En estudios anteriores se ha mostrado que células CHO productoras de tPA sufren una alteración del estado metabólico cuando el cultivo es suplementado con una mezcla de glucosa y galactosa. Este cambio se caracteriza por la reincorporación de lactato a la célula, pero su destino metabólico no ha sido determinado aún. Para comprender las condiciones que permiten la utilización de lactato como fuente de carbono se realizaron cuatro experimentos en cultivo batch con distintas combinaciones de glucosa y galactosa. Cuando el medio es suplementado solamente con glucosa se observa una producción sostenida de lactato. En cambio, en las condiciones con glucosa y galactosa se ve que primero se utiliza exclusivamente glucosa y se produce lactato, y una vez que se agota esta fuente de carbono comienza el consumo de galactosa junto a lactato. Al comparar mediante análisis de flujos metabólicos los estados de las células con y sin alteración metabólica, se observa un cambio en la distribución de flujos involucrados en el metabolismo del piruvato. Cuando la tasa específica de consumo de la fuente de carbono principal es baja no se produce suficiente piruvato para que las células mantengan sus requerimientos energéticos. Este resultado es consistente con los entregados por el modelo dinámico del metabolismo de glucosa y galactosa desarrollado en este trabajo. Inicialmente en los cultivos se observan flujos intracelulares altos, los cuales disminuyen lenta pero continuamente hasta alcanzar una condición en que no se produce suficiente piruvato para mantener el metabolismo energético de la célula. El consumo de lactato es posible en cultivos suplementados con glucosa y galactosa debido a que la célula alcanza condiciones intra y extracelulares específicas que permiten la inversión de la reacción catalizada por la enzima lactato dehidrogenasa y del gradiente que impulsa transporte de lactato. La evidencia encontrada en este trabajo sugiere que durante el consumo de glucosa se produce piruvato en exceso lo que lleva su acumulación y posterior conversión hacia lactato el cual se acumula también en el interior de la célula. Las altas concentraciones de lactato en el medio intracelular y la acidificación de éste debido a la glicólisis promueven el flujo del ácido láctico hacia el exterior de la célula mediante el transportador de monocarboxilatos. Cuando comienza el consumo de galactosa, el cual es más lento que el de glucosa, la concentración de piruvato, lactato y H+ disminuye permitiendo la inversión de la dirección de transporte del transportador y de la enzima lactato dehidrogenasa, promoviendo el consumo de lactato. Mediante el análisis de flujos metabólicos se determinó que en esta etapa del cultivo la mayoría de los recursos celulares y el ácido láctico son utilizados para mantener el metabolismo energético lo que explica también la disminución de la proliferación celular observada. Los resultados obtenidos indican que las concentraciones de piruvato, H+, lactato intra y extracelular, el estado RedOx y su evolución en el tiempo son los responsables en determinar la dirección del metabolismo del lactato. El entendimiento de la vía del lactato permitiría nuevos diseños de medio de cultivo, en los cuales se produzcan concentraciones menores de lactato. En cultivos donde el lactato es consumido o producido en una nueva tasa se observa una viabilidad extendida y por lo tanto en estas condiciones es factible alcanzar mayores niveles de producción de proteína recombinante.

Magíster en Ciencias de la Ingeniería, Mención Química / Ingeniera Civil en Biotecnología / El cultivo de células animales ha cobrado gran importancia en la industria biotecnológica, dada su capacidad de producir proteínas recombinantes compatibles con su uso terapéutico en humanos. Este potencial ha motivado la búsqueda de estrategias para la optimización de los procesos cuyo objetivo es la síntesis de grandes cantidades de proteínas con aplicaciones biomédicas. Una de las estrategias utilizadas corresponde al cultivo en fuentes alternativas de carbono, tales como galactosa, las que al ser consumidas lentamente llevan a la obtención de un metabolismo más eficiente, con una reducción de la acumulación metabolitos inhibitorios tanto del crecimiento celular como de la síntesis del producto. Sin embargo, se ha observado que estos cultivos presentan baja velocidad de crecimiento por lo que es necesario suplementar estos medios con glucosa o realizar modificaciones al metabolismo celular de forma de obtener cultivos con mayores rendimientos. Para la obtención de una línea celular que presente un desempeño mejorado en cultivos con galactosa, se transfectaron células CHO de forma de sobre-expresar proteínas asociadas a pasos previamente reportados como limitantes del metabolismo de la galactosa, específicamente el transportador Slc2a8 y galactoquinasa Galk1. No se tuvieron resultados concluyentes con respecto a la sobre-expresión del transportador Slc2a8, debido a que el pool de clones obtenidos luego de la transfección no mantuvo su viabilidad durante tiempo suficiente para caracterizar su comportamiento en cultivo. Por otro lado, los resultados obtenidos mostraron que los clones seleccionados (CHO-Galk1) alcanzan mayor densidad celular en cultivos desarrollados en medio con glucosa y galactosa, además de ser capaces de crecer en un medio que sólo presenta galactosa, contrario a lo observado en la línea parental. Las células CHO-Galk1-2 presentan una mayor concentración de producto, llegando a sintetizar un 42% más de tPA que el control. El aumento más drástico de tasa de producción está asociado a la fase de crecimiento en galactosa. Los resultados obtenidos para el metabolismo de glucosa del clon CHO-Galk1-2 presentan diferencias con respecto al cultivo control, por lo que se plantea que la sobre-expresión de este gen puede tener efectos positivos en el metabolismo de glucosa. El análisis de flujos metabólicos permite observar un metabolismo eficiente, centrado en la producción de energía, asociado a un alto flujo en el ciclo del TCA, producción de biomasa y producto.