Les bactériophages ARN F-spécifiques sont des virus qui infectent Escherichia coli et possèdent une structure et une taille comparables à celles des principaux virus entériques pathogènes. Ils sont proposés comme indicateurs de pollution fécale du milieu hydrique, comme modèles du comportement des virus pathogènes dans l’environnement et comme outil de discrimination de l’origine de la pollution fécale. En effet, dans les eaux usées, il a été rapporté que les génogroupes II et III avaient principalement une origine humaine alors que les génogroupes I et IV avaient, quant à eux, plutôt une origine animale. Paradoxalement, peu de données existent quant à la répartition des différents génogroupes dans les eaux naturelles. L’objectif de ce travail a, par conséquent, été de préciser les relations existantes entre les différents génogroupes des phages ARN F-spécifiques et la pollution fécale et virale des eaux naturelles. Tout d’abord, nous avons développé les premiers systèmes de RT-PCR en temps réel capables d’identifier les quatre génogroupes dans les eaux environnementales. La sensibilité, la spécificité et la rapidité de détection constituent les avantages majeurs de cette approche. Par rapport aux outils existants, cette méthode permet de s’affranchir de l’étape de culture et donc de minimiser les problèmes engendrés par des taux d’inactivation importants des particules virales infectieuses, en réponse aux stress environnementaux. En effet, les études de persistance, réalisées aussi bien dans l’eau usée que dans l’eau souterraine, démontrent que, selon les conditions expérimentales, le génome phagique est de 3 à 20 fois plus résistant que les phages infectieux. Dans un second temps, l’analyse d’échantillons d’eaux usées urbaines nous a permis de vérifier que, malgré le changement de référentiel de mesure (génome versus particule infectieuse) inhérent à notre méthode de détection, les bactériophages ARN F-spécifiques pouvaient donner des informations intéressantes quant à la caractérisation de la pollution fécale. Dans ce type de milieu, les génogroupes II et III sont majoritairement retrouvés à des concentrations relativement stables au cours du temps. De manière ponctuelle, la présence du génogroupe I a pu, à la fois, être mise en relation avec les précipitations et avec la présence de pathogènes à caractère zoonotique (Cryptosporidium et Giardia), suggérant un apport de pollution animale par des phénomènes de ruissellement. Ceci a conforté l’idée que le génotypage pourrait constituer un outil intéressant de discrimination de l’origine de la pollution fécale. En revanche, la comparaison des résultats de génotypage aux concentrations en virus pathogènes montre que ces phages ne sont pas adaptés à la prédiction de la présence de norovirus et d’entérovirus, en raison d’un caractère saisonnier de ces derniers. Les deux études de cas consacrées aux eaux naturelles constituent l’étape majeure de notre étude. Dans un contexte de pollution principalement anthropique, il est démontré qu’au niveau de l’eau de rivière, le génogroupe II est très majoritairement observé. Les variations de concentration de ce génogroupe ont pu être corrélées positivement avec les indicateurs bactériens (E. coli, entérocoques) et avec les adénovirus humains attestant de son origine fécale humaine. Le génogroupe I est également très souvent représenté mais avec de plus amples variations de concentration. Ce génogroupe n’a été corrélé ni aux indicateurs bactériens, ni au génogroupe II, ni aux adénovirus humains, étayant l’hypothèse d’une autre origine de ce génogroupe. La corrélation positive avec les valeurs de turbidité de l’eau laisse supposer un apport de ces phages suite à des événements de ruissellement. Ainsi, dans l’eau de rivière, les génogroupes I et II semblent apporter des informations intéressantes quant à l’origine de la pollution fécale. Dans ce cadre, nous proposons l’utilisation d’un ratio de concentrations des génogroupes I et II pour caractériser la pollution fécale. A titre d’exemple, pour une concentration en E. coli de 3,6 log10 NPP/100mL, la valeur du log10 (GGII/GGI) peut être aussi bien de 3,8 que de -1,7. Avec la turbidité de l’eau, ce ratio a été le seul paramètre permettant de distinguer une modification dans la nature de la pollution fécale. Le génome des phages ARN F-spécifiques n’a pas été mis en évidence dans les prélèvements d’eaux souterraines protégées de la pollution fécale. Par contre, du génome d’adénovirus humains a été identifié dans 7 échantillons sur 60. Ainsi, des marqueurs plus persistants que le génome des phages ARN F-spécifiques peuvent être détectés. Au cours de l’étude de persistance menée dans ce milieu, aucune dégradation de l’ADN n’a été observée sur les 200 jours de l’expérience, supportant l’idée que l’ADN est un marqueur de pollution fécale extrêmement conservateur. Finalement, les méthodes nouvellement développées au cours de cette thèse ont abouti à une meilleure connaissance de la distribution des différents génogroupes au sein des eaux naturelles. Le génotypage des phages ARN F-spécifiques apporte des informations originales par rapport aux indicateurs bactériens, mais ne constitue pas, à lui seul, l’indicateur universel de pollution fécale ou virale des eaux. / F-specific RNA phages, which are non pathogenic viruses with similar size and structure to human enteric viruses, have been proposed like faecal pollution indicators, like models for pathogenic viruses in environment and like tools for microbial source tracking. The key trait on which the F-specific RNA phage approach of source tracking is based is that genogroups I and IV are predominantly isolated from non human faeces, while genogroups II and III are predominantly isolated from human faeces and sewage. Paradoxically, few data are available as for the genogroups distribution in environmental waters. So, the topic of this study was to provide additional information about the relationships between the genogroups of F-specific RNA phages and the level of faecal and viral pollution to environmental waters. First, the methodological work undertaken at the beginning of this project made it possible to develop the first real-time RT-PCR assays able to typing the F-specific RNA phages. The major advantages of this approach are a good sensitivity, a quick detection and a great specificity. Compared with the current tools, this method allows to avoid the phage cultivation and thus to play down the biases associated with the survival characteristics of infectious F-specific RNA phages in the environmental waters. Indeed, survival studies, realized in urban wastewater and also in ground water, have shown that the inactivation rates of infectious particles are always more important that this of viral RNA, whatever the experimental design was. Secondly, the analysis of urban wastewater samples enabled to check that F-specific RNA phages could give interesting information as for the characterization of faecal pollution in spite of the change of reference frame of measurement inherent in our detection method (genome versus infectious particle). In these kinds of samples, the majority of phages isolated belonged to the genogroups II and III, and they exhibited steady concentrations. In several particular samples, the high concentration of genogroup I phages has been associated with rainfall events and with the presence of zoonotic pathogens (Cryptosporidium and Giardia). This observation suggests the presence of an animal pollution after streaming phenomena. All the results obtained with urban wastewaters strengthen the use of F-specific RNA phages like reliable source identification tool. On the other hand, the comparison between the pathogenic virus concentrations and the results of genotyping has shown that phage genogroups are not relevant indicators for the presence of enteric viruses. For instance, norovirus and enterovirus concentrations in wastewater displayed a seasonal distribution while human genogroups exhibited steady concentrations over the time. Thirdly, two particular case studies devoted to natural waters constitute the major aspect of our work. In river water principally influenced by human wastes, genotyping results show that genogroup II is very largely isolated. For the first time, positive correlations between the concentrations of genogroup II phages, bacterial indicators (E. coli, enterococci) and human adenoviruses was observed, which attests the human faecal origin of this genogroup. Genogroup I was also often isolated but it appeared irregularly distributed. The correlation analysis has shown that genogroup I was linked neither with the concentration of genogroup II nor with that of bacterial or viral faecal indicators. The absence of a link between the concentrations of these two genogroups supports the assumption of another faecal origin. Conversely, a relationship was shown between genogroup I and the water turbidity observed at the sampling. This suggests that the origin of this genogroup could be related to streaming phenomena following precipitations. Thus, in river water the genogroup I and II would be the two most interesting genogroups in order to characterize faecal pollution. As a consequence, genogroup II/genogroup I ratio may be an interesting tool for faecal source tracking. Indeed, depending on the sign of the ratio, it seems possible to determine the main source of pollution at a given point. For example, for an E. coli concentration of 3.6log10 MPN/100mL, log-ratio values could as well be 3.8 as -1.7. With the water turbidity, this log-ratio was the only parameter enabled to highlight a change of faecal pollution nature. In ground waters protected from faecal pollution, genome of F-specific RNA phages was not observed while genome of adenoviruses was isolated in 7 samples on the 60 analyzed. This observation suggests that more persistent markers than RNA of phages could be detected in ground waters. More over, in persistence study, no degradation of adenoviral DNA was observed during all the time (200 days) of the experiment. Finally, the typing method newly developed during this study led to a better knowledge of the distribution of different the genogroups within environmental waters. F-specific RNA phage typing provides original information compared to the bacterial indicators, but does not constitute alone the universal indicator of faecal or viral pollution of waters.

Les vaisseaux sanguins sont tapissés d'une monocouche de cellules endothéliales qui est principalement responsable du maintien de la pression artérielle et des fonctions cardiaques via la relâche de médiateurs, en particulier le monoxyde d'azote (NO) et l'endothéline (ET). Le NO est un puissant vasodilatateur des cellules musculaires lisses suite à sa liaison à la guanylate cyclase tandis que l'ET-1, un vasopresseur très puissant, agit via deux récepteurs: ETA et ETB. La littérature traitant de la réactivité croisée entre l'ET-1 et le NO ne cesse d'augmenter. Brièvement, il a été rapporté que l'ET-1, via ses récepteurs ETB entraîne la libération d'une faible quantité de NO et que ce dernier, régule à la baisse la production d'ET-1 des cellules endothéliales. Dans ces conditions, le NO semble être un répresseur du système des endothélines. À l'inverse, plusieurs pathologies vasculaires et cardiaques sont associées avec une augmentation de l'ET-1 par exemple l'infarctus du myocarde et le choc endotoxique. Des études indépendantes rapportent, dans ces mêmes conditions, une production accrue de NO pouvant aller jusqu'à 100 fois. L'aspect contradictoire de ces effets est très intrigant et pourrait être explicable en partie par le fait qu'il existe deux familles d'isoenzymes responsable de la synthèse du NO appelés monoxyde d'azote synthase (NOS). Nous avons formulé l'hypothèse que la iNOS et la eNOS ont des effets opposés sur la régulation du système des endothélines. Les interactions entre l'ET-1 et les différentes NOS sont complexes et encore mal comprises dû au manque d'inhibiteurs vraiment sélectifs. Lors de notre étude nous utilisons des souris ayant une répression homozygote chronique pour le gène codant pour la iNOS ou eNOS en comparaison avec des souris de type sauvage. Ceci nous permet d'étudier l'influence des NOS et/ou de leur NO sur la régulation de la réponse pressive à l'endothéline et de l'expression de ces récepteurs. Les souris iNOS (-/-) ont des paramètres hémodynamiques de base semblables à celle de type sauvage. Cependant, notre étude a révélé que le contenu protéique cardiaque en récepteur ETA est réduit tandis que ETB est inchangé comparé au souris sans modification génique. En ce sens, nous observons une réduction de réponse pressive à l'endothéline-1 chez ces souris anesthésiées sans changement de la réponse pressive à l'IRL-1620, un agoniste sélectif des récepteurs ETB. D'un autre côté, l'inactivation du gène codant pour la eNOS entraîne chez ces souris un état hypertensif. Nos études moléculaires démontrent chez ces animaux, des niveaux de récepteurs ETA augmentés, et ETB réduits dans les tissus cardiaques des souris eNOS (-/-). De plus, leur réponse pressive suite à l'administration intraveineuse d'endothéline-1 ou d'IRL-1620 est augmentée ou réduite, respectivement. Chez les animaux conscients, les deux modèles murins ont répondu avec la même amplitude à l'effet hypotensif d'un traitement à l'antagoniste ETA, l'ABT-627. La pression des souris eNOS (-/-) est toutefois normalisée suite à trois jours de traitement. D'un autre côté, l'administration d'un antagoniste ETB, l'A-192621, augmente la pression artérielle moyenne dans une plus grande mesure chez les eNOS (-/-) comparé aux souris iNOS (-/-) ou de type sauvage. En outre, nous avons notés une augmentation significative de l'endothéline immunoreactive dans les artères mésentériques chez les souris eNOS (-/-) comparés aux souris iNOS (-/-), ces dernières ont des niveaux semblables à leur consoeurs non manipulées génétiquement. Notre étude montre que la répression de la iNOS ou de la eNOS a des impacts distincts sur l'endothéline-1 et ses récepteurs. Nous avons aussi montré que le coeur est le principal organe atteint; subissant ces modulations importantes des récepteurs de l'endothéline dans les conditions d'inactivation de la iNOS ou la répression de la eNOS chez des souris adultes. [Symboles non conformes]

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Chaque année, environ 175 millions de personnes souffrent d’infection du tractus urinaire (ITU) dans le monde. Pour diagnostiquer une ITU, une culture d’urine est réalisée mais nécessite un long délai. Pendant ce temps les patients sont souvent traités avec un antibiotique à large spectre qui peut entrainer des complications et contribuer à l’augmentation du nombre de bactéries résistantes. La plupart des échantillons reçus au laboratoire sont négatifs (≤10[indice supérieur 5] ufc /mL) ou contiennent Escherichia coli. Nous avons mis au point une méthode de dépistage rapide des échantillons positifs afin de sauver des coûts et éviter des complications. D’abord un protocole d’extraction d’ADNg a été élaboré avec la même efficacité pour tous les microorganismes. Cette méthode, appelé EtNa, chauffe le microorganisme dans une solution de 70 % éthanol et NaOH. Cette solution permet l’adsorption de l’ADN directement sur une colonne de silice afin de favoriser sa purification par un robot pipeteur. Elle a été comparée favorablement avec d’autres méthodes retrouvées dans la littérature et trousses commerciales, mais a l’avantage d’extraire les bactéries Gram positifs, Gram négatifs et levures avec une efficacité similaire et ce, avec un même protocole simple et sans produits chimiques toxiques. La deuxième étape du projet a été de mettre au point une méthode pour dépister les microorganismes pouvant causer les ITU en utilisant la PCR en temps réel pour amplifier le gène d’ARNr 23S des bactéries et 28S des levures. Grâce à une stratégie innovatrice de dénaturation des sondes, le pathogène peut être détecté et partiellement identifié. Une valeur seuil permettant de distinguer les échantillons positifs a été évaluée et correspond à un Cp de 26 (10[indice supérieur 5] ufc/mL). Un témoin interne est utilisé et permet de contrôler l’extraction et l’amplification. La méthode de dépistage a été éprouvée in vitro avec des souches de bactéries et levures, puis essayée avec quelques échantillons d’urines en provenance de la clinique. Puisque les résultats obtenus étaient très encourageants, l’analyse d’autres échantillons est importante pour faire une validation complète.

Le virus ostreid herpesvirus type 1 (OsHV-1), peut être considéré comme un des agents infectieux majeur affectant les élevages d’huîtres creuses, Crassostrea gigas, en France. Des différences de sensibilité à l’infection ont également été observées au sein de cette espèce. Des travaux précédents suggèrent un lien entre la base génétique et la survie des animaux face à l’infection. Dans ce contexte, l’objectif principal du travail de thèse était de mieux comprendre les interactions entre l’huître creuse et OsHV-1, et plus particulièrement, les bases moléculaires du cycle viral. Nos résultats montre que le virus est capable de se répliquer chez l’hôte quel que soit son stade de développement, et sa sensibilité. Cependant, la cinétique de multiplication est plus rapide chez des individus sensibles comparés aux moins sensibles. Il apparaît également que chez les individus survivants, le virus ne soit plus détectable après une phase de réplication active. Cette observation laisse suspecter (i) une rémission avec une élimination du virus ou (ii) une persistance du virus sans symptômes détectables. Ces résultats mettent en lumière la possibilité du virus de circuler au sein des individus survivants. Ces individus peuvent excréter des particules virales et intervenir ainsi dans le processus d’infection en milieu naturel. L’ensemble de ces résultats représentent une premier contribution à la compréhension du cycle d’ OsHV-1 chez l’huître creuse, plus particulièrement au niveau moléculaire. / In France, Ostreid herpesvirus type 1 (OsHV-1), can be considered one of the major infectious agents in Pacific oysters, Crassostrea gigas. Susceptibility differences to infection were observed in this species. Previous work suggested that the genetic basis and the survival animals to infection were related. In this context, the main objective of this thesis was to understand the interactions between oysters and OsHV-1, in particular, the molecular basis of the viral cycle. Our results shows that the virus is able to replicate in the host regardless of its stage of development or its susceptible. However, multiplication kinetic is faster in susceptible individuals compared to less susceptible individuals. After a active replication, it would appear that the virus is no detectable in survival individuals. This observation suggests (i) a remission with elimination of the virus or (ii) a virus persistence without detectable symptoms. These results highlight the ability of the virus circulating in the host without causing mortality. These individuals can excrete viral particles and interfere with the infection process in field. All these results represent a first contribution to the understanding of OsHV-1 cycle in Pacific oysters, particularly at the molecular level.

Résumé: L’expression des gènes modifiés contribue à l’initiation et la progression du cancer. Malheureusement, les recherches actuelles s’attardent essentiellement à l’expression globale des gènes sans tenir compte des différentes isoformes des ARNm résultant de l’épissage alternatif, codant potentiellement pour des protéines de fonctions différentes. En effet, la haute similitude et la complexité des isoformes ARNm rendent la discrimination des isoformes laborieuse, raisons pour lesquelles l’épissage alternatif est historiquement étudié gène par gène. C’est la raison pour laquelle nous avons développé une méthodologie à haut débit pour la quantification des isoformes d’ARNm. Basé sur cette technique, cette Thèse présente une série d’évidences qui appuie l’hypoThèse selon laquelle certaines isoformes d’ARNm sont nécessaires à la tumorigénèse. Précédemment, des études bioinformatiques à grande échelle ainsi que des validations expérimentales à petite échelle ont révélé la présence d’isoformes spécifiques à certains types de cancers. Toutefois, ces conclusions ont été tirées à partir de tumeurs dont le contenu cellulaire est hétérogène. Or, il est bien connu que les niveaux des isoformes d’ARNm diffèrent largement en fonction du type cellulaire et il est possible que les différences observées dans des tumeurs entières soient des artéfacts résultant de la complexité cellulaire des tissus comparés. En nous basant sur le cancer de l’ovaire comme modèle, nos préparations homogènes de différents types cellulaires nous ont permis de révéler la présence d’isoformes associées au cancer indépendamment de l’hétérogénéité des tumeurs. Étonnamment, les changements les plus intéressants ne se retrouvent pas dans les cellules cancéreuses à proprement dites, mais dans les cellules "normales" en bordure de la tumeur. Notre analyse des facteurs de régulation de ces isoformes nous a permis d’affirmer que ces changements ne sont pas dûs à un dérèglement anarchique des cellules cancéreuses, mais découlent plutôt d’un programme destiné à avantager les cellules cancéreuses. Pour évaluer la fonction des isoformes d’ARNm, nous avons généralisé des outils moléculaires permettant de reprogrammer spécifiquement l’expression d’isoformes de gènes cible dans des lignées cellulaires cancéreuses. Ainsi, le criblage systématique d'isoformes d’ARNm de gènes cibles associés au cancer a permis de révéler leur caractère pro-cancer dans des essais in vitro. L'ensemble de ces travaux démontrent la contribution des isoformes d’épissage dans le développement des tumeurs solides. // Abstract: Cancer cells modify their gene expression pattern to promote tumor growth. Unfortunately, current research focuses almost exclusively on global gene expression changes, without taking into account the fact that the majority of genes produce multiple alternative splicing variants, which potentially code for proteins of different functions In fact, the main reason splicing isoforms are still studied on a gene by gene basis is because the high sequence similarity and complexity of mRNA isoforms make it very difficult to detect and quantify them. To overcome this difficulty, we developed a high-throughput methodology to accurately quantify splicing isoforms. This methodology has been applied in this thesis to generate evidence supporting a causal role for splicing isoforrns in the tumorigenesis of solid tumors. A few years ago, genome-wide bioinformatics predictions, and some experimental validations in human tissues, suggested the existence of cancer-specific splicing isoforms. However, these conclusions may be simply explained by the cellular heterogeneity of tumor. In fact, it is well established that alternative splicing is a cell type-specific process. To address this, we microdissected cancer tissues and demonstrated that some splicing isoforms are truly cancer-associated and independent of tumor cell type content. Surprisingly, the most interesting changes were found in the "normal" stromal cells surrounding the tumor and not within the cancer cells. Our analysis of splicing-factor expression changes using the same tissue set allowed us to confirm that these splicing shifts were not a random process, but rather part of a defined splicing program promoting tumor development. To evaluate the functional contribution of splicing isoforms, we developed molecular tools that modulate splicing of endogenous targets in cancer cell lines. We used these tools to decipher the pro-cancer properties of cancer-associated splicing isoforms using in vitro assays. Overall, this work demonstrated the contribution of splicing isoforms in solid tumor development.

Leptospirose est la zoonose bactérienne la plus répandue dans le monde et son incidence est plus forte dans les régions tropicales où le taux de mortalité peut excéder 10%. Un diagnostic rapide est fondamental car le traitement a plus de chance d’être efficace lorsqu’il est précoce. Nous avons utilisé le diagnostic par biologie moléculaire (RT-PCR) pour contribuer à mieux connaitre l’épidémiologie de la leptospirose aux Antilles. Dans les deux premiers articles, nous rapportons pour la première fois en Martinique la survenue de cas groupés de leptospirose après des événements sportifs (course à pied, canyoning). La présence d’abrasions cutanées a été identifiée comme facteur de risque de l’infection et ces travaux ont mis en évidence l’intérêt du diagnostic par RT-PCR pour informer rapidement les personnes exposées et débuter tôt les antibiotiques. Le troisième travail est une étude de cohorte prospective portant sur 102 patients et nous rapportons l’association entre l’élévation de la concentration sanguine de leptospires mesurée à l’admission et la sévérité de la maladie. Les principaux éléments cliniques initiaux associés à la sévérité étaient l’hypotension, les anomalies auscultatoires, l’ictère et l’anurie. L’identification de l’espèce Leptospira interrogans, le sérovar Icterohaemorrhagiae /Copenhageni, et la présence de rats à domicile étaient aussi associés à la sévérité. L’utilisation du diagnostic par biologie moléculaire nous a permis de contribuer à l’étude de facteurs de risque et des facteurs pronostiques de la leptospirose, mais aussi à mieux connaître le poids réel de la maladie aux Antilles. / Leptospirosis is the most widespread zoonosis in the world and its incidence is higher in in tropical areas where its fatality rates can exceed 10%. Availability of rapid diagnostic tools is a top-priority, since antibiotic is more efficient when given early. In this work, we rely on molecular diagnosis (RT-PCR) to contribute to the study of leptospirosis epidemiology in the Caribbean. In the first two papers, we describe for the first time in Martinique outbreaks of leptospirosis after sporting events (trail running, canyoning). The occurrence of cutaneous abrasions was identified as a risk factor for infection and data from those outbreaks suggest that rapid diagnostic assays such as PCR are particularly appropriate in this setting for early diagnosis, information of exposed participants, and treatment during acute phase of the disease. The third paper is a cohort study of 102 patients and we report that high level leptospiremia at the time of admission was associated with severity of the disease. The main clinical findings at the time of admission that were associated with severe leptospirosis included: hypotension, chest auscultation abnormalities, icterus, and oligoanuria. Identification of Leptospira interrogans species, serovar Icterohaemorrhagiae/Copenhageni, and the presence of rats in the house were also associated with severity. Detection methods using RT-PCR allowed us to contribute to the study of risk and prognostic factors, but also to have a better understanding of leptospirosis public health impact in the Caribbean.

Les salmonelles sont l'une des causes les plus importantes de maladie transmise par les produits laitiers crus. L'appréciation du risque associé à la consommation de ces produits est nécessaire et la méthode la plus appropriée pour réaliser ce but est l'utilisation du processus d'analyse de risque qui associe les microbes pathogènes dans l'aliment au problème de santé publique. Le but principal de cette thèse est donc d'évaluer quantitativement le risque de salmonellose humaine lié à la consommation de Camembert fromage au lait cru. Les lacunes qui sont en général identifiées pour l'appréciation des risques sont le manque de données quantitatives sur les microbes pathogènes contaminant les aliments. Donc, comme premier objectif de cette thèse, nous avons developeé une méthode rapide, sensible et fiable pour la quantification des salmonelles dans le lait artificiellement contaminé. La méthode a combiné les principes de la méthode du nombre-le plus-probable (NPP) avec une analyse PCR en temps réel. Avec cette analyse (NPP-PCR en temps réel) fiable niveau de la contamination (1- 5 ufc/mL) du lait peut être énuméré après 8 h d'enrichissement non-sélectif dans l'eau peptone tamponée. Toutes les valeurs de nombre le plus probable ont bien correspondu au niveau estimé de contamination des salmonelles inoculées dans des échantillons de lait. Afin d'évaluer l'utilité de cette analyse de quantification, nous l'avons appliquée aux échantillons naturellement contaminés de lait de tank d'exploitations laitières situées dans l'Ouest de la France. Huit (2,68%) des 299 échantillons de lait de tank étaient trouvés positifs, avec des comptes estimés de nombre plus probable s'étendant de 3,7 à 79,2 /mL de lait. En dépit des problèmes d'inhibition observés avec quelques échantillons de lait, l'application de l'analyse par PCR en temps réel pour mesurer des salmonelles dans le lait cru s'est avérée être rapide, facile à exécuter et extrêmement sensible. Dans l'appréciation des risques potentiels liés aux salmonelles dans le lait cru et les produits à base de lait cru il était nécessaire d'examiner la vii capacité des salmonelles à se développer dans le lait. Par conséquent, nous présentons dans cette thèse des modèles primaires et secondaires décrivant mathématiquement la croissance des salmonelles (S. Typhimurium et S. Montevideo) dans le lait à température constante pendant différentes périodes d'incubation. Le modèle logistique avec délai a été employé pour décrire la croissance des salmonelles en fonction du temps. Les taux de croissance spécifiques de S. Typhimurium et de S. Montevideo différent selon le sérotype et la température. Les taux de croissance maximum ont été alors modélisés en fonction de la température en utilisant le modèle cardinal secondaire de Rosso. Les valeurs cardinales obtenues avec S. Typhimurium et S. Montevideo étaient: Tmin 3,02, 3,40 ; Topt 38,44, 38,55 et Tmax 44,51, 46,97°C, respectivement. À la température optimum de croissance (Topt) les taux de croissance maximum étaient 1,36 et 1,39 log10 ufc/h-1 pour S. Typhimurium et S. Montevideo respectivement. Les modèles primaires et secondaires ont permis de bons ajustements aux données de croissance avec un pseudo R2 = 0.97-0.99. Un modèle d'appréciation du risque de salmonellose humaine liée à la consommation de Camembert au lait cru est présentée qui est basée sur les résultats des objectifs précédemment mentionnés dans cette thèse. Différentes distributions ont été posées en hypothèse pour des paramètres du modèle et une simulation de Monte Carlo a été employée pour modeler le processus et pour mesurer le risque lié à la consommation de la portion de 25 g du fromage. Le 99th percentile du nombre de cellules de salmonelles dans les portions de 25 g de fromage était 5 cellules à l'heure de la consommation, correspondant à 0,2 cellule des salmonelles par gramme. Le risque de salmonellose par portion de 25 g est compris entre 0 et 1,2 × 10-7 avec une médiane de 7,4 × 10-8. Pour 100 millions de portions de 25g, le nombre de cas de salmonellose prévue par le modèle est en moyenne de 7,4. Quand la prévalence est réduite dans le modèle d'un facteur de 10, le nombre de cas par 100 millions de portions est réduit à moins de 1 cas. En dépit des limites et des données manquantes, nous avons démontré l'avantage de l'appréciation du viii risque non seulement comme outil d'évaluation de risque mais également comme dispositif d'aide à la prise de décision et à la gestion des risques.

Plus de 130 espèces de Vibrio, bactéries ubiquitaires des milieux marins et estuariens sont décrites, dont certaines sont des pathogènes d’organismes marins (poissons, coraux, coquillages, …). Douze espèces sont pathogènes pour l’homme, parmi lesquelles V. cholerae, V. parahaemolyticus et V. vulnificus. Les cas d’infections humaines sont essentiellement liés à la consommation de produits de la mer crus ou à l’exposition de plaies cutanées à l’eau de mer. En France, ce risque est faible mais pourrait s’accentuer en raison de la consommation croissante de produits de la mer, de l'augmentation de la part des individus immunodéprimés dans la population, de l'impact des activités anthropiques et du réchauffement climatique sur le milieu marin. Une meilleure compréhension de l'écologie de ces bactéries (distribution, abondance et diversité) est un pré-requis à la mise en place d’une surveillance environnementale de ce risque. L’étude menée au cours de ma thèse en zone Manche-Mer du Nord, dans le cadre du programme Vibrio Manche (2009-2012, partenariat EDFR&D/Ifremer/Institut Pasteur de Lille), avait pour objectif d'évaluer la diversité et la distribution spatio-temporelle côtière des vibrions, dont des espèces potentiellement pathogènes pour l’homme et les animaux, et leur relation avec les paramètres environnementaux biologiques (phytoplancton et zooplancton) et physico-chimiques. La stratégie de suivi a reposé sur le dénombrement et l’isolement de souches de Vibrio, à 22°C et 37°C sur milieu sélectif, à partir d’eau de mer et de sédiments superficiels collectés au cours de neuf campagnes d’échantillonnage et associés à la mesure de paramètres environnementaux. Le développement et la validation d’outils d’identification des souches environnementales par PCR en temps réel et le séquençage de marqueurs génétiques discriminants ont conduit à mettre en évidence une grande diversité d’espèces parmi les isolats à 22°C, celle-ci étant composée principalement de pathogènes d’organismes marins dont l’espèce V. splendidus. Les isolats à 37°C, marqués par la prédominance de deux espèces, V. alginolyticus et V. harveyi, et la rareté des pathogènes humains détectés dans les conditions d’analyses retenues pour cette étude. Au terme de l’étude, nous avons mis en évidence la présence de 20 et 17 espèces de vibrions respectivement à 22°C (deux campagnes) et 37°C (neuf campagnes) sur la zone étudiée, et l’influence probable de conditions environnementales contrastées sur la structure de ces populations. En termes d’abondance, les vibrions cultivables à 37°C ont montré une forte saisonnalité, et une relation significative à la température de l’eau et à l’abondance totale du zooplancton. La saisonnalité des vibrions cultivables à 22°C a été moindre, et leur abondance a pu être reliée de façon significative à la concentration en chlorophylle a totale et également à l’abondance totale en zooplancton. Ces éléments de connaissance et la stratégie d’identification développée pourront, à terme, contribuer au développement d’outils de surveillance microbiologique environnementale et ouvrent des perspectives pour mieux comprendre l’écologie des vibrions et les facteurs structurant non seulement leur abondance, mais aussi leur diversité. / One hundred and thirty species of vibrios, ubiquitous bacteria of marine and estuarine environments have been described, some of them being pathogenic for marine organisms. Twelve species are classified as human pathogens, Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus and V. vulnificus being the most frequently reported in cases of infection. Human infections are linked mostly to raw seafood consumption or to the exposure of skin wounds to contaminated seawater. In France, the risk is low but it is expected to increase in the future due to the increase of raw seafood consumption, the part of immuno-compromised people, but also the impact of anthropic activities and global warming on the marine environment. A better understanding of the ecology of these bacteria (distribution pattern, abundance and diversity) is a prerequisite for the monitoring of the Vibrio-risk in the environment. The 2-year study carried out in the Eastern English Channel during my PhD was part of the Vibrio Manche program (2009-2012, funding EDF R&D/Ifremer/Institut Pasteur de Lille), which main objective was to characterize the spatio-temporal distribution of the vibrios, among which the potentially pathogenic species for human and animal, and their relations with the biotic(phytoplankton and zooplankton) and abiotic environmental parameters. The strategy consisted in the enumeration and isolation of Vibrio strains, at 22°C and37°C on a selective medium, from seawater and superficial sediments collected during nine sampling campaigns and associated with the recording of environmental parameters. The protocol developed in this study provides an appropriate and rapid screening tool to identify a large number of bacterial strains routinely isolated from the environment. This was based on real-time PCR assays and the sequencing of discriminant genetic markers. We highlighted the important diversity of species among the 22°C isolates, represented mainly by species pathogenic for marine organisms such as V. splendidus. Contrastingly, the 37°C isolates were mainly represented by two species, V. alginolyticus and V. harveyi, and the potentially pathogenic species for humans were rarely detected using this experimental approach. We detected 20 and 17 species of vibrios among the 22°C (two sampling campaigns) and 37°C(nine sampling campaigns) isolates, respectively, and highlighted the probable influence of contrasted environmental conditions on these populations structure. These two populations presented different seasonal dynamics, as the seawater temperature and the zooplankton abundance showed to be the main drivers for the 37°C population. The 22°C population seemed to be linked to the chlorophyll a concentration and zooplankton abundance. These data and the approach developed in this study could contribute to the development of tools for the monitoring of coastal environment and they give perspectives to better understand the ecology of the vibrios and the environmental factors driving their abundance and diversity.

La tuberculose continue d’être une cause majeure de morbidité et de mortalité dans le monde, principalement dans les pays en voie de développement, bien qu’elle soit une maladie curable. Le diagnostic rapide et précis de la TB active est essentiel pour l’initiation rapide du traitement et le contrôle de la maladie. Le développement de nouveaux tests rapides de diagnostic de TB active représente un véritable challenge pour l’optimisation du diagnostic.L’objectif principal de nos travaux de thèse était de développer et d’évaluer des approches de PCR en temps réel ciblant la séquence d’insertion IS6110 pour la détection de l’ADN de MTB dans les expectorations.Nous avons tout d’abord développé une PCR en temps réel ciblant la séquence répétée IS6110 pour la quantification de l’ADN de MTB. L’évaluation des étapes d’optimisation de la sensibilité de la PCR IS6110 a permis de préciser les performances analytiques et le gain de sensibilité comparativement à une PCR ciblant le gène unique senX3. Au terme d’une comparaison de six protocoles de lyse/ extraction la méthode Chelex® s’est avérée être la plus efficace dans la récupération de l’ADN. La performance diagnostique de la PCR optimisée a été évaluée et comparée avec la PCR automatisée Xpert MTB/RIF sur un panel de 62 échantillons respiratoires.Dans un deuxième temps, nous avons comparé la performance diagnostique de la PCR IS6110 optimisée, le test Xpert MTB/RIF et la version ultrasensible récemment commercialisée du test PCR leader Xpert MTB/RIF Ultra pour la détection de l’ADN de MTB dans des expectorations ayant une faible charge bacillaire.Enfin, à partir de 203 LCR collectés dans le cadre du diagnostic de méningites aseptiques au Burkina Faso, nous avons évalué la performance de la PCR en temps réel multiplexe (IS6110, HSV1, HSV2) combinée à l’extraction par la méthode Chelex® pour la détection de l’ADN de MTB et d’Herpès. / TTuberculosis continues to be a major cause of morbidity and mortality worldwide, mainly in developing countries, despite being a curable disease. The rapid and accurate diagnosis of active TB is essential for rapid initiation of treatment and disease control. The development of new rapid diagnostic tests for active TB represents a real challenge for the optimization of the diagnosis.The main objective of our thesis work was to develop and evaluate real-time PCR approaches targeting the IS6110 insertion sequence for the detection of sputum MTB DNA. We first developed a real-time PCR targeting the IS6110 repeat sequence for the quantification of MTB DNA. The evaluation of the sensitivity optimization steps of the IS6110 PCR made it possible to specify the analytical performances and the sensitivity gain compared to a PCR targeting the single gene senX3. After a comparison of six lysis / extraction protocols, the Chelex® method proved to be the most efficient in the recovery of DNA. The diagnostic performance of optimized PCR was evaluated and compared with automated Xpert MTB / RIF PCR on a panel of 62 respiratory specimens.In a second step, we compared the diagnostic performance of the optimized IS6110 PCR, the Xpert MTB / RIF test and the highly marketed ultra-sensitive version of the Xpert MTB / RIF Ultra leader PCR assay for the detection of sputum MTB DNA. having a low bacillary load.Finally, from 203 LCR collected in the context of the diagnosis of aseptic meningitis in Burkina Faso, we evaluated the performance of the multiplexed real-time PCR (IS6110, HSV1, HSV2) combined with extraction by the Chelex® method for the detection of MTB and Herpes DNA.