. Healthy plants showed higher development than infected ones. The photosynthesis analyzes showed that healthy plants assimilated 20% more CO2, than infected plants only at 30 DAP.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2013. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2013-10-29T13:51:11Z No. of bitstreams: 1 2013_MarinaTagliari.pdf: 6194299 bytes, checksum: acf4157c8673383ce7571bb7098e8789 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-10-30T11:21:20Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_MarinaTagliari.pdf: 6194299 bytes, checksum: acf4157c8673383ce7571bb7098e8789 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-30T11:21:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_MarinaTagliari.pdf: 6194299 bytes, checksum: acf4157c8673383ce7571bb7098e8789 (MD5) / O lepidóptero Condylorrhiza vestigialis é uma das principais pragas desfolhadoras da cultura de álamo no Brasil. Como uma alternativa de controle desta praga, o baculovírus Condylorrhiza vestigialis multiple nucleopolyhedrovirus (CoveMNPV) vem sendo aplicado em plantações de Álamo na região de Cascavel-PR. Devido à ocorrência no campo de lagartas mortas por infecção viral apresentando tegumento liquefeito e intacto, os genes virais catepsina (v-cath) e quitinase (chiA), essenciais para a liquefação do tegumento da lagarta morta por vírus, foram investigados quanto a sua presença ou ausência nos genomas de dois isolados de campo de CoveMNPV. A amplificação destes genes por PCR usando oligonucleotídeos degenerados foi altamente inespecífica em ambas as amostras. Embora os produtos detectados em gel de agarose fossem dos tamanhos esperados, as suas sequências não corresponderam aos genes v-cath e chiA, indicando uma possível ausência desses genes no genoma de CoveMNPV. Bioensaios demonstraram um comportamento semelhante para ambas às amostras de campo, onde à maioria das lagartas mortas apresentou o tegumento íntegro. Os perfis de restrição do DNA viral, gerados pela clivagem com cinco endonucleases de restrição (BamHI, BstEII, EcoRI, HindIII e PstI), foram idênticos para ambos os isolados, tanto para bandas principais como submolares. Para melhor entender as diferenças nos dois isolados de campo de CoveMNPV, seus genomas foram sequenciados utilizando o sequenciador automático FLX 454 (Roche). Após a montagem, anotação e análise, os dois isolados foram comparados por meio da avaliação de polimorfismos, onde o percentual de similaridade entre eles foi de 99.97%. O genoma do CoveMNPV é de 125.767 pares de base (pb) e tem um conteúdo G+C de 42.9%, e contém 138 fases abertas de leitura (ORFs), 9 bros e 4 hrs. Análise filogenética baseada nas sequências deduzidas de aminoácidos do genoma completo e nas sequências nucleotídicas de 11 genes comuns a todos os baculovírus (core genes) classificou o CoveMNPV como espécie irmã do clado AgMNPV/CfDEFMNPV. A ausência dos genes v-cath e chiA foi confirmada no genoma de ambos os isolados, e análise filogenética do locus lef-7/gp64 sugere que este evento tenha ocorrido no ancestral do AgMNPV, CfDEFMNPV e CoveMNPV. Com base na presença de bandas submolares no perfil de restrição do DNA dos isolados de CoveMNPV, clones virais foram purificados por plaque assay a partir de uma das misturas de genótipos de campo. Três destes clones, nomeados CoveMNPV-C2, -C6 e -C8, foram selecionados e amplificados in vivo e in vitro. Análise comparativa dos DNAs não mostrou qualquer alteração entre os perfis de restrição gerados por BstEII, HindIII e PstI, sugerindo a não recuperação do genótipo de campo após a primeira passagem dos clones in vivo. Os clones foram submetidos a ensaios de infectividade in vivo e in vitro, evidenciando diferenças nos seus graus de virulência. Além disto, os OBs dos clones demonstraram diferenças na morfologia do poliedro como revelado por microscopia eletrônica de transmissão. Com base nestes dados, os genes polh e fp25k responsáveis pela formação do poliedro, antes e após a passagem dos clones in vivo, foram amplificados e sequenciados. Nenhuma alteração no gene polh foi detectada, mas o gene fp25k do C8 e C6 apresentou uma mutação frameshift pela inserção de um único nucleotídeo resultando em uma proteína truncada. Após a passagem destes clones in vivo houve uma diminuição na frequência do mutante com relação ao selvagem. Os OBs do C8 apresentaram poucos ou nenhum ODV no seu interior, fenótipo este esperado para um fp25k mutado, e o que também justifica sua menor virulência observada em ensaios in vivo. O clone que se mostrou mais virulento em ensaios in vivo, CoveMNPV-C2, foi similar ao isolado de campo após passagem in vitro, não mostrando qualquer mutação no gene fp25k e produzindo ODVs oclusos. Estas evidências sugerem que este clone é geneticamente mais estável, uma vez que não houve alteração em consequência da passagem em cultura de células, enquanto que os outros clones foram identificados como mutantes de poucos poliedros (FP: few polyhedra). _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The lepidopteran, Condylorrhiza vestigialis is a major defoliating pest of poplar in Brazil. The baculovirus Condylorrhiza vestigialis multiple nucleopolyhedrovirus (CoveMNPV) has been applied in poplar plantations in the region of Cascavel-PR as an alternative to chemical control of this pest. Due to the occurrence of dead caterpillars in the field with either intact or liquefied integument, the presence or absence of virus-encoded cathepsin (v-cath) and chitinase (chiA) genes, essential for the liquefaction of the integument of caterpillars killed by virus, were investigated in the genomes of two CoveMNPV field isolates. Amplification of these genes by PCR using degenerate primers was highly nonspecific in both samples. Although some products detected by agarose gel electrophoresis were of the expected sizes, their sequences did not correspond to the v-cath and chiA genes, indicating a possible lack of these genes in the CoveMNPV genome. Bioassays showed a similar behavior for both field samples, where most killed caterpillars possessed an intact integument. The restriction profiles of the viral DNA, generated by cleavage with five restriction endonucleases (BamHI, BstEII, EcoRI, HindIII and PstI), was identical in the two isolates, for both major and submolar bands. To better understand the differences in the two CoveMNPV field isolates, their genomes were sequenced using the 454 FLX automated sequencer (Roche). Following assembly, annotation and analysis, the two genomes were compared to evaluate polymorphisms, where the percentage similarity between them was 99.97%. The CoveMNPV genome is 125,767 base pairs (bp) and has a G+C content of 42.9%, and contains 138 open reading frames (ORFs), 9 bros and 4 hrs. Phylogenetic analysis based on deduced amino acid sequences of the complete genome and nucleotide sequence of 11 core genes placed CoveMNPV as sister to AgMNPV and CfDEFMNPV. The absence of v-cath and chiA genes was confirmed in the genome of both isolates, and phylogenetic analysis of the lef-7/gp64 locus suggests that this event occurred in the ancestor of AgMNPV, CfDEFMNPV and CoveMNPV. Based on the presence of submolar bands in DNA restriction profiles of CoveMNPV isolates, viral clones were purified by plaque assay from a mixture of field genotypes. Three of these clones, named CoveMNPV-C2, -C6-and -C8, were selected and amplified in vivo and in vitro. Comparative DNA analyses showed no change in the restriction profiles generated by BstEII, HindIII and PstI suggesting the no recovery of field genotype after the first passage of the clones in vivo. The clones were also subjected to in vivo and in vitro infectivity assays, showing differences in their degree of virulence. Furthermore, the OBs of the clones also demonstrated differences in polyhedron morphology as revealed by transmission electron microscopy. Based on these data, the polh and fp25k genes responsible for polyhedron formation, before and after passage of the clones in vivo, were amplified and sequenced. No change in the polh gene was detected, but the fp25k gene of C8 and C6 showed a frameshift mutation by insertion of a single nucleotide resulting in a truncated protein. After the passage of these clones in vivo there was a decrease in the frequency of the mutant relative to the wild-type. The OBs of C8 had few or no ODVs inside, which is the expected phenotype for an fp25k-defective mutant, and also explains its lower observed virulence in in vivo assays. The clone showing greater virulence in in vivo assays, CoveMNPV-C2, was similar to the field isolate after passage in vitro, did not show any mutation in the fp25k gene and produced occluded ODVs. This evidence suggests that this clone is genetically more stable, since it did not change as a result of passage in cell culture, whereas other clones were identified as few polyhedra (FP) mutants.

A cultura da macieira no Brasil ocupa cerca de 35 mil hectares com uma produção que chega, em alguns anos, a 1 milhão de toneladas. Dentre os principais vírus que infectam as plantas estão os chamados latentes Apple stem grooving virus (ASGV), Apple chlorotic leaf spot virus (ACLSV) e Apple stem pitting virus (ASPV) como também o Apple mosaic virus (ApMV). Atualmente, entre as doenças fúngicas mais importantes estão à podridão de olho de boi causadas por Cryptosporiopsis perennans e a mancha foliar da gala causada por Colletotrichum gloeosporioides. O objetivo deste trabalho foi o de avaliar a predisposição em frutos e folhas da cultivar Maxi Gala com infecções virais a C. perennans e a C. gloeosporioides, respectivamente. Em frutos as infecções virais utilizadas foram: ACLSV (C), ACLSV+ ASPV+ ApMV (C+P+M), ASGV (G), ASGV + ASPV (G+P), ASGV + ACLSV + ASPV (G+C+P), ASGV + ACLSV + ASPV + ApMV (G+C+P+M). Foram analisadas nos frutos durante a colheita e após o armazenamento as variáveis de incidência e o número de lenticelas necrosadas, teor de açúcar, firmeza, escala iodo-amido, lenticelas abertas (l.a.), atividade das enzimas peroxidases (PO) e polifenol oxidase (PPO) e teor de fenóis. Em plantas com infecção do vírus ASGV foram avaliadas a incidência, número de manchas, severidade, taxa de progresso da doença, período de incubação, a atividade de enzimas PO e PPO e teor de fenóis analisadas em ramos. Os frutos com infecções virais apresentam maior predisposição a C. perennans, pois tiveram mais incidência, exceção de C, durante a colheita e após armazenamento e número de lenticelas necrosadas após o armazenamento. Os frutos com G+C+P+M apresentaram-se mais maduros e mais l.a. na colheita e após o armazenamento. Os frutos com infecção de G e G+C+P+M apresentaram menor atividade da PO, mas sem alteração da PPO ou do teor de fenóis. As plantas com ASGV apresentaram maior predisposição à infecção de C. gloeosporioides, pois apresentaram maior incidência, número de manchas, severidade e menor tempo de incubação e PPO. / Apples are grown in Brazil on approximately 35 thousand hectares with a production that reaches 1 million ton in some years. The so called latent apple viruses Apple stem grooving virus (ASGV), Apple chlorotic leaf spot virus (ACLSV) and Apple stem pitting virus (ASPV) as well as Apple mosaic virus (ApMV) stand out as the most commonly involved in apple viral infections. Bull´s eye rot caused by Cryptosporiopsis perennans and the Gala leaf spot caused by Colletotrichum gloeosporioides are among the most important fungal diseases. The objective of this study was to evaluate the effect of viral infections on predisposing apple plants, cv. Maxi Gala, to subsequent infections by C. perennans and by C. gloeosporioides in fruits and leaves, respectively. In fruits the treatments ACLSV (C), ACLSV+ ASPV+ ApMV (C+P+M), ASGV (G), ASGV + ASPV (G+P), ASGV + ACLSV + ASPV (G+C+P), ASGV + ACLSV + ASPV + ApMV (G+C+P+M) were analyzed at harvest and after cold room storage period in relation to disease incidence, number of necrotic lenticels, sugar content, firmness, iodine-starch, lenticel opening (l.o.), the activity of peroxydases (PO), polyphenol oxydase (PPO) and the phenol content. In plants pre-infected with ASGV the incidence and the number of leafspots per leaf, severity and the rate of disease progress, incubation period of Colletotrichum gloeosporioides, the activity of the enzymes PO and PPO and phenol content in twigs were analysed. The incidence of C. perennans in fruits pre-infected with viruses was higher, excepting C, in these fruits at harvest and after cold storage, and the number of necrotic lenticels was higher. Ripeness of fruits pre-infected with G+C+P+M was advanced and fruits had higher l.o. at harvest and after storage. Fruits pre-infected with G and G+C+P+M showed a lower PO activity, but their PPO activity and phenolics contents were unaltered. C. gloeosporioides had a higher infectivity on leaves of plants with ASGV,showed higher disease incidence, leafspots and disease severity and lower incubation period and activity of PPO.

Orientador: Clarice Weis Arns / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-22T10:44:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 CampalansBarnier_JacquelineFilomena_M.pdf: 4654088 bytes, checksum: 978db089660720ba3b71b40c66f83d54 (MD5) Previous issue date: 1996 / Resumo: O vírus respiratório sincicial dos bovinos (BRSV) produz uma doença respiratória que está amplamente distribuída no mundo e causa severas perdas econômicas nos países produtores. Com o objetivo de determinar se as doenças respiratórias que afetam os bovinos no Brasil têm alguma relação com o BRSV, realizou-se um estudo soro lógico e isolamento viral. Foram analisadas 864 amostras de soros procedentes dos Estados do sul e sudeste do país (RS, PR, SP, MS, RJ e MG), usando os testes sorológicos de soroneutralização (TSN) e ensaio imunoenzimático (ELISA). Ambos os testes mostraram um alto nível de positividade anti-BRSV (68% e 75% respectivamente) com diferença significativa a p < 0.05%. Não foram detectadas grandes diferenças entre as regiões estudadas, mas se observa uma ligeira tendência a maior soropositividade com a maior latitude. Animais jovens apresentaram índices maiores de soropositividade (média 85%), sendo o TSN o mais sensível nessa faixa etária, refletindo a maior susceptibilidade a infecções primárias dos bezerros em relação a animais adultos. O isolamento viral foi realizado a partir de 33 amostras de secreções nasotraqueais inoculadas sucessivamente em cultura de células CER e MDBK, caracterizado por testes físico-químicos e observações morfológicas ao microscópio eletrônico. Foi também realizado um teste de TSN cruzada com duas amostras BRSV padrões e seus respectivos antisoros. Os resultados demonstraram que a amostra isolada é um vírus pleomórfico, espiculado, de RNA, envelopado, termolábil e não hemoaglutinante. O TSN cruzada mostrou que existe uma semelhança antigênica entre a amostra isolada no Brasil com as duas cepas BRSV padrões estudadas / Abstract: The bovine respiratory syncytial virus (BRSV) causes a respiratory disease which is widely distributed worldwide and causes economic loses in the producing countries. A serological and viral isolation study was carried out in order to determine whether the respiratory diseases that affect the cattle in Brazil have any relation with BRSV. Eight hundred sixty four serum samples proceeding from the southern states (Rio Grande do Sul, Paraná, São Paulo, Mato Grosso do Sul, Rio de Janeiro and Minas Gerais) were analyzed using the serogical tests of seroneutralization (TSN) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Both tests showed a high leveI of positivity anti BRSV (68% and 75% respectively) with significant difference (p < 0.05). There were not big differences between the regions studied, however a slight tendency to higher seropositivity was observed the bigger the latitude. Young animaIs showed higher index of seropositivity (mean 85%), the TSN being more sensible in this age range, reflecting the higher susceptibility to primary infections of calves in relation to adult animaIs. Viral isolation was carried out in 33 samples of nasotracheal inoculated successively in CER and MDBK cell culture, characterized by physical-chemical tests and morphological observation at the electronic microscope. A test of crossed TSN with pattern BRSV strains and their respective anti serum was carried out. The results showed that the sample isolated is a pleomorphic virus, spicular, of RNA, enveloped, thermolabiIe, and not hemaggIutinating. The crossed TSN showed that there is a antigenic similarity between the strain isolated in Brazil and two pattern BRSV strains studied. / Mestrado / Microbiologia / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Jorge Vega / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-26T18:25:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Freitas_DanieleScandiuccide_M.pdf: 13458049 bytes, checksum: 8ce2699f8ad4ca2dc0d5a9d25aceb112 (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: Foi estudado um vírus, preliminarmente considerado da família Potyviridae, infectando em condições naturais duas espécies de crotalária, nas quais induz sintomas de mosaico. O vírus foi denominado vírus do mosaico da crotalaria (VMCr). Foram analisados os seguintes aspectos: círculo de hospedeiras, propriedades "in vitro", transmissão por afídeos e pela semente, formas de transmissão mecânica, citopatologia, purificação, relações serológicas com outros potyvirus e massa da proteína do capsídeo. O círculo de hospedeiras ficou restrito a espécies da família Legumínosae, sendo uma das hospedeiras características Phaseolus vulgarís. 'Preto G-2', espécie na qual induz necrose local seguida de necrose sistêmica. As propriedades in vitro apresentaram valores dentro da faixa dos potyvirus. Foi demonstrada a transmissão pelos afídeos Aphis gossypíi, Myzus persicae e M. nicotíanae e com menor eficiência por lámina cortante. A transmissão mecânica convencional teve eficiência de cerca de 80%. Não foi observada transmissão pela semente. Foram observadas inclusões através de microscopia de luz, e caracterizada por microscopia eletrônica: elas são formadas por estruturas do tipo "cata-vento" e feixes ou rolos características dos potyvirus. O protocolo de purificação empregado apresentou baixo rendimento. Na comparação serológica através do teste de EllSA foi verificada relação com o vírus do endurecimento dos frutos do maracujá isolado no Brasil (VEFM). Utilizando anti-soro para esse vírus foi detectado o VMCr pela técnica PTA-ELlSA e western-blot. Através deste último método foi estimada a massa molecular relativa da proteína capsidial em 37 kDa. Considera-se que o VMCr seja um isolado do VEFM que tem evoluído no sentido de infectar principalmente leguminosas. Dados recentes da literatura indicam que o VEFM isolado no Brasil seria mais próximo ao vírus do maracujá isolado em África do Sul, diferente do VEFM. Isto provavelmente explicaria a divergência dos resultados aquI apresentados, no referente à morfologia das inclusões citoplasmáticas, dos relatados para o VEFM em outros países / Abstract: A virus isolated from Grata/aria species showing the mosaic symptom, preliminarily identified as a potyvirus, was studied. The virus was named Crotalaria mosaic virus. The characteristics studied were: host range, "in vitro" properties, transmission by aphids, seed transmission and different meehanieal transmission methods, eytopathology, serologieal relation with other potyviruses and molecular mass of the capsid protein. The host range is limited to speeies of the Leguminosae family and one eharacteristie host is Phaseo/us vulgaris 'Preto G-2', whieh shows local neerosis followed by systemie neerosis. The "in vitra" properties parameters were similar to the values reported for most potyviruses. Transmission of the virus by Aphis gossypíi, Myzus persicae e M. nicotíanae was demonstrated. Mechanieal transmission was effieient (80% transmission), and transmission by knife blade also was possible but with lowefficieney. Seed transmission was not observed. intracellular inelusions observed by light and electron microscopy were pinwheel and seroll type. The purifieation of the virus was possible with the proeedure used but virus yield was poor. Comparisons by PT A-ELlSA tests showed serologieal relation with the Brazilian isolate of passion-fruit woodiness virus (PWV). Using antiserum against PWV was possible to deteet erotalaria mosaie virus by PT A-ELlSA and western-blot. The relative molecular mass of the capsid pratein was estimated to be 37 kDa. Probably erotalaria mosaie virus is a strain of PWV that evolved toward a narrow host range of speeies mainly belonging to the Leguminosae family. Reeent reports indicate that most Brazilian isolates of PV'N are more related to the South African Passion-fruit virus, differing from standard type PWV. This fact may explain the differences observed in the morphology of cytoplasmic inclusions from data reported for PV / Mestrado / Mestre em Biologia Vegetal

Orientador: Marcelo de Carvalho Ramos / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-07-26T21:28:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fissore_AndreaCarla_M.pdf: 2517669 bytes, checksum: f5d656b5d5b9dead6673ba7e34c73aed (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: Objetivo: Deternllnar a freqüência do alelo recessivo ccr-5 em população de indivíduos infectados pelo HIV -1. Material e Métodos: Foram estudados 187 pacientes, que freqüentam os ambulatórios da Disciplina de Moléstias Infecciosas do Hospital das Clínicas da UNICAMP. Foram selecionados pacientes de ambos os sexos com testes positivos para o anti-HIVl por ELISA e Westem-Blot, em qualquer fase clínica da doença. Para amplificação foram utilizados os seguintes primers: 5'-CCTGGCTGTCGTCCATGCTG-3' e 5'CTGATCTAGAGCCATGTGCACAACTCT-3'. Após a desnaturação a 94°C por 5min, seguiram-se 34 ciclos de: 94°C por lmin; 57°C por lmin; 72°C por lmin e extensão final a 72°C por 7min. A seguir, foi realizada a digestão enzimática com 1 J.lg de cada amostra, incubadas por 60min à 37°C com 10U de EcoRI. Foram também deternllnadas a carga viral pela técnica do NASBA e deternllnação de subpopulações linfocitárias por citometria de fluxo (Ortho Diagn.). Resultados e Conclusões: Do total de 187 indivíduos analisados, 15 apresentaram padrões de restrição do produto de PCR compatíveis com heterozigose para a deleção delta 32 (freqüência=8,02%). Essa freqüência é semelhante à encontrada em populações caucasianas européias. Com respeito à carga viral e quantidade de células CD4 e CD8, os dados foram prejudicados pela administração de medicação antiretroviral na maioria desses indivíduos. Todos os pacientes que apresentavam a mutação e que pud~ram ser classificados clinicamente possuíam estadiamento B2 ou maior / Abstract: Previous studies have shown a relationship between a 32-base-pair deletion within the J3-chemokine receptor 5 (ccr5) gene and the acquisition and progression of the Acquired Human Immunodeficiency Syndrome (AIDS). Several. populations have been tested concerning this deletion, and it was found that Caucasians have a higher probability of bearing this defect, whereas in black and japanese populations it is virtually absent. In Brazil, no studies have been done to estimate this frequency in HIV infected populations, so faro In an urban brazilian population 93% of individuaIs tested showed normal CCR-5 anele and 7% were heterozygous CCRS/ ~ccr5. In this study 187 HIV-infected persons were tested to determine the prevalence of this mutation. Genomic DNA samples were amplified using primers producing a 735bp fragment, which was submmited to c1eavage with EcoRl. Normal homozygous aneles showed two fragments of 332 and 403 bp, and in heterozygous aneles an additional371 bp fragment was found. No homozygous individuaIs were found in this population, and the frequency ofheterozygous CCR5/~ccr5 was found to be 8,02% / Mestrado / Ciencias Basicas / Mestre em Clinica Medica

Orientador: Clarice Weis Arns / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-27T02:26:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Domingues_HelenaGallicchio_M.pdf: 3430595 bytes, checksum: ec59d99db25139771cd4d4d2b1ba15b4 (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: Neste trabalho foram adaptados e padronizados dois ensaios imunoenzimáticos (dot ELISA e S-ELISA), para auxiliar 110 diagnóstico do vírus respiratório sincicial bovino (BRSV). A amostra vira! padrão, BRSV -25-BR isolada 110 Brasil foi utilizada nos dois ensaios, tendo sido produzida em célula CER e processadas por ultracentrifugação em gradiente descontínuo de sacarose 30-55% (v/v). Foram analisadas 423 amostras de sorosco1etados nos principais centros de bovinocultura do país. as quais foram submetidas ao teste padrão de soroneutralização (SN). onde 67,8% das amostras foram positivas. A técnica de dot-EUSA, utjlizando O.7/µg de proteína purificada por disco, detectou 71,6% deamostras positivas, apresentando uma sensibilidade de 92.3% e especificidade de 71,3%. Oteste de S-EUSA, utilizando 3,0 µg de proteina bruta por poço, detectou 72.5% de amostras positivas, com sensibilidade de 91.6% e especificidade de 68,4%. Por meio dos dados coletados, valida-se os testes de S-ELISA e dot-ELISA para a detecção de anticorpos anti-BRSV como alternativa para o uso em laboratório e no campo / Abstract: Two Enzyme-Linked Immunosorbent Assay techniques (dot-ELISA e S-ELISA) were developed to detection of antibodies against Bovine Respiratory Syncytial Virus (BRSV). The antigen was produced in Chicken Embroyo Related (CER) continuous cell line, inoculated with virus strain , BRSV-25-BR, isolated in Brazil, and it was processed by centrifugation 1hrougb a discontinue sucrose gradient (30-55% p/v). Four hundred twenty three bovine serum samples were analised by the standard test of serum neutralization (SN), and 67,8% were positive. Dot-ELISA test was standardized, utilizing 0,7 .µg of purified BRSV protein per nitrocelulosis disc, anel 3,0 µg per well in the S-ELISA test. The dot-ELISA test detected 71,6% of positives serum samples, showing a sensitivity of 92,3% and a specificity of 71.3%. The S-ELlSA test, detected 72,5% of positive serum samples. with a sensitivity of 91,6% and specificity by 68,4%. These results show that dot-ELISA and S-ELISA tests may be an option to detect anti-BRSV antibodies in labarotory and field / Mestrado / Microbiologia / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientador : Eliana Amaral / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-07-28T19:30:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gomes_FranciscodeAssisSilva_M.pdf: 200129 bytes, checksum: 891e41bb2ff27438da30457c0ed2a0e7 (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: Desde 1988, o CAISM/UNICAMP realiza acompanhamento de gestantes infectadas pelo Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV). A instituição vivenciou diversas fases de intervenções para prevenção da transmissão materno-infantil (TMI): até 1994, apenas amamentação contra-indicada, sem uso de antiretrovirais (ARV); de 1995 a 1996, com uso do protocolo ACTG 076 incompleto, sem o componente intraparto; em 1997 e 1998, utilizando o protocolo ACTG 076 completo; e em 1999-2000 com terapia antiretroviral múltipla e cesárea eletiva. Este estudo de coorte retrospectiva objetivou descrever o efeito das diversas intervenções implementadas por protocolos assistenciais, sobre a TMI e prematuridade, em gestantes com infecção pelo HIV que tiveram parto na instituição entre 1990 e 2000. A confirmação de infecção congênita foi através dos resultados de exames clínicos e laboratoriais (ELISA, PCR, carga viral) das crianças acompanhadas no Ambulatório de Imunodeficiência Pediátrica do Hospital das Clínicas. Aquelas que abandonaram o seguimento foram convidadas a retornar, após contato com seus responsáveis. Foram calculadas as taxas de transmissão materno-infantil do HIV nas 4 fases do estudo e para cada variável sociodemográfica, clínica e intervenção profilática (amamentação, tipo de terapia antiretroviral, tipo de parto). As diferenças na distribuição das categorias das variáveis epidemiológicas e clínicas nas 4 fases foram testadas através do Teste de Qui Quadrado, ANOVA e Teste de Fisher. Calculou-se a razão de risco de transmissão congênita para condições clínicas, características epidemiológicas e cada intervenção de forma isolada. Em 197 casos, observou-se, no decorrer das fases, um considerável aumento no uso de terapia ARV combinada. Houve uma acentuada redução na TMI da 1a para a 4a fase terapêutica, de 32,3% para 2,9%. A maior queda foi observada após disponibilização do esquema completo do ACTG 076 (3a fase). Nenhum caso de TMI ocorreu entre gestantes tratadas com terapia ARV múltipla na gestação. Concluiu-se que a adoção das intervenções propostas na literatura foi possível e trouxe um benefício superior àquele descrito na literatura / Abstract: Since 1988, CAISM/UNICAMP provides prenatal care to HIV infected women, going through several intervention phases to prevent maternal-infant transmission (MIT): until 1994, only avoiding breastfeeding was recommended; from 1995-96, incomplete ACTG 076 (pregnancy and neonatal components); 1997-98, complete ACTG 076 use; 1999-2000, multiple therapy and elective Csection. This retrospective cohort intends to describe the effect of these interventions phases implemented according to clinical guidelines, on the MIT and preterm delivery, among women delivering at CAISM from 1990-2000. Congenital infection was confirmed getting information from clinical records for children followed at the Immunodeficiency Paediatric Clinic, based on ELISA, PCR and/or viral load. Lost of follow up children were invited to return, through their parents or legal representatives. Sample size calculations, based on the ACTG 076 protocol, suggested 312 mother-infant pairs. Data analysis was performed using the software SAS, version 8.0. MIT-HIV rates were calculated to each of four intervention phases, as well as to each epidemiological, clinical variable, and particular interventions (avoidance of breastfeeding, ACTG 076, multiple therapy, mode of delivery). The difference among categorical variables were tested using chi2 test. Prevalence rates for transmission were calculated to epidemiological, clinical, phases and intervention variables. In 197 valid cases, ageing of the cohort, knowledge on partner¿s serologic status and risk behavior and improvement in using multiple therapy were noted. A sharp reduction on MIT, from 32,3% to 2,9% was observed from the 1st to the 4th intervention phase. The greatest reduction was found after complete ACTG 076 became available. No transmission occurred among women treated with multiple therapy. Adoption of updated clinical guidelines permitted to achieve higher benefits than expected / Mestrado / Tocoginecologia / Mestre em Tocoginecologia

Orientador : Paulo Arruda / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-03T12:02:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pereira_TiagoCampos_M.pdf: 5014451 bytes, checksum: d2047dfc11426a4b6bf79cbe548a81ec (MD5) Previous issue date: 2002 / Mestrado

Orientadores: Clarice Weis Arns, Sandra Cecilia Botelho Costa / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-03T16:35:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Campalans-Barnier_Jacqueline_D.pdf: 1182672 bytes, checksum: 06bfe547650a3661c7baf01f2228c101 (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: O vírus respiratório sincicial bovino (BRSV) causa infecção aguda do trato respiratório em bovinos e está amplamente disseminado no mundo inteiro, provocando grandes perdas econômicas aos produtores. O presente projeto visou realizar a caracterização do vírus respiratório sincicial bovino (BRSV), denominado BRSV-25-BR, isolado de bezerro de dois meses de idade, proveniente de rebanho com sintomas de doença respiratória do Estado do Rio Grande do Sul, comparando o mesmo com isolados de BRSV de outros países. O passo inicial foi adaptar os diferentes isolados virais em sistema celular e, para tanto, foram utilizados cultivos de células CER ("Chicken Embryo Related¿). A análise morfológica do isolado brasileiro foi realizada através de microscopia eletrônica por contrastação negativa e o resultado dessa análise indicou que o isolado estudado, BRSV-25-BR, é um vírion arredondado, pleomórfico, de tamanho aproximado de 100 a 300 nm, com numerosas espículas espalhadas na superfície. Foi realizada uma comparação do genoma dos isolados virais utilizando a técnica de RT-PCR dupla. Foram utilizados os iniciadores B1, B2A, B3 e B4A para a proteína F que resultou na amplificação do fragmento no tamanho esperado, 481 pb. A análise desta seqüência revelou 97% de identidade de nucleotídeos das seqüências da proteína F do isolado BRSV-25-BR com as estirpes de BRSV armazenadas no GeneBank. A RT-PCR dupla utilizando os iniciadores B5A, B6A, B7A e B8 para a proteína G, amplificaram um fragmento do genoma viral do tamanho esperado, 371 pb. A porcentagem de identidade entre a seqüência do BRSV-25-BR e o fragmento equivalente das estirpes armazenadas no GeneBank encontrada foram entre 92 e 95%. A seqüência dos aminoácidos derivados da proteína G do isolado brasileiro comparado com as seqüências dos isolados registrados no GeneBank sugere sua associação ao subgrupo B. A informação obtida nesta pesquisa a partir da seqüência da proteína G permite afirmar que o isolado do Brasil é uma estirpe de BRSV diferente daquelas atualmente circulantes nas demais partes do mundo. Esta informação contribui para uma maior compreensão da epidemiologia e para o desenvolvimento de vacinas adequadas para o nosso meio / Abstract: The bovine respiratory syncytial virus (BRSV) causes acute infection in the respiratory tract of cattle and is wide spread in the world, causing significant economic losses. The objective of this project was to characterize the BRSV, named BRSV-25-BR, isolated from a 2 months calve from Rio Grande do Sul state cattle, which presented respiratory disease symptoms. This sample was compared against BRSV strain isolates from other countries. The initial step was to adapt the viral samples in cellular culture. To achieve this purpose, a CER (Chicken Embryo Related) cell culture was used. The morphologic analysis was done through electronic microscopy using a negative stain. A genomic comparison to the viral isolates was carried out. The outcomes of the analyses indicate that the analyzed sample, named BRSV-25-BR, is an rounded, pleomorphic virion, between 100-300 nm in size and numerous spikes over the surface. The amplification of the expected size fragment, which was 481 pb, was observed through a nested RT-PCR technique, using the B1, B2A, B3 and B4A primers for the F protein. The analyses of this sequence of nucleotides revealed 97% identity between the F protein sequence of the isolated BRSV-25-BR and the strains of BRSV equivalent sequences stored in the GeneBank. The amplification of the viral genome on an expected size fragment (371 pb) was achieved using the nested RT-PCR, in which the B5A, B6A, B7A and B8 primers for the G protein were used. The identity percentage between the BRSV-25-BR sequence and the compensative fragment of the GeneBank stored strains was smaller, ranging between 92% and 95%. A probable association to the B subgroup is suggested from the deduzed amminoacid sequence of the G protein of the Brazilian sample compared to the sample sequences registered in the GeneBank. The information gathered from this research project allows to affirm that the isolated Brazilian sample belongs to a kind of BRSV different from those present in the world and contribute with a values to epidemiologic studies / Doutorado / Ciencias Basicas / Doutor em Clínica Médica