Made available in DSpace on 2018-08-01T22:56:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_9027_Lívia Reisen Perin.PDF: 49 bytes, checksum: 8c6e65937148973000b4ea24ffddbae3 (MD5) Previous issue date: 2017-02-13 / O tratamento para a leishmaniose tegumentar e visceral tem um custo elevado e uma alta toxidade para o organismo, com isso, vem-se buscando alternativas. O alfabisabolol, um óleo essencial presente em várias plantas, é descrito como um bom agente leishmanicida. O objetivo do trabalho foi avaliar o efeito in vitro, de diferentes concentrações, do alfa-bisabolol e seus derivados sintéticos sobre os macrófagos e formas promastigotas e amastigotas de Leishmania amazonensis e L. infantum. Avaliar se os derivados tem resultados melhores contra os parasitos e menor toxicidade, que o alfa-bisabolol. Para atividade contra as formas promastigotas, a L. amazonensis e L. infantum foram plaqueadas em placas de 96 poços e tratadas com diferentes concentrações do alfa-bisabolol e seus derivados (P1, P2 e P3), em um experimento foi feito a contagem das Leishmania spp. em microscópio óptico nos tempos de 24, 48 e 72 horas e no outro foi avaliado a viabilidade e feito o IC50 de cada composto no tempo de 48 horas. No teste de citotoxicidade, macrófagos foram plaqueados em placas de 96 poços e tratados com as mesmas concentrações dos compostos da avaliação das formas promastigotas, após 48 horas foi analisado a viabilidade e o CC50. Na avaliação da atividade contra as formas amastigotas, os macrófagos foram infectados e tratados com diferentes concentrações dos compostos. Após 48 horas de tratamento foi observado em microscópio óptico a porcentagem de macrófagos infectados e o número de amastigotas para cada macrófago. Foi calculado o índice de seletividade através da divisão do CC50 dos macrófagos pela IC50 das Leishmania spp. Para avaliação da carga intracelular de Leishmania spp. foi feito a infecção dos macrófagos e após as 48 horas de tratamento as células foram lisadas para liberar as amastigotas e analisar a viabilidade e a capacidade das mesmas se transformarem novamente em promastigotas. Foi analisado a morfologia, em microscópio óptico, de promastigotas tratadas com os compostos. Os resultados foram avaliados pela análise de variância (ANOVA) e teste de tukey para comparação das médias e feito o cálculo do IC50, com o software GraphPad Prism 5.0.4. O alfa-bisabolol (IC50: 3,43 µg/mL) apresentou uma melhor atividade contra as formas promastigotas da L. amazonensis, para a L. infantum o melhor foi P1 (IC50: 9,1 µg/mL). O composto com menor toxidade para os macrófagos foi o P3 (CC50: 31,23 µg/mL). Na atividade contra as formas amastigotas o P3 (IC50: 3,39 µg/mL) e o alfa-bisabolol (IC50: 7,629 µg/mL) foram melhores para a L. amazonensis e L. infantum, respectivamente. Considerando o índice de seletividade alfa-bisabolol e o P1 foram mais promissores para as formas promastigotas de L. amazonensis e L. infantum, respectivamente. E para a forma amastigota o derivado P3 foi melhor. Além disso, todos os compostos diminuem a capacidade das amastigotas de se transformarem novamente em promastigotas Observou que as promastigotas tratadas tinham presença de vacúolos e alteração do formato, mudança no número de núcleos e cinetoplasto.

Titulo Ingeniero en Biotecnología Molecular

Doctora en Ciencias de la Ingeniería, Mención Ingeniería Química y Biotecnología / Las células animales son uno de los principales sistemas para la producción de biofármacos, sin embargo la mayoría de las estrategias para mejorar su productividad no están respaldadas por conocimiento específico para las líneas celulares usadas en la industria. En este trabajo se reconstruye un modelo a escala genómica para células CHO para ampliar el conocimiento de procesos celulares asociados con productividad en la síntesis de biofármacos. Para lograr este objetivo analizamos el modelo a escala genómica de ratón iMM1415 usando herramientas desarrolladas para explorar el efecto de knockout de genes y determinación de flujos en crecimiento celular. Nuestros resultados muestran que esta red metabólica está dominada por metabolismo de lípidos. Adicionalmente, confirmamos que un enfoque de sampleo, donde se explora el espacio de soluciones en vez de imponer un objetivo de optimización, es más apropiado para el estudio del metabolismo en sistemas complejos como células animales. Posteriormente, se desarrolla en estudio comparativo de las herramientas desarrolladas para la generación automática de modelos preliminares, donde los resultados obtenidos utilizando tres algoritmos (modelSEED, Pantograph y Pathway tools) muestran que Pantograph es la herramienta más apropiada para la generación de un modelo a escala genómica de células CHO. Este algoritmo produce un modelo basándose en un modelo previo y ortología entre ambos organismos, produciendo un modelo preliminar que hereda características como asociaciones de genes distintas para distintos organelos celulares lo que es crucial para potenciales aplicaciones de modelos para eucariontes. El modelo iNJ1301 para células CHO es reconstruido de acuerdo a la metodología propuesta basándose en iMM1415 y el modelo humano Recon 1. iNJ1301 tiene 3,709 reacciones asociadas a 1,301 genes y fue validado con información experimental para esta línea celular prediciendo correctamente el crecimiento celular en un 88% de los casos simulados. Adicionalmente, este modelo es reducido imponiendo cambios en expresión de genes reportados para representar un metabolismo ineficiente del carbono caracterizado por síntesis de lactato y el shift metabólico observado en esta línea celular, mostrando el potencial de este enfoque para ser usado en la integración de datos transcriptómicos. Al utilizar un nuevo enfoque basado en ortología se pudieron encontrar nuevas asociaciones de genes no incluídas en reconstrucciones creadas utilizando metodologías clásicas para la generación de modelos, por lo que los resultados de este trabajo fueron incorporadas en el modelo consenso iCHO1766. La identificación de marcadores asociados a productividad mejorada en células CHO ha sido abordada desde la perspectiva genómica, transcriptómica y proteómica. En este trabajo integramos datos transcriptómicos para dos clones de células CHO que muestran distintos perfiles de productividad en el modelo iNJ1301. Datos de un alto (HP) y bajo (LP) productor de IgG son integrados al modelo usando iMAT (integrative metabolic analysis tool) obteniéndose modelos reducidos que presentan una alta conservación de vías metabólicas de glutatión y azúcares nucleotídicos. Este enfoque es luego acoplado con sampleo de las redes metabólicas encontrándose que ambos modelos presentan comportamientos distintos, donde el clon HP está enfocado en el uso del ciclo del TCA y la vía pentosas fosfato. Finalmente, concluimos que este enfoque que combina distintas herramientas utilizadas en biología de sistemas es una nueva herramienta que permite el estudio exhaustivo de sistemas biológicos complejos tales como líneas celulares animales.

Ingeniera Civil en Biotecnología / Aristotelia chilensis (Eleaocarpáceas), comúnmente conocida como maqui, es una especie vegetal distribuida en el Centro y Sur de Chile. El fruto de esta planta es de gran interés para la industria alimenticia y farmacológica debido a que posee potentes capacidades antioxidantes. Lo anterior es producto de su elevado contenido de antocianinas, en particular de delfinidinas, metabolitos secundarios implicados en la formación de la pigmentación azul y en la protección de las plantas contra la luz ultravioleta (UV). Actualmente, la producción frutícola de maqui se basa principalmente en la recolección del fruto desde árboles en condiciones silvestres. Además, su producción se ve limitada por la estacionalidad del fruto, que sólo se da en temporada de verano. Estas limitantes impiden que la demanda creciente de maqui se vea satisfecha. Debido a lo anterior, resulta fundamental la búsqueda de nuevas estrategias biotecnológicas para la producción de extractos ricos en antocianinas de maqui. El presente trabajo tiene por objetivo el desarrollo de una estrategia para la producción de extractos ricos en antocianinas a partir de cultivos celulares de A. chilensis. Para lograr lo anterior se estudió la inducción callogénica a partir de diferentes explantes (embrión, cotiledón y hoja) en diferentes combinaciones y concentraciones de reguladores del crecimiento. Las condiciones de cultivo que indujeron la formación de callos de maqui fueron medio Murashige & Skoog 4,43[g/L] con 3% de sacarosa, 0,7% de agar y la adición de las hormonas kinetina y NAA 1[mg/L] cada una. Además, para el mantenimiento de los callos inducidos, el medio de cultivo Gamborg b-5 3,21[g/L] brindó una mayor velocidad de crecimiento y aumento de biomasa. Posteriormente, se establecieron cultivos de células en suspensión en medio Murashige & Skoog 4,43[g/L] con 3% de sacarosa, 1[mg/L] de kinetina y NAA y exposición a luz (16 h luz; 8 h oscuridad). Los cultivos en suspensión fueron elicitados por medio de metil jasmonato (MJ) 100 µM y ácido abscísico (ABA) 100 µM, los cuales no entregaron resultados positivos en la producción de antocianinas. Además, se estableció un cultivo en suspensión con medio Gamborg b-5 3,21[g/L] con 3% de sacarosa, 2[mg/L] de 2,4-D y exposición a luz (16 h luz; 8 h oscuridad); el cual presentó características de crecimiento positivas, alcanzado una concentración de biomasa final de más de 5 veces la concentración inicial del cultivo. Asimismo, se estableció una línea de callos iniciados a partir de embriones y mantenidos en medio Gamborg b-5 3,21[g/L] con 3% de sacarosa, 0,7% de agar, 2[mg/L] de auxina 2,4-D y exposición a fotoperiodo (16 h luz; 8 h oscuridad). Esta línea presentó una pigmentación color violeta oscuro producto de la síntesis de antocianinas por parte de sus células. Análisis de los callos por medio de HPLC-PAD-MS revelaron la presencia de los mismos tipos de antocianinas presentes en el fruto de A. chilensis. Sin embargo, los perfiles de antocianinas fueron diferentes a los del fruto, conteniendo principalmente cianidinas. Finalmente, en el presente trabajo de tesis fue posible el establecimiento de cultivos celulares productores de antocianinas. Sin embargo, es necesaria la identificación de las variables críticas del proceso de producción de estos metabolitos, con el objetivo de maximizar su síntesis, particularmente la síntesis de delfinidinas glicosiladas.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La contaminación de los cultivos celulares por Mycoplasma spp. dificulta tanto la investigación básica como el desarrollo y producción de productos biológicos. Los efectos de esta bacteria en las células cultivadas son cambios en el metabolismo, propiedades inmunológicas y bioquímicas, crecimiento, viabilidad, etc. La infección de cultivos celulares con Mycoplasma spp. puede no ser detectada por inspección visual o microscopía común, por lo tanto, es importante realizar evaluaciones periódicas de rutina con un método rápido, altamente sensible y específico. En consideración a lo anterior, esta memoria de título se basó en el diagnóstico molecular de Mycoplasma spp., mediante la detección del gen 16S rRNA utilizando la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa convencional, en muestras procedentes de cultivos celulares de distintos laboratorios de la Universidad de Chile y del Instituto de Salud Pública de Chile. Los resultados obtenidos tanto en los controles positivos como en los controles negativos, permitieron validar este método en la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias y al aplicarlo en muestras sospechosas, se logró la detección positiva en una muestra procedente del Instituto de Ciencias Biomédicas de la Universidad de Chile. Este hallazgo, fue confirmado por alineamiento de secuencias nucleotídicas respecto de datos oficiales del GenBank®, utilizando los programas Clustal W y BLAST, ambos de acceso gratuito on line que entregaron un 97% de porcentaje de identidad nucleotídica respecto de Mycoplasma spp

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / El cultivo de células C2C12 de músculo esquelético responde a la depolarización de membrana producida por estimulación eléctrica, generando una señal lenta de calcio. Esto se traduce en un aumento de la concentración de calcio en el núcleo mediada por el receptor de Inositol 1, 4, 5 - trifosfato (IP3R), activando factores transcripcionales y regulando la expresión de ciertos genes tempranos. Esta Memoria de Título relaciona la síntesis proteica en cultivo celular C2C12 con la generación de la señal lenta de calcio intracelular inducida por estimulación eléctrica. En el desarrollo de esta investigación se utilizaron cultivo celular C2C12 diferenciados a miotubos, estimulación eléctrica directa y electroforesis bidimensional en geles de poliacrilamida (2D-PAGE). El análisis de los geles se realizó mediante el programa Flicker; y el análisis estadístico (t de Student con un 95% de confianza) mediante el programa StatGraphics Plus 5.1TM. La identificación de las manchas de proteína de realizó mediante espectrometría de masas (MS) y búsqueda en bases de datos específicas (MASCOT, SwissProt, MS – Fit y ProFound). Los resultados obtenidos permitieron detectar cambios significativos en la expresión proteica de células musculares C2C12 sometidas a estimulación eléctrica. La proteína expresada diferencialmente fue la Hsp70 o proteína de estrés calórico de 70KDa, la que aumentó su expresión en respuesta al estrés producido por la estimulación eléctrica. Esta proteína cumple un importante rol en el metabolismo proteico, facilita la regeneración y reparación del músculo esquelético dañado, previene la agregación y la apoptosis celular y favorece la mantención de la homeostasis en células musculares. / Fondecyt no. 1061154, Centro FONDAP de Estudios Moleculares de la Célula

La biotecnología ha adquirido un rol fundamental en la industria de producción de biofármacos, la cual ofrece nuevas alternativas para el tratamiento de diversas enfermedades. Entre los más utilizados están los anticuerpos monoclonales, los cuales se utilizan para el tratamiento de enfermedades autoinmunes, cáncer, rechazo de transplante renal, tratamiento de cardiopatía coronaria, prevención de enfermedades infecciosas, diagnóstico clínico, aplicaciones industriales e investigación. Son producidos principalmente por células modificadas genéticamente, como por ejemplo la línea celular CHO-K1. En este caso, se produce el anticuerpo monoclonal recombinante anti factor de necrosis tumoral alfa, el cual se utiliza en el tratamiento de artritis reumatoide y otras enfermedades. Es por ello que se planteó desarrollar un cultivo celular en suspensión libre de componentes animales para realizar ensayos preclínicos, para la posterior administración de este anticuerpo a pacientes que lo necesitan. Se purificaron desde un cultivo bacteriano de Escherichia coli DH5α los plasmidios que contienen los genes que codifican para las cadenas del anticuerpo, se co-transfectaron células CHO-K1 con aquellos plasmidios, se seleccionó el mejor clon productor, y se caracterizó su crecimiento en adherencia suplementado con 10%, 0% v/v suero fetal bovino (FBS), y en suspensión en matraces Erlenmeyer sin FBS, proceso que fue realizado luego de muchos pasajes sucesivos. El estado metabólico de cada condición se puede apreciar en la razón lactato producido sobre glucosa consumida. Se observó que al cambiar el FBS por diversos suplementos alimenticios, la concentración de células viables máxima (de 1,87∙106 cels/ml a 1,17∙106 cels/ml), viabilidad y tasa específica de crecimiento (de 0,038 hr-1 a 0,027 hr-1) disminuyeron ligeramente, y la productividad de anticuerpo medida en absorbancia a 405 nm (de 0,155 a 0,414) y la tasa específica de absorbancia (de 0,0083 [106 /(hr x cels)] a 0,012 [106 /(hr x cels)]) aumentaron ligeramente, lo cual muestra que el cambio de medio de cultivo hizo que el clon creciera más lentamente, pero fuera un mejor productor. Los cambios más drásticos en las variables medidas fueron observados en el cultivo en suspensión sin FBS, las cuales siguieron la misma tendencia anterior (concentración de células viables máxima de 0,34∙106 cels/ml y tasa específica de crecimiento de 0,009 hr-1), con la excepción de la productividad de anticuerpo, ya que la concentración de células viables fue demasiado baja para mostrar una producción de anticuerpo significativa. Además, la concentración de lactato estuvo en niveles inhibitorios al segundo día de cultivo. Analizando los perfiles metabólicos, se observó que las células en suspensión utilizaron la energía sólo para mantención, crecieron muy poco y luego murieron. Este fenómeno pudo haber ocurrido porque no se utilizó el medio de cultivo, concentración de nutrientes, suplementos, estrategia de alimentación, modo de operación del biorreactor, protocolo de adaptación y/o vectores de expresión adecuados, con lo cual queda propuesta una serie de estrategias para mejorar el comportamiento de los clones en cultivos futuros.

Ingeniero Civil en Biotecnología / Ingeniero Civil Químico / Debido a que el hígado posee funciones únicas, es de gran interés desarrollar herramientas que permitan conseguir un mejor entendimiento global del comportamiento de las células hepáticas bajo cambios de las condiciones de crecimiento causado por agentes externos, tales como cambios en la suplementación de la fuente de carbono o la utilización de drogas en el medio de cultivo. El objetivo de este de esta memoria es establecer una metodología que permita realizar estudios metabólicos en células de origen hepático, con herramientas in silico que complemente los trabajos de investigaciones in vitro. Para ello, se utilizará la línea celular HepG2, ya que presenta ventajas frente a otras células de origen hepático, como su alta capacidad proliferativa y su fenotipo estable. Junto a esto se diseñó un modelo hepático para describir el metabolismo intracelular, que considera 37 metabolitos y 32 reacciones, abarcando las principales vías metabólicas de una célula hepática. En un primer estudio experimental se analizó como afecta en el metabolismo de las células la aplicación de agente nocivo acetaminofén (APAP), y si el daño es contrarrestable utilizando N-acetilcisteína (NAC) como agente protector. Como resultado se obtuvo que la concentración utilizada de APAP en el medio (1 [mM]) es altamente tóxica ya que frena de inmediato el crecimiento celular, entrando a una fase de muerte celular. Del análisis de flujo metabólico aplicado a este caso se obtuvo que existe una alta tasa específica de producción de lactato, y por ende, los flujos son redireccionados para que aumenten los niveles de piruvato intracelular a partir de diversa fuentes de carbono además de la glucosa (triptófano y triglicéridos), y sea utilizado en la síntesis de lactato. Con respecto a la protección, sólo fue posible obtener una curva de crecimiento comparable al control cuando se utilizó NAC (5 [mM]) 3 horas después que se administrara APAP. La aplicación previa tuvo el mismo resultado que el caso en que sólo se utiliza APAP. El análisis de flujo metabólico del único caso en que hubo una protección efectiva está sujeto a errores de cálculos de tasas específicas, al igual que el caso control. Grandes desbalances de carbono y nitrógeno, junto con una distribución de flujos internos con comportamientos no esperados, no permiten comparar los resultados entre los casos. Sin embargo, este hecho refleja lo importante que es tener mediciones precisas y un buen diseño experimental para calcular las tasas específicas de consumo/producción, para así obtener un correcto funcionamiento del modelo hepático planteado. En el segundo estudio, se analizaron los cambios metabólicos que se generan al utilizar diferentes suplementaciones del carbohidrato en el medio. Los casos fueron una suplementación pura de glucosa, una pura de fructosa y una mezcla de ellas (en una razón 1:1). Al realizar las curvas de crecimiento, se obtuvieron parámetros de crecimiento similares, siendo el caso de fructosa pura en donde las células crecen a menor velocidad, dado que están acostumbradas a crecer en un medio con glucosa. Este hecho se ratifica al realizar el análisis de flujo metabólico, donde el caso de mayor consumo de hexosa, producción de lactato y síntesis de triglicéridos fue el caso en que se suplementó exclusivamente con glucosa. En los casos en que existía fructosa en el medio, las células presentaron una tasa menor de consumo de azúcar, y por consiguiente una menor producción de triglicéridos. Además en estos dos casos, los flujos hacia síntesis de lactato y síntesis de triglicéridos son más bajo, pero con un flujo permanente en el ciclo TCA cercano al doble que el caso de suplementación con glucosa pura. El modelo hepático fue capaz representar el metabolismo de la línea celular HepG2 en ambos estudios. Sin embargo, debido a los resultados del primero, es necesario realizar más ensayos de toxicidad de sustancias, para validar el modelo y la metodología empleada en este trabajo, con el fin de caracterizar y mejorar funciones hepáticas en sistemas de cultivo in vitro.

Magíster en Ciencias de la Ingeniería, Mención Química / Ingeniero Civil Químico / Resultados experimentales señalan que las células animales pueden alcanzar múltiples estados metabólicos con distintas razones de tasa de producción de lactato a tasa de consumo de glucosa (DL=DG), lográndose razones muy por debajo de la razón estequiométrica igual a 2 [mol=mol]. En el presente trabajo de tesis se planteó y ajustó un modelo metabólico que describe el metabolismo de un cultivo de control y se corroboró su falta de capacidad de alcanzar más de un estado estacionario a través de la comparación con datos experimentales y un análisis de estabilidad posterior. La simplificación de dicho modelo inicial, la obtención de un único punto atractor como estado estacionario y el análisis de variaciones de niveles de expresión génica de ciertas enzimas glicolíticas permitió el planteamiento de un modelo de regulación que varía la concentración de la enzima lactato deshidrogenasa (LDH) con el cual se simuló un cultivo hasta alcanzar estado metabólico alterado (DL=DG <0,1 [mol=mol]). El modelo metabólico regulado se utilizó para la simulación de un cultivo continuo alterado para el diseño y ajuste de controladores proporcional (P), basado en modelo lineal y basado en modelo no lineal para la regulación de la concentración de glucosa de entrada frente a perturbaciones en el crecimiento celular. La simulación de la respuesta de lazo cerrado del sistema mostró una fuerte interacción de lazos con el lazo de control de crecimiento celular y los análisis de robustez y de sensibilidad permitieron concluir que el controlador P posee una mayor robustez que el controlador basado en modelo lineal, pero que este último posee una mejor respuesta frente a limitantes que podrían existir a nivel industrial. Por otra parte, el pobre desempeño del controlador basado en modelo no lineal demuestra un desafío de ajuste del mismo producto de las múltiples posibles fuentes del mal desempeño. Como línea de trabajo futuro se puede mejorar la respuesta simulada de los controladores basados en modelo, analizando la eliminación de offset para el caso lineal y los problemas de rendimiento del basado en modelo no lineal.

Magíster en Ciencias de la Ingeniería, Mención Química / Ingeniera Civil en Biotecnología / El cultivo de células animales ha cobrado gran importancia en la industria biotecnológica, dada su capacidad de producir proteínas recombinantes compatibles con su uso terapéutico en humanos. Este potencial ha motivado la búsqueda de estrategias para la optimización de los procesos cuyo objetivo es la síntesis de grandes cantidades de proteínas con aplicaciones biomédicas. Una de las estrategias utilizadas corresponde al cultivo en fuentes alternativas de carbono, tales como galactosa, las que al ser consumidas lentamente llevan a la obtención de un metabolismo más eficiente, con una reducción de la acumulación metabolitos inhibitorios tanto del crecimiento celular como de la síntesis del producto. Sin embargo, se ha observado que estos cultivos presentan baja velocidad de crecimiento por lo que es necesario suplementar estos medios con glucosa o realizar modificaciones al metabolismo celular de forma de obtener cultivos con mayores rendimientos. Para la obtención de una línea celular que presente un desempeño mejorado en cultivos con galactosa, se transfectaron células CHO de forma de sobre-expresar proteínas asociadas a pasos previamente reportados como limitantes del metabolismo de la galactosa, específicamente el transportador Slc2a8 y galactoquinasa Galk1. No se tuvieron resultados concluyentes con respecto a la sobre-expresión del transportador Slc2a8, debido a que el pool de clones obtenidos luego de la transfección no mantuvo su viabilidad durante tiempo suficiente para caracterizar su comportamiento en cultivo. Por otro lado, los resultados obtenidos mostraron que los clones seleccionados (CHO-Galk1) alcanzan mayor densidad celular en cultivos desarrollados en medio con glucosa y galactosa, además de ser capaces de crecer en un medio que sólo presenta galactosa, contrario a lo observado en la línea parental. Las células CHO-Galk1-2 presentan una mayor concentración de producto, llegando a sintetizar un 42% más de tPA que el control. El aumento más drástico de tasa de producción está asociado a la fase de crecimiento en galactosa. Los resultados obtenidos para el metabolismo de glucosa del clon CHO-Galk1-2 presentan diferencias con respecto al cultivo control, por lo que se plantea que la sobre-expresión de este gen puede tener efectos positivos en el metabolismo de glucosa. El análisis de flujos metabólicos permite observar un metabolismo eficiente, centrado en la producción de energía, asociado a un alto flujo en el ciclo del TCA, producción de biomasa y producto.