Doctora en Ciencias de la Ingeniería, Mención Química / La venta de biofármacos representa una industria billonaria que ha crecido exponencialmente desde la década de los 70's debido al aumento de la demanda por estas proteínas terapéuticas altamente específicas. Estas proteínas recombinantes son sintetizadas por diferentes líneas celulares, especialmente aquella derivada de ovarios de hámster chino CHO ya que presentan altas tasas específicas de producción de proteína recombinante y son fácilmente adaptables a escalas industriales. Hoy en día, más de la mitad de los anticuerpos monoclonales que se encuentran en el mercado son producidos por células CHO. Para incrementar el rendimiento de los procesos productivos, diferentes metodologías han sido usadas por investigadores. Resultados positivos han sido obtenidos aplicando principios de ingeniería y utilizando herramientas de biología molecular para modificar reacciones bioquímicas. Proyectos de Ingeniería Metabólica han sido exitosos en reducir la producción de metabolitos indeseados, especialmente lactato, e incrementar la síntesis de proteína recombinante. En este trabajo se estudia el efecto que tienen diferentes estrategias de Ingeniería Metabólica sobre el metabolismo y cultivo de células CHO. Se ha probado que el metabolismo de carbono de células CHO es altamente ineficiente, consumiendo una cantidad de glucosa mayor de la necesaria para mantener el metabolismo energético y proliferación celular. En este trabajo se construyeron clones de células CHO productoras de IgG recombinante que sobre-expresan PYC2, MDH II y trasportador de fructosa. La expresión de estos genes permitiría aliviar cuellos de botella en el metabolismo central del carbono de las células. En este trabajo se estudiaron y contrastaron los efectos de la sobre-expresión de estos genes sobre la extensión de los cultivos, metabolismo y productividad. Los resultados indican que todos los clones estudiados presentan un metabolismo más eficiente, caracterizado por una menor producción de lactato por glucosa consumida y que no todos mejoraron su proliferación celular y/o productividad específica. Células CHO sobre expresando PYC2 mejoraron su tasa máxima de crecimiento, pero redujeron la tasa de producción de proteína recombinante; la sobre-expresión de MDH II conduce a la reducción del crecimiento celular y síntesis de proteína; finalmente, sobre-expresar el transportador de fructosa aumenta la proliferación celular y síntesis de proteína recombinante en medios con fructosa. Proponemos que las diferencias en producción de proteína se deben a alteraciones del estado RedOx de la célula que afectan en ensamblado de las cadenas peptídicas y la secreción de éstas. Reducir la expresión del gen Lactato deshidrogenasa A ha sido el objetivo de numerosos trabajos con el fin de reducir la síntesis de lactato e incrementar la producción de proteína recombinante. Utilizando el nuevo sistema para edición genómica CRISPR-Cas logramos interrumpir una de las copias del gen. Resultados del análisis de cultivos fed-batch de estas células indican que el crecimiento celular y el metabolismo fueron afectados y la síntesis específica y volumétrica de la proteína recombinante incrementó considerablemente. Se realizó un análisis a profundidad del metabolismo de las células deficientes en LDHa. Se midió la razón NAD+/NADH de éstas y el valor indicó que las células mutadas presentan niveles de NAD +/NADH menores que las del cultivo control, sugiriendo una mejora en su metabolismo energético debido a la mayor acumulación de NADH. Mediante Análisis de Flujos Metabólicos se estimó los flujos entre las reacciones más importantes del metabolismo central de las células. Los resultados confirmaron que en las células mutantes existen mayores flujos en el ciclo del TCA, debido principalmente a un mayor aporte de carbonos provenientes del catabolismo de amino ácidos. Estas células también presentan un menor flujo en la vía de la glicólisis, lo que se correlaciona con la menor proliferación que estas presentaron, y esto último puede explicar el aumento de síntesis de proteínas. En este trabajo se aplicaron exitosamente conceptos de Ingeniería Metabólica para la construcción de clones con distintos metabolismos. Este trabajo revela los efectos de varias modificaciones, lo que lo hace una fuente útil información acerca de los efectos que tienen variadas estrategias metabólicas sobre cultivos de células CHO. Finalmente, este trabajo resulta ser un aporte para la comunidad científica contribuyendo con la primera comparación de diferentes clones que sobre-expresan genes claves del metabolismo central del carbono y entregando el primer estudio en profundidad del efecto de reducir la expresión del gen de la LDHa.

Magíster en Ciencias de la Ingeniería, Mención Química / Ingeniera Civil en Biotecnología / El cultivo de células animales ha cobrado gran importancia en la industria biotecnológica, dada su capacidad de producir proteínas recombinantes compatibles con su uso terapéutico en humanos. Este potencial ha motivado la búsqueda de estrategias para la optimización de los procesos cuyo objetivo es la síntesis de grandes cantidades de proteínas con aplicaciones biomédicas. Una de las estrategias utilizadas corresponde al cultivo en fuentes alternativas de carbono, tales como galactosa, las que al ser consumidas lentamente llevan a la obtención de un metabolismo más eficiente, con una reducción de la acumulación metabolitos inhibitorios tanto del crecimiento celular como de la síntesis del producto. Sin embargo, se ha observado que estos cultivos presentan baja velocidad de crecimiento por lo que es necesario suplementar estos medios con glucosa o realizar modificaciones al metabolismo celular de forma de obtener cultivos con mayores rendimientos. Para la obtención de una línea celular que presente un desempeño mejorado en cultivos con galactosa, se transfectaron células CHO de forma de sobre-expresar proteínas asociadas a pasos previamente reportados como limitantes del metabolismo de la galactosa, específicamente el transportador Slc2a8 y galactoquinasa Galk1. No se tuvieron resultados concluyentes con respecto a la sobre-expresión del transportador Slc2a8, debido a que el pool de clones obtenidos luego de la transfección no mantuvo su viabilidad durante tiempo suficiente para caracterizar su comportamiento en cultivo. Por otro lado, los resultados obtenidos mostraron que los clones seleccionados (CHO-Galk1) alcanzan mayor densidad celular en cultivos desarrollados en medio con glucosa y galactosa, además de ser capaces de crecer en un medio que sólo presenta galactosa, contrario a lo observado en la línea parental. Las células CHO-Galk1-2 presentan una mayor concentración de producto, llegando a sintetizar un 42% más de tPA que el control. El aumento más drástico de tasa de producción está asociado a la fase de crecimiento en galactosa. Los resultados obtenidos para el metabolismo de glucosa del clon CHO-Galk1-2 presentan diferencias con respecto al cultivo control, por lo que se plantea que la sobre-expresión de este gen puede tener efectos positivos en el metabolismo de glucosa. El análisis de flujos metabólicos permite observar un metabolismo eficiente, centrado en la producción de energía, asociado a un alto flujo en el ciclo del TCA, producción de biomasa y producto.

Uma linhagem celular de CHO, previamente modificada geneticamente pela introdução de cDNA da 2,6 sialiltransferase de rato, gerou, pela primeira vez, um hTSH recombinante com sialilação humanizada (hlsr-hTSH), mais similar ao hormônio nativo, com 61% de ligação de ácido siálico na conformação 2,3 e 39%, na conformação 2,6. O clone mais produtivo, quando submetido à amplificação gênica com 8 M de metotrexato, apresentou um nível de secreção de aproximadamente 2 g de hTSH/106 células/dia, nível este útil para a purificação e caracterização do produto. A massa molecular relativa do heterodímero e das subunidades e do hlsr-hTSH purificado, determinada por espectrometria de massa MALDI-TOF, e a hidrofobicidade relativa, determinada por RP-HPLC, não apresentaram diferenças significativas com relação às preparações de hTSH recombinante derivadas de células CHO sem a modificação devida ao gene da 2,6 sialiltransferase. Entretanto, algumas diferenças foram observadas na composição dos N-glicanos, com mais estruturas tri- e tetra-sialiladas no hlsr-hTSH. O hlsr-hTSH mostrou-se eqüipotente (p>0,05) à preparação comercial de r-hTSH (Thyrogen) e 1,5 vezes mais potente do que a preparação nativa de hTSH (p<0,001), quando analisado por um bioensaio in vivo baseado na capacidade do TSH de estimular a liberação de T4. / A CHO cell line, previously genetically modified by the introduction of rat 2,6-sialyltransferase cDNA, generated for the first time a human-like sialylated recombinant hTSH (hlsr-hTSH) more similar to the native hormone, with 61% of 2,3- and 39% of 2,6-linked sialic acid residues. The best clone, when submitted to gene amplification with up to 8 M methotrexate, presented a secretion level of ~2 g hTSH/106 cells/day, useful for product purification and characterization. The relative molecular masses (Mr) of the heterodimer and of the - and -subunits of purified hlsr-hTSH, determined by MALDI-TOF mass spectrometry, and the relative hydrophobicities, determined by RP-HPLC, were not remarkably different from those presented by two r-hTSH preparations secreted by normal CHO cells. Some differences were observed, though, in N-glycan composition, with more tri- and much more tetra-sialylated structures in hlsr-hTSH. When analyzed via an in vivo bioassay based on hTSH-induced T4 release in mice, hlsr-hTSH was shown to be equipotent (p > 0.05) with the commercial preparation of r-hTSH (Thyrogen), and 1.5-fold more potent than native hTSH (p < 0.001).

Uma linhagem celular de CHO, previamente modificada geneticamente pela introdução de cDNA da 2,6 sialiltransferase de rato, gerou, pela primeira vez, um hTSH recombinante com sialilação humanizada (hlsr-hTSH), mais similar ao hormônio nativo, com 61% de ligação de ácido siálico na conformação 2,3 e 39%, na conformação 2,6. O clone mais produtivo, quando submetido à amplificação gênica com 8 M de metotrexato, apresentou um nível de secreção de aproximadamente 2 g de hTSH/106 células/dia, nível este útil para a purificação e caracterização do produto. A massa molecular relativa do heterodímero e das subunidades e do hlsr-hTSH purificado, determinada por espectrometria de massa MALDI-TOF, e a hidrofobicidade relativa, determinada por RP-HPLC, não apresentaram diferenças significativas com relação às preparações de hTSH recombinante derivadas de células CHO sem a modificação devida ao gene da 2,6 sialiltransferase. Entretanto, algumas diferenças foram observadas na composição dos N-glicanos, com mais estruturas tri- e tetra-sialiladas no hlsr-hTSH. O hlsr-hTSH mostrou-se eqüipotente (p>0,05) à preparação comercial de r-hTSH (Thyrogen) e 1,5 vezes mais potente do que a preparação nativa de hTSH (p<0,001), quando analisado por um bioensaio in vivo baseado na capacidade do TSH de estimular a liberação de T4. / A CHO cell line, previously genetically modified by the introduction of rat 2,6-sialyltransferase cDNA, generated for the first time a human-like sialylated recombinant hTSH (hlsr-hTSH) more similar to the native hormone, with 61% of 2,3- and 39% of 2,6-linked sialic acid residues. The best clone, when submitted to gene amplification with up to 8 M methotrexate, presented a secretion level of ~2 g hTSH/106 cells/day, useful for product purification and characterization. The relative molecular masses (Mr) of the heterodimer and of the - and -subunits of purified hlsr-hTSH, determined by MALDI-TOF mass spectrometry, and the relative hydrophobicities, determined by RP-HPLC, were not remarkably different from those presented by two r-hTSH preparations secreted by normal CHO cells. Some differences were observed, though, in N-glycan composition, with more tri- and much more tetra-sialylated structures in hlsr-hTSH. When analyzed via an in vivo bioassay based on hTSH-induced T4 release in mice, hlsr-hTSH was shown to be equipotent (p > 0.05) with the commercial preparation of r-hTSH (Thyrogen), and 1.5-fold more potent than native hTSH (p < 0.001).

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissGMCS.pdf: 2717580 bytes, checksum: ff4f01b1bf27d70757eb37ee1960edef (MD5) Previous issue date: 2004-06-25 / Financiadora de Estudos e Projetos / Disintegrins are proteins present in the poison of serpents that have been calling the pharmaceutical industry attention due to their capacity to prevent the progression of cancerous cells. A receiving key-protein called integrin addresses the formation of new blood vessels instructing the tumor cells to increase and spread. The disintegrin acts as an inhibitor that blocks this interaction. In order to produce substantial amounts of disintegrin in industrial scale, its expression in CHO-K1 cells was carried out by cloning the characteristic DNA extracted from the poison producing glands of the serpent Agkistrodon contortrix laticinctus. Usually CHO-K1 cells are cultivated in medium containing bovine fetal serum. However, its presence in the cultivation medium hinders the stages of detection, extraction and purification of the protein of interest. The objective of this work was to study the CHOZMD cell growth and the desintegrin production in serum free medium, as well as to develope a methodology for the detection and quantification of the disintegrin present in the medium. The cultivations were carried in culture bottles of 25cm2, 75cm2 and 150cm2 and later in spinner flask with a volume of 500mL, incubated with an amount of CO2 controlled in 10% v/v, pH between 7.0 to 7.4, a temperature of 37 °C, under agitation conditions. The cells were cultivated in the presence of the microcarrrier Pronectin F which enables the attainment of high cell concentration. The culture media DMEM and CHO-S-SFM II were used in the cultivations by means of a gradual adaptation process for a serum free medium, through the reduction of DMEM+serum proportion at each change, until that it was totally replaced by the serum free medium. The cells were maintained in 100% serum free medium during 6h with the withdrawal of 250 ml after 3 h and of the remaining volume after 6h of cultivation. For the detection of the disintegrin, the samples were initially filtered in Milipore filter, then concentrated in ultra filter Amicon and finally centrifuged in membranes Centriprep and Centricon. The disintegrin, protein of ~70kDa, present in the treated samples was detected using Bio Dot equipment with nitrocelulose membrane incubated with specific antibodies. The samples were applied in ion exchange column and the fractions obtained applied in nitrocelulose membrane. In the cultivations carried out in serum free medium with the microcarrier Pronectin F a maximum cell concentration of 1.74.106 cel.ml-1 was reached, which is slightly inferior to the value reached in the cultivations in medium containing serum (2.7.106 cel.mL-1). However, concerning product formation, the immunodetecion results revealed the presence of the disintegrin in the cultivations carried out with serum free medium. Cultivations carried out in spinner flask, with a volume of 200mL and using microcarrier Citodex 1 and medium supplemented with 1% hemolymph (v/v) presented maximum cell concentration of 2.6.106 cel.mL-1. The detection method developed was effective in the identification of the target protein in the samples from the cultivation medium containing hemolymph. Preliminary tests demonstrated loss of protein might be related to gradual degradation in cultivation medium or retention in ion exchange column. / Desintegrinas são proteínas presentes no veneno de serpentes que têm despertado interesse da indústria farmacêutica por sua capacidade de impedir a progressão de células cancerígenas. Uma proteína-chave receptora chamada integrina direciona a formação de novos vasos sangüíneos instruindo as células do tumor a crescerem e se espalharem. A desintegrina atua como um inibidor que bloqueia essa interação. Para que quantidades substanciais de desintegrina possam ser produzidas em escala industrial, realizou-se a expressão da mesma em células CHO-K1, produzidas por clonagem do ADN característico retirado das glândulas produtoras do veneno da serpente Agkistrodon contortrix laticinctus. Normalmente as células CHO-K1 são cultivadas em meio contendo soro fetal bovino. No entanto, a presença do mesmo no meio de cultivo dificulta as etapas de detecção, extração e purificação da proteína de interesse. O objetivo deste trabalho foi estudar o crescimento de células CHO-K1 e a produção da desintegrina em meio livre de soro, assim como desenvolver uma metodologia para a detecção e quantificação da desintegrina presente no meio. Os cultivos foram realizados em garrafas de cultura de 25cm2, 75cm2 e 150cm2 e posteriormente em frasco spinner com um volume de 500mL, incubados em estufa com uma quantidade de CO2 controlada em 10% v/v, pH entre 7,0 a 7,4, a uma temperatura de 37 °C em condições de agitação brandas. As células foram cultivadas na presença do microcarrregador sólido Pronectin F, que possibilita a obtenção de uma alta concentração de células. Os meios de cultura DMEM e CHO-S-SFM II foram utilizados nos cultivos por um processo de adaptação gradual para um meio livre de soro, reduzindo-se a proporção de meio com soro a cada troca, até que fosse totalmente substituído para o meio livre de soro. As células foram mantidas em meio 100% livre de soro durante 6 h com a retirada de 250 ml após 3 h e o restante após 6 h de cultivo. Para a detecção da desintegrina, as amostras foram primeiramente filtradas em filtro Millipore e o filtrado concentrado em ultrafiltro Amicon e centrifugadas em membranas Centriprep e Centricon. A desintegrina, proteína de ~70KDa presente nas amostras tratadas, foi detectada utilizando-se equipamento Bio Dot em membrana de nitrocelulose incubada com anticorpos específicos. As amostras foram aplicadas em coluna de troca iônica e as frações obtidas aplicadas em membrana de nitrocelulose. Nos cultivos realizados em meio livre de soro com o microcarregador Pronectin F foi atingida uma concentração celular máxima de 1,74.106 cel.ml-1, a qual é ligeiramente inferior ao valor alcançado nos cultivos em meio contendo soro (2,7.106 cel.mL-1). Entretanto no que se refere à formação do produto o resultado na membrana de nitrocelulose evidencia a presença da desintegrina no meio de cultivo livre de soro. Cultivos realizados em meio suplementado com 1% v/v de hemolinfa apresentaram concentração celular máxima de 2,6. 106 cel.mL-1 em frasco Spinner, com um volume de 200mL e utilizando microcarregador Citodex 1. O método de detecção desenvolvido foi efetivo na identificação da proteína de interesse nas amostras retiradas do cultivo em meio contendo hemolinfa. Testes preliminares demonstraram que a proteína pode estar degradando gradativamente em meio de cultivo ou ficando retida na coluna de troca iônica.

O projeto de novos materiais para aplicações tecnológicas em biomateriais e bioengenharia é altamente dependente de como as células aderem à superfície de um material. A adesão e crescimento em biomateriais depende de propriedades do substrato, tais como molhabilidade da superfície, a topografia e a composição química de superfície. O objetivo deste estudo foi investigar as interações de diversos materiais com culturas celulares de células epitelial CHO (Ovário de Hamster Chinês). Os materiais utilizados foram SU-8 2005 (elétron-resiste, Microchem), PDMS (Poli (dimetil siloxano), Down Corning), DLC (Diamond-like Carbon) e vidro foi utilizado como referência. Superfícies de vidro, SU-8, PDMS e DLC lisas (planas) e isentas de modificação ou tratamento específico foram avaliadas quanto ao cultivo de células CHO. Valores médios dos fatores de forma (Ff) de 450 células foram calculados para cada uma das culturas realizadas sobre os 4 substratos. Foram obtidos Ff próximos a 0,52 para o vidro, o SU-8 liso e o DLC, demonstrando um bom espraiamento das células nessas superfícies. A superfície de PDMS apresentou valor unitário para o fator de forma (Ff), que está relacionado a um baixo espraiamento das células. A energia de superfície (ES) obtida para o PDMS é compatível com o resultado de fator de forma (Ff), uma vez que o menor valor para ES é coerente com a baixa adesão celular, o que gerou células com elevado fator de forma (Ff). O SU-8 foi modificado por implantação iônica com uma dose de 1,2x1016 átomos/cm2 e a energia de implantação foi de 8 keV, como referência foi utilizada uma superfície lisa de SU-8 sem implantação. Os resultados mostraram que o número de células vivas por unidade de área foi superior na superfície de SU-8 com prata implantada, mostrando o bom desempenho da cultura nesse substrato. As superfícies de DLC modificadas por tratamento com plasma de oxigênio (DLC-O) e com plasma de hexafluoreto de enxofre (DLC-F) foram utilizadas para cultura celular, os resultados de três experimentos independentes de contagem de número de núcleos (marcados com DAPI) por unidade de área confirmaram os resultados obtidos através do teste de viabilidade (marcados com trypan blue). A superfície de DLC-O, apresentou um maior número de núcleos por unidade de área, quando comparado à superfície DLC-F, da mesma forma que nos resultados obtidos pelo teste de viabilidade. As energias de superfície para as amostras de DLC-F e DLC-O indicaram que a superfície DLC-O é mais hidrofílica do que a superfície DLC-F, que está coerente com o que é conhecido da literatura e com os resultados obtidos em nosso trabalho. Cultura de células CHO foram realizadas em superfícies litografadas com estruturas hexagonais periódicas com o parâmetro 2R (diâmetro do círculo inscrito) sendo 12 µm, 30 µm, 80 µm, 280 µm, 560 µm e também em SU-8 liso. Estas superfícies foram caracterizadas por microscopia óptica de fluorescência com relação ao número de núcleos (marcados com o fluoróforo DAPI) por unidade de área, isto é, núcleos/mm2. Obteve-se histogramas com o número médio de núcleos por mm2 em três experimentos independentes, onde o número núcleos/mm2 foi consideravelmente maior para 80 µm. As superfícies contendo cavidades periódicas de 12 µm e 30 µm apresentaram dificuldade para as células CHO aderirem à superfície. Em uma outra etapa realizou-se culturas celulares em triplicata dos substratos com as superfícies 12 µm, 80 µm, 280 µm, 560 µm e também em SU-8 liso. As células em cada uma das superfícies foram analisadas por microscopia óptica (MO) para avaliação da viabilidade celular, utilizando marcador trypan blue. Obteve-se histogramas com os valores médios para o número de células vivas/mm2 para as culturas celulares que corrobora os resultados obtidos no histograma da cultura celular que tiveram os núcleos marcados pelo fluoróforo DAPI. Assim, fica confirmado o melhor desempenho da cultura celular no substrato 80 µm que apresentou o maior número de células vivas/mm2 As micrografias obtidas através de marcação por DAPI foram analisadas através da função de correlação com intuito de se entender como as células estavam organizadas. Isso foi feito para cada uma das superfícies litografadas, 12 µm, 30 µm, 80 µm, 280 µm, 560 µm e também em SU-8 liso. As superfícies dos substratos 80 µm apresentaram os menores valores de distâncias para primeiros e segundos vizinhos, ou seja, as células estão mais próximas umas das outras. As demais superfícies tendem a separar mais as células. Obteve-se também os valores de raio de aglomerado (rc), distância entre os aglomerados (dc) e o número de primeiros vizinhos (Np) através do ajuste da função de correlação. A análise de correlação mostrou com clareza o que não era evidenciado apenas visualizando-se as imagens. Ela mostra que as células, mesmo em SU-8 liso tem a forte tendência de formar aglomerados de células com raio de aproximadamente 45 µm. No caso de substratos lisos, células CHO apresentaram a melhor adesão na superfície do SU-8, seguido do DLC, enquanto que o PDMS foi a pior situação, devido à baixa molhabilidade do material. No caso de superfícies com microestrutura, SU-8 contendo microcavidades hexagonais de 12 e 30 µm mostraram ser as situações mais adversas para o crescimento de células CHO, provavelmente por causa da topografia das cavidades serem de menor tamanho quando comparadas ao tamanho das células CHO. Em vez disso, SU-8, contendo microcavidades hexagonais de 80 µm foi a superfície mais favorável para o crescimento de células CHO. / The design of new materials for technological applications in biomaterials and bioengineering is highly dependent on how the cells adhere to the material surface. The cells adhesion and growth on biomaterials depends on substrate properties such as surface wettability, topography and the chemical composition. The aim of this study was to investigate the interactions of various materials with cell cultures of epithelial cells CHO (Chinese Hamster Ovary). The materials used were SU-8 2005 (electron resists, Microchem), PDMS (poly (dimethyl siloxane), Dow Corning), DLC (Diamond-like Carbon) and glass was used as reference. Unmodified and flat surfaces of glass, SU-8, PDMS and DLC were evaluated for the culture of CHO cells. Form factor (Ff) values were calculated as average of 450 cells for each of the cultures performed on the four substrates. Ff close to 0.52 was obtained for flat surfaces of glass, SU-8 and DLC, showing a good cell spreading on these surfaces. The surface of PDMS presented a form factor (Ff) near unity, which is related to low spreading cell. The surface energy (ES) obtained for the PDMS is coherent with the Ff result, since the smallest value of ES is consistent with the low cell adhesion, which resulted in cells with a high Ff. The SU-8 was modified by ion implantation using a dose of 1.2x1016 atoms/cm2 and an implantation energy of 8 keV, unmodified flat SU-8 was used as a reference. The cell culture results showed that the number of live cells per unit area was greater in the SU-8 surface implanted with silver, showing a good performance in the culture substrate. The DLC surfaces modified by plasma treatment with oxygen (DLC-O) and sulfur hexafluoride (DLC-F) were used for cell culture. The results of three independent experiments, counting the number of nuclei (marked with DAPI) per unit area, confirmed the results obtained by the viability test (marked with trypan-blue). The surface of the DLC-O had higher number of nuclei per unit area when compared to the surface of the DLC-F, similarly to the results obtained for the viability test. The surface energies of the DLC-F and DLC-O samples indicated that the DLC-O surface is more hydrophilic than the DLC-F surface, which is consistent with results obtained with our work and with the literature. CHO cell culture were performed on surfaces with periodic hexagonal structures with the diameter of inscribed circle (2R) given by 12 µm, 30 µm, 80 µm, 280 µm, 560 µm and also on flat SU-8. These surfaces were characterized by fluorescence optical microscopy with respect to the number of nuclei (marked with fluorophore DAPI) per unit area, i.e. nuclei/mm2. Histograms were obtained for the average number of nuclei per mm2 in three independent experiments, where the substrate with periodic hexagonal structures with 2R = 80 µm presented considerably higher nuclei/mm2. Surfaces containing periodic cavities of 2R =12 µm and 30 µm were adverse for CHO cells adhesion. In another approach, cell culture were analyzed by light microscopy (LM) for evaluation of cell viability using trypan-blue marker. This was carried out in triplicate cell culture on substrates with surfaces 12 µm, 80 µm, 280 µm, 560 µm and also on flat SU-8. Histograms were generated for average number of living cells/mm2 for each substrate, which corroborates with the results obtained for the cell culture marked with fluorophore DAPI. Thus, it is confirmed the better performance of the cell culture on substrates with 2R = 80 µm, presenting the highest number of living cells/mm2. The micrographs obtained with cells marked with DAPI were analyzed through the correlation function with the aim of understanding how the cells were organized. This was performed for each of the lithographed surfaces 12 µm, 30 µm, 80 µm, 280 µm, 560 µm and also flat SU-8. The surfaces of the substrates with 2R = 80 µm had the lowest values for length between its neighbors, that is, the cells are closer to each other. The remaining surfaces tend to separate the cells. Also were obtained the cluster radius values (rc), the distance between the clusters (dc) and the number of nearest neighbors (Np) through the correlation function fitting. The correlation analysis clearly showed what was not possible to observe by viewing the images. It shows that the cells, even in flat SU-8, have a strong tendency to form clusters of cells within about 45 micrometers. In the case of flat substrates, CHO cells exhibited better adhesion to the surface of SU-8, followed by the DLC, while the PDMS was worse due to low wettability of the material. In the case of surfaces with microstructures, SU-8 containing hexagonal microstructures of 12 and 30 µm showed to be the most adverse conditions for the CHO cell growth, probably because of the topography of the cavities being smaller in size compared to the size of CHO cells. SU-8 with 80 µm hexagonal microstructures was more favorable surface for the growth of CHO cells.

O projeto de novos materiais para aplicações tecnológicas em biomateriais e bioengenharia é altamente dependente de como as células aderem à superfície de um material. A adesão e crescimento em biomateriais depende de propriedades do substrato, tais como molhabilidade da superfície, a topografia e a composição química de superfície. O objetivo deste estudo foi investigar as interações de diversos materiais com culturas celulares de células epitelial CHO (Ovário de Hamster Chinês). Os materiais utilizados foram SU-8 2005 (elétron-resiste, Microchem), PDMS (Poli (dimetil siloxano), Down Corning), DLC (Diamond-like Carbon) e vidro foi utilizado como referência. Superfícies de vidro, SU-8, PDMS e DLC lisas (planas) e isentas de modificação ou tratamento específico foram avaliadas quanto ao cultivo de células CHO. Valores médios dos fatores de forma (Ff) de 450 células foram calculados para cada uma das culturas realizadas sobre os 4 substratos. Foram obtidos Ff próximos a 0,52 para o vidro, o SU-8 liso e o DLC, demonstrando um bom espraiamento das células nessas superfícies. A superfície de PDMS apresentou valor unitário para o fator de forma (Ff), que está relacionado a um baixo espraiamento das células. A energia de superfície (ES) obtida para o PDMS é compatível com o resultado de fator de forma (Ff), uma vez que o menor valor para ES é coerente com a baixa adesão celular, o que gerou células com elevado fator de forma (Ff). O SU-8 foi modificado por implantação iônica com uma dose de 1,2x1016 átomos/cm2 e a energia de implantação foi de 8 keV, como referência foi utilizada uma superfície lisa de SU-8 sem implantação. Os resultados mostraram que o número de células vivas por unidade de área foi superior na superfície de SU-8 com prata implantada, mostrando o bom desempenho da cultura nesse substrato. As superfícies de DLC modificadas por tratamento com plasma de oxigênio (DLC-O) e com plasma de hexafluoreto de enxofre (DLC-F) foram utilizadas para cultura celular, os resultados de três experimentos independentes de contagem de número de núcleos (marcados com DAPI) por unidade de área confirmaram os resultados obtidos através do teste de viabilidade (marcados com trypan blue). A superfície de DLC-O, apresentou um maior número de núcleos por unidade de área, quando comparado à superfície DLC-F, da mesma forma que nos resultados obtidos pelo teste de viabilidade. As energias de superfície para as amostras de DLC-F e DLC-O indicaram que a superfície DLC-O é mais hidrofílica do que a superfície DLC-F, que está coerente com o que é conhecido da literatura e com os resultados obtidos em nosso trabalho. Cultura de células CHO foram realizadas em superfícies litografadas com estruturas hexagonais periódicas com o parâmetro 2R (diâmetro do círculo inscrito) sendo 12 µm, 30 µm, 80 µm, 280 µm, 560 µm e também em SU-8 liso. Estas superfícies foram caracterizadas por microscopia óptica de fluorescência com relação ao número de núcleos (marcados com o fluoróforo DAPI) por unidade de área, isto é, núcleos/mm2. Obteve-se histogramas com o número médio de núcleos por mm2 em três experimentos independentes, onde o número núcleos/mm2 foi consideravelmente maior para 80 µm. As superfícies contendo cavidades periódicas de 12 µm e 30 µm apresentaram dificuldade para as células CHO aderirem à superfície. Em uma outra etapa realizou-se culturas celulares em triplicata dos substratos com as superfícies 12 µm, 80 µm, 280 µm, 560 µm e também em SU-8 liso. As células em cada uma das superfícies foram analisadas por microscopia óptica (MO) para avaliação da viabilidade celular, utilizando marcador trypan blue. Obteve-se histogramas com os valores médios para o número de células vivas/mm2 para as culturas celulares que corrobora os resultados obtidos no histograma da cultura celular que tiveram os núcleos marcados pelo fluoróforo DAPI. Assim, fica confirmado o melhor desempenho da cultura celular no substrato 80 µm que apresentou o maior número de células vivas/mm2 As micrografias obtidas através de marcação por DAPI foram analisadas através da função de correlação com intuito de se entender como as células estavam organizadas. Isso foi feito para cada uma das superfícies litografadas, 12 µm, 30 µm, 80 µm, 280 µm, 560 µm e também em SU-8 liso. As superfícies dos substratos 80 µm apresentaram os menores valores de distâncias para primeiros e segundos vizinhos, ou seja, as células estão mais próximas umas das outras. As demais superfícies tendem a separar mais as células. Obteve-se também os valores de raio de aglomerado (rc), distância entre os aglomerados (dc) e o número de primeiros vizinhos (Np) através do ajuste da função de correlação. A análise de correlação mostrou com clareza o que não era evidenciado apenas visualizando-se as imagens. Ela mostra que as células, mesmo em SU-8 liso tem a forte tendência de formar aglomerados de células com raio de aproximadamente 45 µm. No caso de substratos lisos, células CHO apresentaram a melhor adesão na superfície do SU-8, seguido do DLC, enquanto que o PDMS foi a pior situação, devido à baixa molhabilidade do material. No caso de superfícies com microestrutura, SU-8 contendo microcavidades hexagonais de 12 e 30 µm mostraram ser as situações mais adversas para o crescimento de células CHO, provavelmente por causa da topografia das cavidades serem de menor tamanho quando comparadas ao tamanho das células CHO. Em vez disso, SU-8, contendo microcavidades hexagonais de 80 µm foi a superfície mais favorável para o crescimento de células CHO. / The design of new materials for technological applications in biomaterials and bioengineering is highly dependent on how the cells adhere to the material surface. The cells adhesion and growth on biomaterials depends on substrate properties such as surface wettability, topography and the chemical composition. The aim of this study was to investigate the interactions of various materials with cell cultures of epithelial cells CHO (Chinese Hamster Ovary). The materials used were SU-8 2005 (electron resists, Microchem), PDMS (poly (dimethyl siloxane), Dow Corning), DLC (Diamond-like Carbon) and glass was used as reference. Unmodified and flat surfaces of glass, SU-8, PDMS and DLC were evaluated for the culture of CHO cells. Form factor (Ff) values were calculated as average of 450 cells for each of the cultures performed on the four substrates. Ff close to 0.52 was obtained for flat surfaces of glass, SU-8 and DLC, showing a good cell spreading on these surfaces. The surface of PDMS presented a form factor (Ff) near unity, which is related to low spreading cell. The surface energy (ES) obtained for the PDMS is coherent with the Ff result, since the smallest value of ES is consistent with the low cell adhesion, which resulted in cells with a high Ff. The SU-8 was modified by ion implantation using a dose of 1.2x1016 atoms/cm2 and an implantation energy of 8 keV, unmodified flat SU-8 was used as a reference. The cell culture results showed that the number of live cells per unit area was greater in the SU-8 surface implanted with silver, showing a good performance in the culture substrate. The DLC surfaces modified by plasma treatment with oxygen (DLC-O) and sulfur hexafluoride (DLC-F) were used for cell culture. The results of three independent experiments, counting the number of nuclei (marked with DAPI) per unit area, confirmed the results obtained by the viability test (marked with trypan-blue). The surface of the DLC-O had higher number of nuclei per unit area when compared to the surface of the DLC-F, similarly to the results obtained for the viability test. The surface energies of the DLC-F and DLC-O samples indicated that the DLC-O surface is more hydrophilic than the DLC-F surface, which is consistent with results obtained with our work and with the literature. CHO cell culture were performed on surfaces with periodic hexagonal structures with the diameter of inscribed circle (2R) given by 12 µm, 30 µm, 80 µm, 280 µm, 560 µm and also on flat SU-8. These surfaces were characterized by fluorescence optical microscopy with respect to the number of nuclei (marked with fluorophore DAPI) per unit area, i.e. nuclei/mm2. Histograms were obtained for the average number of nuclei per mm2 in three independent experiments, where the substrate with periodic hexagonal structures with 2R = 80 µm presented considerably higher nuclei/mm2. Surfaces containing periodic cavities of 2R =12 µm and 30 µm were adverse for CHO cells adhesion. In another approach, cell culture were analyzed by light microscopy (LM) for evaluation of cell viability using trypan-blue marker. This was carried out in triplicate cell culture on substrates with surfaces 12 µm, 80 µm, 280 µm, 560 µm and also on flat SU-8. Histograms were generated for average number of living cells/mm2 for each substrate, which corroborates with the results obtained for the cell culture marked with fluorophore DAPI. Thus, it is confirmed the better performance of the cell culture on substrates with 2R = 80 µm, presenting the highest number of living cells/mm2. The micrographs obtained with cells marked with DAPI were analyzed through the correlation function with the aim of understanding how the cells were organized. This was performed for each of the lithographed surfaces 12 µm, 30 µm, 80 µm, 280 µm, 560 µm and also flat SU-8. The surfaces of the substrates with 2R = 80 µm had the lowest values for length between its neighbors, that is, the cells are closer to each other. The remaining surfaces tend to separate the cells. Also were obtained the cluster radius values (rc), the distance between the clusters (dc) and the number of nearest neighbors (Np) through the correlation function fitting. The correlation analysis clearly showed what was not possible to observe by viewing the images. It shows that the cells, even in flat SU-8, have a strong tendency to form clusters of cells within about 45 micrometers. In the case of flat substrates, CHO cells exhibited better adhesion to the surface of SU-8, followed by the DLC, while the PDMS was worse due to low wettability of the material. In the case of surfaces with microstructures, SU-8 containing hexagonal microstructures of 12 and 30 µm showed to be the most adverse conditions for the CHO cell growth, probably because of the topography of the cavities being smaller in size compared to the size of CHO cells. SU-8 with 80 µm hexagonal microstructures was more favorable surface for the growth of CHO cells.

Orientador: Ana Lúcia Tasca Gois Ruiz / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T08:33:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DellaTorre_Adriana_M.pdf: 5760504 bytes, checksum: f3ad129dc63417ce4365252cefc87c39 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A "carqueja", Baccharis trimera (Less.) DC. (Asteraceae), é uma espécie vegetal característica de regiões tropicais, muito utilizada na medicina popular como anti-inflamatória, no tratamento de problemas hepáticos e renais, bem como para disfunções estomacais e intestinais. Recentemente, estudos demonstraram potencial atividade esquistossomicida sobre vermes adultos de Schistosoma mansoni (linhagem BH) para o óleo essencial (OE). Assim, este projeto teve por objetivo avaliar as atividades antiproliferativa e mutagênica, além da composição química do OE de B. trimera cultivada no campo experimental do CPQBA/UNICAMP. Coletas mensais (Janeiro/2012 a Dezembro/2012) das partes aéreas de B. trimera foram realizadas para a preparação do OE. Além disso, na época de floração em Julho, foram coletadas amostras das partes aéreas de indivíduos machos e fêmeas de B. trimera, diferenciadas morfologicamente pelas inflorescências. Todos os OEs preparados por hidrodestilação foram analisados por cromatografia gasosa acoplada a detector de massas (CG/EM) e avaliados quanto à atividade antiproliferativa in vitro e quanto à mutagenicidade no modelo de indução de micronúcleos com bloqueio da citocinese, com e sem ativação metabólica. A análise por CG/EM indicou que os compostos majoritários dos OEs foram biciclogermacreno, E-cariofileno, germacreno D, ?-pineno, globulol, ?-mirceno e ?-cadineno. Também foi observada uma variação na proporção relativa dos compostos presentes nos OEs obtidos das plantas fêmeas em relação aos machos. No teste de atividade antiproliferativa, em linhagens tumorais e não-tumorais, observou-se um perfil de atividade citostática semelhante para todas as amostras, independente da época de coleta, com valores de GI50 maiores que 25 ?g/mL. No teste do micronúcleo (MN) sem ativação metabólica, os OEs coletados no inverno (Jul/2012) e primavera (Out/2012) induziram um aumento na frequência de MNs, em relação ao controle de células sem tratamento, nas concentrações de 25 e 12,5 ?g/mL, enquanto os OEs obtidos no verão (Jan/2012) e outono (Abr/2012) apresentaram indução de MNs, estatisticamente significativa, somente na concentração de 25 ?g/mL. Nos experimentos realizados com os OEs extraídos de partes aéreas dos indivíduos machos e fêmeas, verificou-se que as plantas fêmeas não apresentaram potencial mutagênico nas três concentrações testadas (6,25; 12,5 e 25 ?g/mL), enquanto o OE obtido a partir dos indivíduos machos induziu aumento na frequência de MNs nas mesmas concentrações. Esses resultados sugerem que os sesquiterpenos hidrocarbonetos que predominam no OE obtido das partes aéreas das plantas machos (54,07%) podem estar envolvidos na ação mutagênica. Por outro lado, no teste com ativação metabólica, verificou-se uma redução significativa na frequência de MNs induzida pelos OEs em relação ao teste sem ativação, sugerindo que a metabolização dos OEs resultou em compostos com menor potencial mutagênico. Finalmente, no teste preliminar de antimutagenicidade, evidenciou-se no pós-tratamento e no tratamento simultâneo do OE com o metilmetanosulfonato uma possível reversão ou redução da clastogenicidade causada por este indutor de MNs. Esses dados sugerem possíveis atividades antimutagênica e mutagênica do OE das partes aéreas de B. trimera, com diferença significativa no potencial indutor de MNs entre indivíduos machos e fêmeas e que essa atividade é reduzida na presença de enzimas metabólicas, sugerindo uma potencial segurança de uso in vivo / Abstract: "Carqueja", Baccharis trimera (Less.) DC. (Asteraceae) is a native species from tropical regions widely used in folk medicine as anti-inflammatory, to treat liver and kidney problems as well as stomach and intestinal disorders. Recent studies have demonstrated the potential of B. trimera essential oil (EO) as schistosomicidal on adult worms of Schistosoma mansoni (BH strain). Therefore, this project aimed the evaluation of chemical composition, antiproliferative and mutagenic activities of EO obtained from B. trimera aerial parts cultivated in CPQBA/UNICAMP experimental field. B. trimera aerial parts were collected monthly (January/2012 to December/2012) and immediately submitted to EO extraction by hydrodistillation. Moreover, samples of males and females of B. trimera aerial parts morphologically differentiated by inflorescences were collected during the flowering season (July/2012). All EOs were analyzed by gas chromatography coupled to mass detector (GC/MS). They were also evaluated for antiproliferative activity in vitro and mutagenicity in cytokinesisblock micronucleus assay (CBMN), with and without metabolic activation. GC/MS analysis indicated that EOs major compounds were bicyclogermacrene, E-caryophyllene, germacrene D, ?-pinene, globulol, ?-myrcene and ?-cadinene, besides a variation on relative proportion of compounds between EOs of female and male plants. Antiproliferative assay in tumor and nontumor cell lines showed a similar cytostatic activity profile for all samples, independent of the collection time, with GI50 values above 25 ?g/mL. In CBMN assay without metabolic activation, EOs collected in winter (Jul/2012) and spring (Oct/2012) induced at 25 and 12.5 ?g/mL an increase in micronuclei frequency in comparison to untreated control cells, whereas EOs obtained in summer (Jan/2012) and autumn (Apr/2012) showed statistically significant micronuclei induction only at 25 ?g/mL. CBMN assay performed with male and female aerial parts EOs demonstrated that female plants showed no mutagenic potential in three concentrations (6.25, 12.5 and 25 ?g/mL) whereas male aerial parts EO induced an increase in micronuclei frequency at the same concentrations. These results suggested that sesquiterpenes hydrocarbons predominately present in male aerial parts EO (54.07%) should be involved in mutagenic action. Moreover, there was a reduction in micronuclei frequency induced by EOs when CBMN assay was carried out with metabolic activation, which suggests that enzymatic metabolism of EOs resulted in compounds with low mutagenic potential. Finally, preliminary evaluation of antimutagenicity has evidenced that simultaneous and post treatments of EO with methylmetanesulfonate (MMS) could reverse and/or reduce clastogenicity caused by this inducer of MNs. These data suggest possible antimutagenic and mutagenic activities of aerial parts of B. trimera EO, with a significant difference in potential inducer of MNs between males and females plants. Moreover, mutagenic activity decreased in the presence of metabolic enzymes, suggesting a potential safe use in vivo / Mestrado / Fármacos, Medicamentos e Insumos para Saúde / Mestra em Biociências e Tecnologia de Produtos Bioativos

O objetivo do projeto foi desenvolver linhagens celulares para um anticorpo terapêutico anti-hTNF&#945; e comprovar sua funcionalidade. Os genes anti-hTNF&#945; foram clonados em células CHO para seleção da população estável mista, demonstrando expressão de anticorpo com reconhecimento de hTNF&#945; em estrutura tridimensional. A população de transfectantes de maior produtividade específica foi escolhida para geração de linhagem monoclonal utilizando a tecnologia robótica ClonePix FL. Não houve diferença estatística entre o anti-hTNF&#945; purificado e o produto de referência na cinética de ligação ao TNF&#945; e reconhecimento diferencial por Fc&#947;Rs em ensaios por SPR O ensaio de atividade funcional mostrou que o anti-TNF&#945; desenvolvido pôde neutralizar a citotoxicidade induzida em células L929 e inibir a expressão de ELAM-1 em HUVEC. Os resultados finais permitiram identificar os três melhores clones, estáveis por 60 gerações. A comparabilidade entre o anti-TNF&#945; desenvolvido e a referência permite admiti-lo como não inferior, um dos requisitos para o desenvolvimento de biossimilar. / The aim of the project was to develop a therapeutic anti-hTNF&#945; antibody and evaluate its functionality. The anti-hTNF&#945; synthezised genes were cloned into CHO cells and stable pools were selected, producing antibodies able to hTNF&#945; three-dimensional structure recognition. The stable pools displaying higher antibody yields were the source for the generation of monoclonal lineage by ClonePix FL robotic technology. The clones selection proceeded using different criteria as cell density, specific productivity, fed-batch performance, kinetics measured by surface plasmonic resonance, hTNF&#945; binding through ELISA, western-blotting and SPR, Fc&#947;Rs binding by SPR. Besides, a small number of clones was tested in functional assays by the impairment of cytotoxicity of hTNF&#945; over L929 cells and the inhibition of ELAM-1 expression by HUVEC. The long term stability testing allowed to finally select 3 top clones, not inferior to adalimumab reference by the above criteria.

O projeto de obtenção de huAcMos (Anticorpos Monoclonais Humanizados) tinha como escopo a humanização de anticorpos murinos com potencial terapêutico, inserção das sequências em vetores de expressão e transfecção em células CHO (do inglês, Chinese Hamster Ovary). A expressão do huAcMo Anti-CD18 resultou em baixos níveis da proteína recombinante e inciamos o processo de expressão de isoformas do huAcMo Anti-CD3. As células foram transfectadas com seqüências codificadoras do fragmento FvFc Anti-CD3 e clonadas pelo equipamento ClonePix FL. O fragmento foi caracterizado e demonstrou uma menor afinidade quando comparada com a molécula murina original. Ulizamos o sistema de recombinação homóloga (CHO Flp-In, Invitrogen) para expressão da molécula inteira do huAcMo Anti-CD3. Os clones foram caracterizados e demonstrou, assim como o fragmento FvFc, uma menor afinidade pelo alvo. As diferenças nas propriedades de ligação são freqüentemente encontradas após processos de humanização; dependendo da função efetora esta diminuição de afinidade não é negativa para a molécula. / The humanized antibodies (huMab) project intent to use murine antibodies with therapeutic potencial to obtain more human sequences with maintened specificity. The sequences were inserted in expression vectors and transfected in CHO (Chinese Hamster Ovary) cells. Anti-CD18 huMab expression results in low levels of recombinant protein and lead us to try the expression of Anti-CD3 isoforms. The cells were transfected for the expression of a FvFc antibody fragment and cloned using ClonePix FL equipment. The fragment characterization demonstrate a lower affinity when compared with the murine molecule. We use the homologous recombination system (CHO Flp-In) for the expression of the whole molecule of huMab Anti-CD3; like the FvFc fragment, the whole molecule demonstrate a lower affinity for the target. The differences in the affinity properties are frequently found after humanization process and depending on the expected efector functions is not negatively characterized.