O projeto de obtenção de huAcMos (Anticorpos Monoclonais Humanizados) tinha como escopo a humanização de anticorpos murinos com potencial terapêutico, inserção das sequências em vetores de expressão e transfecção em células CHO (do inglês, Chinese Hamster Ovary). A expressão do huAcMo Anti-CD18 resultou em baixos níveis da proteína recombinante e inciamos o processo de expressão de isoformas do huAcMo Anti-CD3. As células foram transfectadas com seqüências codificadoras do fragmento FvFc Anti-CD3 e clonadas pelo equipamento ClonePix FL. O fragmento foi caracterizado e demonstrou uma menor afinidade quando comparada com a molécula murina original. Ulizamos o sistema de recombinação homóloga (CHO Flp-In, Invitrogen) para expressão da molécula inteira do huAcMo Anti-CD3. Os clones foram caracterizados e demonstrou, assim como o fragmento FvFc, uma menor afinidade pelo alvo. As diferenças nas propriedades de ligação são freqüentemente encontradas após processos de humanização; dependendo da função efetora esta diminuição de afinidade não é negativa para a molécula. / The humanized antibodies (huMab) project intent to use murine antibodies with therapeutic potencial to obtain more human sequences with maintened specificity. The sequences were inserted in expression vectors and transfected in CHO (Chinese Hamster Ovary) cells. Anti-CD18 huMab expression results in low levels of recombinant protein and lead us to try the expression of Anti-CD3 isoforms. The cells were transfected for the expression of a FvFc antibody fragment and cloned using ClonePix FL equipment. The fragment characterization demonstrate a lower affinity when compared with the murine molecule. We use the homologous recombination system (CHO Flp-In) for the expression of the whole molecule of huMab Anti-CD3; like the FvFc fragment, the whole molecule demonstrate a lower affinity for the target. The differences in the affinity properties are frequently found after humanization process and depending on the expected efector functions is not negatively characterized.

O projeto de obtenção de huAcMos (Anticorpos Monoclonais Humanizados) tinha como escopo a humanização de anticorpos murinos com potencial terapêutico, inserção das sequências em vetores de expressão e transfecção em células CHO (do inglês, Chinese Hamster Ovary). A expressão do huAcMo Anti-CD18 resultou em baixos níveis da proteína recombinante e inciamos o processo de expressão de isoformas do huAcMo Anti-CD3. As células foram transfectadas com seqüências codificadoras do fragmento FvFc Anti-CD3 e clonadas pelo equipamento ClonePix FL. O fragmento foi caracterizado e demonstrou uma menor afinidade quando comparada com a molécula murina original. Ulizamos o sistema de recombinação homóloga (CHO Flp-In, Invitrogen) para expressão da molécula inteira do huAcMo Anti-CD3. Os clones foram caracterizados e demonstrou, assim como o fragmento FvFc, uma menor afinidade pelo alvo. As diferenças nas propriedades de ligação são freqüentemente encontradas após processos de humanização; dependendo da função efetora esta diminuição de afinidade não é negativa para a molécula. / The humanized antibodies (huMab) project intent to use murine antibodies with therapeutic potencial to obtain more human sequences with maintened specificity. The sequences were inserted in expression vectors and transfected in CHO (Chinese Hamster Ovary) cells. Anti-CD18 huMab expression results in low levels of recombinant protein and lead us to try the expression of Anti-CD3 isoforms. The cells were transfected for the expression of a FvFc antibody fragment and cloned using ClonePix FL equipment. The fragment characterization demonstrate a lower affinity when compared with the murine molecule. We use the homologous recombination system (CHO Flp-In) for the expression of the whole molecule of huMab Anti-CD3; like the FvFc fragment, the whole molecule demonstrate a lower affinity for the target. The differences in the affinity properties are frequently found after humanization process and depending on the expected efector functions is not negatively characterized.

O emprego de novas tecnologias, como a transgenia, associadas ao melhoramento convencional de cana-de-açúcar apresenta grande potencial no combate a pragas e desenvolvimento de novas variedades. Entretanto, a falta de especificidade na expressão temporal e/ou local dos genes introduzidos tem se mostrado um fator limitante para o sucesso de produtos derivados da transgenia. Os promotores das metalotioneínas, por exemplo, podem representar uma alternativa ao uso de promotores constitutivos, particularmente, aqueles de metalotioneínas do tipo 1 (MT1) por apresentarem níveis elevados de expressão, em diferentes tecidos/órgãos e serem responsivos a estresses bióticos e abióticos. O uso de promotores sintéticos, contendo apenas elementos-cis, como GCG-like, W boxes e JERE, tem sido relevante por induzirem a expressão gênica local em resposta ao ataque de agentes bióticos. Este trabalho teve por objetivo a caracterização funcional de promotores de genes de metalotioneínas de cana-de-açúcar e o uso de elementos regulatórios sintéticos e, em paralelo, avaliou-se o uso de promotores sintéticos no controle da expressão gênica em cana-de-açúcar. Após as análises de expressão transiente, verificou-se que o promotor SoMT1b apresentou atividade GUS e GFP em epitélios de cebola e os promotores sintéticos, 4X Wbox, 4X GCC-like, 4X JERE e 4xW 4xS-box, e o promotor SoMT1b foram capazes de dirigir a expressão do gene repórter uidA (GUS) em calos embriogênicos de cana-de-açúcar. Em análise de expressão estável, o promotor SoMT1b foi capaz de dirigir a expressão do gene GUS para os frutos e sementes de tomate \'Micro-Tom\', mas não foi responsivo a estresse por herbivoria, cádmio e cobre. Também foi realizada a transformação de plantas de cana-de-açúcar, as quais ainda estão sendo analisadas. Os resultados obtidos demonstram a funcionalidade do promotor SoMT1b / New technologies, like genetic transformation, associated with conventional breeding of sugarcane have a large potential in developing new varieties tolerant to biotic and abiotic stress. However, the lack of specificity in the spatial and/or temporal expression of the introduced genes has been a limited factor for the success of products derived from transgeny. Metallothionein promoters, for instance, can represent an alternative to the use of constitutive promoters, particularly those from metallothionein type 1 (MT1) because they present high expression levels in different tissues / organs and are responsive to biotic and abiotic stress. Another alternative is the use of synthetic promoters which contain only cis elements, as GCG-like, W-box and JERE, which induces local gene expression in response to pathogen attack. In this work, we aimed to make the functional characterization of sugarcane metallothionein promoters and synthetic regulatory elements, in parallel, we evaluated the use of synthetic promoters in the control of gene expression in sugarcane. After transient expression analyzis, it was found that SoMT1b promoter was able to control the expression of the reporter genes to GUS and GFP in onion epithelium and GUS in sugarcane embryogenic calli. Additionally, synthetic promoters 4X Wbox, 4X GCC-like, 4X JERE and 4xW 4xS-box were able to direct the expression of the gene uidA (GUS) in embryogenic calli of sugarcane. In stable transformation analysis, SoMT1b promoter was capable of directing uidA expression in fruits and seeds of tomato cv. \'Micro-Tom\', but it was not responsive to herbivory, cadmium and copper stress. It was also carried out the transformation of sugarcane plants with the construction containing the SoMT1b promoter, but these are still being analyzed. The results demonstrate the functionality of the SoMT1b promoter in sugarcane and tomato

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O emprego de novas tecnologias, como a transgenia, associadas ao melhoramento convencional de cana-de-açúcar apresenta grande potencial no combate a pragas e desenvolvimento de novas variedades. Entretanto, a falta de especificidade na expressão temporal e/ou local dos genes introduzidos tem se mostrado um fator limitante para o sucesso de produtos derivados da transgenia. Os promotores das metalotioneínas, por exemplo, podem representar uma alternativa ao uso de promotores constitutivos, particularmente, aqueles de metalotioneínas do tipo 1 (MT1) por apresentarem níveis elevados de expressão, em diferentes tecidos/órgãos e serem responsivos a estresses bióticos e abióticos. O uso de promotores sintéticos, contendo apenas elementos-cis, como GCG-like, W boxes e JERE, tem sido relevante por induzirem a expressão gênica local em resposta ao ataque de agentes bióticos. Este trabalho teve por objetivo a caracterização funcional de promotores de genes de metalotioneínas de cana-de-açúcar e o uso de elementos regulatórios sintéticos e, em paralelo, avaliou-se o uso de promotores sintéticos no controle da expressão gênica em cana-de-açúcar. Após as análises de expressão transiente, verificou-se que o promotor SoMT1b apresentou atividade GUS e GFP em epitélios de cebola e os promotores sintéticos, 4X Wbox, 4X GCC-like, 4X JERE e 4xW 4xS-box, e o promotor SoMT1b foram capazes de dirigir a expressão do gene repórter uidA (GUS) em calos embriogênicos de cana-de-açúcar. Em análise de expressão estável, o promotor SoMT1b foi capaz de dirigir a expressão do gene GUS para os frutos e sementes de tomate \'Micro-Tom\', mas não foi responsivo a estresse por herbivoria, cádmio e cobre. Também foi realizada a transformação de plantas de cana-de-açúcar, as quais ainda estão sendo analisadas. Os resultados obtidos demonstram a funcionalidade do promotor SoMT1b / New technologies, like genetic transformation, associated with conventional breeding of sugarcane have a large potential in developing new varieties tolerant to biotic and abiotic stress. However, the lack of specificity in the spatial and/or temporal expression of the introduced genes has been a limited factor for the success of products derived from transgeny. Metallothionein promoters, for instance, can represent an alternative to the use of constitutive promoters, particularly those from metallothionein type 1 (MT1) because they present high expression levels in different tissues / organs and are responsive to biotic and abiotic stress. Another alternative is the use of synthetic promoters which contain only cis elements, as GCG-like, W-box and JERE, which induces local gene expression in response to pathogen attack. In this work, we aimed to make the functional characterization of sugarcane metallothionein promoters and synthetic regulatory elements, in parallel, we evaluated the use of synthetic promoters in the control of gene expression in sugarcane. After transient expression analyzis, it was found that SoMT1b promoter was able to control the expression of the reporter genes to GUS and GFP in onion epithelium and GUS in sugarcane embryogenic calli. Additionally, synthetic promoters 4X Wbox, 4X GCC-like, 4X JERE and 4xW 4xS-box were able to direct the expression of the gene uidA (GUS) in embryogenic calli of sugarcane. In stable transformation analysis, SoMT1b promoter was capable of directing uidA expression in fruits and seeds of tomato cv. \'Micro-Tom\', but it was not responsive to herbivory, cadmium and copper stress. It was also carried out the transformation of sugarcane plants with the construction containing the SoMT1b promoter, but these are still being analyzed. The results demonstrate the functionality of the SoMT1b promoter in sugarcane and tomato

Les cellules souches embryonnaires (cellules ES) sont pluripotentes et ont donc le potentiel de se différencier en cellules des trois feuillets embryonnaires, ainsi qu’en cellules de la lignée germinale. Ces propriétés en font un modèle pour l’étude des mécanismes de prolifération et de différenciation. Le facteur de transcription Lmx1b est impliqué dans la maintenance du phénotype différencié des neurones dopaminergiques mésencéphaliques. Et il a aussi été montré comme un facteur clef dans la différenciation et la maintenance des neurones sérotoninergiques du rhombencéphale générés dans les noyaux du Raphé. Dans ce travail, nous nous sommes intéressés aux capacités de Lmx1b d’influencer la différenciation des cellules ES de souris en neurones sérotoninergiques. La première stratégie adoptée a résulté en une expression ectopique stable de Lmx1b dans les cellules ES et leurs dérivés. Le niveau d’expression de Lmx1b a fortement influencé les capacités de différenciation neuronale des cellules. Puis, l’analyse de marqueurs de différenciation spécifiques a montré une augmentation de l’expression des marqueurs sérotoninergiques, au contraire des marqueurs dopaminergiques ou de neurones moteur. La seconde stratégie a consisté en une surexpression inductible de Lmx1b dans les précurseurs neuraux dérivés de cellules ES pour mimer l’expression physiologique de Lmx1b. Après induction, Lmx1b était bien exprimé dans les cellules durant toutes les étapes de différenciation neuronale. L’activation de l’expression de Lmx1b au stade des colonies neuroépithéliales a aussi résulté en une amélioration de la différenciation sérotoninergique. Les résultats de ce travail soulignent les capacités de Lmx1b à diriger la différenciation des précurseurs neuraux dérivés de cellules ES vers la voie sérotoninergique in vitro. / Pluripotent Embryonic Stem Cells (ESC) have the potential to develop into cells of the three germ layers and of the germ line. Therefore, they are used as a model to study the proliferation and differentiation mechanisms. The LIM homeodomain transcription factor Lmx1b is involved in the maintenance of the differentiated phenotype of midbrain dopaminergic neurons. And it has been also demonstrated to be a key factor in differentiation and maintenance of hindbrain serotonergic neurons generated in the Raphe Nuclei. Here, we explored the capacity of Lmx1b to direct differentiation of mouse ESC (mESC) into serotonergic neurons. In the first approach, stable ectopic expression of Lmx1b was achieved. First, the level of Lmx1b expression was found to strongly influence the capacity of mESC to accomplish neuronal differentiation. Then, analysis of lineage-specific differentiation markers showed an increase in serotonergic markers’ expression by contrast to dopaminergic or motor neurons markers. In the second approach, Lmx1b was over-expressed in mESC-derived neural precursors by an inducible system in order to mimic the physiological onset of Lmx1b expression. After induction, Lmx1b was found to be stably expressed throughout neuronal differentiation. Activation of Lmx1b expression in neuroepithelial colonies resulted in enhancement of serotonergic differentiation, consistently with the stable system results. The results of this work highlight the capacity of Lmx1b to promote the shift of mESC-derived neural precursors toward a serotonergic fate in vitro.