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Implementación de un sistema de cultivo de células hepáticas como modelo In vitro para estudios metabólicos

Acuña Leppe, Camilo Andrés January 2013 (has links)
Ingeniero Civil en Biotecnología / Ingeniero Civil Químico / Debido a que el hígado posee funciones únicas, es de gran interés desarrollar herramientas que permitan conseguir un mejor entendimiento global del comportamiento de las células hepáticas bajo cambios de las condiciones de crecimiento causado por agentes externos, tales como cambios en la suplementación de la fuente de carbono o la utilización de drogas en el medio de cultivo. El objetivo de este de esta memoria es establecer una metodología que permita realizar estudios metabólicos en células de origen hepático, con herramientas in silico que complemente los trabajos de investigaciones in vitro. Para ello, se utilizará la línea celular HepG2, ya que presenta ventajas frente a otras células de origen hepático, como su alta capacidad proliferativa y su fenotipo estable. Junto a esto se diseñó un modelo hepático para describir el metabolismo intracelular, que considera 37 metabolitos y 32 reacciones, abarcando las principales vías metabólicas de una célula hepática. En un primer estudio experimental se analizó como afecta en el metabolismo de las células la aplicación de agente nocivo acetaminofén (APAP), y si el daño es contrarrestable utilizando N-acetilcisteína (NAC) como agente protector. Como resultado se obtuvo que la concentración utilizada de APAP en el medio (1 [mM]) es altamente tóxica ya que frena de inmediato el crecimiento celular, entrando a una fase de muerte celular. Del análisis de flujo metabólico aplicado a este caso se obtuvo que existe una alta tasa específica de producción de lactato, y por ende, los flujos son redireccionados para que aumenten los niveles de piruvato intracelular a partir de diversa fuentes de carbono además de la glucosa (triptófano y triglicéridos), y sea utilizado en la síntesis de lactato. Con respecto a la protección, sólo fue posible obtener una curva de crecimiento comparable al control cuando se utilizó NAC (5 [mM]) 3 horas después que se administrara APAP. La aplicación previa tuvo el mismo resultado que el caso en que sólo se utiliza APAP. El análisis de flujo metabólico del único caso en que hubo una protección efectiva está sujeto a errores de cálculos de tasas específicas, al igual que el caso control. Grandes desbalances de carbono y nitrógeno, junto con una distribución de flujos internos con comportamientos no esperados, no permiten comparar los resultados entre los casos. Sin embargo, este hecho refleja lo importante que es tener mediciones precisas y un buen diseño experimental para calcular las tasas específicas de consumo/producción, para así obtener un correcto funcionamiento del modelo hepático planteado. En el segundo estudio, se analizaron los cambios metabólicos que se generan al utilizar diferentes suplementaciones del carbohidrato en el medio. Los casos fueron una suplementación pura de glucosa, una pura de fructosa y una mezcla de ellas (en una razón 1:1). Al realizar las curvas de crecimiento, se obtuvieron parámetros de crecimiento similares, siendo el caso de fructosa pura en donde las células crecen a menor velocidad, dado que están acostumbradas a crecer en un medio con glucosa. Este hecho se ratifica al realizar el análisis de flujo metabólico, donde el caso de mayor consumo de hexosa, producción de lactato y síntesis de triglicéridos fue el caso en que se suplementó exclusivamente con glucosa. En los casos en que existía fructosa en el medio, las células presentaron una tasa menor de consumo de azúcar, y por consiguiente una menor producción de triglicéridos. Además en estos dos casos, los flujos hacia síntesis de lactato y síntesis de triglicéridos son más bajo, pero con un flujo permanente en el ciclo TCA cercano al doble que el caso de suplementación con glucosa pura. El modelo hepático fue capaz representar el metabolismo de la línea celular HepG2 en ambos estudios. Sin embargo, debido a los resultados del primero, es necesario realizar más ensayos de toxicidad de sustancias, para validar el modelo y la metodología empleada en este trabajo, con el fin de caracterizar y mejorar funciones hepáticas en sistemas de cultivo in vitro.
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Ingeniería de células CHO para metabolismo en galactosa

Jiménez Tapia, Natalia Eugenia January 2013 (has links)
Magíster en Ciencias de la Ingeniería, Mención Química / Ingeniera Civil en Biotecnología / El cultivo de células animales ha cobrado gran importancia en la industria biotecnológica, dada su capacidad de producir proteínas recombinantes compatibles con su uso terapéutico en humanos. Este potencial ha motivado la búsqueda de estrategias para la optimización de los procesos cuyo objetivo es la síntesis de grandes cantidades de proteínas con aplicaciones biomédicas. Una de las estrategias utilizadas corresponde al cultivo en fuentes alternativas de carbono, tales como galactosa, las que al ser consumidas lentamente llevan a la obtención de un metabolismo más eficiente, con una reducción de la acumulación metabolitos inhibitorios tanto del crecimiento celular como de la síntesis del producto. Sin embargo, se ha observado que estos cultivos presentan baja velocidad de crecimiento por lo que es necesario suplementar estos medios con glucosa o realizar modificaciones al metabolismo celular de forma de obtener cultivos con mayores rendimientos. Para la obtención de una línea celular que presente un desempeño mejorado en cultivos con galactosa, se transfectaron células CHO de forma de sobre-expresar proteínas asociadas a pasos previamente reportados como limitantes del metabolismo de la galactosa, específicamente el transportador Slc2a8 y galactoquinasa Galk1. No se tuvieron resultados concluyentes con respecto a la sobre-expresión del transportador Slc2a8, debido a que el pool de clones obtenidos luego de la transfección no mantuvo su viabilidad durante tiempo suficiente para caracterizar su comportamiento en cultivo. Por otro lado, los resultados obtenidos mostraron que los clones seleccionados (CHO-Galk1) alcanzan mayor densidad celular en cultivos desarrollados en medio con glucosa y galactosa, además de ser capaces de crecer en un medio que sólo presenta galactosa, contrario a lo observado en la línea parental. Las células CHO-Galk1-2 presentan una mayor concentración de producto, llegando a sintetizar un 42% más de tPA que el control. El aumento más drástico de tasa de producción está asociado a la fase de crecimiento en galactosa. Los resultados obtenidos para el metabolismo de glucosa del clon CHO-Galk1-2 presentan diferencias con respecto al cultivo control, por lo que se plantea que la sobre-expresión de este gen puede tener efectos positivos en el metabolismo de glucosa. El análisis de flujos metabólicos permite observar un metabolismo eficiente, centrado en la producción de energía, asociado a un alto flujo en el ciclo del TCA, producción de biomasa y producto.
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Estudio del patrón de expresión proteica mediada por señales de calcio en células musculares C2C12 estimuladas eléctricamente

Lorenzo Alvez, Mariana Rocío January 2009 (has links)
Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / El cultivo de células C2C12 de músculo esquelético responde a la depolarización de membrana producida por estimulación eléctrica, generando una señal lenta de calcio. Esto se traduce en un aumento de la concentración de calcio en el núcleo mediada por el receptor de Inositol 1, 4, 5 - trifosfato (IP3R), activando factores transcripcionales y regulando la expresión de ciertos genes tempranos. Esta Memoria de Título relaciona la síntesis proteica en cultivo celular C2C12 con la generación de la señal lenta de calcio intracelular inducida por estimulación eléctrica. En el desarrollo de esta investigación se utilizaron cultivo celular C2C12 diferenciados a miotubos, estimulación eléctrica directa y electroforesis bidimensional en geles de poliacrilamida (2D-PAGE). El análisis de los geles se realizó mediante el programa Flicker; y el análisis estadístico (t de Student con un 95% de confianza) mediante el programa StatGraphics Plus 5.1TM. La identificación de las manchas de proteína de realizó mediante espectrometría de masas (MS) y búsqueda en bases de datos específicas (MASCOT, SwissProt, MS – Fit y ProFound). Los resultados obtenidos permitieron detectar cambios significativos en la expresión proteica de células musculares C2C12 sometidas a estimulación eléctrica. La proteína expresada diferencialmente fue la Hsp70 o proteína de estrés calórico de 70KDa, la que aumentó su expresión en respuesta al estrés producido por la estimulación eléctrica. Esta proteína cumple un importante rol en el metabolismo proteico, facilita la regeneración y reparación del músculo esquelético dañado, previene la agregación y la apoptosis celular y favorece la mantención de la homeostasis en células musculares. / Fondecyt no. 1061154, Centro FONDAP de Estudios Moleculares de la Célula
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La adhesión de linfocitos B a células endoteliales induce la migración preferencial de linfocitos T de memoria central

Neira Villegas, Jocelyn Cecilia January 2008 (has links)
Memoria para optar al título profesional de Bioquímico / La migración de los linfocitos a los órganos linfoides secundarios es un paso crucial en la iniciación de la respuesta inmune adquirida. Este fenómeno es caracterizado por múltiples eventos que requieren de interacciones entre el endotelio y el linfocito, e involucra la participación de diversas moléculas que favorecen la migración de los linfocitos a través de las células endoteliales columnares (HEC). La transmigración es un proceso activo que depende del estado de activación y diferenciación de los linfocitos y de señales específicas de las células endoteliales. Diversos estudios han demostrado que los linfocitos T de memoria migran selectivamente a través de células endoteliales a sitios de inflamación y/o infección. Además, ciertas evidencias sugieren que la expresión de moléculas MHC-II por células endoteliales facilitan el reclutamiento de linfocitos T antígeno específicos, hacia un tejido. Por otra parte, en nuestro laboratorio hemos demostrado que la adhesión de linfocitos B a células endoteliales columnares derivadas de amígdalas humanas (HUTEC) induce la activación endotelial, conduciendo a la producción de diversas citoquinas y quimioquinas. En esta tesis determinamos que la adhesión de linfocitos B a HUTEC permite la presencia de moléculas MHC-II en la superficie endotelial, además de la producción de un patrón de expresión diferencial de quimioquinas, las cuales podrían estar involucradas en la transmigración de los linfocitos. Los resultados muestran que la presencia de moléculas MHC-II en la superficie de las células endoteliales depende de la adhesión de los linfocitos B, pero no de linfocitos T. Sin embargo, MHC-II no se induce a nivel transcripcional, sugiriendo que las HUTEC adquieren moléculas MHC-II de los linfocitos B humanos durante el proceso de adhesión celular. Además, el contacto de los linfocitos B a HUTEC induce la expresión del mRNA de las quimioquinas CCL2, CCL3, CCL5, CCL7, CXCL8, entre otras. Demostramos que el efecto de la adhesión de linfocitos B a HUTEC induce la transmigración de linfocitos T de memoria central. Por otra parte, investigamos el efecto de factores soluble secretados por HUTEC y/o linfocitos B, después del contacto, en la migración transendotelial. Nuestros resultados muestran que no son necesarios los factores solubles para un incremento en la transmigración, aunque estos factores permiten una migración más eficiente de los linfocitos T. En conclusión, estos resultados sugieren que la interacción de linfocitos B con células endoteliales modula la respuesta inmune, favoreciendo la transmigración preferencial de linfocitos T CD4+ de memoria central / Lymphocytes migration to secondary lymphoid organs is a crucial step in the initiation of the acquired immune response. This phenomenon is characterized by multiple events that require interactions between the endothelium and lymphocytes, and involves diverse molecules that favor the migration of T lymphocytes across the high endothelial cells (HEC). Transmigration is an active process that depends on the state of activation and differentiation of T lymphocytes and specific signals of endothelial cells. Diverse studies have demonstrated that memory T lymphocytes selectively migrate across endothelial cells to sites of inflammation and/or infection. In addition, certain evidences suggest that expression of MHC-II molecules by endothelial cells facilitate the recruitment of antigen specific T lymphocytes towards a tissue. On the other hand, in our laboratory we have demonstrated that the adhesion of B lymphocytes to high endothelial cells derived from human tonsils (HUTEC) induces endothelial activation, leading to the production of several cytokines and chemokines. In this thesis we determined that the adhesion of B lymphocytes to HUTEC cells allows the presence of MHC-II molecules on the endothelial surface, in addition to the production of a differential expression pattern of chemokines, which could be involved in the lymphocytes’ transmigration. These results show that the presence of MHC-II molecules on the surface of endothelial cells depends on the adhesion of B lymphocytes, but not T lymphocytes. However, MHC-II is not induced at transcriptional level, suggesting that HUTEC cells acquire MHC-II molecules from human B lymphocytes during the process of cellular adhesion. In addition, the contact of B lymphocytes to HUTEC cells induces the mRNA expression of chemokines such as CCL2, CCL3, CCL5, CCL7, CXCL8, among others. We demonstrated that the effect of the adhesion of B lymphocytes to HUTEC cells induces the memory central T lymphocytes transmigration. In the other hand, we investigated the effect of soluble factors secreted by HUTEC cells and/or B lymphocytes, after the contact between them, in the transendotelial migration. Our results show that although soluble factors are not necessary to increase the transmigration, these factors allow a more efficient migration of T lymphocytes. In conclusion, these results suggest that the interaction of B lymphocytes with endothelial cells modulates the immune response, favoring the preferential transmigration of central memory CD4+ T lymphocytes
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Papel dos gangliosídios de células estromais sobre a proliferação e sobrevivência de células precursoras mielóides

Ziulkoski, Ana Luiza January 2006 (has links)
A mielopoiese depende do estroma mielossuportivo tanto no que diz respeito a produção de fatores de crescimento como de proteoglicanos de heparan-sulfato. O ambiente intercelular formado entre células do estroma e células progenitoras mielóides possui características ácidas, conferidas por moléculas carregadas negativamente e sensíveis a sialidase. Gangliosídios, glicoesfingolipídios contendo pelo menos uma molécula de ácido siálico, têm sido relacionados à modulação de fatores de crescimento e à diferenciação de células hematopoiéticas. Neste trabalho, estudamos a produção, a distribuição e o papel dos gangliosídios em um modelo experimental in vitro de mielopoiese dependente do estroma derivado de fígado fetal murino AFT-024. Utilizamos como sistema de resposta para o monitoramento da disponibilidade e atividade local de GM-CSF a linhagem celular precursora mielóide FDC-P1, a qual é dependente de GM-CSF para sua sobrevivência e proliferação. O GM3 foi o principal gangliosídio produzido pelo estroma, mas não pelas células mielóides, sendo requerido para que a função mielossuoprtiva do estroma seja ótima. Este gangliosídio foi liberado para o sobrenadante de cultura das células AFT-024 e seletivamente incorporado pelas células progenitoras mielóides, onde foi segregado em rafts e colocalizou-se com a cadeia α do receptor de GM-CSF. Além disso, o gangliosídio GM3 foi encontrado na fração insolúvel de células AFT-024 tratadas com Triton X-100 a 4°C, estando presente também nas frações menos densas do fracionamento em gradiente de sacarose, indicando sua presença em rafts. O GM3 captado pelas células FDC-P1 foi metabolizado, gerando gangliosídios das séries a e b, da mesma forma que o GM3 endógeno. Nestas células, o GM1 é o principal gangliosídio, também sendo encontrado na interface entre estroma e células mielóides, mas com colocalização apenas parcial com a cadeia α do receptor de GM-CSF. As imagens de imunocitoquímica ainda revelaram que o GM1 não apresenta colocalização significante com a cadeia β do receptor de GM-CSF, com o gangliosídio GM3, ou com CD44. Em um outro grupo de experimentos, analisamos o perfil de síntese e shedding de gangliosídios em um estroma derivado de medula óssea, a linhagem celular S17; na linhagem celular GRX, derivada de células estreladas hepáticas isoladas de reação fibro-granulomatosa inflamatória; e em cultivos primários de fibroblasto de pele murinos. Além disso, comparamos a habilidade destes estromas para sustentar a sobrevivência e a proliferação das células precursoras mielóides. A concentração de ácido siálico reflete a capacidade mielossuportiva dos estromas. Embora os diferentes estromas sintetizem os mesmos gangliosídios, existem diferenças no conteúdo relativo de cada gangliosídio. Aparentemente, o GM3 é o principal gangliosídio envolvido na modulação da atividade dos fatores de crescimento. O shedding foi similar ao perfil de síntese de gangliosídios, mas a atividade mielossuportiva dos sobrenadantes foi diferente entre os tipos celulares e em relação a sustentação por contato. No entanto, a proliferação das células FDC-P1 diminuiu em todos os sobrenadantes obtidos de células estromais em que a síntese de gangliosídios foi inibida e onde o gangliosídio GM3 foi neutralizado pelo anticorpo monoclonal anti-GM3. As diferenças encontradas na capacidade de sustentação da proliferação de células progenitoras mielóides por fator de crescimento solúvel ou apresentado podem estar relacionadas a diferenças na concentração de gangliosídios inseridos na membrana plasmática ou liberados para o meio de cultura. Sendo assim propomos que as células do estroma mielossuportivo produzem e secretam os fatores de crescimento necessários e seus cofatores, tais como proteoglicanos de heparan-sulfato. O estroma também fornece gangliosídios, os quais são transferidos do estroma para as célulasalvo, onde geram domínios de membrana específicos contendo complexos macromoleculares que incluem os receptores para fatores de crescimento.
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Estabelecimento da técnica de indução da diferenciação celular in vitro de células tronco embrionárias de camundongos em células cardíacas e células nervosas.

Paz, Ana Helena da Rosa January 2006 (has links)
Células tronco são células que possuem a capacidade de originar diferentes tipos celulares maduros. Podem ser classificadas como células tronco embrionárias (células ES), quando isoladas de embriões em estágios iniciais do desenvolvimento; ou como células tronco adultas, quando isoladas de diferentes tecidos de indivíduos adultos. Por outro lado, as células tronco podem ser classificadas conforme o seu potencial de diferenciação celular. Assim, podem ser denominadas como totipotentes, isoladas do embrião, quando este possui até oito células. Células tronco totipotentes possuem a capacidade de gerar todos os tipos celulares oriundos dos três folhetos embrionários, e também podem dar origem aos tecidos formadores dos anexos embrionários. Somente as células totipotentes possuem esta capacidade, e por isso, somente estas, podem gerar um novo indivíduo completo. As células tronco pluripotentes, isoladas de blastocistos ou de carcinomas embrionários, possuem a capacidade de se diferenciar em todos os cerca de 200 tipos de tecidos especializados, que compõem o indivíduo adulto. Contudo, vale ressaltar que as células tronco pluripotentes jamais poderão originar um novo indivíduo. Por fim, existe ainda a classificação de células tronco multipotentes, que possuem a característica de gerar alguns tipos celulares e apresentam uma menor capacidade de multiplicação in vitro, quando comparadas com os outros tipos de células tronco. Estas células podem ser encontradas em diferentes órgãos de indivíduos adultos, como por exemplo, medula óssea, sangue de cordão umbilical, cérebro, fígado e outros. No presente trabalho, visamos o estabelecimento da rotina de manutenção de células tronco embrionárias de camundongo in vitro. Sob a forma indiferenciada e no sistema de indução de diferenciação celular. Para tanto, utilizamos a linhagem de células tronco embrionárias de camundongos, denominada R1. Seguindo protocolos específicos, direcionamos o processo de diferenciação celular para a geração majoritária de células cardíacas e nervosas. Os resultados da diferenciação celular das células tronco embrionárias de camundongos foram analisados a partir da morfologia celular e através da utilização de técnicas de biologia molecular. A obtenção de culturas de células tronco embrionárias enriquecidas em células cardíacas e nervosas comprovou, através do presente trabalho, que os objetivos propostos foram atingidos. Tendo sido estabelecidas, como rotina, em nossa Universidade, as técnicas de cultivo de células ES em estado indiferenciado, e através do método de indução de diferenciação celular in vitro para células cardíacas e nervosas. Os resultados obtidos confirmam os dados descritos na literatura, o que indica que a técnica foi implantada de forma adequada. Assim, adquirimos o domínio das técnicas necessárias para a utilização das ES in vitro como uma nova ferramenta de trabalho podendo ser utilizada em diferentes projetos de pesquisa. / Stem cells are able to originate different cell types. Stem cells can be classified as embryonic stem cells (ES cells) wich can be isolated from pre-implantation embryos; or as adult stem cells wich can be obtained from different adult tissues. On the other hand, stem cells can be classified considering their ability to differentiate into different cell types. Firstly, stem cells can be named as totipotent when isolated from 8 cell stage embryos. Totipotent stem cells are capable to differentiate into all cell types from the three germ layers. Additionally, the totipotent cells can generate the embryonic acessories. This characteristic promotes this cell type as the only cell group able to generate an entire individual. Pluripotent stem cells, isolated from the blastocyst or from embryonic carcinoma (EC), presents the capacity to generate all the 200 cell types that compound the adult individual. It is important to note that the pluripotent stem cells cannot generate a new complete individual. Finally, there is the multipotent stem cells, which can generate some cell types and presents a reduced ability to replicate in vitro when compared with another stem cell types. Multipotent stem cells can be isolated from different adults tissues and organs, for example, bone marrow, umbilical blood cord, brain, liver and others. In the present experiment, we established the routine of in vitro mice embryonic cell culture techniques. On the undifferentiated and into differentiation system. For that we worked with R1 mice stem cell line. Based on described protocols for induction of differentiation system direct to cardiogenesis and neurogenesis. The obtained results from the induction of differentiation were detected by morphological and molecular analyses. The goals of the present study can be verified by the establishment of the ES cell culture system and with the obtained ES culture cells enriched with cardiac and neuronal cells. In this way, we can notice the establishment of the ES cells described techniques by our research group in our University. Our results confirm the described literature data ensuring the well establishment of the ES cell culture system. With this work we acquire the ability to perform in vitro experiments with mice embryonic stem cells, so our group can use these cells as a new research toll which can be applied in different science projects.
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AVALIAÇÃO DO IMIQUIMODE SOBRE A RESPOSTA INATA E O FENÓTIPO FUNCIONAL DE LINFÓCITOS T DURANTE O DESENVOLVIMENTO DO MELANOMA EXPERIMENTAL.

ABREU, CAYO AMARAL 03 1900 (has links)
Submitted by Pós Imunologia (ppgimicsufba@gmail.com) on 2017-07-31T19:06:05Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Cayo Amaral Abreu (1).pdf: 920431 bytes, checksum: ab2e71045643d125d189674441bd23b6 (MD5) / Approved for entry into archive by Edvaldo Souza (edvaldosouza@ufba.br) on 2017-08-01T20:27:18Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação Cayo Amaral Abreu (1).pdf: 920431 bytes, checksum: ab2e71045643d125d189674441bd23b6 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-01T20:27:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Cayo Amaral Abreu (1).pdf: 920431 bytes, checksum: ab2e71045643d125d189674441bd23b6 (MD5) / PAPES/CNPq, CAPES / O melanoma é um tipo de tumor de pele com altas taxas de incidências por todo mundo. Buscando formas de terapia auxiliar, destaca-se o Imiquimode (IMIQ), um creme de uso tópico que atua no receptor tipo toll-7 (TLR-7) estimulando o sistema imune inato a promover atividades tumoricidas. No presente estudo o tumor de linhagem B16F0 foi inoculado na orelha dos camundongos, seguidos do tratamento com o creme IMIQ. A mortalidade e o desenvolvimento tumoral foram acompanhados, nos diferentes grupos experimentais. Após 12 dias de tratamento, baços e linfonodos cervicais foram removidos em grupos de animais tratados e não tratados. As células foram colocadas em cultivo, plaqueadas e marcadas para análise em citômetro de fluxo. Grupos tratados com IMIQ apresentaram considerável eficácia no aumento da sobrevida e na contenção do tumor. Além disso, foi demonstrado que a atividade antitumoral é dependente da molécula de CD1, comprovando a importância das células NKT no combate ao melanoma. Ademais, nos grupos tratados, houve maior produção de IFN-γ por linfócitos TCD8 esplênicos, e TNF-α por células TCD4 e TCD8 de linfonodos drenantes. Pôde-se ainda notar o aumento de granzima B (GZB) produzida por células dendríticas (DCs) no baço de animais com melanoma. Já na estimulação de esplenócitos com o mitógeno Concanavalina A, foi evidenciada inibição na produção de GZB por células dendríticas. Conclui-se que NKT pode ser a principal responsável pela migração dessa população celular e que a produção de GZB por DCs pode ser inibida mediante a presença de antígenos tumorais. / Melanoma is a type of skin tumor with high incidence rates worldwide. Aiming for forms of auxiliary therapy, Imiquimode (IMIQ), a topical cream that acts on the toll-7 receptor (TLR-7), stimulates the innate immune system to promote tumoricidal activities. In the present study the B16F0 lineage tumor was inoculated into the ears of the mice, followed by treatment with the IMIQ cream. Mortality and tumor development were monitored in the different experimental groups. After 12 days of treatment, spleens and cervical lymph nodes were removed in groups of treated and untreated animals. Cells were plated, plated and labeled for flow cytometer analysis. Groups treated with IMIQ showed considerable efficacy in increasing survival and tumor containment. In addition, it has been demonstrated that the antitumor activity is dependent on the CD1 molecule, proving the importance of NKT cells in the fight against melanoma. In addition, in the treated groups, there was a greater production of IFN-γ by splenic TCD8 lymphocytes, and TNF-α by TCD4 and TCD8 cells from draining lymph nodes. It was also possible to note the increase of granzyme B (GZB) produced by dendritic cells (DCs) in the spleen of animals with melanoma. Already in the stimulation of splenocytes with the mitogen Concanavalin A, inhibition was demonstrated in the production of GZB by dendritic cells. It is concluded that NKT may be the main responsible for the migration of this cell population and that the production of GZB by DCs can be inhibited by the presence of tumor antigens.
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Adenosine production via CD39/CD73 pathway promotes Leishmania amazonensis survival in macrophages.

Bajracharya, Bijay January 2014 (has links)
Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto. / Submitted by Maurílio Figueiredo (maurilioafigueiredo@yahoo.com.br) on 2014-10-10T20:16:09Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) TESE_AdenosineProductionCD39.pdf: 1471044 bytes, checksum: 2af62f7d8c073380843cd9a8ae7ce6be (MD5) / Approved for entry into archive by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2014-11-07T12:09:27Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) TESE_AdenosineProductionCD39.pdf: 1471044 bytes, checksum: 2af62f7d8c073380843cd9a8ae7ce6be (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-07T12:09:27Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) TESE_AdenosineProductionCD39.pdf: 1471044 bytes, checksum: 2af62f7d8c073380843cd9a8ae7ce6be (MD5) Previous issue date: 2014 / Item withdrawn by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2014-12-05T12:14:11Z Item was in collections: PPCBIOL - Doutorado (Teses) (ID: 17) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) TESE_AdenosineProductionCD39.pdf: 1471044 bytes, checksum: 2af62f7d8c073380843cd9a8ae7ce6be (MD5) / Item reinstated by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2015-12-15T16:43:13Z Item was in collections: PPCBIOL - Doutorado (Teses) (ID: 17) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) TESE_AdenosineProductionCD39.pdf: 1471044 bytes, checksum: 2af62f7d8c073380843cd9a8ae7ce6be (MD5) / A leishmaniose cutânea (CL), causada por L. amazonensis, é caracterizada por uma intensa imuno- supressão e multiplicação descontrolada do parasito em modelos experimentais e é geralmente grave em humanos, variando desde a forma cutânea até a cutâneo-difusa. Não existem mecanismos precisos conhecidos sobre como L. amazonensis modula a resposta imunológica para que os macrófagos (MФ) infectados com L. amazonensis se tornem refratários à ativação por células T efetoras. Aqui, nós investigamos o possível mecanismo regulador que Leishmania provavelmente pode induzir em MФ residentes durante a interação precoce, de modo a impedir ativação das células. Neste estudo, analisou-se a expressão de CD39 e CD73, por citometria de fluxo, em MФ peritoneais murinos infectados com promastigotas metacíclicas de L. amazonensis e também a porcentagem dessas células que expressam a CD39 e CD73 foi avaliada. Nossos resultados mostraram que em 72hrs inativos os MФ tiveram baixa expressão de CD73. Curiosamente, no entanto, ao contrário de MФ tratados com LPS os infectados com L. amazonensis expressaram altos níveis de CD73. Esta informação foi posteriormente validada pelos resultados de estudos no contexto ex-vivo que mostrou igualmente que MФ infectados são predominantemente CD73+. Quando as atividades enzimáticas de CD39 e CD73 foram bloqueadas, tal como pelo uso de DIDS e MAD αβ, tanto a infecção quanto o número de amastigotas diminuiu significativamente após 48 horas de incubação. Da mesma forma, a inibição dos receptores de adenosina A2a e A2b de ZM241385 e MRS1754 também apresentou os mesmos efeitos sobre a sobrevivência do parasito e infectividade. Em estudo posterior, em busca de um possível papel da HIF- 1α na infecção por Leishmania, investigamos os efeitos da FM19G11, inibidor do HIF- 1α, na expressão de CD39 e CD73, bem como na infecção parasitária . Observou-se que, apesar de HIF - 1α poder influenciar na sobrevivência do parasito, os seus efeitos sobre a expressão de CD39 e CD73 não eram visíveis. Também foi avaliada, por PCR em tempo real, a expressão de receptores de adenosina em populações infectadas, nas quais não se observou nenhuma mudança significativa na expressão após 24 horas de infecção. Além disso, também foi avaliada a produção de citocinas, tais como TNF- α e IL-10 a partir da produção de NO nos grupos tratados. Surpreendentemente, não houve variação nos níveis destes mediadores, sugerindo a existência de outros mecanismos independentes da mediação por citocina para produção de Óxido Nítrico, tais como a produção de ROS ou efeitos leishmanacidas independentes do triptofano. Concluindo, nossos dados mostram que a infecção por L. amazonensis regula a expressão CD73 durante 24 horas de infecção e sua sobrevivência depende de atividades enzimáticas, bem como de receptores A2a e A2b. __________________________________________________________________________________________ / ABSTRACT:Cutaneous leishmaniasis (CL) caused by L. amazonensis is characterized by intense immune-suppression and uncontrolled parasite multiplication in experimental models and is usually severe in humans ranging from cutaneous to diffuse cutaneous leishmaniasis. There are no precise mechanisms known how L. amazonensis modulates immune response so that macrophages (MФ) infected with L. amazonensis are refractory to activation by effector T cells. Here, we investigated the possible regulatory mechanism that Leishmania can likely induce in host MФ during early interaction so as to prevent their host cells from activation. In this study, we analyzed the expression of CD39 and CD73, by flow cytometry, in murine peritoneal MФ infected with metacyclic promastigotes of L. amazonensis and percentage of those cells expressing CD39 and CD73 was evaluated. Our results showed that 72hrs rested MФ down regulated CD73 expression. Interestingly, however, unlike LPS treated MФ, L. amazonensis infected MФ up regulated CD73 expression. This data was further validated by the findings from in ex-vivo studies which equally support that infected MФ are predominantly CD73 positive. When CD39 and CD73 enzymatic activities were blocked such as by the use of DIDS and αβ MAD, both infection and amastigote number decreased significantly within 48hrs of incubation. Similarly, inhibition of adenosine receptors A2a and A2b by ZM241385 and MRS1754 also had the same effects on the parasite survival and infection. In another study, in search of a possible role of HIF-1α in Leishmania infection, we investigated the effects of FM19G11, inhibitor of HIF-1α, on expression of CD39 and CD73 as well as parasitic infection. We observed that although HIF-1α can influence in the parasite survival, their effects on CD39 and CD73 expression were not visible. We also evaluated the expression of adenosine receptors in infected population by real time PCR in which we observed no significant change in the expression after 24hrs of infection. Moreover, we also evaluated cytokine production such as TNF-alpha, IL-10 and NO production from the treated groups. Surprisingly, there was no alternation in the levels of these mediators suggesting other mechanisms, independent of cytokine mediated nitric oxide production such as ROS production or tryptophan independent oxygen anti-leishmanacidal effects, involved in it. In conclusion, our data show that L. amazonensis infected up regulates CD73 expression during 24hrs of infection and its survival is dependent on enzyme activities as well as A2a and A2b receptors.
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Aspectos genéticos e celulares do diabetes mellitus tipo 1

Chagastelles, Pedro Cesar January 2010 (has links)
O Diabetes mellitus tipo 1 (DM1), na maioria dos casos, é causado pela destruição de células β pancreáticas, levando à hiperglicemia. Atualmente a única fonte de novas células β e os únicos tratamentos capazes de restaurar o padrão fisiológico de secreção de insulina nesses pacientes são o transplante de pâncreas e de ilhotas pancreáticas. O transplante de ilhotas apresenta problemas relacionados a enxertia, devido principalmente a baixa vascularização, o que leva à morte de células β nos primeiros dias pós-transplante. Células-tronco mesenquimais apresentam características interessantes para o tratamento do DM1. A primeira aplicação explorada nesse trabalho foi a capacidade de diferenciação de MSCs humanas e murinas em células produtoras de insulina (CPIs). A identidade das células isoladas foi confirmada pela caracterização imunofenotípica e pela capacidade de diferenciação adipogênica e osteogênica in vitro. Quatro protocolos de diferenciação em CPIs foram testados em MSCs derivadas de ilhotas pancreáticas e um em MSCs derivadas de rim murino. A análise da expressão gênica de insulina em células diferenciadas em todos os protocolos testados mostrou níveis insignificantes ou nulos de expressão desse hormônio. A segunda aplicação explorou o co-transplante de ilhotas pancreáticas com MSCs derivadas de rim em camundongos diabéticos. Os resultados mostraram aumento da taxa de cura e melhora na glicemia pós-transplante, bem como uma tendência ao aumento do conteúdo total de insulina em animais co-transplantados em comparação com animais que receberam apenas ilhotas. Não houve diferenças no peso e teste de tolerância à glicose entre os grupos. Foi observado aumento na vascularização do enxerto nos animais que receberam MSCs. Paralelamente, foi estudada a associação de variantes alélicas dos genes PTPN22, KIR, HLA classe I e II e a susceptibilidade ao desenvolvimento de DM1 em uma população do Rio Grande do Sul. Foi observada associação entre o alelo 1858T e o risco aumentado de DM1. A genotipagem do KIR e HLA-C mostrou uma frequência maior de alelos do grupo 2 do HLA-C em controles não diabéticos, bem como o genótipo 2DL1/C2+, sugerindo um papel protetor desse genótipo. Além disso, indivíduos com haplótipo KIR2DL2/DR3+ e KIR2DL2/DR3/DR4+ tem risco aumentado de desenvolvimento de DM1. MSCs parecem possuir baixa capacidade de diferenciação em células β in vitro, entretanto, possuem efeitos benéficos importantes quando cotransplantadas com ilhotas pancreáticas. Essa aplicação tem grande potencial e deveria ser testada em estudos clínicos com o objetivo de melhorar a enxertia e diminuir o número de ilhotas necessárias para cada paciente. / Type 1 Diabetes (DM1), in almost all the cases, is caused by the destruction of beta-cells by cells of the immune system, leading to hyperglycemia. The only source for new beta-cells available is through the pancreas and islet transplantation, two treatments able to restore insulin secretion pattern in this patients. Islet transplantation presents issues related to grafting, caused mainly by poor vascularisation post-transplant, leading to betacell death in the first days after transplantation. Mesenchymal stem cells have interesting characteristics to the treatment of DM1. The first application explored in this work was testing the capacity of differentiation of human and mouse MSCs into insulin-producing cells (CPIs). Identity of isolated cells was confirmed by immunophenotyping and potential of adipogenic and osteogenic differentiation in vitro. Four protocols were tested in human islet-derived MSCs and one in mouse kidney-derived MSCs to generate CPIs. Analysis of insulin expression in differentiated cells from all protocols showed no or very little expression levels of this hormone. The second application was to evaluate the role of MSCs in the co-transplantation with pancreatic islets in diabetes mice. Our results showed an increased number of cured mice and a decrease in glycemic levels post transplant in islet+MSCs group, as well as a tendency to an increase in total insulin content in islet+MSCs compared with islet-only group. No differences could be found in weight and intraperitoneal glucose tolerance test between groups. An increase in graft vascularisation was observed in MSCs-receiving animals. At the same time, we studied the association of allelic variants in PTPN22, KIR, HLA class I and II genes and its association with the developing of DM1. We reported and association of the 1858T allele and an increased risk of DM1. Genotyping shows an increased frequency of group 2 alleles (C2) of HLA-C in controls as well as the 2DL1/C2+ genotype, suggesting a protective role of this genotype. Moreover, individuals with KIR2DL2/DR3+ and KIR2DL2/DR3/DR4+ haplotypes have increased risk of developing DM1. MSCs seem to have low capacity of in vitro differentiation in a beta-cell phenotype, however, they exert important benefic effects when co-transplanted with pancreatic islets in diabetic mice. This application has great potential and should be tested in clinical trials aiming the improvement of islet grafting and decrease in the number of islets needed for transplantation.
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Aspectos genéticos e celulares do diabetes mellitus tipo 1

Chagastelles, Pedro Cesar January 2010 (has links)
O Diabetes mellitus tipo 1 (DM1), na maioria dos casos, é causado pela destruição de células β pancreáticas, levando à hiperglicemia. Atualmente a única fonte de novas células β e os únicos tratamentos capazes de restaurar o padrão fisiológico de secreção de insulina nesses pacientes são o transplante de pâncreas e de ilhotas pancreáticas. O transplante de ilhotas apresenta problemas relacionados a enxertia, devido principalmente a baixa vascularização, o que leva à morte de células β nos primeiros dias pós-transplante. Células-tronco mesenquimais apresentam características interessantes para o tratamento do DM1. A primeira aplicação explorada nesse trabalho foi a capacidade de diferenciação de MSCs humanas e murinas em células produtoras de insulina (CPIs). A identidade das células isoladas foi confirmada pela caracterização imunofenotípica e pela capacidade de diferenciação adipogênica e osteogênica in vitro. Quatro protocolos de diferenciação em CPIs foram testados em MSCs derivadas de ilhotas pancreáticas e um em MSCs derivadas de rim murino. A análise da expressão gênica de insulina em células diferenciadas em todos os protocolos testados mostrou níveis insignificantes ou nulos de expressão desse hormônio. A segunda aplicação explorou o co-transplante de ilhotas pancreáticas com MSCs derivadas de rim em camundongos diabéticos. Os resultados mostraram aumento da taxa de cura e melhora na glicemia pós-transplante, bem como uma tendência ao aumento do conteúdo total de insulina em animais co-transplantados em comparação com animais que receberam apenas ilhotas. Não houve diferenças no peso e teste de tolerância à glicose entre os grupos. Foi observado aumento na vascularização do enxerto nos animais que receberam MSCs. Paralelamente, foi estudada a associação de variantes alélicas dos genes PTPN22, KIR, HLA classe I e II e a susceptibilidade ao desenvolvimento de DM1 em uma população do Rio Grande do Sul. Foi observada associação entre o alelo 1858T e o risco aumentado de DM1. A genotipagem do KIR e HLA-C mostrou uma frequência maior de alelos do grupo 2 do HLA-C em controles não diabéticos, bem como o genótipo 2DL1/C2+, sugerindo um papel protetor desse genótipo. Além disso, indivíduos com haplótipo KIR2DL2/DR3+ e KIR2DL2/DR3/DR4+ tem risco aumentado de desenvolvimento de DM1. MSCs parecem possuir baixa capacidade de diferenciação em células β in vitro, entretanto, possuem efeitos benéficos importantes quando cotransplantadas com ilhotas pancreáticas. Essa aplicação tem grande potencial e deveria ser testada em estudos clínicos com o objetivo de melhorar a enxertia e diminuir o número de ilhotas necessárias para cada paciente. / Type 1 Diabetes (DM1), in almost all the cases, is caused by the destruction of beta-cells by cells of the immune system, leading to hyperglycemia. The only source for new beta-cells available is through the pancreas and islet transplantation, two treatments able to restore insulin secretion pattern in this patients. Islet transplantation presents issues related to grafting, caused mainly by poor vascularisation post-transplant, leading to betacell death in the first days after transplantation. Mesenchymal stem cells have interesting characteristics to the treatment of DM1. The first application explored in this work was testing the capacity of differentiation of human and mouse MSCs into insulin-producing cells (CPIs). Identity of isolated cells was confirmed by immunophenotyping and potential of adipogenic and osteogenic differentiation in vitro. Four protocols were tested in human islet-derived MSCs and one in mouse kidney-derived MSCs to generate CPIs. Analysis of insulin expression in differentiated cells from all protocols showed no or very little expression levels of this hormone. The second application was to evaluate the role of MSCs in the co-transplantation with pancreatic islets in diabetes mice. Our results showed an increased number of cured mice and a decrease in glycemic levels post transplant in islet+MSCs group, as well as a tendency to an increase in total insulin content in islet+MSCs compared with islet-only group. No differences could be found in weight and intraperitoneal glucose tolerance test between groups. An increase in graft vascularisation was observed in MSCs-receiving animals. At the same time, we studied the association of allelic variants in PTPN22, KIR, HLA class I and II genes and its association with the developing of DM1. We reported and association of the 1858T allele and an increased risk of DM1. Genotyping shows an increased frequency of group 2 alleles (C2) of HLA-C in controls as well as the 2DL1/C2+ genotype, suggesting a protective role of this genotype. Moreover, individuals with KIR2DL2/DR3+ and KIR2DL2/DR3/DR4+ haplotypes have increased risk of developing DM1. MSCs seem to have low capacity of in vitro differentiation in a beta-cell phenotype, however, they exert important benefic effects when co-transplanted with pancreatic islets in diabetic mice. This application has great potential and should be tested in clinical trials aiming the improvement of islet grafting and decrease in the number of islets needed for transplantation.

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