Doctora en Ciencias de la Ingeniería, Mención Química / La venta de biofármacos representa una industria billonaria que ha crecido exponencialmente desde la década de los 70's debido al aumento de la demanda por estas proteínas terapéuticas altamente específicas. Estas proteínas recombinantes son sintetizadas por diferentes líneas celulares, especialmente aquella derivada de ovarios de hámster chino CHO ya que presentan altas tasas específicas de producción de proteína recombinante y son fácilmente adaptables a escalas industriales. Hoy en día, más de la mitad de los anticuerpos monoclonales que se encuentran en el mercado son producidos por células CHO. Para incrementar el rendimiento de los procesos productivos, diferentes metodologías han sido usadas por investigadores. Resultados positivos han sido obtenidos aplicando principios de ingeniería y utilizando herramientas de biología molecular para modificar reacciones bioquímicas. Proyectos de Ingeniería Metabólica han sido exitosos en reducir la producción de metabolitos indeseados, especialmente lactato, e incrementar la síntesis de proteína recombinante. En este trabajo se estudia el efecto que tienen diferentes estrategias de Ingeniería Metabólica sobre el metabolismo y cultivo de células CHO. Se ha probado que el metabolismo de carbono de células CHO es altamente ineficiente, consumiendo una cantidad de glucosa mayor de la necesaria para mantener el metabolismo energético y proliferación celular. En este trabajo se construyeron clones de células CHO productoras de IgG recombinante que sobre-expresan PYC2, MDH II y trasportador de fructosa. La expresión de estos genes permitiría aliviar cuellos de botella en el metabolismo central del carbono de las células. En este trabajo se estudiaron y contrastaron los efectos de la sobre-expresión de estos genes sobre la extensión de los cultivos, metabolismo y productividad. Los resultados indican que todos los clones estudiados presentan un metabolismo más eficiente, caracterizado por una menor producción de lactato por glucosa consumida y que no todos mejoraron su proliferación celular y/o productividad específica. Células CHO sobre expresando PYC2 mejoraron su tasa máxima de crecimiento, pero redujeron la tasa de producción de proteína recombinante; la sobre-expresión de MDH II conduce a la reducción del crecimiento celular y síntesis de proteína; finalmente, sobre-expresar el transportador de fructosa aumenta la proliferación celular y síntesis de proteína recombinante en medios con fructosa. Proponemos que las diferencias en producción de proteína se deben a alteraciones del estado RedOx de la célula que afectan en ensamblado de las cadenas peptídicas y la secreción de éstas. Reducir la expresión del gen Lactato deshidrogenasa A ha sido el objetivo de numerosos trabajos con el fin de reducir la síntesis de lactato e incrementar la producción de proteína recombinante. Utilizando el nuevo sistema para edición genómica CRISPR-Cas logramos interrumpir una de las copias del gen. Resultados del análisis de cultivos fed-batch de estas células indican que el crecimiento celular y el metabolismo fueron afectados y la síntesis específica y volumétrica de la proteína recombinante incrementó considerablemente. Se realizó un análisis a profundidad del metabolismo de las células deficientes en LDHa. Se midió la razón NAD+/NADH de éstas y el valor indicó que las células mutadas presentan niveles de NAD +/NADH menores que las del cultivo control, sugiriendo una mejora en su metabolismo energético debido a la mayor acumulación de NADH. Mediante Análisis de Flujos Metabólicos se estimó los flujos entre las reacciones más importantes del metabolismo central de las células. Los resultados confirmaron que en las células mutantes existen mayores flujos en el ciclo del TCA, debido principalmente a un mayor aporte de carbonos provenientes del catabolismo de amino ácidos. Estas células también presentan un menor flujo en la vía de la glicólisis, lo que se correlaciona con la menor proliferación que estas presentaron, y esto último puede explicar el aumento de síntesis de proteínas. En este trabajo se aplicaron exitosamente conceptos de Ingeniería Metabólica para la construcción de clones con distintos metabolismos. Este trabajo revela los efectos de varias modificaciones, lo que lo hace una fuente útil información acerca de los efectos que tienen variadas estrategias metabólicas sobre cultivos de células CHO. Finalmente, este trabajo resulta ser un aporte para la comunidad científica contribuyendo con la primera comparación de diferentes clones que sobre-expresan genes claves del metabolismo central del carbono y entregando el primer estudio en profundidad del efecto de reducir la expresión del gen de la LDHa.

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Doctora en Ciencias de la Ingeniería, Mención Ingeniería Química y Biotecnología / Las células animales son uno de los principales sistemas para la producción de biofármacos, sin embargo la mayoría de las estrategias para mejorar su productividad no están respaldadas por conocimiento específico para las líneas celulares usadas en la industria. En este trabajo se reconstruye un modelo a escala genómica para células CHO para ampliar el conocimiento de procesos celulares asociados con productividad en la síntesis de biofármacos. Para lograr este objetivo analizamos el modelo a escala genómica de ratón iMM1415 usando herramientas desarrolladas para explorar el efecto de knockout de genes y determinación de flujos en crecimiento celular. Nuestros resultados muestran que esta red metabólica está dominada por metabolismo de lípidos. Adicionalmente, confirmamos que un enfoque de sampleo, donde se explora el espacio de soluciones en vez de imponer un objetivo de optimización, es más apropiado para el estudio del metabolismo en sistemas complejos como células animales. Posteriormente, se desarrolla en estudio comparativo de las herramientas desarrolladas para la generación automática de modelos preliminares, donde los resultados obtenidos utilizando tres algoritmos (modelSEED, Pantograph y Pathway tools) muestran que Pantograph es la herramienta más apropiada para la generación de un modelo a escala genómica de células CHO. Este algoritmo produce un modelo basándose en un modelo previo y ortología entre ambos organismos, produciendo un modelo preliminar que hereda características como asociaciones de genes distintas para distintos organelos celulares lo que es crucial para potenciales aplicaciones de modelos para eucariontes. El modelo iNJ1301 para células CHO es reconstruido de acuerdo a la metodología propuesta basándose en iMM1415 y el modelo humano Recon 1. iNJ1301 tiene 3,709 reacciones asociadas a 1,301 genes y fue validado con información experimental para esta línea celular prediciendo correctamente el crecimiento celular en un 88% de los casos simulados. Adicionalmente, este modelo es reducido imponiendo cambios en expresión de genes reportados para representar un metabolismo ineficiente del carbono caracterizado por síntesis de lactato y el shift metabólico observado en esta línea celular, mostrando el potencial de este enfoque para ser usado en la integración de datos transcriptómicos. Al utilizar un nuevo enfoque basado en ortología se pudieron encontrar nuevas asociaciones de genes no incluídas en reconstrucciones creadas utilizando metodologías clásicas para la generación de modelos, por lo que los resultados de este trabajo fueron incorporadas en el modelo consenso iCHO1766. La identificación de marcadores asociados a productividad mejorada en células CHO ha sido abordada desde la perspectiva genómica, transcriptómica y proteómica. En este trabajo integramos datos transcriptómicos para dos clones de células CHO que muestran distintos perfiles de productividad en el modelo iNJ1301. Datos de un alto (HP) y bajo (LP) productor de IgG son integrados al modelo usando iMAT (integrative metabolic analysis tool) obteniéndose modelos reducidos que presentan una alta conservación de vías metabólicas de glutatión y azúcares nucleotídicos. Este enfoque es luego acoplado con sampleo de las redes metabólicas encontrándose que ambos modelos presentan comportamientos distintos, donde el clon HP está enfocado en el uso del ciclo del TCA y la vía pentosas fosfato. Finalmente, concluimos que este enfoque que combina distintas herramientas utilizadas en biología de sistemas es una nueva herramienta que permite el estudio exhaustivo de sistemas biológicos complejos tales como líneas celulares animales.

Doctor en Ciencias de la Ingeniería, Mención Química / In the first chapter, this thesis aims to demonstrate the great potential of Constraint-Based Reconstruction and Analysis (COBRA) methods for studying and predicting specific phenotypes in the bacterium Acidithiobacillus ferrooxidans. A genome-scale metabolic reconstruction of Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC 23270 (iMC507) is presented and characterized. iMC507 is validated for aerobic chemolithoautotrophic conditions by fixating carbon dioxide and using three different electron donors: ferrous ion, tetrathionate and thiosulfate. Furthermore, the model is utilized for (i) quantitatively studying and analyzing key reactions and pathways involved in the electron transfer metabolism, (ii) describing the central carbon metabolism and (iii) for evaluating the potential to couple the production of extracellular polymeric substances through knock-outs. The second chapter work outlines the effort towards advancing the field of systems metabolic engineering by using COBRA methods in conjunction with chemoinformatic approaches to metabolically engineer the bacterium Escherichia coli. A complete strain design workflow integrating synthetic pathway prediction with growth-coupled designs for the production of non-native compounds in a target organism of interest is outlined. The generated enabling technology is a computational pipeline including chemoinformatics, bioinformatics, constraint-based modeling, and GEMs to aid in the process of metabolic engineering of microbes for industrial bioprocessing purposes. A retrosynthetic based pathway predictor algorithm containing a novel integration with GEMs and reaction promiscuity analysis is developed and demonstrated. Specifically, the production potential of 20 industrially-relevant chemicals in E. coli and feasible designs for production strains generation is outlined. A comprehensive mapping from E. coli s native metabolome to commodity chemicals that are 4 reactions or less away from a natural metabolite is performed. Sets of metabolic interventions, specifically knock-outs and knock-ins that coupled the target chemical production to growth rate were determined. In the third chapter, in order to aid the field of cancer metabolism, potential biomarkers were determined through gain of function oncometabolites predictions. Based on a chemoinformatic approach in conjunction with the global human metabolic network Recon 2, a workflow for predicting potential oncometabolites is constructed. Starting from a list of mutated enzymes genes, described as GoF mutations, a range of promiscuous catalytic activities are inferred. In total 24 chemical substructures of oncometabolites resulting from the GoF analysis are predicted.

Ingeniero Civil en Química / Ingeniero Civil en Biotecnología / Debido a la gran demanda de proteínas recombinantes y en particular de anticuerpos para el uso terapéutico en humanos, se busca optimizar los cultivos celulares para obtener mayor producción de proteínas y menores costos de producción. Uno de los métodos utilizados en el mejoramiento de los cultivos es la ingeniería celular donde, mediante la inserción o eliminación de un gen, se modifican las vías metabólicas de las células. Las líneas celulares animales tienen la desventaja de que su metabolismo es incapaz de oxidar la glucosa completamente a CO2 y H2O. La mayor parte de la glucosa, es oxidada a piruvato y finalmente a lactato, el que tiene un impacto negativo en el crecimiento celular y en la producción de proteínas. El trabajo consistió en caracterizar los clones CHO MDHII y CHO PYC generados a partir de una línea celular CHO productora de IgG, que sobreexpresan los genes MDHII y PYC2 las cuales han mostrado mejorar la eficiencia del metabolismo en otras líneas celulares, produciendo menos lactato y aumentando el flujo de carbonos desde la glicólisis hacia el ciclo del TCA. Para ello fue necesario hacer una selección previa de clones, de tal forma de escoger a los que presentaran mayor productividad específica de IgG y mayor eficiencia metabólica, caracterizada por valores bajos de producción de lactato por glucosa consumida (ΔL/ΔG). Luego se procedió a realizar las curvas de crecimiento para los clones y las células CHO wild-type que se utilizó como control. Para la caracterización del metabolismo, se midió la glucosa consumida, la producción de lactato, IgG y amonio, y se calcularon las tasas de consumo y producción de los metabolitos. La caracterización de la expresión transcripcional se realizó mediante un PCR en tiempo real, para el que fue previamente necesario extraer el RNA de las muestras, seguida de la síntesis de cDNA. Los resultados mostraron una menor producción de biomasa y anticuerpo IgG en los clones en comparación al control CHO wild-type, debido a un aumento inesperado en la producción de este último. Por otro lado, sí fue posible demostrar una mayor eficiencia metabólica de los clones debido a la disminución en la producción de lactato, en el caso del clon CHO MDHII y a una menor diferencia entre las tasas de producción de lactato y consumo de glucosa, en el clon CHO PYC. Al comparar las eficiencias de ambos clones, las células CHO MDHII mostraron una mayor eficiencia metabólica lo que se debería a un mayor flujo de carbonos desde la glicólisis al ciclo del TCA. Se cree que el clon CHO PYC no mostró una mayor eficiencia metabólica debido a que se generaría una acumulación de malato que no podría ser procesada por la enzima MDHII en el ciclo del TCA. Los cálculos de productividad específica de IgG demostraron que la producción de proteína recombinante estaría asociada al crecimiento celular y se cree que el consumo de glutamina cumpliría un rol importante en la producción de biomasa e IgG debido a que se obtuvieron mayores concentraciones de amonio en las células con mayor densidad y producción de proteína. El análisis de la expresión transcripcional no permitió detectar diferencias en la amplificación de los genes MDHII y PYC2, principalmente debido a la variación en los resultados obtenidos y a que no fue posible amplificar un producto específico para el gen PYC2. Del trabajo se puede concluir que el clon CHO MDHII presentó una mayor eficiencia metabólica debido a la menor producción de lactato y exhibió mayor producción de biomasa e IgG que el clon CHO PYC. Para comprender mejor el comportamiento de estos clones, se debe llevar a cabo un estudio de los flujos en las vías metabólicas y buscar métodos de cultivo que optimicen el crecimiento celular y la producción de proteína, para obtener el máximo beneficio de los clones. Por otro lado, es importante que en el proceso de la selección de clones, la productividad de proteína recombinante de los clones se compare con una muestra control, de tal manera de verificar que estos presentan una mejora. Además se deben seleccionar los clones que presenten una mayor densidad celular y menor producción de lactato, ya que se ha visto que estas características mejoran la productividad.

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Magíster en Ciencias de la Ingeniería, Mención Química / Ingeniera Civil en Biotecnología / El cultivo de células animales ha cobrado gran importancia en la industria biotecnológica, dada su capacidad de producir proteínas recombinantes compatibles con su uso terapéutico en humanos. Este potencial ha motivado la búsqueda de estrategias para la optimización de los procesos cuyo objetivo es la síntesis de grandes cantidades de proteínas con aplicaciones biomédicas. Una de las estrategias utilizadas corresponde al cultivo en fuentes alternativas de carbono, tales como galactosa, las que al ser consumidas lentamente llevan a la obtención de un metabolismo más eficiente, con una reducción de la acumulación metabolitos inhibitorios tanto del crecimiento celular como de la síntesis del producto. Sin embargo, se ha observado que estos cultivos presentan baja velocidad de crecimiento por lo que es necesario suplementar estos medios con glucosa o realizar modificaciones al metabolismo celular de forma de obtener cultivos con mayores rendimientos. Para la obtención de una línea celular que presente un desempeño mejorado en cultivos con galactosa, se transfectaron células CHO de forma de sobre-expresar proteínas asociadas a pasos previamente reportados como limitantes del metabolismo de la galactosa, específicamente el transportador Slc2a8 y galactoquinasa Galk1. No se tuvieron resultados concluyentes con respecto a la sobre-expresión del transportador Slc2a8, debido a que el pool de clones obtenidos luego de la transfección no mantuvo su viabilidad durante tiempo suficiente para caracterizar su comportamiento en cultivo. Por otro lado, los resultados obtenidos mostraron que los clones seleccionados (CHO-Galk1) alcanzan mayor densidad celular en cultivos desarrollados en medio con glucosa y galactosa, además de ser capaces de crecer en un medio que sólo presenta galactosa, contrario a lo observado en la línea parental. Las células CHO-Galk1-2 presentan una mayor concentración de producto, llegando a sintetizar un 42% más de tPA que el control. El aumento más drástico de tasa de producción está asociado a la fase de crecimiento en galactosa. Los resultados obtenidos para el metabolismo de glucosa del clon CHO-Galk1-2 presentan diferencias con respecto al cultivo control, por lo que se plantea que la sobre-expresión de este gen puede tener efectos positivos en el metabolismo de glucosa. El análisis de flujos metabólicos permite observar un metabolismo eficiente, centrado en la producción de energía, asociado a un alto flujo en el ciclo del TCA, producción de biomasa y producto.

[EN] Monoterpenes (C10) are isoprenoids usually employed as aromatic additives, are important components of wine aroma and some of them have antimicrobial and health beneficial properties. An efficient microbial production of these metabolites could be an inexpensive and environmentally friendly alternative to current techniques: chemical synthesis or extraction from natural sources. They are usually produced in plants from geranyl pyrophosphate (GPP), a common intermediate of isoprenoid pathway in microorganisms and higher organisms; what opens the possibility of producing them in yeasts as Saccharomyces cerevisiae, qualified as GRAS, and that has been widely employed for biotransformation and production of enzymes and metabolites of biotechnological interest. In this work, the inherent ability of this yeast for heterologous production of monoterpenes (linalool, geraniol, etc.) capable to improve organoleptic and/or functional properties of certain foods either being used as additives or produced during the elaboration process (e.g. vinification) has been characterized and improved by metabolic engineering approaches. Among the most relevant results we can find the selection of wine strain T73 because of its better ability to produce monoterpenes, and the improvement of this production by overexpressing a deregulated version of Hmg1p (catalyzes mevalonic acid synthesis, MVA) and IDI1 (encodes isopenthenyl pyrophosphate isomerase, that catalyzes the isomerization of farnesyl pyrophosphate synthase -FPPS- substrates). In addition, characterization of the FPPS role in GPP availability for the Clarkia breweri linalool synthase resulted in a 50 times increased production in yeast strains with wild-type enzyme (encoded by ERG20) replaced by one modified in its active site (K197E), encoded by erg20-2 allele; reaching a global improvement of 80 times the basal linalool production (14.51 ± 0.90 µg/L) when coexpressing IDI1 gene and erg20-2 allele in linalool producing strains lacking endogenous FPPS activity (1144.68 ± 139.39 µg/L). Geraniol producing strains (bearing Ocimum basilicum -sweet basil- GES gene that encodes geraniol synthase) derived from T73 were included in microvinification assays and geraniol concentration was over its perception threshold and a metabolic dispersion to other monoterpene (linalool, nerol and citronellol) and aromatic esters (geranyl and citronellyl acetate) was also detected. Increased monoterpene production established in IDI1 overexpressing strains under laboratory conditions was reproduced in these assays, demonstrating that the modification of key steps of MVA pathway is a valid strategy to modulate and/or improve wine aroma. / [ES] Los monoterpenos (C10) son isoprenoides habitualmente utilizados como aditivos aromáticos, son componentes importantes del aroma de los vinos y algunos tienen propiedades antimicrobianas y/o beneficiosas para la salud. La producción eficiente de estos metabolitos en microorganismos podría ser una alternativa más económica y respetuosa con el medio ambiente que las técnicas empleadas en la actualidad: síntesis química y/o extracción de fuentes naturales. En las plantas los monoterpenos son producidos por monoterpeno sintasas que utilizan como sustrato geranil pirofosfato (GPP), siendo éste un intermediario común de la ruta de isoprenoides en microorganismos y organismos superiores, lo que abre la posibilidad de producirlos en la levadura Saccharomyces cerevisiae, que tiene el calificativo GRAS, y que ha sido además ampliamente utilizada para la biotransformación y producción de enzimas y metabolitos de interés biotecnológico. En este trabajo se ha caracterizado y mejorado, mediante técnicas de ingeniería metabólica, la capacidad inherente que tiene esta levadura para la producción heteróloga de monoterpenos (linalol, geraniol, etc.), que puedan mejorar las características organolépticas y/o funcionales de ciertos alimentos al ser usados como aditivos o al aumentar su concentración durante el propio proceso de elaboración (p. ej. vinificación). Entre los resultados más destacados están la selección de la cepa vínica industrial T73 por su mayor capacidad para producir monoterpenos, y la mejora de dicha producción mediante la sobreexpresión desregulada de la enzima Hmg1p (cataliza la formación del ácido mevalónico, MVA) y del gen IDI1 (codifica isopentenil pirofosfato isomerasa, que cataliza la isomerización de los sustratos de la farnesil pirofosfato sintasa, FPPS). Además, la caracterización del rol de la enzima FPPS en la disponibilidad de GPP para su aprovechamiento por la enzima linalol sintasa de Clarkia breweri, derivó en una producción de linalol 50 veces mayor en cepas en las que una versión modificada en su centro activo (K197E), codificada por el alelo erg20-2, reemplazaba a la enzima silvestre (codificada por ERG20); alcanzándose una mejora global de 80 veces respecto a la producción de linalol inicial (14,51 ± 0,90 µg/L), al sobreexpresar conjuntamente el gen IDI1 y el alelo erg20-2 en cepas productoras de linalol que carecen de la función FPPS endógena (1144,68 ± 139,39 µg/L). Las cepas productoras de geraniol (expresan el gen GES que en Ocimum basilicum -albahaca- codifica geraniol sintasa) derivadas de T73 se incluyeron en ensayos de microvinificación y la concentración de este monoterpeno en el vino final no sólo estuvo por encima de su umbral de percepción, sino que se produjo una dispersión metabólica del geraniol hacia otros monoterpenos (linalol, nerol y citronelol) y esteres (geranil y citronelil acetato) aromáticos. Además, el incremento de la producción de monoterpenos observado en condiciones de laboratorio en cepas que sobreexpresan el gen IDI1 se reprodujo en estos ensayos, demostrando que la modificación de pasos clave de la ruta MVA es una estrategia válida para modular y/o mejorar el aroma del vino. / [CAT] Els monoterpens (C10) són isoprenoids habitualment utilitzats com additius aromàtics, són components importants de l'aroma dels vins i alguns tenen propietats antimicrobianes i/o beneficioses per a la salut. La producció eficient d'aquests metabòlits en microorganismes podria ser una alternativa més econòmica i respectuosa amb el medi ambient que les tècniques emprades en l'actualitat: síntesi química i/o extracció de fonts naturals. A les plantes els monoterpens són produïts per monoterpeno sintases que utilitzen com a substrat geranil pirofosfat (GPP), sent aquest un intermediari comú de la ruta dels isoprenoids en microorganismes i organismes superiors, el que obri la possibilitat de produir-los en el llevat Saccharomyces cerevisiae, amb qualificatiu GRAS, i que ha sigut a més àmpliament utilitzat per a la biotransformació i producció d'enzims i metabòlits d'interès biotecnològic. En aquest treball s'ha caracteritzat i millorat, mitjançant tècniques d'enginyeria metabòlica, la capacitat inherent que té aquest llevat per a la producció heteròloga de monoterpens (linalol, geraniol, etc.), que puguen millorar les característiques organolèptiques i/o funcionals de certs aliments en ser usats com additius o en augmentar la seua concentració durant el propi procés d'elaboració (p. ex. vinificació). Entre els resultats més destacats es troben la selecció de la soca vínica industrial T73 per la seua major capacitat per a produir monoterpens, i la millora d'aquesta producció mitjançant la sobreexpressió desregulada de l'enzim Hmg1p (catalitza la formació de l¿àcid mevalònic, MVA) i del gen IDI1 (codifica isopentenil pirofosfat isomerasa, que catalitza la isomerització dels substrats de la farnesil pirofosfat sintasa, FPPS). A més, la caracterització del rol de l'enzim FPPS en la disponibilitat de GPP per al seu aprofitament per l'enzim linalol sintasa de Clarkia breweri, va derivar en una producció de linalol 50 vegades major en soques en les que una versió modificada en el seu centre actiu (K197E), codificada per l'al¿lel erg20-2, reemplaçava a l'enzim silvestre (codificada per ERG20); aconseguint una millora global de 80 vegades respecte a la producció de linalol inicial (14,51 ± 0,90 µg/L), en sobreexpressar conjuntament el gen IDI1 i l'al¿lel erg20-2 en soques productores de linalol que no tenen la funció FPPS endògena (1144,68 ± 139,39 µg/L). Les soques productores de geraniol (expressen el gen GES que en Ocimum basilicum -alfàbrega- codifica geraniol sintasa) derivades de T73 es van incloure en assajos de microvinificació i la concentració d'aquest monoterpè en el vi final no només va estar per sobre del seu llindar de percepció, sinó que es va produir una dispersió metabòlica del geraniol cap a altres monoterpens (linalol, nerol i citronel¿lol) i èsters (geranil i citronel¿lil acetat) aromàtics. A més, l'increment de la producció de monoterpens observat en condicions de laboratori en soques que sobreexpressen el gen IDI1 es va reproduir en aquests assajos, demostrant que la modificació de passos clau de la ruta MVA és una estratègia vàlida per modular i/o millorar l'aroma del vi. / Rico Molins, J. (2015). Producción heteróloga de monoterpenos en Saccharomyces cerevisiae: selección y mejora de cepas mediante técnicas de ingeniería metabólica [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/49359 / TESIS

Tesis para optar al grado de Doctora en Ciencias de la Ingeniería Mención Ingeniería Química y Biotecnología / Salinosporamide A is a cytotoxic that has been proven to combat various types of cancer and malaria. It is currently in phases II and III of approval as an anticarcinogen. The advantages that poses over other cytotoxics are greater activity at low concentrations and highly specific. It acts on the proteasome-ubiquitin system, responsible of apoptosis in cells. This secondary metabolite is naturally ocurred in the actinomycetes bacterium strictly marine, Salinispora tropica that needs a specific ionic force in the medium to grow. Due to his nature it is a promisory source of secondary metabolites for pharmaceutical use hereby is constantly studied. The CNB440 strain is the representative strain of the species and posses a Genome-Scale Metabolic Model (GSM). The goal of this work was to implement diverse metabolic and genetic strategies that allow improve the production of Salinosporamide A. Chapter 4 of this thesis details the proves to establish the protocols for growth and determination of Salinosporamide A, Define the sensitivity of bacteria to kanamycin (100 ug/ml), thiostreptone (12 µg/ml) and apramycin (12 µg/ml). The growth curves in several minimum mediums, and stablish the methodology for the determination of Salinosporamide A. Chapter 5 describes the genetic strategy used to modify the bacterium and generate a higher concentration of Salinosporamide A. The strategy followed was by recombination homologous with the temperature sensitive vector (pGM1190) and transferred to S. tropica by conjugation with the strain E. coli ET12567/pUZ8002, to delete specific sites on the chromosome of S. tropica. These molecular tools have been successfully used in the transformation of various Streptomyces, but had not been tested in Salinispora. The sites suggested to be deletedto increase the production of the secondary metabolite were 3 clusters of genes sporolides, lymphostine and salinilactam. But due to various complications in the development of the present work only the deletion of the sporolide gene cluster was evaluated and this resulted in an increase of 20% in metabolite production. Chapter 6 details the use of genome-scale metabolic model iCC908 for increase the production of Salinosporamide A. The first stage consisted in establishing the working environment of the model, to increase the accuracy of the model, integrated growth data, metabolites in medium production and determination of Salinosporamide A, with this was also able define in silico the supplementation of medium production, to obtain more Salinosporamide A. . The second stage consisted of applying different algorithms OptKnock, OptGene, OptOrf, GDLS, FSEOF, which browse reactions or genes within the genome-scale model that could be, deleted, blocked or overexpressed to increase the production of the secondary metabolite. We found several candidates that were evaluated in silico and we proposed to evaluate the deletion of two genes. As the last stage, were evaluated the metabolic pathways that increase production by gene overexpression. The evaluation of this metabolic pathways consist in add diverse substrates that increase the flow in the pathway of the gene to be overexpresed, tyrosine at a concentration of 5mM increase the production of the secondary metabolite Salinosporamide A by 180%, enhancing the presence of phenylalanine in the medium. With these results it was possible to obtain a medium production that increased in 2.8 times Salinosporamide A by fermentation based on the use of the genome-scale metabolic model. And also was possible transform the strain S. tropica with genetic tools previously proved in Streptomyces.

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